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CURSO
ENZIMAS MICROBIANAS COMO FERRAMENTAS DE
SUSTENTABILIDADE
Apostila
2009
Manaus – Amazonas
ÍNDICE
pg
Capítulo 5. Fontes, produção e aplicação de proteases (Profa. Dra. Ana Lúcia F. Porto)..... 52
Capítulo 9. Enzimas em bebidas alcoólicas e não alcoólicas (Prof. Dr. Michele Vitolo)...... 109
Capítulo 10. Aplicação de pectinases na clarificação de sucos regionais (Profa. Dra. Maria
Francisca S. Teixeira)............................................................................................................. 127
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CAPÍTULO 1
BIOTECNOLOGIA, ENZIMAS E ALIMENTOS
Doutor Michele Vitolo
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empregada para este fim – a partir de 1940 - foi a seleção de mutantes com as características
desejadas. As mutações eram provocadas com agentes físicos (por exemplo, luz UV) ou
químicos, os quais causavam modificações aleatórias no DNA da célula, sendo os mutantes
selecionados a partir de meios de cultura desprovidos de nutrientes específicos. O cruzamento
seletivo entre cepas aparentadas, sobretudo da mesma espécie, também foi muito usado para o
melhoramento celular. No entanto, a grande reviravolta – ocorrida em 1972 - no
melhoramento da capacidade produtiva das células (microbianas ou não) foi o
desenvolvimento das tecnologias do DNA-recombinante e da fusão de células (hibridoma) –
as quais constituem a chamada engenharia genética - que possibilitaram a introdução de
mudanças específicas e planejadas diretamente no DNA celular (Tabela 1).
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ADN-RECOMBINANTE HIBRIDOMA
(Bayer, 1927) (MILSTEINE, 1975)
ENZIMAS
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CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
BIOTECNOLOGIA
ENZIMAS
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da fusão celular, resultou uma variedade de shikon que produz a cada 23 dias a mesma
quantidade de corante por planta. O preço da shikonina caiu vertiginosamente, tornando-se
um dos corantes vermelhos mais utilizados na formulação de alimentos. O mercado atual de
shikonina é da ordem de US$ 1 milhão/ano.
2.4.1. Enzimas
Na atualidade as enzimas são catalisadores muito utilizados na indústria (alimentícia,
farmacêutica, têxtil, papel e celulose, químico-farmacêutica), em métodos analíticos
(químicos e de diagnóstico), em medicamentos (por exemplo, auxiliares digestivos) e como
alvos naturais de fármacos inibidores específicos (por exemplo, o omeprazol, fármaco usado
para diminuir a quantidade de suco gástrico na luz do estômago, é um inibidor da enzima que
catalisa a saída do ácido clorídrico das células acinares). Na Figura 3 apresenta-se a
multiplicidade de usos das enzimas.
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mesmo processo fermentativo. Como resultado final pode ocorrer um desiquilíbrio nas
quantidades das enzimas obtidas. Um procedimento geral usado pelo fabricante é o de obter
suas enzimas com grau alimentício, mesmo que sejam usadas em outro setor.
USO ANALÍTICO
DISPOSITIVOS
REAGENTES
ANALÍTICOS
Diagnóstico/análises químicas
MEDICAMENTOS
ENZIMAS
TERAPÊUTICA
REAÇÕES INTRACELULARES
FÁRMACOS
INIBIDORES
PROCESSOS INDUSTRIAIS
INDÚSTRIA QUÍMICO-
INDÚSTRIA DE ALIMENTOS
FARMACÊUTICA
TEXTIL
OUTROS
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a reação depende do tipo de enzima escolhida. Há casos em que a presença ou ausência deles
afeta a performance catalítica da enzima, podendo, inclusive, interferir em parâmetros como
pH e temperatura. Por exemplo, no caso da glicoseisomerase – enzima usada na fabricação de
xaropes de frutose, muito usados como adoçantes em formulações alimentícias e
farmacêuticas – o íon magnésio atua como ativador, ao passo que o íon cálcio age como
inativador. Em geral, bloqueadores da atividade enzimática devem ser evitados, sobretudo na
área de alimentos.
Além dos fatores mencionados, estritamente ligados ao processo em si, devem ser
lembrados, também, os métodos de análise – devem ser simples e de fácil execução. São
importantes para controlar a atividade do preparado enzimático adquirido, assim como
durante o processo e detectar sua presença no produto final. Lembra-se que cada produtor de
enzima tem seu método de análise preferencial e unidades de atividade criadas a seu bel
prazer. Isto dificulta a comparação direta entre os vários fornecedores de enzimas. Por isso, o
usuário consciente deve ter um método analítico-padrão, deixando o do fabricante, apenas,
para fins de controle de seu produto específico (já que o usuário resolveu escolher um dado
fornecedor) -; disponibilidade – o usuário deve certificar-se de que a enzima esteja sempre
disponível no mercado, sobretudo na quantidade, atividade e qualidade desejadas. Isto é vital
quando se operam processos com extratos enzimáticos líquidos ou imobilizados, porque
constituem-se em situações em que a reprodutibilidade e o desempenho catalítico constante e
previsível são exigências para conduzir o processo de modo otimizado -; suporte técnico e
prestação de serviço – o fabricante da enzima deve fornecer informações precisas e
atualizadas ao usuário. Qualquer modificação no processo de fabricação da enzima obriga o
produtor a avaliar os eventuais efeitos no processo do usuário -; e, custo (geralmente a enzima
corresponde a uma fração pequena do custo global do processo [algo em torno a 5%, no
máximo]. A tendência de se usar a enzima mais barata é uma regra comum. Mas o usuário
deve ficar atento para a pureza e a atividade do preparado enzimático, as quais devem ser
compatíveis com o processo. Inclusive, as eventuais atividades colaterais do preparado
enzimático comercial devem ser avaliadas com critério).
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ENZIMAS APLICAÇÕES
Amilases Panificação, xaropes, cervejaria, sucos
Proteases Panificação, cervejaria, laticínios
Lactase Deslactosação do leite integral ou do soro
Fosfatase Alimentos infantis
Catalase Desglicosação de ovos
Glicose oxidase Desglicosação de ovos
Tanase Cervejaria
Naringinase Sucos de fruta
Pectinases Vinhos e sucos de fruta
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4. BIBLIOGRAFIA
KREUZER, h., MASSEY, A. Engenharia genética e biotecnologia. 2ª Edição, Artmed Editora S.A., Porto
Alegre, 2002. 434p.
SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W. Biotecnologia industrial: Engenharia
bioquímica. São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol.2. 593p.
TOMOTANI, E.J., NEVES, L.C.M., VITOLO, M. Oxidation of glucose to gluconic acid by glucose oxidase in a
membrane bioreactor. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.121-124, p.149-162, 2005.
SAID, S., PIETRO, R.C.L.R. Enzimas como agentes biotecnológicos. Ribeirão Preto, Leggis Summa, 2004.
NAGODAWITHANA, T., REED, G. Enzymes in food processing. 3rd Ed., San Diego, Academic Press, 1993.
WOLFBERG, A. Genes on the web – direct-to-consumer marketing of genetics testing. New England Journal
of Medicine, v. 355, n.6, p.543-545, 2006.
CASTLE, D. Science, society and the supermarket: the opportunities and challenges of nutrigenomics. Wiley
Interscience, 2007.
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CAPÍTULO 2
FUNDAMENTOS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA
Doutor Michele Vitolo
1. INTRODUÇÃO
A evolução da enzimologia pode ser dividida em quatro fases, a saber, totalmente
empírica, descritiva, quantitativa e aplicativa com planejamento. A fase empírica –
transcorrida entre 4000-3000AC e início do século XIX - compreende o uso de enzimas em
processos feitos em grande escala – curtume, coagulação do leite para fazer queijo, por
exemplo – sem a mínima noção do tipo de agente responsável pela conversão. A fase
descritiva – ocorrida ao longo do século XIX – correspondeu ao período em que a atividade
enzimática começou a ser observada com mais atenção e método. Assim por exemplo,
observou-se que extratos aquosos de estômagos de aves tinham a capacidade de digerir a
carne animal; extratos aquosos de cereais digeriam materiais amiláceos, como a ptialina da
saliva agia sobre um pedaço de pão; extrato aquoso de levedura de panificação era capaz de
hidrolisar a sacarose, dando o açúcar invertido como produto final. A fase quantitativa, que
se refere ao estabelecimento de modelos matemáticos para quantificar a atividade enzimática,
iniciou-se no final do século XIX, sendo o primeiro modelo quantitativo – conhecido como
modelo de Michaelis-Menten – estabelecido em 1913 e aperfeiçoado por Briggs e Haldane em
1926. Neste mesmo ano, Sumner cristalizou a urease e identificou-a como uma proteína. A
característica protéica das enzimas foi ficando cada vez mais clara, à medida que novas
enzimas eram descobertas, caracterizadas quimicamente e descritas ao longo de todo o século
XX. A fase de aplicação planejada, apesar de ter começado na primeira década do século
passado – uso da amilase e da invertase na hidrólise do amido e da sacarose, respectivamente
– acelerou-se a partir dos anos quarenta, quando novas enzimas apareceram no mercado e os
conhecimentos básicos sobre elas foram se ampliando e aperfeiçoando.
