1 Western Blotting

La guía completa para

INMUNOTRANSFERENCIA

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BIENVENIDO
Acerca de esta guía

Este folleto tiene como objetivo darle una guía completa sobre cómo realizar una
transferencia de Western que produce resultados óptimos. El folleto incluye
protocolos originales de Western Blot de laboratorio, consejos técnicos útiles y
solución de problemas. Esta guía le llevará a través del paso a paso experimento,
lo que le permite obtener el máximo de su investigación.

Qué hay adentro 6-9

Protocolo de transferencia de Western Standard

10-11
Cómo optimizar su Western Blot

12-13
SDS-PAGE gel Recetas

14-15
Cómo optimizar sus resultados con las proteínas de bajo peso molecular

dieciséis

Tricina Gel Receta para las proteínas de bajo peso molecular

17
Escoger el derecho de tampón de lisis

18-23
Solución de problemas

26-30
Cargando Los anticuerpos de control

31
Contáctenos
4 Western Blotting

El índice de referencia de los

anticuerpos
Desde el día en que se fundó, Proteintech ha estado haciendo todos sus productos con los
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validado y disponible para su entrega al día siguiente.
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Estándar Western Blot

PROTOCOLO
SDS-PAGE 1. Construir un gel de SDS-PAGE de acuerdo con el peso molecular (MW) de
su proteína (s) objetivo.
Consulte la página 12 para las recetas de gel de SDS-PAGE.

2. Preparar muestras en tubos de microcentrífuga. Añadir tampón de muestra SDS 4x lo que la

cantidad total de proteínas es 30-50μg por muestra (de acuerdo con la cantidad de
proteína medida por Bradford o ensayo de la proteína BCA).

3. tubos de microcentrífuga Flick para mezclar las muestras, hacerlas girar en breve, y luego se
calientan a 95-100 ° C durante 5 minutos.

4. Preparar el aparato de electroforesis y sumergirse en 1x tampón de ejecución. Eliminar peines

de gel y limpiar pozos de cualquier gel de apilamiento residual pipeteando tampón de
desplazamiento arriba y abajo en cada pocillo usando la punta de carga de gel ( Figura 1) .

5. Cargar las muestras y los marcadores de proteínas apropiadas en el gel usando una punta.

6. Coloque la tapa del depósito de gel. A su vez en el paquete de energía electroforesis y ajustado a
un voltaje bajo (como la muestra corre a través del gel de apilamiento), aumentando a un
voltaje más alto (por ejemplo, 120 V) cuando el frente de colorante llega a la capa de
separación. Detener la ejecución gel cuando el frente de colorante migra a la posición
deseada.

Consejo: geles de Tris-Tricina proteínas de bajo PM separadas (<20 kDa) mejor

de geles de Tris-glicina. Consulte la página 16.

Transferencia de membrana Tenga en cuenta: Las membranas de PVDF (PSQ o membranas con
microporos 0.22μm para los objetivos de menos de <30 kDa) son muy
recomendables.

1. Remojar las membranas en metanol durante 30 segundos antes de pasar a

transferir buffer.

2. Remojar los papeles de filtro y esponjas en tampón de transferencia.

3. Secuencialmente ensamblar los componentes de transferencia de acuerdo con la

ilustración mostrada en la página siguiente ( Figura 2) , y asegurar sin burbujas se
encuentran entre ninguna de las capas. Aplicar sistemas de transferencia semi-secos o
húmedos de acuerdo con las instrucciones del fabricante del aparato de transferencia.
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Figura 1

Figura 2

incluso la carga de sus muestras de proteínas.

acrilamida ellos están bloqueando. Utilice puntas de pipeta de carga de gel para facilitar la fácil e

enjuagar cada pocillo a fondo con tampón de ejecución para asegurar que no bits restantes de

las proteínas unidas a SDS-viajan hacia el electrodo positivo. Después de retirar los peines de gel

SDS a los resultados de proteínas en el complejo que tiene una carga global negativa. Por lo tanto,

y la membrana: la membrana de PVDF se encuentra más cercano al electrodo positivo. La unión de

“Sandwich” Una representación de los componentes de una transferencia Nota la orientación del gel
8 Western Blotting

inmunotransferencia 1. Después de la transferencia, se lava la membrana dos veces con agua

destilada.

2. Marca suavemente las bandas de la escala MW en la membrana usando un lápiz.

3. Si se desea, manchar la membrana con solución de rojo Ponceau comercial durante 30

segundos para visualizar las bandas de proteína, a continuación, lavar solución de
color rojo Ponceau con cantidades generosas de 1x TBST.

4. Bloquear con TBST 1x que contiene (2-5%) no grasa de leche en polvo (o 1-5% de
BSA para la detección de fosfo-epítopos) con constante de balanceo durante 1
hora o durante la noche a 4 ° C.

5. Diluir el anticuerpo primario en solución con una relación de dilución de partida

de 1 bloqueo: 1000.
(Diluciones óptimas deben ser determinadas experimentalmente con una serie de
dilución.) Incubar la membrana con anticuerpo primario durante 1 hora (o durante la noche
a 4 ° C) en un agitador de sobremesa.

6. membrana Lavar tres veces con TBST 1x durante 10 minutos cada uno.

