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ANDROLOGIA
E MANIPULAÇÃO DE
SÊMEN EQUINO
Julho
2015
05-12
ÍNDICE
4. EXAME ANDROLÓGICO 11
4.1 INTRODUÇÃO 11
4.2 MATERIAL NECESSÁRIO 11
4.3 SEQUÊNCIA DO EXAME 11
7 COLHEITA DO SÊMEN 21
7.1 ANÁLISE DO SÊMEN 22
7.1.1 EXAMES IMEDIATOS 22
7.1.2 EXAMES MEDIATOS 22
7.2 CÂMARA DE NEUBAUER 23
7.3 PADRÕES DE PATOLOGIAS ESPERMÁTICAS 26
7.4 PRINCIPAIS CAUSAS DAS PATOLOGIAS ESPERMÁTICAS 28
7.5 MODELO DE LAUDO DE EXAME ANDROLÓGICO 31
7.6 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE SÊMEN DE
GARANHÕES DESCRITOS POR VÁRIOS PESQUISADORES 33
9. CONGELAÇÃO DE SÊMEN 34
9.1 INTRODUÇÃO 34
9.2 MATERIAL NECESSÁRIO 34
9.3 SEQUÊNCIA PARA CONGELAÇÃO 34
9.4 LAUDO PARA SÊMEN CONGELADO 38
2
9.5 PROVAS LABORATORIAIS DE INTEGRIDADE DA MEMBRANA
PLASMÁTICA 39
11. AUTORES 45
3
1.ANATOMIA DO SISTEMA GENITAL MASCULINO
GARANHÃO
4
2. ENDOCRINOLOGIA DA REPRODUÇÃO DO
GARANHÃO
Para que os testículos possam produzir espermatozóides de maneira contínua é
necessário que o eixo hipotálamo – hipófise – gônadas, esteja em sincronia, de tal forma
que os hormônios envolvidos para esta finalidade sejam liberados em quantidades
adequadas.
O hipotálamo é uma região cerebral localizada no diencéfalo, responsável pela
liberação de GnRH. Este hormônio peptídico via sistema porta hiposisário vai até a
hipófise, onde é reconhecido pelas células lá presentes desencadeando a secreção das
gonadotrofinas (FSH e LH) que através corrente da sangüínea se dirigem até os testículos,
resultando na produção de esteróides (estrógeno e testosterona), que participam da
formação dos espermatozóides.
Os hormônios envolvidos na reprodução são liberados através de retroalimentação
positiva ou negativa, conforme a necessidade. Sua produção é estimulada ou inibida, de
maneira a se manter concentrações adequadas para a plena produção espermática.
Nos testículos há a presença de dois tipos de células. As células de Leydig que
produzem testosterona pelo estímulo do LH, testosterona esta que é “ligada” por uma
proteína ligadora de andrógenos (ABP) a luz das células de Sértoli (estimulada pelo FSH)
produtoras da ABP e responsáveis pelo controle da espermatogênese.
Conforme há um aumento das concentrações de testosterona circulante, ocorre
uma retroalimentação negativa a nível do hipotálamo resultando numa diminuição dos
pulsos de liberação de GnRH desencadeando uma menor liberação de gonadotrofina (LH)
que diminui a produção de testosterona pelos testículos. Quando existe a necessidade de
uma maior produção deste hormônio ocorre uma retroalimentação positiva e os níveis
testosterona são novamente restabelecidos.
Outro hormônio que participa dos processos de regulação da secreção de GnRH é
a inibina produzida pelas células de Sértoli, ela promove uma maior ou menor liberação dos
pulsos de GnRH que diminuem ou aumentam a secreção do FSH afetando a produção da
ABP e da própria inibina.
É de grande importância o conhecimento deste mecanismo para um bom
diagnóstico de alterações reprodutivas que possam vir a afetar o macho prejudicando sua
função reprodutiva e qualidade espermática.
Segue abaixo o esquema do eixo hipotálamo - hipófise – gônadas.
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NEUROENCDOCRINE AND ANATOMY AND FUNCTION. Proposed positive(+)
and (-) feedback control of hormone production and release in the stallion. VNO
,Vomeronasal organ: GnRh, gonadotropin-releasing hormone: LH, luteinizing hormone;
PRL prolactin; FSH, follicle-stimulating hormone; T, testosterone; E, estrogens; I,
inhibin; A, activin. Potencial external influences on hypothalamic secretion are also cted.
(Adapta also Adapted from Pickett,B.W.,Amann,R.P.,McKinnon,A.O.,et al: Management
of the stallion for maximum reproductive efficiency. II. Animal Reproduction Laboratory
General Series Bulletin nº 05,Fort Collins,CO: Colorado State University,1989,p1) (Equine
Breeding Management and Artificial Insemination, Juan C. Samper, second edition).