Lembra-se que todas as enzimas conhecidas até agora são de natureza protéica, mas
que nem toda a proteína tem a capacidade de atuar como catalisador. Recentemente,
descobriu-se que algumas moléculas de ácido ribonucléico têm propriedades catalíticas, sendo
chamadas de ribozimas. Suas funções restringem-se na modificação de algumas moléculas de
RNAm antes de sua tradução em proteína no ribossomo. As ribozimas poderão ser
empregadas na terapia gênica (SAID e PIETRO, 2004).
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2. ESPECIFICIDADE
As enzimas catalisam especificamente uma reação, aceitando, em geral, somente uma
substância como substrato. Mesmo quando a enzima catalisa a conversão de mais de um
substrato ela o faz com velocidades diferentes (Tabela 1).
A especificidade decorre das características particulares de uma região da
macromolécula enzimática, denominada sítio ativo. Então, o substrato – reagente a ser
modificado pela enzima – se encaixa no sítio ativo, onde é transformado em outro composto
(produto). Existem duas teorias que procuram explicar o modo como se dá a interação
enzima-substrato. Uma delas – a teoria da chave-fechadura, proposta por Fisher no início do
século XX – preconiza que o substrato se encaixa no sítio ativo da enzima de modo análogo
ao encaixe de uma chave (seria o substrato) na correspondente fechadura (seria a enzima).
Para tal devem ser satisfeitas duas condições, a saber, complementaridade estrutural entre o
sítio ativo e o substrato; o substrato e o sítio ativo terem polaridade e tamanho compatíveis. A
outra teoria – proposta por Koshland nos anos sessenta do século XX, chamada de teoria do
encaixe induzido – propõe que o sítio ativo seria uma região da molécula enzimática
susceptível de sofrer ligeiras modificações conformacionais, quando o substrato se aproxima
dela, de tal sorte a facilitar a interação enzima-substrato. Na essência, as duas teorias diferem
na característica estrutural atribuída ao sítio ativo, ou seja, rígida (segundo Fischer) ou
flexível (segundo Koshland). Em todo o caso, ambas fornecem uma idéia bem clara sobre o
mecanismo da interação substrato/enzima.
Atualmente, considera-se que o sítio ativo seja constituído por duas sub-regiões. Em
uma delas se dá o encaixe do substrato (denominada sítio de ligação) e na outra se dá a
transformação química do substrato (denominada sítio catalítico).
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3. ATIVIDADE ENZIMÁTICA
3.1. Introdução
O conhecimento e a quantificação da atividade enzimática é importante, quando se
deseja utilizar as enzimas quer em processos industriais quer em quaisquer métodos
analíticos.
Centrando a atenção nos processos industriais, algumas considerações devem ser feitas
com o intuito de avaliar a propriedade ou não de se empregar enzimas como catalisadores de
reações específicas. Os questionamentos básicos seriam: a) Quanto da enzima será
necessária? b) Qual a duração da reação? c) Qual a concentração de substrato a ser
transformada? d) Quais as condições de reação? e) Quais os custos envolvidos?
Uma vez tomada a decisão em favor do processo enzimático, e sabendo que a enzima
per si tem um custo – ela deve ser adquirida no mercado -, deve-se avaliar o impacto que este
custo exerce sobre o processo como um todo. Em linhas gerais, o custo efetivo de um
processo catalisado por enzima deriva da razão entre o custo adicional da enzima e o aumento
do rendimento e/ou do valor agregado do produto final, ou, ainda, à economia global
conseguida no processo.
Do exposto, decorre que o sucesso no uso da enzima implica na otimização do
trinômio quantidade de enzima necessária/condições operacionais/rendimento da reação.
Teoricamente, sendo as enzimas catalisadores – portanto regeneráveis ao fim de cada
ciclo de reação – uma pequena quantidade de enzima pode transformar qualquer quantidade
de substrato. Contudo, deve existir uma correlação ótima e finita entre a quantidade de
catalisador, sua atividade inicial e a quantidade de substrato a ser transformada. Além disso,
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lembra-se que os processos enzimáticos industriais duram desde minutos (por exemplo, ação
de proteases sobre as proteínas da cevada maltada – visando o aumento do teor de nitrogênio
no mosto a ser usado na fabricação de cerveja – dura menos de 60 min) até algumas horas
(por exemplo, a sacarificação do amido liquefeito pela glicoamilase dura cerca de 3h,
enquanto que a hidrólise da lactose do soro de leite pela β-galactosidase – também chamada
de lactase – dura cerca de 20h) (GODFREY e WEST, 1996). Obviamente a tecnologia
enzimática visa à ocorrência de reações rápidas, sem no entanto perder de vista as restrições
impostas pelas condições de processamento e de escala, que devem ser justificadas do ponto
de vista econômico.
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(P)
(g/L)
(S) (P)
(E)
(ES)
Tempo
Figura 1. Variação das concentrações de enzima (E), substrato (S) e produto (P) em função do
tempo. 1ª fase; 2ª fase e 3ª fase.
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t
(Sn)
Quantidade de S (S3)
Consumida (g/L)
(S2)
(S1)
0 5 10 15 20 25
Tempo (min)
Figura 2. Variação do consumo de substrato em função do tempo de reação. A quantidade de
enzima presente no meio reacional foi suposta constante (E0). No intervalo de tempo
0→t tem-se que o consumo de substrato varia linearmente com o tempo, ou seja, a
velocidade de consumo de substrato (v = - dS/dt) permanece constante, indicando que a
concentração inicial de substrato (S1, S2, S3,.....Sn) é suficiente para saturar toda a
quantidade de enzima presente (E0). Acima do tempo t a correlação de consumo frente
ao tempo de reação para S1 deixa de ser linear, neste caso, então, a quantidade de
substrato presente no meio reacional já não é mais suficiente para saturar toda a enzima
presente. Por conseguinte, no trecho linear de cada curva tem-se representada a
condição em que a concentração de (ES) permanece constante, ou seja, o intervalo 0→t
corresponde à 2ª fase referida na Figura 1. Lembra-se que as curvas indicadas
correspondem às concentrações iniciais crescentes de substrato (S1 < S2 <S3...< Sn).
tendo-se em decorrência v1 < v2 < v3 .... < vn.
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v = (-
v3
v2
(S)
0
0 S1 Km S2 S3 S4 ……. Sn
Figura 3. Gráfico da velocidade (v = - dS/dt) da reação enzimática em função da concentração
inicial de substrato. A curva – identificada matematicamente como hipérbole retangular
– mostra que a partir da concentração inicial de substrato S2 a velocidade da reação
passa a não aumentar na mesma proporção que a concentração inicial de substrato, até
que a partir de S4 torna-se invariante em relação ao aumento da concentração inicial de
substrato. A reação, portanto, passa a ocorrer com a velocidade máxima (Vmax),
lembrando que nesta condição a enzima encontra-se saturada com substrato, ou seja, o
complexo ES é a forma dominante da enzima nesta fase da catálise (2ª fase). Indica-se,
também, nesta figura a constante cinética Km – que corresponde à concentração inicial
de substrato na qual a velocidade da reação é a metade da velocidade máxima – a qual
junto com a Vmax e sob condições definidas de reação caracterizam a atividade catalítica
da enzima.
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E
S
P
ES
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(pH, temperatura, agitação, concentrações dos reagentes, etc.). Estas constantes devem ser
calculadas a partir de um quadro (Tabela 2) aonde se dispõe a velocidade da reação medida
experimentalmente frente às correspondentes concentrações iniciais de substrato.
A Eq.15 pode ser escrita da seguinte forma:
1/v = (1/Vmax) + (1/S).(KM/Vmax) (Eq. 16)
A partir de um gráfico (1/v) versus (1/S) calculam-se as constantes cinéticas referidas.
A respeito do KM deve-se lembrar de três aspectos importantes: a) Quando KM = (S),
ou seja, numericamente igual à concentração de substrato, a Eq. 15 se transforma em v
= Vmax/2; b) KM serve de referencial para fixar a concentração inicial de substrato –
Quando (S) for pelo menos 100 vezes maior que o KM a reação transcorre em condição
de saturação; quando (S) for pelo menos 100 vezes menor que o KM a reação se dá em
condição não saturante -; c) KM é uma característica da enzima sob condições definidas
de reação.
Vamos analisar a 3ª fase da reação catalisada por uma enzima. Esta é a fase em que a
concentração de (ES) deixa de ser constante (Figura 1).