7. Incubar la membrana con un anticuerpo adecuado conjugado con HRP

secundario (que reconoce la especie hospedadora del anticuerpo primario),
diluido de acuerdo con las instrucciones. Incubar durante 1 hora con balanceo
constante.

8. membrana Lavar tres veces con TBST 1x durante 10 minutos cada uno.

Consejo: No deje que la membrana seca en cualquier etapa de la

proceso de transferencia.

Detección de señal 1. Preparar sustrato ECL de acuerdo con las

instrucciones del fabricante.
2. Incubar la membrana completamente con el sustrato durante 1-5 minutos
(ajustar el tiempo para sustratos más sensibles de ECL, por ejemplo,
SuperSignal West Femto Substrato quimioluminiscente [Pierce]).

3. Exponer a la membrana a película de autorradiografía en un cuarto oscuro

o leer usando un sistema de imágenes de quimioluminiscencia.

4. Alinear la película revelada en la orientación correcta a la mancha y marcar las

bandas de la escala MW directamente en la película. También es aconsejable añadir
notas tales como el contenido de carril, el tiempo de exposición de la película, y las
propiedades ECL.

Consejo: Utilice exposición múltiple longitudes para determinar la óptima

tiempo de exposición. Use marcadores fluorescentes y cortar la esquina superior derecha de
la película como una guía para la orientación de la película blot.
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Estándar Western Blot

PROTOCOLO
buffers requeridos 1x TBST (1000 ml)

20 mM Tris-base 2,4 g

NaCl 150 8,76 g

KCl 50 mM 3,73 g

0,2% de Tween-20 2 ml

Ajustar el pH a 7,6. Añadir

ddH2O a 1000ml

4x SDS tampón de muestra (100 ml)

150 mM Tris HCl (pH 7,0) 15 ml (de una solución madre 1 M)

25% de glicerol 25ml

12% de SDS 12 g

0,05% azul de bromofenol 0,05 g

6% de ß-mercaptoetanol 6ml

Añadir ddH2O a 100 ml, alícuota y se almacena a -20ºC.

Transferencia Wet Buffer (1000 ml)

25 mM Tris-base 3,03 g

192 mM glicina 14,4 g

Metanol al 20% 200ml

Añadir ddH2O a 1000 ml.

Transferencia Semi-seco Buffer (1000 ml)

48 mm Tris-base 5,81 g

La glicina 39mm 2,93 g

0,0375% de SDS 0,375 g

Metanol al 20% 200ml

Añadir ddH2O a 1000ml

10 Western Blotting

Cómo optimizar su

Western Blot
La obtención perfecta, listas para publicar los resultados de inmediato no es exactamente la
norma cuando se realiza la transferencia Western. Sin embargo, hay algunos pasos que puede
tomar para refinar sus experimentos de transferencia y aseguran que se bajan a la mejor
comienzo posible.

1. SDS-PAGE

Sus experimentos de transferencia Western comienzan mucho antes de empezar a trabajar con su
membrana. Si el gel se hizo de manera descuidada o dejar que funcione a una tensión excesiva,
sus resultados finales se verán afectados. Si lanzas sus propios geles, tener un cuidado especial
para asegurar la uniformidad en su composición. Seleccione el porcentaje de acrilamida derecho y
evitar que el efecto de tinte frente “sonriente” por resistir la tentación de ejecutar sus geles con
tensiones elevadas.

Por encima de todo, la carga de una cantidad uniforme de proteína; el laboratorio de validación
Proteintech encuentra que 0-50ug de proteínas es una cantidad adecuada para la detección de la
mayoría de las proteínas, y por lo general da libre de rayas y bandas bien separadas.

2. membrana
elección de la membrana puede hacer una gran diferencia en el resultado de sus experimentos
de transferencia Western. Los dos tipos principales son la membrana de PVDF y de
nitrocelulosa, pero ahora hay varias versiones de cada uno en el mercado de consumo. PVDF
tiende a ser bueno para las proteínas expresadas humilde, pero de gran fondo y funciona mejor
con antígenos hidrófilos polares / / cargadas de destino. Las membranas de nitrocelulosa son
buenas para las proteínas normales o altamente expresados ​y que funciona mejor con los
antígenos hidrófobos / no polares.

Concentración 3. Anticuerpo

El siguiente paso debe ser determinar la concentración de anticuerpos de trabajo óptimo.

La velocidad de unión entre el anticuerpo y el antígeno se ve afectado por sus
concentraciones relativas en solución (entre otras variables). A menudo tendrá que ajustar
la concentración de anticuerpos para obtener mejores borrones. Este paso se llama
valoración de anticuerpos, y debe llevarse a cabo cada vez que se utiliza un nuevo
anticuerpo o nuevo conjunto de condiciones experimentales.

“A menudo tendrá que ajustar la concentración de anticuerpos para

obtener mejores borrones.”
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“Recuerde que los tampones de bloqueo a base de leche

contienen cosas tales como la biotina endógena,
glucoproteínas y enzimas que pueden interferir con la
señal.”

4. condiciones de bloqueo

Varios tampones de bloqueo están disponibles y no todos ellos funcionan en todas las
situaciones. Es importante probar varios tampones de bloqueo para cada par
antígeno-anticuerpo. Recuerde que los lácteos a base tampones bloqueantes contienen
cosas tales como la biotina endógena, glicoproteínas y enzimas que pueden interferir con
la señal. tampones a base de leche, por ejemplo, contienen fosfatasas activos que
sabotear su detección de proteínas fosforiladas; en estos casos, probar alternativas tales
como albúmina de suero bovino bloqueantes basadas.