6
3. PATOLOGIAS DO SISTEMA REPRODUTIVO DO
GARANHÃO
Fimose
Incapacidade de expor o pênis comumente, podendo ser congênito ou adquirida, por
traumas ou infecções. Tratamento: cirúrgico.
Parafimose
Balanopostite
Hematoma peniano
Edema prepucial
Laceração prepucial
7
Lesões traumáticas no prepúcio, dependendo da extensão e tempo de evolução
sutura com plastia local almejando evitar alterações no óstio prepucial, se o tempo de
evolução for maior que 24hs ferida já contaminada tratamento tópico (limpeza, agentes
desinfetantes, ducha e repelentes), cicatrização por segunda intenção.
3.2 TESTÍCULOS
Degeneração testicular
8
penetrância incompleta. Tratamento: por se tratar de uma patologia de origem genética
deve-se afastar o animal da reprodução.
Para se diferenciar um quadro de hipoplasia testicular de uma degeneração
necessita-se de uma anamnese bem detalhada. Nos casos de degeneração os testículos
tinham tamanho normais, nas hipoplasias sempre foram pequenos e as alterações do
ejaculado não se alteram como no caso da Degeneração Testicular,
Orquite
Neoplasias testiculares
Hérnia inguino-escrotal
Rotação testicular
Torção Testicular
9
No testículo afetado, observa-se um giro no eixo longitudinal de modo que nos
casos de torção de 90° a cauda do epidídimo estará em posição lateral ou medial e nos
casos de torção de 180° a cauda do epidídimo estará em posição cranial. Dependendo do
grau de torção pode haver comprometimento circulatório e, nesses casos, o tratamento é
cirúrgico com a retirada do testículo afetado.
EPIDÍDIMO:
a)Defeitos congênitos:
Aplasia Segmentar: todo ou parte do epidídimo, vasos deferentes ou vesículas
seminais podem estar ausentes.
Hipoplasia : geralmente acompanha a hipoplasia testicular.
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CONDUTOS ESPERMÁTICOS:
GLÂNDULAS ANEXAS:
11
4.EXAME ANDROLÓGICO
4.1. INTRODUÇÃO
O exame andrológico reflete as atuais condições reprodutivas de um macho. O
potencial reprodutivo do animal deve ser verificado sempre antes do inicio da estação de
monta, para diagnóstico de sub ou infertilidade, na ocorrência da puberdade, para realizar a
criopreservação de sêmen, antes de comercializações, etc.
A avaliação andrológica consiste na observação das condições semiológicas, bem
como as condições de sanidade, alterações genéticas, saúde geral, deficiências na cópula
por alterações locomotoras ou alterações do sistema genital (impotência coeundi) e
problemas espermáticos (impotência generandi).
O laudo de um exame andrológico nunca é definitivo (para o resto da vida
reprodutiva), sempre deve-se levar em consideração que o animal logo após o exame pode
vir a sofrer de alguma patologia que leve-o a depreciações em sua qualidade espermática,
por isso o laudo não deve ser emitido com uma validade superior a 60 dias (tempo de
duração da espermatogênese e do trânsito epididimário).
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B) Identificação do proprietário:
Nome, endereço, telefone, nome da propriedade
C) Exame do animal:
Testículos e Bolsa escrotal – Observa-se bem o escroto, se não há feridas, bernes, edema,
varicocele (dilatações vasculares), então palpa-se os testículos que no equino têm a
forma ovóide e posicionamento horizontal em relação ao animal. Devem ter mobilidade
dentro da bolsa, ausência de dor a palpação, simetria, consistência fibroelástica. Devem
ser feitas mensurações individuais de cada testículo, que demonstram com maior
exatidão a verdadeira massa testicular, devendo ser realizadas com o auxílio de um
paquímetro. Comprimento normal varia entre 5 e 12cm (do polo proximal até o polo
distal do testículo), largura normal varia entre 4 e 8 cm (medida latero-madial, na
porção média do testículo), altura normal varia entre 4 e 8 cm (medida infero-superior,
na porção média do testículo).
13
andrológico, sendo somente requerido quando há suspeita de algum processo patológico
específico.
A ultrassonografia do trato reprodutivo de garanhões é uma excelente ferramenta no
diagnóstico de inúmeras condições patológicas como granuloma espermático, epididimites,
criptorquidismo, varicocele, estruturas císticas do epidídimo, aumento da espessura da
túnica vaginal e neoplasias testiculares. Além disso, este exame permite aferições exatas de
medidas tais como altura, largura e comprimento, bem como área transversal e
circunferência na parte mais larga de cada testículo, medidas estas utilizadas para estimar
volume testicular e produção diária de espermatozóides.