Para equacionar esta fase, vamos reescrever a Eq. 15 da seguinte maneira:
v = -(dS/dt) = Vmax/[1 + (KM/S)] (Eq. 17)
rearranjando,
- dS .[1 + (KM/S)] = Vmax.dt (Eq. 18)
Integrando,
t = [(S0 – S) – KM.Ln (S/S0)] ÷ Vmax (Eq. 19)
A Eq. 19 correlaciona o consumo de substrato com o tempo durante todo o período de
duração da reação.
A Eq. 19 pode ser modificada como segue:
Definindo a conversão (Y) como :
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4.1.2. Temperatura
A temperatura exerce efeito generalizado no andamento de uma reação, influindo na
solubilidade dos reagentes, na velocidade global da reação e, no caso das enzimas, afeta as
constantes cinéticas e a estabilidade. Segundo a lei de Van’t Hoff, frente a um aumento de 10º
C na temperatura a velocidade da reação dobra, porém no caso das enzimas pode ser até mais
que o dobro.
É muito difícil estabelecer uma temperatura ótima para a ação de uma enzima, porque
a macromolécula está submetida aos eventos simultâneos da ativação e da desnaturação.
Devido à coexistência ativação/desnaturação, o tempo durante o qual a enzima é submetida a
uma dada temperatura torna-se um fator importante na sua estabilidade.
O efeito da temperatura na vida de prateleira da enzima, também, é um aspecto
importante a ser considerado, pois um mesmo preparado enzimático mantido a diferentes
temperaturas apresenta perda de atividade diferenciada. Modificações introduzidas na
estrutura molecular da enzima, quer por via química (engenharia de proteínas) quer por
modificação genética da fonte (biologia molecular), com a finalidade de torná-la mais ou
menos termoestável é um objetivo dos fabricantes de enzimas industriais.
4.1.3. Outros
Apenas a título de lembrança, citam-se os efeitos: a) força iônica – relacionada à
concentração de íons presentes no meio reacional – e que pode afetar a solubilidade e a
ionização dos grupos ionizáveis presentes nas cadeias laterais dos aminoácidos constituintes
da enzima; b) Atividade de água, ou seja, o teor de água existente no meio reacional, que
poderá interferir na intensidade e no mecanismo catalítico da enzima. A atividade de uma
enzima pode ser severamente diminuída em ambiente de baixo teor de água ou, caso a enzima
catalise uma hidrólise, o seu mecanismo de ação poderá deixar de ser hidrolítico e passar a ser
transferásico (ao invés de romper uma ligação passa a formá-la).
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4.2.1. Ativadores/Desativadores
O ativador é uma substância, muitas vezes um íon, que aumenta a atividade da enzima
e que pode ser um elemento integrante da macromolécula (se for de natureza orgânica é
chamado de grupo prostético) ou estar solubilizado no meio reacional e se unir à enzima
somente no momento da catálise (ou seja, na presença do substrato. Neste caso, tem-se a
coenzima, se o composto for orgânico).
4.2.2. Estabizadores
A presença do substrato, em geral, estabiliza a enzima, sobretudo frente à temperatura.
Por exemplo, em preparados enzimáticos líquidos às vezes são acrescentados substratos
modificados. Assim, amilases podem ser estabilizadas com amido hidrolisado, as proteases
com peptídeos. Nos casos em que a enzima pode catalisar a reação P → S, o produto,
também, pode estabilizar a enzima. Só que neste caso se torna um problema a eliminação da
atividade da enzima no final do processo. Há casos em que o íon metálico, além de ativador,
atua como agente estabilizador (por ex., o Ca+2 estabiliza a α-amilase).
4.2.3. Inibidores
Os inibidores são substâncias específicas que, em baixas concentrações, diminuem a
velocidade da reação enzimática. Atuam no nível do sítio ativo ou de sítios auxiliares, sem
prejudicar a estrutura terciária e/ou quaternária da proteína, ao contrário do que fazem os
reagentes químicos inespecíficos (álcali, ácido, sais, uréia, detergentes).
Do ponto de vista industrial é importante ter consciência de que o inibidor reduz a
eficiência catalítica da enzima. Evitá-lo é a maneira correta.
Os principais tipos de inibidores são: a) irreversível: liga-se à molécula da enzima
através de ligação covalente, inutilizando-a por completo; b) reversível: liga-se à molécula da
enzima através de ligações não covalentes, de tal sorte que seu efeito pode ser revertido ao
usar-se uma concentração adequada de substrato. Existem três tipos básicos de inibidores
reversíveis, a saber, competitivo – o substrato e o inibidor disputam o sítio ativo da enzima e
dependendo da concentração relativa entre eles o efeito inibitório pode ser reduzido ou até
eliminado; em outras palavras, eles se excluem mutuamente -, não competitivo – inibidor e
substrato não se excluem mutuamente, porque se ligam em pontos diferentes da molécula da
enzima – e incompetitivo, o inibidor só se liga à enzima após o substrato ter se introduzido
no sítio ativo, ou seja, o inibidor se liga diretamente no complexo enzima-substrato.
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6. EXERCÍCIOS PROPOSTOS
1. O eixo 1/v de um gráfico de recíprocos mostra a legenda v-1: (nmoles/L.min)-1x102. O eixo 1/S
apresenta a legenda (S)-1: (M-1)x10-4. A reta intercepta o eixo das ordenadas (1/v) em “2” e o eixo das
abscissas (1/S) em “-4”. Calcular Vmax e KM.
2. Uma preparação enzimática tem uma atividade específica de 42 U/mg de proteína e contém 12 mg
de proteína por mL. Calcule a velocidade inicial da reação numa mistura padrão de 1 mL contendo 5
µL de preparado enzimático. Se a reação for deixada ocorrer por 10 min, haveria ou não necessidade
de se diluir o preparado enzimático?
DADOS: A velocidade inicial de uma reação enzimática é mantida até que 5% do substrato inicial
seja consumido. Uma unidade de atividade (U) é definida como µmoles de substrato
consumido/min.mL.
3. A atividade de uma enzima foi determinada a uma concentração inicial de substrato de 1x10-5M. O
Km da enzima é 2x10-3M. Ao final de 1min, 2% do substrato foi convertido em produto. Pergunta-se:
(a) Que percentagem de substrato será convertida em produto ao final de 3min? Quais são as
concentrações de produto e substrato após 3 min?
b) Se a concentração inicial de substrato fosse 1x10-6M, que percentagem seria convertida em produto
decorridos 3 min?
(c) Qual a velocidade máxima (Vmax) que pode ser alcançada?
(d) A que concentração mínima de substrato a Vmax será observada?
(e) A esta concentração mínima de substrato, que percentagem de substrato será convertida em
produto em 3 min?
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
GODFREY, T., WEST, S. Industrial Enzymology. 2nd Edition, New York: Stockton Press, 1996. 609p.
AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A. Biotecnologia Industrial. São Paulo, Edgard
blucher Ltda, vols. 1,2,3 e 4. 2001.
SAID, S., PIETRO, R.C.L.R. enzimas como agentes biotecnológicos. Leggis Summa, Ribeirão Preto, SP, 2004.
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CAPÍTULO 3
FONTES E PRODUÇÃO DE ENZIMAS: FUNDAMENTOS
Doutor Michele Vitolo
1. FONTES
As enzimas podem ser obtidas de animais, vegetais e microrganismos, conforme
descrito no Capítulo 1 (item 2.4.1.1). Em princípio, todas as enzimas de origem animal e
vegetal têm sua correspondente microbiana. Lembra-se, no entanto, que elas são moléculas
protéicas diferentes, só se assemelhando em dois aspectos, a saber, o de serem proteínas e o
de atuarem sobre o mesmo substrato.
2. OBTENÇÃO E PURIFICAÇÃO
Para a obtenção das enzimas a partir das fontes citadas são empregados diferentes
processos, os quais são selecionados de acordo com o grau de pureza desejado para o
preparado enzimático a ser comercializado.
Em termos genéricos, as etapas para a obtenção de enzimas são: FONTE →
EXTRAÇÃO → FILTRAÇÃO/CENTRIFUGAÇÃO → PRECIPITAÇÃO →
PURIFICAÇÃO → SECAGEM → ESTABILIZAÇÃO → PADRONIZAÇÃO →
EMBALAGEM.
Como a propagação das fontes animal e vegetal se dá em fazendas, as enzimas
provenientes dessas fontes são obtidas através da extração de tecidos animais e vegetais. Ou
seja, a indústria produtora desse tipo de enzima, recebe a fonte já no ponto de partida para a
extração, não tendo que se preocupar com a propagação da mesma. Nas figuras 1, 2, 3 e 4 são
apresentados, apenas como exemplos, os esquemas de obtenção da quimosina (renina),
pancreatina, urease e bromelina, respectivamente.