5. Lavado
Si el Western blot muestra alta señal de fondo, la revisión de los pasos de lavado en la
próxima carrera a través ha demostrado ser útil. El aumento de tiempos de lavado y los
volúmenes reducirán la señal de fondo junto con la realización de cambios de tampón
adicionales o usando un detergente fuerte (por ejemplo, SDS en lugar de Tween 20).

6. Detección
La etapa de detección es integral a la obtención de una buena señal de transferencia de
Western. Hay muchos reactivos quimioluminiscentes y alternativas de quimioluminiscencia por
ahí, como la detección fluorescente, de modo que hay un montón de opciones si su método de
detección de corriente no está cumpliendo con los estándares de laboratorio. Puede elegir
reactivos con mayor sensibilidad o las que producen señal de duración más largo, por ejemplo.
La última opción aumentará la capacidad de reproducción de los borrones
inconmensurablemente. Un método más sencillo es experimentar con tiempos de película a la
exposición. Este es probablemente el paso de optimización realiza con más frecuencia, ya que
es rápido y fácil. Siempre exponer sus manchas para una serie de puntos de tiempo
individuales.
12 Western Blotting

SDS-PAGE

GEL RECETAS
Con el fin de orientar las proteínas con MWs entre 20 y 200 kDa, se necesita
para crear un gel de SDS-PAGE convencional usando las recetas que se
muestran abajo. El porcentaje de gel se requiere corresponde con el MW de
la proteína diana.

receta 1 Gel de separación (mls, 10 ml total)

MW de proteína
80-200 35-100 25-60 20-40
diana (kDa)

Gel Porcentaje 8% 10% 12% 15%

ddH2O 2.1 1.5 0.8 0

30% de
2.7 3.3 4 5
acrilamida

2x Separación
5.0 5.0 5.0 5.0
Buffer

10% de APS 0.1 0.1 0.1 0.1

TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01

Gel de apilamiento (MLS)

4 ml 6ml 8ml

MW de proteína
- - -
diana (kDa)

Gel Porcentaje 4% 4% 4%

ddH2O 1.4 2.1 2.7

30% de
0.5 0.8 1.1
acrilamida

2x apilamiento
2.0 3.0 4.0
Buffer

10% de APS 0.04 0.06 0.08

TEMED 0,004 0,006 0,008

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receta 2 2x Separación Buffer Receta (hace 1000 ml)

Tris HCl (pH 8,8) 90,8 g

SDS 2,0 g

Disolver compuestos a fondo. Ajustar el pH lentamente a pH 8,8 con HCl

concentrado, a continuación, añadir ddH2O a 1000ml.

receta 3 2x Stacking Buffer Receta (hace 1000 ml)

Tris HCl (pH 6,8) 30,35 g

SDS 2,0 g

Disolver compuestos a fondo. Ajustar el pH lentamente a pH 6,8 con HCl

concentrado, a continuación, añadir ddH2O a 1000ml.

receta 4 1x Ejecución de la receta de Buffer (hace 1000 ml)

Tris-base 1,51 g

glicina 7,5 g

SDS 0,5 g

Disolver compuestos a fondo, a continuación, añadir ddH2O a 1000ml.

El punto de referencia en
la validación
Anticuerpos ahora se detectan con muestras de siRNA-tratada.

Proteintech están estableciendo un nuevo punto de referencia en la validación del anticuerpo

con su iniciativa siRNA desmontables, con el objetivo de mejorar la fiabilidad y producir
anticuerpos específicos detectados con muestras siRNA transfectadas accesibles a todos los
investigadores. www.ptglab.com
14 Western Blotting

Cómo optimizar sus resultados con

PROTEÍNAS bajo MW
En extremos del espectro de peso molecular (MW), técnicas habituales de
SDS-PAGE y transferencia Western sufren de limitaciones: mala separación,
reducción de la señal, o incluso una ausencia total de bandas de destino.
proteínas de bajo PM (<20 kDa) son difíciles de detectar, sin embargo varias
modificaciones de protocolo se pueden emplear cuando el manejo de estas
proteínas para mejorar su retención y resolución.

uso Tricina
En general, los geles de glicina son ideales para la resolución de cualquier proteína que caen dentro
del rango de MW de 30-250 kDa. Sin embargo, geles de acrilamida en base a un sistema de tampón
Tris-Tricina se espera mejorar considerablemente sus posibilidades de “ver” a su banda (s) de destino
si se está trabajando por debajo del rango de 30 kDa.

Puede encontrar una receta para un gel de Tricina 15% en la página 16.

17.2kd
14.6kd

10.6kd
8.2kd

6.4kd

2.5kd

UN segundo

Comparación de Tricine- (A) y glicina-SDS-PAGE (B) separación de fragmentos de

mioglobina. Adaptado de Schägger y von Jagow 1987.

¿Por qué funciona

La diferencia en la capacidad de separación de glicina y tricina geles se atribuye a las

diferentes propiedades de los compuestos de glicina y tricina, tales como sus valores de
pK y la movilidad iónica. Tricina es más óptima para la separación de proteínas de bajo
MW porque “pilas” proteínas en bandas más uniformes. Una capa de apilamiento basado
tricine- desplaza el límite de apilamiento superior hacia abajo hasta un mínimo de 30 kDa
para la primera pila, 1 la prevención de la sobrecarga en la interfaz entre las capas de gel.

