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23/06/2017

Universidade de Brasília Por que usar CROMATOGRAFIA ? ? ?


Instituto de Química Quantificação das Impurezas de um Produto

Praticidade de Execução das Análises

Aula 6.1 CG Determinação da Formulação


Introdução aos Métodos Cromatográficos
Análise Instrumental Teórica e Experimental Estudo de Estabilidade e Degradação
(Código 107514)
Profa. Sonia Naomi Nomi Determinação da Porcentagem do
Princípio Ativo

23/09/2017
AITE-1/2017 1 AITE-1/2017 2

Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas: Cromatografia Gasosa Cromatografia: Princípios e Teoria
Técnica Planar Coluna

Dois tipos principais de cromatografia:


•Cromatografia a gás (CG) Amplamente utilizada em laboratórios de química
FM Líquido Gás Líquido
analítica e ambiental
•Cromatografia a líquido (CLAE)

Cromatografia a gás (gás-líquido): separa componentes gasosos baseando-se em


processos de adsorção ou partição do analito entre a fase móvel (gasosa) e a fase
Troca Afinidade Fase
FE Líq Sól Líq Sól Líq Sól
Iônica Ligada
Exclusão estacionária (líquida ou sólida). Não há interação da FM com o analito gasoso.
Cromatografia a líquido: separa os analitos dissolvidos em uma fase móvel líquida por
diversos processos de interação com a fase estacionária. Dentre este processos pode-se
Tipo de cromatografia mencionar: exclusão por tamanho, troca iônica, adsorção, partição, etc.
CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE
AITE-1/2017 3 AITE-1/2017 4

Instrumentação – Cromatografia Gasosa INSTRUMENTAÇÃO


Gás de Arraste
registrador ou
computador
controle de Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amostra - apenas a carrega através da coluna. Assim é
(Septo de Borracha) usualmente referida como GÁS DE ARRASTE
pressão Injetor T=C°
(vaporizador
de amostra) Requisitos:
T=C° INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou
fornos superfícies do instrumento.

reservatório PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária (FE).
de gás COMPATÍVEL com o sistema de detecção
(Fase móvel) Condutividade Térmica  He, H2
He, N2 ou H2 Ionização de chama  N2, H2
Condutividade eletrolítica  N2, Ar + 5% CH4
amplificador
detector Impurezas típicas em gases e seus efeitos:
oxida / hidroliza algumas FE
coluna T=C° H2O, O2
incompatíveis com alguns detectores
(Fase estacionária)
P.S.: Necessário o Controle de Temperatura! hidrocarbonetos
ruído no sinal de alguns
AITE-1/2017 T=C° 5 AITE-1/2017
detectores
6

1
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Alargamento
Alargamento
Componentes da Linha de Gás dominado pela
dominado pela
velocidade finita Gás de arraste
difusão de transf. massa
• Vazões controladas por reguladores de pressão no cilindro (1) e um no cromatógrafo (4) longitudinal
• Pressões de entrada de 10 a 50 psi acima da pressão ambiente = vazões de 25 a 150 mL/min em • He e H2 fornecem uma melhor resolução (menor
colunas recheadas e 1 a 25 mL/min em colunas capilares de tubo aberto. N2 altura de prato) do que o N2 em vazões elevadas.
3 A razão é que os solutos se difundem mais

(resolução)
4 6
rapidamente pelo H2 e pelo He do que em N2.
2

1 - Cilindro de Gás Pressurizado


2 - Regulador de Pressão Primário 5
3 - “Traps” para eliminar impurezas do gás
4 - Regulador de Pressão Secundário
5 - Regulador de Vazão (Controlador Diferencial de Fluxo)
6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro)
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Nota: Tubos e Conexões: Aço Inox ou Cobre (manter pureza dos gases)

Sistema de Injeção da amostra


Sistema de Injeção da amostra
• Temperatura do injetor deve ser suficientemente elevada para que a amostra se
vaporize imediatamente sem decomposição • Amostras deve ser introduzida em tamanho adequado e como uma
Regra Geral: Tinj = 50 oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil zona “estreita” de vapor.
• Injeção lenta ou volumosa causa espalhamento das bandas e resolução pobre.
• Volume Injetado depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra • Amostras líquidas
• Seringas calibradas inseridas por septos ou diafragmas na cabeça da coluna
Coluna Amostras Líquidas Amostras Gasosas • Amostras gasosas e líquidas
Empacotada
0,2 L – 20 L 0,1 mL – 50 mL • Válvulas de amostragem
 = 3,2 mm
Capilar • Amostras sólidas
0,01 L – 3 L 1 L - 100 L
 = 0,25 mm • dissolvidas em um solvente adequado e injeta-se a solução.