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Funículo Ducto
Espermático Deferente
Artéria
Testicular
Corpo do
epidídimo
Cabeça do
Epidídimo
Veia central
Cauda do
Epidídimo
Túnica
Albugínea
15
Figura 2 – O esquema à esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado no testículo
para avaliação da veia central. Na imagem ultrassonográfica (direita) de um testículo normal (corte transversal), a veia
central aparece como uma estrutura anecóica com formato circular (seta).
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A túnica vaginal visceral está intimamente justaposta à túnica albugínea em torno
do testículo, epidídimo e funículo espermático. A próxima camada externa é a túnica
vaginal parietal que é a continuação do peritônio parietal. Entre as duas camadas vaginais
existe uma pequena quantidade de líquido peritoneal (TURNER, 1998).
17
Figura 5 – Exame ultrassonográfico dos testículos e epidídimos.
18
Figura 6 – Exame ultrassonográfico do funículo espermático.
19
Figura 7 – O esquema à esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado para avaliação
do funículo espermático. Na imagem ultrassonográfica (direita) a artéria testicular é identificada como estruturas
anecóicas em cortes (seta branca), e o plexo pampiniforme como uma estrutura heterogênea envolvendo a artéria (seta
preta).
Figura 8 – O esquema à esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado no testículo
para avaliação da veia central. Na imagem ultrassonográfica (corte longitudinal), a veia central aparece como uma
estrutura anecóica (setas), que diminui em diâmetro à medida que segue para a região caudal.
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Figura 9 – O esquema à esquerda demonstra que o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado na superfície
dorso-lateral do testículo para avaliação do corpo do epidídimo. Na imagem ultrassonográfica o corpo do epidídimo
(setas) apresenta-se hipoecóico em relação ao parênquima testicular normal.
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Figura 10 – O esquema demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência na imagem à esquerda e 7,5 MHz de
frequência na imagem à direita) foi colocado para avaliação da cauda do epidídimo. Na imagem ultrassonográfica,
observa-se a cauda do epidídimo (setas) hipoecóica em relação ao parênquima testicular. A presença de líquido na
cavidade vaginal facilita o exame.
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Em certas posições é possível visualizar ramos da artéria testicular (Figura 11),
sendo esses vasos maiores e mais proeminentes próximo à cauda do epidídimo. O
parênquima testicular normal possui textura homogênea (LOVE, 1992).
Figura 11 – O esquema à esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado no testículo,
possibilitando a vizualização dos ramos da artéria testicular (setas).
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tratamento de algumas afecções do trato reprodutivo interno de garanhões, e é indicado na
investigação de certas perturbação na qualidade seminal, particularmente: hemospermia piospermia.
Para a realização do exame completo do trato urogenital de garanhões, incluindo a
visualização da uretra peniana, uretra pélvica, glândula vesicular e bexiga urinária, é indicado a
utilização de videoendoscópio flexível de no mínimo 100 cm de comprimento e com um diâmetro
não maior do que 10 mm.
O exame é realizado com o cavalo em estação, devidamente contido e sedado. Antes do
procedimento o pênis deve ser higienizado com água corrente ou solução fisiológica, para
minimizar a contaminação do trato urinário, e a utilização de luvas estéreis é recomendada aos que
manuseiam o equipamento. São necessárias no mínimo três pessoas para a realização do exame: a
primeira deve segurar a cabeça do cavalo e prezar pela segurança das demais; a segunda é
responsável por segurar o pênis, inserir o endoscópio na uretra e progredir caso necessário; e a
terceira a responsável por manipular o aparelho, injetar ar e outras substâncias quando pertinente.
A progressão do endoscópio no interior da uretra deve ser cuidadosa, de forma lenta e
suave, para permitir um exame minucioso, e minimizar traumas que possam alterar a aparência da
mucosa. O pênis pode ser manuseado com auxílio de uma compressa e tração constante deve ser
aplicada. Após a introdução do endoscópio a distensão da uretra com ar é necessária para uma
melhor visualização do lúmen e estruturas adjacentes e uma breve inspeção de toda uretra deve ser
realizada, antes que apareçam áreas de hiperemia causadas pela presença do aparelho, que possam
ser confundidas com processos inflamatórios pré-existentes.
A mucosa uretral possui coloração rósea pálida, e contém numerosas dobras longitudinais.
Sua aparência e a técnica de avaliação são semelhantes as do esôfago. A vascularização do tecido
submucoso torna-se mais evidente conforme o endoscópio progride em direção à bexiga. Quando o
aparelho alcança o arco isquiático, o operador consegue perceber o trajeto curvilíneo que o
equipamento realiza e a imagem endoscópica torna-se invertida. Ocorre um alargamento da uretra e
as aberturas dos múltiplos ductos das glândulas bulbouretrais podem ser visualizadas em duas
fileiras ao longo do teto da uretra pélvica, que na imagem endoscópica, situa-se ventralmente.