1 H Schägger y G von Jagow. dodecil Tricina-sulfato de sodio-poliacrilamida electroforesis en gel

para la separación de proteínas en el rango de 1 a 100 kDa. Anal Biochem. 1987; 166 (2):
368-79.
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Transferencia de proteínas

Así como asegurar la separación óptima de proteínas de bajo PM, también hay que
tener cuidado en la etapa de transferencia de la proteína. proteínas de bajo PM son
susceptibles a “sobre la transferencia”
- pérdida de la muestra debido a la falta de la retención por la membrana de transferencia y / o
transferencia demasiado rápida.

La elección y la membrana de tamaño de poro

La mayoría de los laboratorios tienen una opción preferida de la membrana de transferencia de

Western, sin embargo PVDF es una mejor elección en el caso de proteínas más pequeñas, de
bajo PM, debido a su mayor capacidad de unirse a proteínas. Hay varios tamaños de poro de la
membrana en oferta - optar por un tamaño de poro más pequeño para obtener mejores
transferencias de sus proteínas diana MW bajas.

40 kD

kd 30 kD

kD de 20

kD de 15

5 kD 10

El laboratorio Proteintech detectó 4 kDa proteína sarcolipin con anticuerpo anti-sarcoplin (18395-1-AP; 1: 300),
después de la separación en un gel de Tricina del 15% y la transferencia de proteínas a 0,22 micras de poro de
membrana de tamaño de PVDF.

Condiciones de transferencia

Además de la elección de la membrana, factores tales como sistema de transferencia, la longitud, la

temperatura, y memoria intermedia de composición entran en juego cuando se trata de proteínas de
bajo MW. En el caso de proteínas pequeñas, menos es a menudo más cuando se trata de transferir
la longitud y la tensión. Cuánto debe ajustar éstos por los que será hasta la marca y el modelo del
sistema que está siendo utilizado.

otros consejos

Tenga en cuenta que algunas proteínas se escaparán el frente de colorante del buffer de carga de muestra.

Usted puede elegir para absorber el gel en un tampón sin SDS (o simplemente H2O) durante 5
minutos antes de la creación de su transferencia. Esto ayuda a eliminar SDS, que recubre
pequeñas proteínas y fragmentos de proteínas en cargas negativas, aumentando su velocidad de
paso a través de la membrana de transferencia Western.
dieciséis Western Blotting

Tricina Gel Receta para

PROTEÍNAS bajo MW
Para las proteínas diana con MW de menos de 20 kDa, un sistema de gel de tricina
obtendrá una resolución más alta y es altamente recomendado. Hacer tres capas de geles
de tricina como se establece en la siguiente tabla y el diagrama. Aplicar memoria
intermedia específica en ejecución gel de tricina al sistema en ejecución y llevar a cabo la
transferencia de la forma habitual.

Receta Artículos Separación intermedio apilamiento

Porcentaje de
15% 10% 4%
gel

El volumen de gel 6 ml 3 ml 2 ml

38% Glicerol 1,6 - -

ddH2O - 1.2 1.4

30% de
2.7 0.8 0.3
acrilamida

M Tris HCl 3,0 (pH

2.14 1 -
8,5)

M Tris HCl 1,0 (pH

- - 0.3
6,8)

10% de SDS 0.06 0.03 0.02

10% de APS 0.06 0.03 0.02

TEMED 0,003 0,003 0,002

Gel de apilamiento
4%

Gel intermedio
10%

Gel de separación
15%
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El derecho de elegir

Tampón de lisis
Preparación de lisados La lisis celular es la ruptura de la membrana celular y la separación de proteínas a partir
​de proteínas de las partes no solubles de la célula. tampones lisado contienen diferentes detergentes
que ayudan a liberar las proteínas solubles (Triton-X, tween, SDS, CHAPS).
Dependiendo de la localización de la proteína de interés, se necesita un búfer de lisado
diferente para obtener un alto rendimiento y pureza de la proteína. Sin embargo, cada
proteína es diferente y puede reaccionar de manera diferente con los tampones y
detergentes. Si no recibe su proteína de interés en solución o que se está estudiando
una especial interacción proteína-proteína, puede probar diferentes tampones e
intercambiar los detergentes.

Reglas generales lisado de células completas / proteínas unidas a membrana

Los tampones más comúnmente usados ​son RIPA y NP-40. propiedades duras
de tampón RIPA son los más adecuados para hard- proteínas a-solubilizar.

RIPA: Tris 25 mM, HCl (pH 7,6) NaCl 150 mM, 1% NP-40, 1% de desoxicolato de
sodio, 0,1% de SDS

NP-40: 50 mM Tris, HCl (pH 8,5) NaCl 150 mM, 1% de detergente

proteínas nucleares / mitocondrias

RIPA es la opción preferida aquí. Sin embargo, los protocolos de las fracciones se utilizan
a menudo para aumentar la concentración de la proteína deseada.

proteínas citoplasmáticas

A lisis Tris-HCl veces muestra ventajas sobre tampón RIPA. Las condiciones
óptimas deben ser probados para la proteína de interés.