Micro seringas de 1, 5, 10 L
AITE-1/2017 9 AITE-1/2017 10

Injetor com divisão (“splitter”) Injetor com Divisão (“Splitter”)


Seringa
septo
- Usualmente utiliza-se microsseringas
para injetar uma amostra líquida ou
gasosa através de um diafragma ou septo
câmara de
gás de auto-selante de borracha de solicone, em
Mistura/vaporização um vaporizador instantâneo localizado no Coluna CAPILAR
arraste
topo da coluna. Φ=0,25 mm

purga de gás - Um sistema divisor de amostra é


coluna empregado para liberar somente uma
pequena fração da amostra injetada no
topo da coluna e rejeitar o restante.

válvula Rejeito

Para amostras que contém 0,1 % de analito


AITE-1/2017Na injeção com divisão de fluxo apenas 0,1 – 10% da amostra injetada alcança a coluna. 11 AITE-1/2017 12

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Sistemas de Injeção - Seringas Injetor Convencional (Splitless)


• Amostras líquidas septo
gás de  Introdução da
0,1 – 10% alcança a coluna ~80% vai para coluna arraste (silicone) agulha
Para compostos que se da microseringa Fluxo do vapor da
decompõe acima do seu amostra através
ponto de ebulição. Os bloco metálico da coluna
compostos passam aquecido
direto sem passar pelo
injetor aquecido
coluna

“Split” “Splitless” “On-Column”

Amostra diluída em um solvente de baixo ponto de ebullição é injetada a uma tpt de Para amostras que contém menos que 0,01 % de analito Injeção da amostra
AITE-1/2017
coluna 40-50°C abaixo do ponto de ebulição do solvente. 13 AITE-1/2017 (traço) e vaporização
14

Sistemas de Injeção – Válvulas de amostragem Colunas: Definições Básicas


(loop)
• Amostras gasosas ou líquidas

Resistência maior ao Não há alargamento


Com esse dispositivo, erros devido ao
fluxo de gases, logo de picos devido a
tamanho da amostra podem ser reduzidos ao
comprimentos múltiplos caminhos
intervalo de 0,5 a 2% relativos.
menores porque não existem
partículas da fase
Mais comumente usado em HPLC
estacionária no
percurso do fluxo

EMPACOTADA CAPILAR
 = 3 a 6 mm  = 0,1 a 0,5 mm
L = 0,5 m a 5 m L = 5 m a 100 m
Recheada com sólido pulverizado (FE Paredes internas recobertas com um
sólida ou FE líquida depositada sobre as filme fino (fração de  m) de FE líquida
AITE-1/2017 15 AITE-1/2017 partículas do recheio) ou sólida (sílica fundida (SiO2)) 16

Colunas para CG * Construídas de aço inoxidável,


vidro, sílica fundida ou Teflon Fornos para Colunas
• Ampla faixa de temperatura: T ambiente até 400 oC;
• A maioria das análises é realizada em colunas capilares estreitas e compridas
(>50m) enroladas em bobinas com diâmetros de 10 a 30 cm. • Controle independente dos outros módulos: não deve ser afetado pela temperatura
do injetor e detector;
• Temperatura uniforme: sistemas de ventilação interna para manter a temperatura
A escolha da FE líquida para uma homogênea em todo forno.
determinada analise é baseada na
regra”semelhante dissolve semelhante”. As Forno Termostatizado
colunas apolares são normalmente
melhores para os solutos apolares
enquanto as colunas polares são
geralmente melhores para solutos polares

Os grupos silanol retem fortemente alguns


compostos POLARES atraves da ligação de
H, o que leva à formação de caudas nos
picos cromatográficos
A temperatura ótima da coluna depende do ponto de ebulição da amostra e do grau de separação requerido.
AITE-1/2017 17 AITE-1/2017 18

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Programação de Temperatura (Rampa de


Fornos para Coluna Temperatura)
• Permite a separação de compostos de diferentes volatilidades na
• Principais características: mesma amostra;
• Fácil acesso para troca de coluna - Temperatura da coluna baixa:
• Aquecimento de resfriamento rápido TFIM
• Componentes mais voláteis (<PE) são separados
• Temperatura deve se manter estável e reprodutível (exatidão e precisão de  • Componentes menos voláteis (>PE) demoram a