Imediatamente após estas aberturas encontra-se uma elevação da mucosa, que consiste no colículo
seminal. Este é o local onde terminam os ductos deferentes e se abrem as glândulas vesiculares.
Quatro aberturas podem estar presentes, quando os ductos das glândulas vesiculares e dos ductos
deferentes se abrem de maneira independente. Duas aberturas são vistas quando ocorre união prévia
de um ducto deferente e um ducto da vesícula seminal correspondente, formando um ducto comum,
denominado ducto ejaculatório (Figura 1 A, B e C).
As aberturas das glândulas vesiculares podem ser canuladas neste local com um cateter de
polietileno de pequeno diâmetro, permitindo a coleta de amostra do conteúdo dessas glândulas, bem
como a instilação de medicamentos no interior das mesmas .
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Ampolas
Vesículas
Seminais Próstata
Bulbouretrais
A B C
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FIGURA 2. A) Imagem endoscópica do momento em que a abertura de um dos ductos ejaculatórios
é cateterizada para posterior introdução do endoscópio na vesícula seminal. B) Aspecto de uma
vesícula seminal normal. C e D) Aspecto de duas vesículas seminais apresentando conteúdo
purulento decorrente de vesiculite seminal.
7. COLHEITA DO SÊMEN
A colheita do sêmen é efetuada por auxílio de vagina artificial, onde o animal deve
ter um condicionamento prévio para que este monte em uma égua em cio ou em manequim.
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7.1.1 EXAMES IMEDIATOS
Logo após a colheita o sêmen deve ser analisado segundo suas características
macro e microscópicas.
27
7.1.3 CÃMARA DE NEUBAUER
28
A concentração espermática média para um garanhão adulto colhido na vagina
artificial é de 0,1-0,2x109 espermatozóides por ml. (100 a 200 milhões/ml)
Neste exemplo temos 12 espermatozóides azuis que deverão ser contados para
efeito de cálculo, os mesmos localizam-se nos quadrados cinzas e sobre as linhas, relativos
aos cinco quadrados representados, levando-se em consideração o posicionamento da
cabeça. Espermatozóides que apresentam apenas a cauda dentro do quadrado não são
contados.
Após a contagem das células espermáticas (n),utilizamos a seguinte fórmula para
cálculo da concentração espermática.
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O resultado encontrado é referente a concentração de espermatozóides no
ejaculado por mm3, para converter esse dado para mL, basta multiplicá-lo por 103 (1000).
30
7.3 PADRÕES DE PATOLOGIA ESPERMÁTICA
As patologias espermáticas são divididas em Defeitos Maiores, relacionados com a
infertilidade e Defeitos Menores não interferem diretamente sobre a fertilidade.
DEFEITOS MAIORES
1. Acrossomo:
2. Patologia da cabeça:
Subdesenvolvida ..............................................................
Isolada patológica ............................................................
Estreita na base................................................................
Piriforme..........................................................................
Pequena anormal .............................................................
Contorno anormal ............................................................
“Pouch formation” ...........................................................
3. Gota proximal:
4. Formas teratológicas:
5. Defeito de peça intermediária:
(Desfibrilação, fratura, edema, pseudogota) ........................
6. Patologia da cauda:
Fortemente dobrada ou enrolada.........................................
Dobrada com gota..............................................................
Enrolada na cabeça............................................................
7. Formas duplas:
DEFEITOS MENORES
1. Patologia da cabeça:
Delgada ............................................................................
Gigante, curta, larga, peq. normal....................................
Isolada normal...................................................................
2. Patologia da cauda e implantação:
Retro e abaxial, oblíquo.....................................................
Dobrada ou enrolada.........................................................
3. Gota Citop. Distal:
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Esquema das patologias espermáticas encontradas:
A = Patologias de Acrossomo
B = Patologias de Cabeça
C = Patologias de Inserção de
Cauda
D = Patologias de Peça
Intermediária
E = Patologias de Cauda
F = Formas Teratológicas
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C8 = paraxial D4 = estreita E2 = gota distal
C9 = retroaxial D5 = disforme E3 = gota presa na cauda
C10 = rutura do colo D6a e b = ruturada E4 = gota presa na PI
C11 = ausência genética D7 = repregueada E5 = fortemente dobrada
da cabeça D8 = tipo axial E6 = espiraliforme
D) = Peça Intermediária (PI) D9a e b = tipo fibrilar E7 = enrolada cabeça
D1 = normal E) = Cauda E8 = rudimentar
D2 = curta E1 = gota proximal F) = formas duplas
D3 = comprida
Elementos figurados do sêmen
(Modificado de Mies Filho,1982).
a) espermatozóides normais
b) gotas livres
c) anormalidades primárias
d a h) anormalidades secundárias
d) cabeças isoladas
e) gotas proximais
f) gotas distais
g) cauda dobrada com gota
h) acrossomas livres
i) formações ciliares (medusas)
k) células epiteliais de descamação
l) células linhagem espermática =
casos de degeneração testicular
m) hemácias
n) piócitos
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7.4 Principais causas das patologias espermáticas
A) Cabeça
Acrossomo = As alterações no acrossomo como: forma irregular, enrugado ou
destacado, podem ser devido ao choque térmico, manipulação indevida ou senilidade.