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[FIGURA 1]
1. LIMPEZA
ESTÔMAGOS pH = 3,6
2. SECAGEM EXTRATO EXTRATO
DE
BEZERROS 3. TRITURAÇÃO TECIDUAL 3º C ATIVADO
4. AGITAÇÃO (NaCl
pH = 5,4
10%, POR 2 DIAS)
K2Al2(SO4)3
DECANTAR; NaHPO4
AGITAR; FILTRAR;
FLÓCULO
FILTRAÇÃO NaCl 26% (pH = 1,5)
SECAGEM
RENINA (COALHO)
[FIGURA 2]
LIMPEZA PÂNCREAS
PÂNCREAS ÁGUA
MACERAÇÃO MACERADO
PRENSAGEM
ETANOL
FILTRAÇÃO
CENTRIFUGAÇÃO SECAGEM
TAMIZAÇÃO
PANCREATINA
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[FIGURA 3]
MOAGEM FARINHA
SOJA DESENGORDURAMENTO FARELO
INTEGRAL
ACETONA
ÁGUA + MERCAPTOETANOL
FILTRAÇÃO AGITAÇÃO
REPOUSO
CENTRIFUGAÇÃO
SECAGEM
UREASE
[FIGURA 4]
1 VOLUME DE ACETONA
2 VOLUMES DE ACETONA
DESCASCAR
ABACAXI SUCO
PRENSAR
FILTRAR
FILTRAR
SECAR
BROMELINA
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Contrariamente ao caso das enzimas de origem animal e vegetal, as fontes das enzimas
microbianas devem ser propagadas pelos fabricantes.
A propagação de micro-organismos é feita através do processo de fermentação, no
qual as células são cultivadas em meio de cultivo asséptico. A Figura 5 ilustra as principais
etapas de um processo fermentativo.
STERILIZATION PROCESS
INDUSTRIAL SCALE
FERMENTER CONTROL SYSTEM
FERMENTED MASH
A propagação das células microbianas pode ser feita através de cultivos submerso
(Figura 6) ou em meio semi-sólido (Figura 7).
Apoio:
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CULTIVO SUBMERSO
incubação
inoculação
TANQUE DE SEMEADURA INÓCULO
desprezar filtração
ENZIMA RESÍDUO
EXTRACELULAR
EXTRATO
ENZIMA
Rompimento
INTRACELULAR
filtração
EMBALAGEM
MEIO SEMI-SÓLIDO
FARELO esterilização BANDEJAS
ESTÉRIL distribuição
Incubação (20-45oC)
EXTRATO
EMBALAGEM RESÍDUO
Apoio:
38
CALDO FERMENTADO
ENZIMA INTRACELULAR
ENZIMA EXTRACELULAR
SEPARAÇÃO
SEPARAÇÃO LÍQUIDO/SÓLIDO
LÍQUIDO/SÓLIDO
ROMPIMENTO CELULAR
CONCENTRAÇÃO
PURIFICAÇÃO SEPARAÇÃO
LÍQUIDO/SÓLIDO
PRECIPITAÇÃO DE
ÁCIDOS NUCLÉICOS
PURIFICAÇÃO
Apoio:
39
Apoio:
40
PRECIPITADO Adsorção
centrifugação SOBRENADANTE
NUCLEASE- Agitação (1h) DILUÍDO (11000µS)
RESINA
Repouso (2h)
SP-SEPHADEX C25 (750G)
Lavagem com (NH4)Ac 0,3M (pH 6,0)
Ultracentrifugação
CALDO FERMENTADO
CÉLULAS
CENTRIFUGAÇÃO/RUPTURA
CELULAR
FLOCULAÇÃO
SEPARAÇÃO
CENTRIFUGAÇÃO
SÓLIDO/LÍQUIDO
FILTRAÇÃO
CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA
CROMATOGRAFIA
DE ADSORÇÃO DE TROCA IONICA
DE AFINIDADE
C
Apoio:
41
A ruptura das células pode ser feita através de diferentes métodos, dentre os quais
destacam-se:
1) Cisalhamento sólido: as células são misturadas, por exemplo, com kieselguhr (terra de
diatomácea) e a mistura é submetida a uma dada pressão;
2) Agitação com abrasivos: é um dos métodos mais usados, podendo-se usar esferas de vidro
como agentes de abrasão. Um exemplo de condições seria: diâmetro das esferas: 0,13 a 0,26
mm; agitação: 300 - 500 stokes/min e amplitude: 2,5 polegadas;
3) Cisalhamento líquido: consiste em se passar a suspensão celular através de diminutos
orifícios munidos de válvulas e sob altas pressões. Os equipamentos mais utilizados são a
“French Press” (rompimento descontínuo) e o Manton-Gaulin (rompimento contínuo). A
suspensão celular antes de ser introduzida no aparelho deve estar à 4oC, devido ao
aquecimento resultante do atrito das células com as placas perfuradas. A eficiência da ruptura
depende do grau de homogeneidade da suspensão. Em outros termos, na suspensão não
devem existir filamentos ou grumos celulares. Por isso, agregados miceliais não podem ser
destruídos por este processo.
4) Detergentes: substâncias do tipo dodecilsulfato de sódio, brometo de cetiltrimetilamônio,
Tweens, Triton X100, dentre outras, quando em condições adequadas de pH, força iônica e
temperatura podem romper células com eficiência.
5) Tratamento enzimático: em princípio parece apresentar grande interesse, pois além de ser
suave é seletivo. Porém vários problemas existem: a) alto custo da enzima; b) a enzima lítica
se mistura ao lisado, podendo complicar o posterior processo de extração da enzima de
interesse; c) o número de espécies celulares susceptíveis a este tratamento é pequeno.
6) Tratamento com álcali: é um método barato. Implica em que a enzima resista a pH da
ordem de 12,0 por 20 a 30 min. Uma vantagem adicional é que neste pH, proteases
eventualmente existentes seriam inativadas, ou então substâncias pirogênicas (no caso de
enzimas para fins terapêuticos).
Quando se pensa na ruptura das células para posterior extração da enzima, alguns
pontos de natureza geral devem ser realçados: a) a enzima estará sendo submetida a
sucessivas forças de cisalhamento, à medida que os processos de purificação vão sendo
aplicados (por ex., mistura, centrifugação, ultrafiltração, passagem por bombas, dentre
outras), e por isso poderá ocorrer perda de atividade; b) fatores biológicos do tipo: tamanho da
célula, condições fisiológicas, estrutura da célula, composição da célula e localização da
enzima na estrutura celular, poderão interferir no maior ou menor rendimento do processo de
Apoio:
42
purificação. Lembrar que, uma vez destruída a célula, a enzima de interesse se torna
susceptível à degradação ou inativação por uma série de fatores, onde se incluem: proteases e
metais pesados. Por isso, a adição de substâncias protetoras, nesta fase, pode ser de grande
utilidade (EDTA, β-mercaptoetanol, etc); c) qualidade da água usada nas várias etapas da
purificação.
Uma vez rompidas as células, procede-se à separação sólido/líquido. Neste caso, os
processos utilizados são a centrifugação, floculação ou filtração. A filtração é muito usada nos
processos de clarificação e de esterilização, sendo raramente usada logo após a etapa de
ruptura das células. Uma das razões consiste no fato de que homogenatos animais e
bacterianos são frequentemente viscosos ou gelatinosos e entopem rapidamente o elemento
filtrante, a menos que se use grandes quantidades de auxiliar de filtração.
A próxima fase consiste da remoção dos ácidos nucléicos dissolvidos através do uso
da nuclease. Contudo, quando o produto final é uma enzima de restrição ou qualquer outra
relacionada à DNA, o emprego da nuclease poderá contaminar o produto final, tornando-o
inútil. Neste caso, substitui-se a nuclease por substâncias catiônicas (sulfato de protamina,
sulfato de estreptomicina e polietileneimina).
Uma vez efetuadas as etapas discutidas acima, passa-se para o estágio de recuperação
da enzima, para o qual utilizam-se: a) precipitação; b) cromatografia de adsorção; c)
cromatografia de troca iônica; d) cromatografia de afinidade; e) separação aquosa bifásica:
sistemas bifásicos podem ser usados para separar enzimas de homogenatos celulares e ao
mesmo tempo obter um certo grau de purificação. Tais sistemas podem ser feitos misturando-
se soluções de polietilenoglicol e dextrana ou polietilenoglicol e K2SO4 ou (NH4)2SO4. As
proteínas se particionam entre as duas fases, sendo a exata localização da enzima função do
seu PM, força iônica, temperatura, da concentração e massa molar do polímero.
Neste ponto devemos destacar que os vários recursos utilizados para a purificação
final da enzima são os mesmos utilizados no estágio de recuperação.
Os métodos de purificação, agrupados de acordo com a característica explorada, são:
a) Diferenças nas propriedades iônicas: precipitação, eletroforese e cromatografia de
troca iônica (Figura 9).