No se olvide de sus inhibidores

Desnaturalización / proteólisis y dephosphorylationen (en caso de

phospoproteins) siempre deben mantenerse al mínimo y se añaden recién al
lisado celular (EDTA, ortovanadato de sodio, PSMF, aprotinina).
18 Western Blotting

SOLUCIÓN DE PROBLEMAS
Superar sus dificultades de Western blot con nuestro asesoramiento de
resolución de problemas, que abarca problemas como débil / no hay señal,
bandas no específicas, la señal de alto, y otros temas comunes. 

Débil / No hay señal Problemas con el anticuerpo primario y / o secundario

• Valorar el anticuerpo para determinar la concentración óptima.

• El anticuerpo puede tener una actividad perdida - realizar una transferencia de puntos para
determinar la actividad y la concentración óptima.

• Incluir un control positivo (por ejemplo, proteína sobreexpresada, la proteína

purificada, línea celular positiva, etc. Ajuste carga de proteína en consecuencia).

• Cambiar el tiempo de incubación y la temperatura (4 ° C, durante la noche).

Objetivo abundancia de proteínas es demasiado baja

• Cargar más proteína por pocillo.

• Enriquecer proteínas de baja abundancia mediante inmunoprecipitación, fraccionamiento,

etc.

• Usar un tratamiento adecuado para inducir la expresión proteína diana

o modificación.

• Garantizar la muestra no se ha degradado.

• Incluir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis.

• Utilice el tampón de lisis óptima para la localización subcelular de la

proteína diana.

• Verificar carga de proteína con un anticuerpo control de carga

interno.

elección de la membrana

• Seleccionar PVDF o de las membranas NC en base a la hidrofobicidad /

hidrofilicidad del antígeno diana.

- Consultar la hidrofobicidad / hidrofilicidad de la secuencia del

antígeno.

- membrana de PVDF funciona mejor con antígenos hidrófilos polares / /

cargadas de destino.

- Nitrocelulosa funciona mejor con antígenos hidrófobos / no

polares.
ptglab.com 19

Problemas de bloqueo de amortiguamiento

• El bloqueo durante demasiado tiempo puede enmascarar epítopos específicos y prevenir la unión del
anticuerpo.

• Reducir el porcentaje de, o eliminar, el reactivo de bloqueo de los tampones de

incubación de anticuerpos.

• Cambiar al uso de un reactivo de bloqueo alternativo.

objetivos de bajo peso molecular

• Use un gel de Tris-tricina para dianas proteicas <20 kDa.

(Consulte la página 16 para la receta de gel de Tricina).

• Reducir los tiempos de transferencia y / o utilizar las membranas de tamaño de poro más
pequeños (0,22 m) para las proteínas de bajo MW <30 kDa.

(Consulte la página 14 para cómo optimizar sus resultados con las proteínas de bajo peso
molecular).

• transferencia en húmedo se recomienda para proteínas pequeñas (<10 kDa).

transferencia sin éxito

• Asegurar adecuada transferencia de la configuración (por ejemplo, no hay burbujas de aire

atrapadas entre el gel y la membrana).

• geles más gruesos pueden dar lugar a la transferencia incompleta de peso-proteínas

moleculares de alto.

• Comprobación de la calidad de la transferencia de proteína con una, tinción reversible

universal de proteína, por ejemplo, Ponceau-S.

• transferencia Wet produce transferencias de mayor resolución más de transferencia en seco semi-.

contaminación azida sódica

• La presencia de azida de sodio inhibe la actividad de HRP.

• Utilice tampones libres de azida sódica.

• Asegúrese de lavado suficiente.

exposición de la película demasiado corto reactivo / Detección

no lo suficientemente sensible

• Compruebe varios tiempos de exposición para lograr una detección óptima.

• Pruebe diferentes composiciones y / o marcas de reactivo de detección.

• Diluir los reactivos quimioluminiscentes en agua de alta pureza.

20 Western Blotting

Antecedentes de alto la concentración de anticuerpos demasiado alto

(Distribución uniforme) • Utilice dilución de anticuerpo más alto.

bloqueo insuficiente

• Aumentar la concentración de reactivo de bloqueo (por ejemplo, del 5 al 7%).

• Aumentar el tiempo y / o temperatura de bloqueo.

• Añadir Tween 20 al tampón de bloqueo.

• Incluir reactivo de bloqueo y Tween 20 en el tampón de dilución de

anticuerpo primario.

lavado inadecuado
• Aumentar el tiempo de lavado y el volumen.

membrana seca

• Asegúrese de membrana no se seque durante el proceso de

inmunotransferencia.

la unión del anticuerpo secundario no específica

• Realizar un experimento de control anticuerpo de sólo secundario (omitir la etapa de

incubación primaria).

• Usar un anticuerpo secundario pre-adsorbido con una reducción de reactividad cruzada para las
especies no deseadas.

• Para la detección de proteína fosforilada, no utilice tampones a base de leche tales como
leche sin grasa o tampón de caseína. (Leche y la caseína son ricos en fosfoproteína).

exposición de la película demasiado largo reactivo

/ Detección demasiado sensible

• Compruebe diferentes tipos y dilución del reactivo de detección.

ptglab.com 21

Antecedentes de alto Las sugerencias para solucionar problemas de fondo alto (distribución uniforme)

(Bandas no específico) se pueden aplicar también a escenarios en los que aparecen bandas no
específicas pero distintos en la membrana de Western blot.