A presença de um grânulo no acrossomo, o denominado Knobbed sperm, pode
ser origem hereditária ou relacionado a degeneração testicular e está ligado diretamente
com a infertilidade do animal quando encontrado em grande quantidade.
O Pouch formation, (diadema defect) caracterizado pela presença de vacúolos na
região equatorial da cabeça não mais no acrossomo, formando um colar na cabeça do
espermatozóide são invaginações da membrana nuclear devido a rarefação da cromatina,
apresentam relação direta com a presença de hipoplasia ou degeneração testicular.
Alterações na forma da cabeça como: estreita na base, piriforme, lanciforme,
anã, são patologias de origem testicular podendo ser oriundas de hipoplasia ou degeneração
testicular. Sendo mais comum em cavalos as cabeças sub-desenvolvidas nos casos de
Degeneração Testicular,
B) Colo
Defeitos de inserção como: Abaxial, paraxial e retroaxial, são devido a presença
de “goteira”, falha na formação do espermatozóide. A localização da “goteira” definirá o
tipo da inserção. A inserção abaxial (mais encontrada nos eqüinos e considerada como
normal para cavalos), pode não afetar a fertilidade, pois o espermatozóide tende a se
adaptar com o movimento e conseguir um deslocamento compatível com a fertilização. As
inserções paraxial e retroaxial apresentam uma maior relação com a infertilidade pois
impossibilitam o deslocamento necessário do espermatozóide para a fecundação.
Gotas citoplasmáticas proximais ou distais são restos de citoplasma que são o
nutriente do espermatozóide durante o trânsito epididimário. O espermatozóide durante sua
maturação pelo epidídimo permanece três dias na cabeça do epidídimo ainda com a
presença da gota, posteriormente fica um dia no corpo e finalmente seis dias na cauda onde
deve se desprender desta gota; teorias afirmam que existem enzimas ativadoras no
epidídimo, que dissolveriam a gota. A presença de gotas em grades quantidades podem ser
devido: 1) animal imaturo, que começou a produção a pouco tempo, nestes casos colheitas
seriadas resolvem, um animal que está há muito tempo em descanso sexual também pode
vir a apresentar gotas, devido a um diminuição no trânsito epididimário, da mesma forma
colheitas periódicas levam ao desaparecimento da patologia; 2) disfunção epididimária
devido a alterações de temperatura (deficiência na termorregulação) levando a um
desequilíbrio iônico Na+ e K+, causando alterações no ciclo de maturação; 3) degeneração
testicular, levando a disfunção epididimária; 4) hipoplasia testicular, por se tratar de uma
patologia hereditária a gota sempre irá aparecer no ejaculado.
34
C) Peça Intermediária
Corkscrew defect (defeito em saca rolha), devido a degeneração do plasmalema,
afetando a região das mitocôndrias que fica com aspecto rugoso, podendo dificultar a saída
da gota e mais grave afetando a conformação das microfibrilas que podem se soltar
patologia vista em animais idosos.
Cabeça destacada (isolada), “goteira” rasa quando se forma podendo ser
decorrente de problema de inserção paraxial ou de origem genética.
Forma duplas da PI e/ou cauda, origem hereditária.
D) Cauda
Enrolada, fortemente enrolada, dobrada e fortemente dobrada, são devidas a
uma diminuição no número de microfibrilas 3 ou 4 (Dag defect) neste caso sendo de caráter
hereditário, estes animais apresentam elevado nível de Zn no sêmen. Outra causa da
apresentação de defeitos de cauda no espermatozóides pode ser devido a choque osmótico
ou térmico e disfunções de epidídimo.
E) Outras anormalidades
Aglutinação de cabeça (head aglutination), os espermatozóides chegam em
blocos ao epidídimo, e neste local há presença de antiaglutininas que promovem a
separação das células, uma disfunção epididimária pode levar ao desenvolvimento desta
patologia.
Espermatozóides subdesenvolvidos, animais imaturos ou processos interferindo
na espermatogênese (de animais maduros) havendo a liberação no ejaculado de células
primordiais espermatócitos, espermatogônias, espermátides.