Apoio:
43
[FIGURA 9]
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA
[FIGURA 10]
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
xx////x//xxx// alimentação
/xxx///x/x////
xxxx//x/x/x// Lavagem
⊗⊗ 0000
0000
⊗⊗ 0000
0000 (B)
(A) ⊗⊗ 0000 (C)
0000
⊗⊗ 0000
0000
⊗⊗
0000
Xxx
xxx
Apoio:
44
[FIGURA 11]
*x***xxx*
x***xx*xx Solução contendo as
x**x*****x proteínas a separar.
xxx*****x
xx**xx**
LÍQUIDO CARREADOR
A proteína (*)
0000000000000
0000000000000
0000000000000
0000000000000
0000000000000
0000000000000
0000000000000
sai primeiro
Coluna com resina de
adsorção
xxxxxxx ********
xxxxxxx ********
Cromatograma xxx ********
Apoio:
45
[FIGURA 12]
Cromatografia em gel
SOLUTO DE MAIOR MM
2. BIBLIOGRAFIA
PESSOA-Jr, A., KILIKIAN, B.V. Purificação de produtos biotecnológicos. Barueri, SP, Manole Editora, 2005.
LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W. Biotecnologia Industrial. Vol.3, Editora
Edgard Blucher, São Paulo, SP, 2001.
BLANCH, H.W., CLARK, D.S. Biochemical Engineering. Marcel Dekker, Inc., New York, USA, 1996.
GODFREY, T., WEST, S. Industrial enzymology. 2nd Ed., MacMillan Press LTDA, London, UK, 1996.
Apoio:
46
CAPÍTULO 4
FONTES, PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DE AMILASES
Doutora Luciana Leomil
1. AMIDO
Apoio:
47
2. AMILASES
As amilases são enzimas da família das hidrolases capazes de degradar o amido e seus
produtos de hidrólise e até sacarídeos menores. São amplamente distribuídas na natureza, e
podem ser produzidos por bactérias, fungos, plantas e animais. Estão entre as enzimas mais
importantes empregadas na indústria, devido à grande aplicação do amido e de seus derivados
em processos industriais.
Estas enzimas podem ser classificadas quanto ao seu mecanismo de ação ou a quanto o
tipo de ligação que hidrolizam. Quanto ao mecanismo de ação podem ser classificadas como
endoamilases (clivam ligações glicosídicas ao acaso no interior do polímero), ou exoamilase
(hidrolisam, sucessivamente, ligações glicosídicas a partir da extremidade não-redutora da
molécula) (GUPTA et al., 2003).
As amilases, quanto às ligações hidrolisadas, podem ser agrupadas em: glicoamilases,
α-amilases, β-amilases, isoamilases, pululanases, ciclodextrina glicotranferase e isomaltase.
2.1. α-Amilases
As α-amilases (EC 3.2.1.1 - 1,4-α-D-glucano, 4-glucano-hidrolases;) são endohidrolases
que rompem as ligações α, 1→4 da molécula do amido ao acaso, dando origem a
oligossacarídeos de baixo peso molecular e provocando rápida liquefação do amido (SAHA e
ZEIKUS, 1992). Os açúcares glicose, maltose, maltotriose, maltotetrose, maltopentose e
maltohexose foram identificados como produtos finais da ação α-amilase (CHANG e
SCWARTZ, 1988; CASTRO, 1992).
Estas enzimas são produzidas por uma variedade de organismos, incluindo bactérias,
fungos e leveduras, entretanto as enzimas derivadas de fungos e bactérias são as dominantes,
e dentre estes os principais produtores de α-amilases incluem o gênero Aspergillus e Bacillus
respectivamente (PANDEY et al., 2000).
2.2. β-amilases
As β-amilases (1,4-β-D-glucano malto hidrolase) é uma exohidrolase que cliva ligações
alternadas de -1,4 da porção não redutora da amilose e amilopectina para produzir a b-
maltose (BHAT, 1998). Esta enzima é incapaz de contornar as ligações glicosídicas do tipo β-
1,6, interrompendo sua atividade nos pontos de ramificação. O amido solúvel quando
Apoio:
48
hidrolisado por esta enzima resulta na produção de 69% de maltose e β-dextrinas (BHAT,
1998).
2.3. Glucoamilase
Esta enzima também é chamada de amiloglucosidase (α-1,4-glucanglucano hidrolase), é
uma enzima sacarificante que produz unicamente glicose através da hidrólise das ligações
glicosídicas α-1,4 e α-1,6 removendo unidades de glicose consecutivamente a partir da
extremidade não redutora da cadeia de amido e de oligossacarídeos deixados pela ação da α-
amilases (OLIVEIRA et al., 1993). Os principais gêneros produtores de glucoamilase são:
Aspergillus e Rhizopus, sendo o Aspergillus niger o melhor produtor desta enzima (SAUER et
al.,2001).
2.4. Pululanase
As Pululanases (α-dextrinas 6-glucohidrolase) clivam as ligações do tipo α-1,6 nos
pontos de ramificação do amido e da amilopectina, fazendo a conversão em molécula de
amilose, que possuem somente ligações do tipo α-1,4. São industrialmente importantes e
geralmente são usadas em combinação com amilases sacarificantes, como: a glucoamilase, α-
amilases e β -amilases para a produção de xaropes, onde a pululanase é adicionada juntamente
com a glucoamilase para aumentar o teor de glicose, reduzindo o tempo de reação (BHAT,
1998).
2.5. α-D-Glucosidase
Esta enzima age nas ligações α-1,4 terminais do amido e libera D-glicose. A enzima
pode ainda clivar ligações terminais α-1,2, α-1,4 e α-1,6 de dissacarídeos e oligossacarídeos
liberando α-D-glicose. É uma enzima muito importante no processo de produção de xarope
com alto teor de glicose (BHAT, 1998).
2.6. EXO-(1-4-α-D)glucanase
Esta enzima libera tipicamente maltoligossacarídeos do amido. Estes
maltoligossacarídeos possuem um alto valor comercial e pode ser usado como suplemento
alimentar para crianças, idosos e pacientes clínicos (BHAT, 1998).
Apoio:
49
2.7. Isoamilase
As isoamilases (glicogênio 6-glucano hidrolase) são capazes de hidrolisar ligações do
tipo α-1,6-D de amilopectina, glicogênio, dextrinas ramificantes e alguns oligossacarídeos.
Entretanto, tais enzimas não hidrolisam as ligações do tipo α-1,6 da pullulana e de b-dextrina-
limite. Tal característica é atribuída a sua baixa atividade às cadeias laterais curtas da
molécula de amido (ARA e ITO, 1993). As isoamilases são usadas pela indústria para a
produção de maltose e glicose a partir de amido em combinação com outras amilases.
2.8 Ciclodextrinases
As ciclodextrinases são enzimas que hidrolizam o amido formando estruturas circulares
denominadas de cliclodextrinas unidas por ligações glicosídicas do tipo α-1,4. Estes anéis
podem ser constituídos por 6, 7 e 8 unidades de glicose, sendo chamadas de α, β e
γ−cliclodextrinas respectivamente. Geralmente são enzimas extracelulares encontradas
principalmente em bactérias do gênero Bacillus (SAHA e ZEIKUS, 1992).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ARA, K.S.K.; ITO, S. Purification and characterization of an alkaline isoamilase from alkalophic strain of
Bacillus. J. Gen. Micro., v.139, p. 781- 786, 1993.
BALL, S.G.; MORELL, M.K. From bacterial glycogen to starch: understanding the biogenesis of the plant starch
granule. Annu. Rev. Plant Biol., v. 54, p. 207-233, 2003.
BECK, E.; ZIEGLER, P. Biosynthesis and degradations of starch in higher plants. Ann. Rev. Plant Physiol.
Plant. Mol. Biol., v. 40, p. 95-117, 1989.
BHAT, M.K. Enzymatic processing of starch: presents and potential benefits. Sug. J., v. 100, p. 372-376, 1998.
CASTRO, G.R.; FERRERO, M.A.; ABATE, C.M.; MENDEZ, B.S.; SIFFERIZ, F. Simultaneous production of
alfa e beta amilase by Bacillus subtilis MIR-5 in batch and continuous culture. Biotech. Lett., v. 14, p. 49-54,
1992.
CHANG, P.L.; SCWARTZ, S.J. Characterization of the action of Bacillus subtilis alpha amylase on sweet
potato. Starch, amylose and amylopectin. J. Food Bioch., v. 12, p. 191-203, 1988.
GUPTA, R.; GIGRAS, P.; MOHAPATRA, H.; GOSWAMI, V.K.; CHAUHAN, B. Microbial α-amylases: a
biotechnological perspective. Process Biochem., v. 38, p. 1599-1616, 2003.