Lo siguiente también se debe considerar:

Objetivo abundancia de proteínas es menor que el umbral de la no unión

específica

• Cargar más proteína por pocillo a SDS-PAGE.

• Enriquecer proteínas de baja abundancia mediante inmunoprecipitación, fraccionamiento,

etc.

degradación de la muestra

• Preparar lisados ​frescos cada vez

• la muestra Uso recién preparada se mantuvo en hielo hasta la adición de

tampón de muestra y de calentamiento inmediato a 95 ° C durante 5-10
minutos.

• Los extractos de tejido tienden a producir más bandas no específicas y

productos de degradación. Utilice extractos de tejido fresco, se sonicó, y
aclaradas.

• Siempre incluya inhibidores de la proteasa (y inhibidores de la fosfatasa

para la detección de blancos fosforilados).

• Garantizar la muestra no se ha degradado.

La interferencia de otras isoformas

• Verificar la presencia de isoformas conocidas en la literatura o en

uniprot.org.
• Utilizar un anticuerpo-isoforma específica.

Ineficiente SDS-PAGE de separación

• Cambiar el porcentaje de gel para adaptarse MW de la proteína diana.

• Menor porcentaje geles de Tris-glicina se deben utilizar para las proteínas más grandes, o
utilizan geles y tampones-base de acetato de Tris.

(Consulte la página 12 para nuestras recetas de gel SDS-PAGE).

• Superior porcentuales Tris-glicina geles (hasta 15%) se deben utilizar para proteínas
más pequeñas (<20 kDa) o utilizar geles de Tris-Tricina.

(Consulte la página 16 para nuestra receta gel de Tricina).

La presencia de modificaciones post-traduccionales

• Sepa su proteína de interés, tamaños de las bandas pueden desplazarse debido a la

glicosilación, fosforilación, la maduración de precursores, etc.
22 Western Blotting

La falta de controles

Mientras que la omisión de las muestras de control de un Western blot no es una causa
de bandas no específicas, su inclusión puede decir por qué se le puede ver en tu
membrana. Los controles se podría incluir son:

• Controles positivos:

- Las muestras de células que sobreexpresan la proteína diana.

- proteína recombinante purificada.

- Cell line / tejido con señal positiva probada.

• Controles negativos:

- Las muestras dirigidos con interferencia de ARN.

- Las muestras de knockout tejidos / células.

- Cell line / tejido con señal negativa probada.

Otro Ghost bandas huecas

Problemas secante • Esto sucede cuando el sustrato ECL se utiliza demasiado rápidamente.

la sobrecarga de la muestra

• Disminuir la carga de proteína total de cada muestra.

El exceso de anticuerpo

• Disminuir las concentraciones de la primaria y / o secundaria de

anticuerpos.

tinción inversa (es decir, bandas blancas sobre un blot oscuro)

• El exceso de anticuerpo secundario primario y / o demasiado.

• Usar anticuerpos en diluciones más altas.

tinción Marcador de peso molecular

• El anticuerpo reacciona con el marcador de PM.

• Añadir un carril en blanco entre el marcador de PM y el primer carril de la muestra.

“sonriendo” bandas

• La migración a través del gel estaba demasiado caliente o demasiado rápido.

• Reducir la tensión aplicada para ejecutar el gel SDS-PAGE o correr el gel en una
habitación fría.
ptglab.com 23

bandas irregulares

• Las altas concentraciones de proteínas pueden dar lugar a bandas de proteínas

difusas.

• Desigual carga de proteína: proteína muestras de ensayo y de la carga por la cantidad de

proteína. Compruebe que incluso la proteína de carga por extracción y reprobing el blot
con un anticuerpo de control interno (o utilizar un anticuerpo control de carga conjugado
con HRP).

• composición de gel desigual (gel ha puesto demasiado rápidamente, mientras que la fundición
o tampón se mezclaron inadecuadamente).

• bandas irregulares pueden deberse a búfer insuficiente que se añade al tanque durante el
funcionamiento.

áreas en blanco / manchas blancas

• Puede ser causado por transferencia o aire desiguales burbujas / indebidos.

Las manchas oscuras / puntos

• Este problema puede ser causado por anticuerpos que se unen al reactivo de
bloqueo en el tampón de bloqueo.

• Cambiar a otro reactivo de bloqueo.

• Se filtra el tampón de bloqueo.

• Lavar el exceso de reactivo de detección de la membrana antes de la

exposición.

GARANTÍA
Proteintech
Proteintech tiene una política de garantía global en el lugar para
sus clientes. No creemos que usted lo necesite, pero que está ahí
por si acaso. La garantía incluye:

• Cubierta para el anticuerpo en cualquier especie y cualquier aplicación,

independientemente de lo que probarlo en.

• reembolso de efectivo completo o un reemplazo disponible.

• No hay requisito para enviar el anticuerpo defectuosa de nuevo a

nosotros.

• Sin extenso proceso de retroalimentación para ir a través de un

reembolso.
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24 Western Blotting

PROMOCIÓN

Tome control de su
INMUNOTRANSFERENCIA

anticuerpos de control sólo $ Proteintech 99

cada uno!
Las proteínas que normalmente sirven como controles internos en su investigación no siempre pueden
tomar el centro del escenario, pero Proteintech entender que son indispensables para la realización de
una investigación significativa, sobre todo para la correcta interpretación de las transferencias de Western.