Medusa, restos ciliares do epidídimo por disfunção epididimária, geralmente nos
casos de recuperação de degeneração testicular.
Pseudogota, semelhante a gota citoplasmática, porém situada na porção média da
PI, e apresentando tamanho maior que a gota tradicional devido ao envolvimento de 1 ou 2
camadas de mitocôndrias.
35
7.5 MODELO DO LAUDO DE EXAME ANDROLÓGICO
fmvz-unesp
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA -
BOTUCATU
Dep. de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
18618 - 000 - Botucatu/ SP - Rubião Junior - Fone/FAX (14)6802 6249/6326
CERTIFICADO ANDROLÓGICO
A.) IDENTIFICAÇÃO DO REPRODUTOR
Nome: Raça: Idade: Registro:
Proprietário: Propriedade:
Endereço:
B.) EXAME CLÍNICO
1. Histórico:
2. Geral:
3. Sistema Genital - Prepúcio: Pênis:
Testículos: Esquerdo Direito
Dimensões (comp., larg. alt.)cm
Simetria
Forma
Posição
Consistência
Sensibilidade Dolorosa
Mobilidade
Epidídimo
Genitália interna:
4. Comportamento sexual (libido):
C.) ESPERMIOGRAMA
I. Método de coleta: Vagina Artificial Data: Horário:
II. Características do ejaculado:
1. Volume ejaculado : ml 5. Motilidade :
2. Cor : 6. Vigor (0-5) :
3. Aspecto : 7. Concentr. (x106/mm3) :
4. Turbilhonamento : - 8. Total esperm. (x109) :
III. Características morfológicas (anexo I):
a. Defeitos maiores: % b. Defeitos menores: % Total: %
IV. Outros elementos: (1. Medusa, 2. Células primordiais, 3. Células gigantes, 4. Leucócitos, 5. Hemácias, 6.
Não detectados Células epiteliais, 7. Cristais de urina, 8. Bactérias.)
D.) OBSERVAÇÃO:
E.) CONCLUSÃO:
------------------------------------------------
Local, ........... Data, .../..../...... Méd. Veterinário Responsável
CRMV
36
fmvz-unesp
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU
Dep. de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
18618 - 000 - Botucatu/SP - Rubião Junior - Fone/FAX (014) 821.2121 - Ramal 2249/2326
1. Medusa : 5. Hemácias :
2.Células primordiais: 6. Células epiteliais:
3. Células gigantes : 7. Cristais :
4. Leucócitos : 8. Bactérias :
-----------------------------------
Local, ........... Data, .../..../...... Med. Veterinário Responsável
CRMV
37
7.6 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE SÊMEN DE
GARANHÕES DESCRITOS POR VÁRIOS PESQUISADORES
8.2 Refrigeração:
38
Para resfriamento entre 15 e 20C podemos utilizar Botuflex ou Botu-Box
(Botupharma) (Anexo2).
Manter fonte de gelo biológica congelada por pelo menos 24 horas em Freezer (-10C).
Não manter o sêmen por um período de tempo superior a 24 horas quando refrigerado a
15°C.
8.3 Inseminação:
As inseminações com sêmen fresco devem ser realizadas utilizando-se entre 500 a
1000x106 sptz viáveis.
9. CONGELAÇÃO DE SÊMEN
9.1 INTRODUÇÃO
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G) Câmara de Neubauer
H) pipeta de Sahli ou micropipeta de 20l (10 a 100L)
I) álcool polivinílico ou bolinhas de metal ou vidro para lacrar palhetas
J) diluente para congelação (BOTU-CRIO®)
K) uma geladeira (no local) a 5°C para estabilização
L) termômetro
M) caixa de isopor 37 a 45L (45cm Comprimento x 36cm Largurax 38cm Altura)
N) grade para as palhetas (local onde são colocadas as palhetas p/ estabilização), (modelo
Botupharma)
O) suporte para manter a grade de palhetas acima do nível do N2 (modelo Botupharma)
P) botijão de N2 (no local)
Q) Banho-Maria
a) Preparo do laboratório
b) Colheita do Semên
O sêmen pode ser colhido com a vagina artificial, modelo (modelo Botupharma) .
- Análise dos parâmetros macro e microscópicos do sêmen.
- Cálculo do número de palhetas a serem congeladas: Cada palheta deve conter 100
milhões de espermatozóides viáveis. Desta forma para o cálculo do número de
palhetas basta dividir por 100 o número total de espermatozóides viáveis do
ejaculado.
40
- Centrifugação: deve ser feita para eliminar o plasma seminal, com sêmen diluído
na proporção de 1:1 com Botu-Semen (Botupharma) 600xg ou 2200 rpm por 10
minutos (Ex. centrífuga da Fanem/Baby/n2 por 10 minutos).