Apoio:
50
KOSSMANN, J., LLOYD, J. Understanding and influencing starch biochemistry. Crit. Rev. Plant Sci., v. 19, p.
171-226, 2000.
OLIVEIRA, I.M.A.; SILVA, F.T.; MARKES, T.A. Produção de Xarope de Frutose. Monografia da Faculdade
de Engenharia de Alimentos - UNICAMP, Campinas - SP, 80p., 1993.
PANDEY, A.; NIGAM P.; SOCCOL, C.R.; SOCCOL, V.T.; SINGH, D.; MOHAN, R. Advances in microbial
amylases. Biotechnol. Appl. Biochem.v. 31, p. 135-152, 2000
SAHA, B.C.; ZEIKUS, J.G. Cyclodextrin degradum enzymes. Starch, v. 44, p. 312-315, 1992.
SAUER, J.; CHRISTENSEN, T.; FRANDSEN, T.P.; MIRGORODSKAYA, E.; MCGUIRE,K. A.; DRIGUEZ,
H.; ROEPSTORFF, P.; SIGURSKJOLD, B.W.; SVENSSON, B. Stability and function of inter domain linker
variants of glucoamylase 1 from Aspergillus niger. Biochem., v. 40, p. 9336-9346, 2001.
ZHANG, P.Y.; WHISTLER, R.L.; BEMILLER, J.N.; HAMAKER, B.R. Banana starch: production,
physicochernical properties, and digestibility - a review. Carbohydr. Polym., v. 59, p. 443-458, 2005.
Apoio:
51
Meio LB 2x – 200 mL
Extrato de levedura 2g
Peptona 4g
NaCl 4g
Ágar Bacteriológico 6g
Amido 1% 2x 2 g para 200 mL de água destilada
Ou
Amido 0,5% 2x 1 g para 200 mL de água destilada
M.F.: fazer estes meios de cultura (LB) e Amido em frascos separados e autoclavar.
Depois, unir estes dois meios em um único frasco de 500 mL, e em seguida, verter os meios
nas placas. Semear as amostras e controles negativo (Escherichia coli ATCC 25922) e
controle-positivo (Bacillus liqueniformis ATCC 6348). Incubar em estufa por mais de 24
horas a 37ºC (LEDERBERG e LEDERBERG, 1951) e, em seguida, adicionar o revelador
(iodo sublimado) para a visualização da formação de halos (indicativo de atividade
enzimática).
A atividade enzimática dos clones serão estimadas semi-quantitativamente usando um
índice enzimático (IE) que expressa a relação do diâmetro médio do halo de degradação e o
diâmetro médio da colônia (HANKIN e ANAGNOSTAKIS, 1975). Ao testar as colônias
produtoras das referidas enzimas, os clones recombinantes escolhidos serão os que
apresentarem melhores índices enzimáticos, perante este ensaio.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
HANKIN, L.; ANAGNOSTAKIS, S.L. The use of solid media for detection of enzyme production by fungi.
Mycologia, v. 67, p. 597-607, 1975.
LEDERBERG, J., LEDERBERG, E.M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. Wisconsin, v.
63, p. 399-406, 1951.
Apoio:
52
CAPÍTULO 5
Proteases
Enzimas proteolíticas, proteases, proteinases ou peptidases são sinônimos utilizados para as
enzimas que catalisam as reações de hidrólise em ligações peptídicas de substratos protéicos
(Lehninger, 2002). As proteases executam uma grande variedade de funções nos organismos vivos,
compreendendo a ativação e a participação de cascatas biológicas, como na digestão, homeostasia e
inflamação em diversos sistemas, sendo imprescindíveis para o perfeito funcionamento celular
(Gavrilescu & Chisti, 2005).
Um tipo particular de proteases são àquelas que apresentam atividade colagenolítica e
que são chamadas de colagenases. Estas enzimas são capazes de degradar tanto moléculas de
colágeno nativo como desnaturado (Tran & Nagano, 2002). Em geral, outras proteases não
digerem a tripla hélice do colágeno, essa degradação só é possível através da ação de enzimas
específicas que requerem íons bivalentes para o desenvolvimento da sua atividade catalítica
sendo, portanto, classificadas como metaloproteases (Goshev et al., 2005).
As enzimas proteolíticas são essenciais em vírus, bactérias, fungos e parasitas para a
sua replicação como também para a propagação das doenças infecciosas (Chou, 2006) e
também estão presentes em vários tecidos de animais, plantas e microrganismos.
Apoio:
53
Apoio:
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Apoio:
55
Apoio:
56
U/mL. A atividade proteásica específica é calculada pela razão entre a atividade proteásica e a
quantidade de proteína contida em 1 mL da amostra (U/mg).
Ação de inibidores
O efeito de substâncias inibidoras da atividade enzimática pode ser realizado
utilizando-se Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 mM como inibidor de
metaloproteases, Fenilmetilsulfonil fluoride 1mM (PMSF) para serino-proteases, Pepstatin A
1 mM para Aspartico-protease e Ácido Iodoacético 1 mM que inibe cisteino-protease. Cada
substância inibidora mantida em contato com a enzima por 30 min à temperatura de 37ºC,
promove-se a reação da atividade proteásica, comparando-se os resultados com o controle
contendo o substrato degradado pela enzima sem acréscimo de inibidor.
Apoio:
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CAPÍTULO 6
ACTINOMICETOS COMO FONTES DE BIOPRODUTOS
Doutor Takeshi Matsuura
Características Gerais
Actinomicetos é o nome genérico atribuído às bactérias do Domínio Actinobactéria,
cuja característica comum é a formação de micélio aéreo e/ou vegetativo em algum estágio de
seu ciclo de vida (McCarthy & Williams, 1990). Estes microrganismos representam um
grande grupo de bactérias ramificadas filamentosas, que formam uma estrutura micelial
semelhante a dos fungos filamentosos. A diferença básica entre estes microrganismos reside
na sua organização celular, na qual os actinomicetos são seres procarióticos, enquanto que os
fungos filamentosos são seres eucarióticos. As características essenciais da natureza
procariótica dos actinomicetos são a ausência de membrana nuclear, a ausência de organelas
citoplasmáticas e a presença de ribossomos 70S. Uma outra diferença comum, é em relação
ao diâmetro das hifas, onde nos actinomicetos, o diâmetro hifal máximo é de 2 µm, enquanto
que nos fungos filamentosos as hifas têm, ao menos, o dobro desta espessura.
Estas bactérias são na grande maioria aeróbias estritas, Gram-positivas com um alto
conteúdo de Guanina e Citosina (G + C), e formam filamentos ramificados ou hifas que
podem persistir como um micélio estável ou podem quebrar-se em elementos em forma de
bacilos ou em forma de cocos.
Distribuição e Ocorrência
Os actinomicetos ocorrem em uma grande diversidade de habitats naturais e artificiais,
crescendo em uma vasta variedade de substratos. O solo é o habitat mais comum para os
actinomicetos e estima-se que se encontram numa proporção de aproximadamente 1 milhão
de células por grama de solo. Embora a maioria seja saprófita estrito, alguns formam
associações parasíticas ou simbióticas com plantas ou animais.
Apesar do solo ser o principal habitat para os actinomicetos, estes também são
encontrados na água, em tecidos vegetais e em tecidos animais. A ubiqüidade dos
actinomicetos sapróbios em ambientes naturais é devido a dois fatores principais que são: a
diversidade metabólica e a evolução de mecanismos específicos de dispersão.
Apoio:
58
O fato de que os actinomicetos estão tão bem adaptados para o crescimento sobre
substratos sólidos sugerem que sua ocorrência em ambientes aquáticos é meramente o
resultado de uma “lavagem”, mas para muitos taxa há evidências de crescimento sobre
material suspenso ou sedimentado.
A evidência atual sobre a atividade dos actinomicetos em ambientes naturais mostra
claramente que eles estão envolvidos em importantes processos em vários habitats, que
podem ser assim resumidos:
• degradação de plantas, animais e polímeros microbianos em solo e feno;
• degradação de hidrocarbonetos petrolíferos e outros produtos manufaturados em
ambientes terrestres e aquáticos;
• degradação de compostos, forragens e materiais correlacionados;
• indução de alergias respiratórias, particularmente entre trabalhadores da
agricultura;
• causadores de doenças de plantas;
• controle biológico de patógenos rizofílicos;
• fixação biológica do nitrogênio em nódulos de plantas não leguminosas;
• produção de sabor e odor em águas potáveis naturais.
Considerações Taxonômicas
Filogeneticamente, as bactérias Gram-positivas são divididas em 2 grandes grupos,
com maior ou menor proporção de Guanina + Citosina (G + C). O grupo com maior
proporção, 69-78%, são os actinomicetos e o grupo com menor proporção inclui os gêneros
Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus e
Mycoplasma.
Para a identificação genérica de um actinomiceto, são necessários dois estudos, os
estudos da micromorfologia, através de microscopia ótica e os estudos químicos.