TEMPERATURA
0,1 oC) R eluir, saindo como picos mal definidos
• Permitir programação linear de temperatura TIN - Temperatura da coluna alta:
• Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) podem ser I
• Componentes mais voláteis (<PE) não são
separadas isotermicamente. separados
tINI tFIM TEMPO

• Componentes menos voláteis (>PE) eluem


R = velocidade de aquecimento
mais rapidamente

O aumento da temperatura da coluna aumenta a pressao de vapor do soluto e o tempo de retenção diminui. Para
separar uma mistura de compostos com ampla faixa de pontos de ebulição e polaridades, eleva-se a tpt da coluna
AITE-1/2017 19 durante
AITE-1/2017a separação. 20

Programação de temperatura (rampa de temperatura) Detectores


isotérmica • Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando
Efeito da temperatura sobre cromatogramas sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste
gasosos: (a) isoterma a 45°C; (b) isoterma a
145°C; (c) programado de 30°C a 180 °C

isotérmica
REGISTRO
DE
SINAL

Programada
ANALÓGICO
Registradores XY
DIGITAL
Integradores
Computadores
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA
AITE-1/2017 21 AITE-1/2017
Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma. 22

Detectores Detector por Condutividade Térmica-DCT


• Princípio: Variação na condutividade térmica do gás durante a passagem do analito
eluído da coluna (transporte de calor);
• Fonte aquecida eletricamente cuja temperatura à potencia elétrica constante
depende da condutividade térmica do gás que a envolve.
Gás Cond. Térmica
J/(K.m.s)
A taxa de transferência de calor entre um corpo
H2 0,170 quente e um corpo frio depende da condutividade
He 0,141 térmica do gás no espaço que separa os corpos
NH3 0,0215
N2 0,0243
C2H4 0,0170 Se a condutividade térmica do gás diminui, a
O2 0,0246 quantidade de calor transferido também diminui -
o corpo quente se aquece.
Ar 0,0162
AITE-1/2017 23 C3H8
AITE-1/2017 0,0151 24
CO2 0,0144
Cl2 0,0076

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Detector por Condutividade Térmica-DCT


Detector por Ionização de Chama - DIC
• Condutividade térmica dos gases He e H2 são de 6 a 10 x maiores do
que a maioria dos compostos orgânicos. • Princípio: produção de íons e elétrons durante a pirólise em uma
chama de ar/H2.
O gás emergido de uma coluna cromatográfica • Detecção envolve o monitoramento da corrente produzida pela coleta
passa por um filamento de W-rênio aquecido. desses portadores de carga
Quando o soluto emerge da coluna, a
condutividade térmica do fluxo gasoso diminui, o
filamento torna-se mais quente, sua resistência
elétrica aumenta e a ddp élétrico nos terminais
dos filamentos aumenta. A variação da ddp é o O efluente da coluna é misturado com
H2 e O2 e queimado. Como numa
sinal do detector.
chama de H2 + O2 não existem íons,
ela não conduz corrente elétrica.

AITE-1/2017 25 AITE-1/2017 DIC é o mais usado em CG 26

Detector por Ionização de Chama - DIC Detector por Ionização de Chama - DIC
• Detector responde ao número de átomos de carbono que entram no detector por • Características:
unidade de tempo, ele é sensível à massa do analito mas não à concentração • Insensível a CO2, H2O, SO2 e NOx
• Poucas centenas de volts são aplicados entre a ponta do queimador e um eletrodo • Pouca alterado pela vazão
localizado acima da chama, que coleta os íons e elétrons. • Alta sensibilidade (10-13 g s-1)
• Destrói a amostra
• Baixo ruído
• Não responde a carbonila, álcool,
Quando um composto orgânico elui,
ele também é queimado. Como na sua
halogênicos e amínicos
queima são formados íons, a chama • LD ~100x menor que DCT
passa a conduzir corrente elétrica

A corrente resultante (~10 -12A) é então dirigida para um Desvantagem: causa destruição de amostra.
amplificador operacional de alta impedancia para a medida.