41
CUIDADOS NA INSEMINAÇÃO COM SÊMEN CONGELADO
Não diluir a dose inseminante, pois isto pode ser altamente lesivo e provocar
dano osmótico.
42
9.4 LAUDO UTILIZADO PARA SÊMEN CONGELADO
fmvz-unesp
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
18618 -000 -Botucatu/SP -Rubião Junior-Fone/FAX (014)6802-6.249//6326
I.-) IDENTIFICAÇÃO
ESTABELECIMENTO :
PROPRIETÁRIO:
NOME DO REPRODUTOR: RAÇA: EMBALAGEM:
PARTIDA: Data:
II.-) EXAME FÍSICO PÓS-DESCONGELAÇÃO:
MÉTODO DE DESCONGELAÇÃO:
VOLUME DA DOSE:
TOTAL DE ESPERMATOZÓIDES DA DOSE:
ANÁLISE SUBJETIVA DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA :
VIGOR (0-5):
ANÁLISE COMPUTADORIZADA ( HTM-IVOS 10)
ANÁLISE DA INTEGRIDADE DA MEMBRANA PELA FLUORESCÊNCIA:
V.-) OBSERVAÇÃO:
VI.-) CONCLUSÕES:
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9.5 PROVAS LABORATORIAIS DE INTEGRIDADE DA
MEMBRANA PLAMÁTICA
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9.5.2 Choque osmótico (Dell'Aqua Jr., et al, 2002)
Outra prova bem simples de ser realizada, submete-se o espermatozóide a
um estresse osmótico utilizando água destilada aquecida a 37°C, coloca-se uma
gota de sêmen em 19 gotas desta água destilada e conta-se também 200 células,
sendo que as que apresentarem dobramento de cauda são consideradas íntegras e
as que permanecerem retas lesadas. A fisiologia do processo é que as membranas
íntegras começam a receber um grande influxo de água pois a água vai do meio
menos concentrado no caso a água que tem osmolaridade 0, para o gradiente mais
concentrado no caso a célula espermática com osmolaridade próximo de
280Mosmol e esse excesso de pressão dentro da célula faz com que esta se
deforme dobrando a cauda. As células que não tinham a membrana íntegra não
fazem esta troca osmótica e permanecem esticadas, o resultado é expresso em
porcentagem, descontando-se os espermatozóides que já apresentavam caudas
dobradas como patologia espermática. Ex. 60% de células dobraram a cauda após
o choque osmótico e o touro tinha 5% de caudas dobradas ou enroladas como
patologia espermática, logo concluímos que este animal tem 55% de células com
integridade de membrana plasmática.
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9.5.3 Sondas fluorescentes
É uma técnica mais refinada, que necessita de um microscópio de
epifluorescência, cujo o custo é elevado, porém pode-se destinar a dose a um
centro que possua esse equipamento para realização do exame. São utilizados duas
sondas fluorescentes (“corantes”), um é um éster de carboxifluoresceína substância
apolar que penetra em membrana íntegra, ela é metabolizada no citoplasma do
espermatozóide por esterases lá presentes e transformado em fluoresceína que não
consegue sair da célula e emite uma coloração verde. O outro corante é uma
substância polar que não consegue penetrar em membrana íntegra. Só o faz
quando ela está lesada ao penetrá-la atinge o núcleo do espermatozóide e libera um
RNAm que codificará as organelas a produzirem uma fluorescência vermelha.
Então as células que se coram de verde são as com membrana íntegra e as que
expressarem cor vermelha apresentam algum tipo de lesão em sua membrana.
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10. TÉCNICAS PARA MELHORAR A QUALIDADE DO
SÊMEN FRESCO, REFRIGERADO E CONGELADO DE
GARANHÕES
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espermatozóides, uma vez que o cushion no fundo do tubo de centrifuga funciona como
uma almofada que reduz a lesão espermática.
Para realizar a remoção do plasma seminal utilizando centrifugação com cushion, o
sêmen deve ser diluído na proporção 1:1 com meio diluente a base de leite desnatado e
armazenado em um tubo falcon de 50 mL. Deve-se depositar cuidadosamente 1 mL de
cushion no fundo do frasco, utilizando uma cateter acoplado a uma seringa. Realiza-se
centrifugação a 1000xg durante 20 minutos.
Posteriormente a centrifugação, o sobrenadante deve ser cuidadosamente removido
através da aspiração com um cateter acoplado a uma seringa ou um equipamento de
aspiração. Após isso, remove-se cuidadosamente também o cushion utilizando um cateter
acoplado a uma seringa e ressuspende-se o pellet com o meio extensor desejado.