Os melhores meios para a observação da morfologia dos actinomicetos são os meios
que contém nutrientes como hidrolisados de caseína, extrato de levedura ou amido.
As estruturas morfológicas utilizadas para diferenciar os gêneros de actinomicetos são:
presença de micélio aéreo e/ou micélio vegetativo; formação de conídios isolados, aos pares,
em cadeias curtas ou em cadeias longas; presença ou ausência de esporângios contendo
Apoio:
59
Apoio:
60
BIBLIOGRAFIA
HOLT, J. G., KRIEG, N. R., SNEATH, P. H. A., STALEY, J. T. & WILLIAMS, S. T. Bergey’s manual of
determinative bacteriology. 9. ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1994.
Apoio:
61
CAPÍTULO 7
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA DE IMOBILIZAÇÃO
Doutor Michele Vitolo
1. INTRODUÇÃO
Como é do conhecimento geral, o ambiente celular (volume da célula ≈ 10-12mL) é
muito pequeno, obrigando as milhares de substâncias existentes em seu interior a interagirem
entre si.
Lembra-se, também, que das milhares de enzimas conhecidas até agora, a maioria
acha-se ligada a estruturas membranosas intracelulares.
Enfim, em seu habitat natural, que é o interior da célula, e onde apresentam suas
maiores atividades catalíticas, as enzimas atuam como catalisadores heterogêneos, ou seja, na
forma pouco solúvel.
Baseados neste fato, os pesquisadores resolveram mimetizar esta situação, através da
ligação da enzima a um material inerte por meio de métodos físicos e/ou químicos.
A técnica da imobilização, embora já tentada em 1916 por Nelson e Griffin
(imobilização da invertase em carvão ativo), adquiriu impulso a partir dos anos 60. Evoluiu
tanto que várias enzimas imobilizadas são encontradas no comércio atualmente. A glicose
isomerase imobilizada (SweetzymeR) – só para citar um exemplo - é usada na produção do
xarope de frutose a partir da glicose oriunda da hidrólise do amido.
Além das enzimas, imobilizam-se, também, células, organelas e fármacos.
2. TIPOS DE IMOBILIZAÇÃO
2.1. Aprisionamento (bom para imobilizar enzimas de alta massa molecular e células)
O aprisionamento consiste em separar o biocatalizador do meio reacional por meio de
um envoltório semipermeável. O material da película envolvente deve possuir porosidade
adequada para reter o biocatalisador e, ao mesmo tempo, deixar a passagem livre para
moléculas de baixa massa molar.
A imobilização por aprisionamento tem como vantagens principais, a saber, o mesmo
processo pode ser usado para imobilizar enzimas, células ou organelas; facilidade de
preparação da membrana envolvente semipermeável; a disponibilidade no mercado dos
materiais para confeccionar o suporte; o biocatalisador uma vez envolto pela membrana fica
protegido do ataque de hidrolases (sobretudo de proteases) e/ou de inibidores de alta massa
Apoio:
62
2.1.1. Enredamento
Através da polimerização de um monômero adequado em presença da enzima, o
catalisador acaba ficando retido entre as malhas do polímero solidificado. O suporte mais
usado é a poliacrilamida, obtida através da reação entre a acrilamida e a N,N-metileno-
bis(acrilamida). Pode ser considerado um método simples e aplicável para muitas enzimas.
De um modo geral, o procedimento consiste na dissolução da enzima em um tampão
contendo acrilamida (monômero) e a bisacrilamida (agente formador de ligações cruzadas),
sendo a polimerização iniciada por radicais livres gerados pela irradiação de UV na mistura,
após a adição de persulfato de amônio ou uma mistura de água oxigenada e sulfato ferroso.
A polimerização pode causar dois riscos à enzima. Primeiro, os monômeros e os
radicais livres podem reagir com grupos essenciais para a catálise provocando a inativação da
proteína e/ou da enzima. Segundo, a desnaturação pode ser provocada pelo calor gerado
durante a reação. Alfani et al., (1) contornaram o problema do superaquecimento, executando
a polimerização entre duas placas de vidro vedadas com tiras de silicone e mergulhadas em
banho de água a 5oC e irradiadas com UV, adaptando-se a lâmpada bem próxima à superfície
do banho. Um modo alternativo, seria conduzir a reação em sistema emulsionado de água em
solvente orgânico, sendo este último o responsável pela absorção do calor gerado. Neste caso,
o tamanho das gotas de água determinariam o tamanho das partículas de gel formadas (2).
Uma outra forma de reduzir a intensidade do calor gerado durante o aprisionamento
consiste no uso de um oligômero como reagente no lugar do monômero. Uma maneira de se
fazer isto é usar um prepolímero fotopolimerizável por UV como o dimetacrilato de
polietilenoglicol. O gel resultante é estável mecanicamente e inerte do ponto de vista químico.
Grupos funcionais extras podem ser introduzidos nos prepolímeros. Um método baseado na
mesma idéia é o uso de prepolímeros de uretano que se polimerizam em água liberando gás
carbônico, formando-se uma espuma de poliuretano, em cujo reticulado a enzima fica retida.
As propriedades finais do suporte são variadas através da escolha adequada do prepolímero de
Apoio:
63
2.1.2. Encapsulamento
Diversos polissacarídeos naturais, tais como alginato, agar e k-caragena, geleificam
sob certas condições e servem para aprisionar biocatalisadores em geral.
O alginato de sódio (copolímero linear dos ácidos D-manurônico e L-gulurônico), que
é solúvel em água, é misturado com uma solução ou suspensão contendo o biocatalisador,
sendo, a seguir, gotejada sobre uma solução de íon bivalente (Ca2+, Ba2+). Tão logo a mistura
contendo alginato entra em contato com a solução de íon bivalente forma-se um gel dentro do
qual o biocatalisador fica retido. O único cuidado, que deve ser tomado ao se usar um sistema
destes, é garantir a inexistência de agentes quelantes (fosfato, EDTA) no meio de reação, pois
na presença deles o gel vai se desarranjando e o biocatalisador acaba por se desprender e se
solubilizar. È um método de imobilização muito usado, por causa da sua simplicidade,
condições brandas de geleificação e a ampla disponibilidade do alginato de sódio no mercado.
A k-caragena é outro polissacarídeo de origem algal, hidrossolúvel e que gelifica ao
entrar em contato com íons K+ e NH4+. Caso na solução de caragenato tenha sido adicionado
um biocatalizador, este ficará retido no interior do gel. O enrijecimento adicional do gel pode
ser conseguido, adicionando-se glutaraldeído e/ou hexametilenodiamina, os quais podem,
também, contribuir na estabilização do biocatalisador.
2.1.3. Microencapsulamento
Enzimas podem ser imobilizadas em microcápsulas formadas por membranas
poliméricas permeáveis a substâncias de baixa massa molar e impermeáveis à enzima.
Basicamente há dois métodos de microencapsulamento. Em um deles o sistema emulsionado
é obtido pela mistura da solução aquosa da enzima com uma solução do polímero (nitrato de
celulose, etilcelulose, poliestireno, acetato de polivinila, por exemplo) em solvente orgânico.
A seguir, adiciona-se à mistura um segundo solvente, que causa a precipitação do polímero na
interface entre a microgota de água (onde a enzima se encontra) e a fase orgânica contendo o
Apoio:
64
2.2.1. Adsorção
A adsorção consiste na adesão de um material biológico à superfície de um suporte
não funcionalizado especificamente para formar ligação covalente.
Apoio:
65
Apoio:
66
Apoio:
67
resíduos de aminoácidos da proteína, tais como amino, guanidino, indol, imidazol e tiol. Os
amino grupos originais só interagiriam com os grupos carboxila da proteína. Por isso, um
número maior de interações tornou-se disponível na quitina tratada. Dentre os vários
exemplos disponíveis pode ser citada a adsorção da β-amilase da soja sobre fenilborato-
agarose (4).
A interação hidrofóbica pode ser melhorada introduzindo-se na proteína cadeias
laterais de caráter hidrofóbico, como a metil-4-fenil-butirimida.
A estabilidade da enzima adsorvida pode ser melhorada através da criação de ligações
cruzadas adicionais, usando-se um reagente bifuncional, como o glutaraldeído. Rucka e
Turkiewicz (5) estabilizaram a lípase em membrana de politetrafluoroetileno através do
entrelaçamento com glutaraldeído, sendo este, um método barato, atóxico e de fácil execução.
O glioxal e o formaldeído, também, podem ser usados. A atividade antimicrobiana destes
compostos é útil na sanitização do sistema imobilizado durante o uso. Este tipo de processo de
imobilização, pode ser considerado do tipo misto, no qual parte da proteína estaria adsorvida e
parte ligada covalentemente ao suporte.