Para más detalles sobre esta oferta promocional y una lista completa de los anticuerpos incluidos,
visite el sitio web Proteintech.

El punto de referencia
en Anticuerpos
ptglab.com 25

Los anticuerpos incluyen:

Nombre de anticuerpos Numero de catalogo Solicitud

alfa tubulina 11 66031-1-lg ELISA, FC, SI, IHC, WB

ß-actina 220 60008-1-lg ELISA, FC, SI, IHC, WB

GAPDH 157 60004-1-lg ELISA, FC, SI, IP, IHC, WB

6-HIS TAG 17 66005-1-lg ELISA, SI, IP, WB

GST-TAG 7 66001-1-lg ELISA, IP, WB

Lo anterior es una pequeña selección de los anticuerpos disponibles al precio de descuento. Una lista completa de
más de 50 anticuerpos incluidos se puede encontrar en ptglab.com.

00 Este número muestra la cantidad de veces que nuestro anticuerpo ha sido citado en una publicación.

www.ptglab.com
26 Western Blotting

Cargando control

ANTICUERPOS
Western Blot requiere controles de carga, que se utilizan para la semi-cuantificación de
los niveles de proteína para asegurar que las alteraciones observadas en las proteínas
diana son en realidad debido a las manipulaciones experimentales. proteínas de control
interno,
es decir, aquellos con niveles constantes, sin cambios, se detectan por lo general en una
segunda ronda de transferencia, después de la detección primaria de su proteína de interés.
Esta etapa se utiliza para normalizar los resultados y normalizar los errores que se meten en un
experimento de Western blot. Los candidatos de control de carga para la transferencia Western
son generalmente proteínas con alta, constitutiva, y sin cambios a lo largo de un experimento
de expresión, independientemente de los tejidos o tipos de células. candidatos de control
requieren una cuidadosa selección, ya que pueden verse afectados por las condiciones de su
experimento. Aquí, hemos proporcionado información de antecedentes sobre una selección de
las proteínas de control interno se dirigen los anticuerpos de control que ofrecemos.

actina Los seis isoformas de actina constituyen una familia de proteínas globulares altamente
conservadas que comprenden tres principales grupos de isoformas: alfa, beta y gamma. Los
Recomendado para:
actins alfa son un constituyente principal del aparato contráctil en los tejidos musculares. Los
célula entera / citoplasma
actins beta y gamma coexisten en la mayoría de tipos de células y son una parte integral del
Peso molecular citoesqueleto. Juntos, actins son las proteínas más abundantes en la célula eucariota típica,
~ 42k Da representando aproximadamente el 15 por ciento de la proteína total en algunos tipos de
células. Como tal, la actina se usa ampliamente como un control interno en experimentos de
transferencia Western.

Llave

Carril 1: Zebra Fish Carril 2: Human

Placenta Carril 3: Corazón humano

kD Carril 4: Cerebro humano Carril 5:

70 kD 100 SW1900 Cell Line Carril 6: A2780 Cell

Line Carril 7: PC-3 Línea Celular Carril

kD 50 kD
8: Cell HepG2 Line Carril 9: HEK293
30 kD 40
Cell Line carril 10: HeLa Cell Line
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 carril 11: NIH3T3 Cell Line carril 12:

SP2 / 0 Cell Line carril 13: RAW264.7

Cell Line carril 14: línea celular C6

El análisis de transferencia Western de ACTB en múltiples líneas celulares y los lisados ​de tejido utilizando
monoclonal anti-beta actina de ratón anticuerpo (60008-1-Ig) a una dilución de 1: 5000.
ptglab.com 27

anticuerpo ß-actina policlonal de Proteintech (20536-1-AP) se generó usando un antígeno

de proteína ß-actina (aminoácidos 14-167). Se reconoce todas las formas de actina, por
lo que es un anticuerpo pan-actina. Sin embargo, si sus estudios implican el trabajo con
muestras de músculo esquelético, o que están trabajando con las condiciones que ven
cambios en el crecimiento de células alteradas o interacciones con la matriz extracelular,
otro control de carga puede ser mejor se adapte a sus necesidades.

Llave

Carril 1: 1: 500 Carril

2: 1: 1 000 Carril 3: 1:

2,000 Carril 4: 1:
kD
4000

70 kD 100

kD 50 kD

30 kD 40

1 2 3 4

lisado de células HeLa (10 ug / carril) se separaron mediante SDS-PAGE y la actina se detectó por el
anticuerpo anti-ß-actina 20536-1-AP a diferentes diluciones. (L-R) 1: 500, 1: 1000, 1: 2000, y 1: 4000.