AITE-1/2017 27 AITE-1/2017 28

Detector por Captura de Elétrons - DCE


Detector por Captura de Elétrons - DCE
• Princípio: supressão de um fluxo de elétrons lentos (termais) causada
pela sua absorção por espécies eletrofílicas. • Características:
• Responde seletivamente a
Um fluxo contínuo de O gás de arraste que entra no detector é compostos orgânicos contendo
eletrons lentos é estabelecido ionizado por elétrons de alta energia (raios β) halogênios
entre um anôdo (fonte emitidos de uma lâmina que contém o isótopo
radioativa radioativo Ni(63). Os elétrons liberados do • Alta sensibilidade a peróxidos,
b -emissora) e um catodo. gás são atraídos para um ânodo, produzindo quinonas e grupos nitro
uma pequena corrente estável. Quando as • Insensível a aminas, alcoóis e
63
Ni moléculas do analito, com uma alta
afindade por elétrons, entram no detector
hidrocarbonetos
Na passagem de uma elas capturam alguns dos elétrons, reduzindo • Não alteram a amostra
substância eletrofílica
alguns elétrons são
a corrente. De modo a manter a corrente significativamente
elétrica constante, o detector responde
absorvidos, resultando uma
supressão de corrente variando a frequência dos pulsos de potencial
Uma aplicação importante do DCE tem sido a detecção e
elétrica. elétrico entre o ânodo e o cátodo.
determinação de inseticidas clorados.
Vindo da coluna
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Espectrômetro de Massas (MS) CG-MS


• Eluente do CG passa para a entrada do MS, no qual as moléculas de
• Informações quali e quantitativas gás são fragmentadas, ionizadas, analisadas e detectadas.
• Alta sensibilidade
• Princípio: Mede as massas e abundâncias de íons em fase gasosa
• Fragmentação e ionização
• Impacto eletrônico (ionização por elétrons) e ionização química
• Separação razão massa /carga (m/z)
• Detecção
Os compostos que saem da coluna passam através de
um conector aquecido para dentro de uma câmara de
ionização, onde são convertidos em íons e acelerados
por um potencial de 15 V antes de entrar no separador
de massa quadrupolar.
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Espectrômetro de Massa Quadrupolar Fontes de Ionização para MS


câmara de Hastes condutoras
ionização
separador
• Fontes de íons produzem fragmentos, os quais também podem ser
Os compostos que saem da coluna passam através de ionizados.
um conector aquecido para dentro de uma câmara de
ionização, onde são convertidos em íons e acelerados • Íons moleculares, íons de fragmentos e moléculas não ionizadas saem
por um potencial de 15 V antes de entrar no separador da fonte de ionização
de massa quadrupolar. ionização por elétrons e ionização quimica

O separador de massa consiste em 4 hastes metálicas vácuo


detector
paralelas nas quais se aplica uma ddp constante e um
potencial elétrico alternado de radiofrequencia. O campo
elétrico deflete os ions em trajetórias complexas quando
eles migram da câmara de ionização na direção do
detector, permitindo que somente íons com um ● LQ = 25 fg - 100 pg
determinado valor da razão massa-carga alcancem o As moléculas q entram na câmara de ionização são convertidas em íons através da ionização por elétrons. Os
detector. ● linearidade de 105 elétrons emitidos por um filamento aquecido (semelhante ao de uma lâmpada incandescente) são acelerados por
Multiplicador de elétrons meio de um potencial de 70V antes de interagirem com as moléculas que entram na camara.
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Tipos de Analisadores para MS


Resultados - CG-MS
• Analisador seleciona os íons provenientes da fonte de acordo com seus
valores m/z
• O MS varre as massas repetidamente durante o experimento
cromatográfico. Os resultados podem ser analisados de diferentes
formas:
• Pela abundância dos íons – cromatograma do total de íons;
• Por um tempo particular durante o cromatograma para identificação das
espécies que estão eluindo naquele momento;
• Pela seleção de um valor único de m/z e monitorá-lo durante o experimento
cromatográfico – monitoramento de íon selecionado.

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Detectores por Espectrometria de massas (MS)

• Os íons separados de acordo com m/z são detectados e um gráfico de


intensidade de sinal x m/z é gerado.
Espectro de massas do CO2
Fragmentos íons positivos:
CO+ (m/z = 28)
Abundância relativa

O+ (m/z = 16)
C+ (m/z = 12)

M + e-  M+ + e- + e-
Íon
70eV 55 eV 0,1 eV
molecular

AITE-1/2017
Razão massa/carga (m/z) 1 eV = 96,5 kJ/mol 37 AITE-1/2017 38