Visando também reduzir estes danos aos espermatozoides decorrente da técnica de
remoção do plasma seminal, pode-se realizar concentrar espermatozoides utilizando um
filtro composto por membrana hidrofílica sintética (Sperm Filter®) com poros de 2μm que
retêm os espermatozóides e possibilitando a passagem somente do plasma seminal.
O sêmen também diluído na proporção 1:1 com meio diluente a base de leite
desnatado é depositado sobre a membrana e deve-se realizar movimentos leves tocando-a
em uma placa de petri de 15 cm. Desta maneira, devido ao tamanho dos poros e à
capilaridade, o plasma seminal passa através do filtro e os espermatozóides ficam retidos.
Posteriormente acrescenta-se o meio extensor ao filtro no volume previamente calculado e
realiza-se homogeneização para ressuspenção dos espermatozóides. O processo dura em
média de 5 minutos e o filtro pode ser usado por até 5 vezes para o mesmo garanhões sem
alterar a qualidade ou a recuperação espermática.
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dos poros e a capilaridade, os espermatozoides ficam retidos no filtro e o plasma seminal
passa através dele (C) .
A seleção espermática é uma técnica que vem sendo largamente utilizada para
aumentar a qualidade e fertilidade do sêmen fresco de garanhões e a resistência de seus
espermatozoides à refrigeração e congelação. Esta técnica consiste em separar os
espermatozoides com motilidade progressiva e sem alterações de morfologia do resto do
ejaculado e para isso é realizado uma centrifugação em gradiente de densidade.
Previamente à seleção espermática, um total de 1 x 109 espermatozoides devem ser
concentrados em 5 mL de diluente comercial à base de leite desnatado, para isso pode-se
utilizar a centrifugação convencional, a centrifugação com cushion ou a filtração em
SpermFilter.
Após isso, 5 mL do gradiente de densidade (Equipure ou Androcol) deve ser
adicionado em um tubo falcon de 15 mL. Os 5 mL com o sêmen concentrado deve ser
cuidadosamente adicionado neste mesmo tubo, acima do gradiente de densidade. Para isso,
pode-se utilizar um pipeta pauter, deslizando vagarosamente o sêmen através das paredes
do tubo. É realizada uma centrifugação de 400 xg por 20 minutos e após isso os
espermatozoides sem alterações morfológicas e com motilidade progressiva ficam
depositados no fundo do tubo falcon. O restante do ejaculado fica retido acima do gradiente
de densidade. Com o auxilio de uma pipeta de 1mL deve-se remover o pellet com os
espermatozoides selecionados e diluí-lo com o meio apropriado.
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Figura 2: A) Adição do sêmen ao Equipre B) Tubo falcon contendo Equipure e sêmen antes
da centrifugação C) Tubo falcon contendo Equipure e sêmen após a centrifugação
11. AUTORES
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É VEDADA A CÓPIA OU MESMO UTILIZAÇÃO EM CURSOS
DE REPRODUÇÃO EQÜINA DESTE MANUAL, SEM PRÉVIA
AUTORIZAÇÃO DOS AUTORES.
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11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Philadelphia,London, 1993.
Antonio Mies Filho. Reprodução dos Animais, 6ª Edição Sulina, Porto Alegre-RS.
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2544, 1986.
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DYCE, K.M.; SACK, W.O.; WENSING, C.J.G. Tratado de anatomia veterinária, 3 ed,
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HAFEZ, E. S. E., HAFEZ, B. In: Reprodução Animal. 7.ed. Barueri:Manole, 2004
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PAPA, F.O., MELO, C.M.; FIORATTI E.G.; DELLA’QUA, J.A.; ZAHN, F.S.;
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RAMIRES NETO, C.; MONTEIRO, G. A. ; SOARES, R. F. ; PEDRAZZI, C. ;
DELL`AQUA, J.A.; PAPA, F. O.; ALVARENGA, M.A. Effect of Removing Seminal
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Equine Veterinary Science, v. 33, p. 40-43, 2012.
SAMPER, J.C; PYCOCK, J.F.; MCKINNON, A.O. Current Therapy in Equine
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Diagnostic Ultrasound. 446-479, 1998.
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ANEXO 1- MONTAGEM DA BOTUFLEX PASSO A PASSO
PPASSA PASSO PASSO
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ANEXO 2 - MONTAGEM DA BOTUBOX PASSO A PASSO
ACONDICIONAR A DOSE DE
SÊMEN DENTRO DA BOTUBOX
DOSE DE SÊMEN
ACONDICIONADA
DENTRO DA BOTUBOX
ACOPLAR A TAMPA
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ANEXO 3-MONTAGEM DA BOTUTAINER PASSO
A PASSO
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ANEXO 4 COMO UTILIZAR O BOTU-IA?
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ANEXO 5 COMO MONTAR A VAGINA ARTIFICIAL
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1
3
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4 5 6 4
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