Los anticuerpos de actina Nombre de anticuerpos No gato Tipo

ß-actina 23 20536-1-AP poli conejo

ß-actina 220 60008-1-lg ratón Mono

Los anticuerpos relacionados Nombre de anticuerpos No gato Tipo

ACTA1 17521-1-AP poli conejo

α- SMA 4 55135-1-AP poli conejo

Conjugada con HRP

HRP-60008 ratón Mono
ß-actina

00 Este número muestra la cantidad de veces que nuestro anticuerpo ha sido citado en una publicación.
28 Western Blotting

COX-4 COX-4, o COXIV (citocromo c oxidasa, subunidad IV), es una subunidad codificada nucleares
de la enzima de cadena respiratoria citocromo c oxidasa mitocondrial humano (COX). La
Recomendado para:
subunidad COX-4 se puede expresar como cualquiera de las dos isoformas. Debido a su alto
mitocondrial
nivel de forma fiable, COX4I1 se detecta comúnmente como un control de carga eficaz de las
Peso molecular proteínas mitocondriales. Sin embargo, algunos se recomienda precaución al seleccionar esta
17 kDa proteína para la detección de Western blot como muchas otras proteínas funcionan a su
tamaño de 17 kDa en SDS-PAGE (asegúrese de que no se oscureció su banda de interés).
Para un control de la carga de proteína mitocondrial alternativa, consulte nuestra entrada
sobre VDAC1 a continuación.

kD 100 kD

50 kD 70

kD 40 kD

20 kd 30

15 kD de

10 kD de

células MCF7 se sometieron a SDS-PAGE seguido de transferencia Western con 11242-1-AP

(anticuerpo COXIV) a una dilución de 1: 1000.

COX-4 Anticuerpos Nombre de anticuerpos No gato Tipo

COX4I1 12 11242-1-AP poli conejo

COX4I1 66110-1-lg ratón Mono

COX4I2 5 11463-1-AP poli conejo

Este número muestra la cantidad de veces que nuestro anticuerpo ha sido citado en una publicación.
00

“Sin embargo, algunos se recomienda precaución al seleccionar

esta proteína para la detección de transferencia de Western
como muchas otras proteínas funcionan a su tamaño 17 kDa
durante SDS-PAGE.”
ptglab.com 29

GAPDH Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, conocido comúnmente como GAPDH, cataliza

Recomendado para:
célula entera / citoplasma
Peso molecular
36 kDa
los seis pasos de la glucólisis. También participa en los eventos nucleares. Su expresión
es alta y constante en la mayoría de los tejidos y tipos celulares. GAPDH se usa
comúnmente como un control de carga de proteína en transferencia de Western y de
control interno para RT-PCR. Sin embargo, la cantidad de expresión de GAPDH puede
variar entre algunos tejidos. También es digno de mención que algunos factores
fisiológicos, tales como la hipoxia y la diabetes, aumentan la expresión de GAPDH en
ciertos tipos de células y tejidos. Proteintech tiene tanto GAPDH monoclonal (60004-1-Ig) y
GAPDH policlonal (10494-1-AP) anticuerpos disponibles, tanto generado contra un
antígeno entero-proteína (aminoácidos 1-335) de origen humano.

Llave

Carril 1: 1: 2,000 Carril

2: 1: 4000 Carril 3: 1:

100 kD 5,000 Carril 4: 1: 16

000
kD 70 kD

40 kD 50

30 kD

1 2 3 4

Western blot con lisado de células HeLa usando anti-GAPDH (10494-1-AP) a diferentes diluciones. (L-R)
1: 2000, 1: 4000, 1: 8000, y 1: 16000.

Los anticuerpos GAPDH Nombre de anticuerpos No gato Tipo

GAPDH 229 10494-1-AP poli conejo

GAPDH 157 60004-1-Ig ratón Mono

Los anticuerpos relacionados Nombre de anticuerpos No gato Tipo

GAPDH conjugada con

HRP-60004 ratón Mono
HRP

00 Este número muestra la cantidad de veces que nuestro anticuerpo ha sido citado en
una publicación.
30 Western Blotting

tubulina Tubulinas son los principales componentes de los microtúbulos. Los microtúbulos están
involucrados en una amplia variedad de actividades celulares. Se expresan altamente y de
Recomendado para:
manera estable y conservadas a través de las especies, y tubulins hacen excelente de
célula entera / citoplasma
células enteras o controles fracción de carga citoplasmáticas. Sin embargo, la expresión de
Peso molecular tubulina puede variar de acuerdo a la resistencia a fármacos antimicrobianos y antimitóticos.
50-55 kDa Proteintech tiene anticuerpos policlonales contra varias subunidades de tubulina, incluyendo
una α- anticuerpo de tubulina (11224-1-AP) y dos anticuerpos SS-tubulina, 10068-1-AP y
10094-1-AP.

Llave

Carril 1: HeLa Cell Carril 2:

NIH3T3 Cell Carril 3: 293

Cell Carril 4: A431 Cell

de 116 kD
Carril 5:

Carril celular
kDa 66 kD
Jurkat 6: Raji Cell

35 kDa 45

123456

Western blot en varias células con anti-tubulina-alfa (11224-1-AP) a una dilución de 1:

1000.

Los anticuerpos de tubulina Nombre de anticuerpos No gato Tipo

alfa tubulina 21 11224-1-AP poli conejo

La tubulina beta 5 10068-1-AP poli conejo

La tubulina beta 13 10094-1-AP poli conejo

Los anticuerpos relacionados Nombre de anticuerpos No gato Tipo

alfa tubulina 11 66031-1-lg ratón Mono

TUB1A conjugada con

HRP-66031 ratón Mono
HRP

Este número muestra la cantidad de veces que nuestro anticuerpo ha sido citado en una publicación.
00
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