Finalmente, deve-se lembrar que uma ampla variedade de suportes tem sido usada na
imobilização por adsorção, dentre eles citam-se: alunina arenosa, amberlite CG-50, bentonite,
gel de fosfato de cálcio, carvão ativo, CM-celulose, CM-sephadex, colágeno, DEAE-celulose,
DEAE-Sephadex, vidro com porosidade controlada, sílica gel, quitina, quitosana e agarose.
Apoio:
68
brandas de temperatura (no máximo igual à do meio ambiente) por um dado tempo, a fim de
que as ligações covalentes entre o suporte e a enzima se estabeleçam.
O uso da ligação covalente para imobilizar enzimas possui como vantagens, a saber, a
ligação forte entre a enzima e o suporte; a fácil interação enzima/substrato devido à
localização superficial do catalisador; o aumento da termoestabilidade em decorrência da forte
interação com o suporte; o aumento da estabilidade operacional (por exemplo, resistência às
forças de cisalhamento), tornando mais flexível a escolha do reator a ser empregado.
Entretanto, as desvantagens apresentadas por este tipo de imobilização, também,
devem ser lembradas: a susceptibilidade de estruturas ativas da macromolécula aos reagentes
utilizados e/ou às tensões conformacionais impostas pela união forçada a um material
estranho (suporte); a atividade catalítica pode diminuir devido à forte ligação existente entre o
suporte e a enzima, podendo, por exemplo, tolher ao catalisador a capacidade de assumir
modificações estruturais adequadas, que favoreçam o encaixe perfeito do substrato em seu
sítio ativo; dificuldade de se estabelecer as melhores condições de imobilização; não é
adequada para imobilizar células; os suportes usados não são recuperáveis com facilidade.
Este tipo de imobilização pode ser escolhido no caso em que a enzima for cara e
termolábil. Em geral, as enzimas utilizadas em métodos analíticos enquadram-se nesta
situação.
O contato covalente entre o suporte e a enzima pode ser feito segundo inúmeras vias
de síntese orgânica, citando-se, dentre elas, a diazotação, a reação com brometo de
cianogênio, a condensação, a alquilação, a silanização e os derivados azídicos.
Apoio:
69
azo em ambos os extremos da molécula, reage com grupos fenilas livres presentes na enzima
e com grupos amino existentes no suporte.
O reativo bifuncional pode ser adicionado tanto à enzima previamente adsorvida no
suporte, quanto à enzima livre com posterior adsorção ao suporte. Outra possibilidade, seria
misturar primeiro o suporte com o regente bifuncional, seguida da adição da enzima.
Finalmente, merece lembrança a possibilidade de se ligar a enzima a um polímero que
é solúvel nas condições de ação da enzima, mas que se torna insolúvel quando uma das
condições de reação é modificada, sobretudo o pH. Takeuchi e Makino (6) imobilizaram por
intercruzamento a celulase com o ácido poli-L-glutâmico, o qual é solúvel em pH 4,5 mas
insolúvel em pH 3,0.
3. SUPORTES
Muitos materiais sólidos ou geliformes podem ser usados como suportes para a
imobilização. Os requisitos básicos para um material ser considerado um suporte adequado
são: a) as características físicas do suporte devem ser adequadas para uso no reator
selecionado; b) manter a estabilidade química e mecânica sob as condições operacionais; c)
conter grupos químicos capazes de se ligarem ao biocatalisador; d) o material constituinte do
suporte deve permitir a obtenção de partículas com dimensões variadas, a fim de que se possa
alcançar um ponto de equilíbrio entre a redução de efeitos difusionais e a operacionalidade do
reator, sobretudo quando este for do tipo leito fixo; e) porosidade compatível com as
dimensões do biocatalisador a ser imobilizado; f) resistência aos microrganismos; g)
estabilidade térmica; h) permitir a regeneração.
Como se depreende do item anterior a diversidade e as características dos suportes são
muito variadas, sendo a origem dos mesmos tanto inorgânica quanto orgânica. Grosso modo e
de acordo com a morfologia, eles podem ser divididos em suportes não porosos e porosos.
Estes últimos, por sua vez, podem ser sólidos de porosidade controlada (poros com diâmetros
homogêneos e distribuídos regularmente pela superfície do material) ou irregular (poros com
diâmetros heterogêneos) ou ainda, géis semi-permeáveis (estrutura reticular, película
envolvente ou copolímeros).
Em conjunto com a morfologia básica do suporte, pode-se usar uma variedade de
configurações, a saber, pós, fibras, membranas, dentre outras.
Os suportes não porosos apresentam como principal vantagem a acomodação das
moléculas de enzima, apenas, na sua superfície externa, o que facilita a interação do
Apoio:
70
catalisador com o substrato. No entanto, a pequena área superficial apresentada por estes
suportes é sua mais notória desvantagem, embora possa ser minimizada, usando-se material
com alto grau de cominuição. Contudo, ainda neste caso, poderão persistir problemas
relacionados à remoção das partículas do meio reacional e/ou à limitação da razão de fluxo no
reator.
O suporte poroso, por sua vez, possui grande área superficial, desde que a distribuição
das moléculas protéicas se dá tanto na face externa quanto interna dos poros. Grupos químicos
carregados localizados dentro dos poros poderão facilitar ou dificultar a catálise, dependendo
se o substrato é ou não ionizável nas condições de reação. Este fato poderá ser capitalizado
favoravelmente para a catálise através de um planejamento adequado, levando em conta os
tipos de enzima e do reator a serem empregados. Deve ser lembrado que problemas
difusionais podem surgir ao se usar suporte poroso, pois o substrato além da solução para a
superfície do suporte, deverá difundir-se, também, através dos poros, porque boa parte das
moléculas do catalisador estão situadas no interior dos mesmos. Aliás, o peso molecular do
substrato passa a ser um fator decisivo no rendimento da reação. Entretanto, a localização
interna da enzima confere-lhe uma proteção maior frente à eventual turbulência no meio de
reação.
Outro ponto a ser considerado relaciona-se à estabilidade dimensional do material
constituinte do suporte, ou seja, se é rígido (inorgânico) ou elástico (orgânico). A estrutura
rígida tem como vantagens a não deformação da matriz quando compactada em reatores do
tipo coluna, a proteção da enzima contra forças de cisalhamento e colaborar na manutenção da
estrutura terciária da proteína. O suporte elástico oferece a vantagem de poder ser empregado
sob a forma de membranas finas, possuindo grande área superficial e oferecendo baixa
resistência difusional. Contudo, devido a sua flexibilidade pode sofrer deformações durante o
uso e com isto afetar a estrutura conformacional da enzima.
Finalmente, o interesse crescente pelas biotransformações tem promovido um aumento
na disponibilidade comercial de suportes e de agentes ativadores e bifuncionais. Para a
imobilização por ligações covalentes dispõe-se para a aquisição, dentre outros, dos produtos:
caolin ativado com glutaraldeído (Biofix®), poliacrilamida derivatizada (Enzacryl®), vidro de
porosidade controlada (Glycophase®), kieselguhr ativado com glutaraldeído (Macrosorb®) e
Sepharose®. A vantagem de se dispor destes materiais já prontos, reside no fato de ser
desnecessário usar métodos de ativação, que em geral empregam reagentes tóxicos. Um
Apoio:
71
exemplo importante é a Sepharose ativada com BrCN, a qual vem sendo usada há anos como
suporte para imobilização.
A escolha do método de imobilização dependerá, basicamente, de dois fatores:
a) características do biocatalisador, que governará a escolha do tipo de imobilização; b)
destino que será dado ao sistema imobilizado.
Não existe um binômio suporte/tipo de imobilização geral, o qual só poderá ser
estabelecido empiricamente. Contudo, o empirismo nesta área tenderá a diminuir à medida
que uma área recentemente criada, a engenharia de proteínas, for sendo desenvolvida e
aprimorada.
Apoio:
72
f = v’/v (1)
A eq. (4) poderá ou não representar uma relação linear, porque “f” é função da
concentração do substrato.
Existem basicamente dois tipos de resistências difusionais:
a) Resistências difusionais externas: surgem devido ao fato de que o substrato deve ser
transportado do seio da solução até a superfície de catálise, devendo, por conseguinte,
atravessar uma camada líquida. É claro que a transformação do substrato somente ocorre após
o mesmo ter alcançado a superfície do catalisador, sendo que o consumo de substrato através
da membrana líquida pode ser imaginado como resultado de um gradiente linear. Estes efeitos
podem ser minimizados quer aumentando-se a agitação da suspensão quer aumentando-se a
velocidade de fluxo do substrato;
b) Resistências difusionais internas: surgem devido à movimentação do substrato no interior
do meio catalítico poroso. Neste caso a difusão ocorre simultaneamente com a reação, o que
provoca um comportamento não linear das variações dos gradientes de concentração do
substrato no interior do sistema imobilizado.
Apoio:
73
4.4. Partição
O comportamento cinético de uma enzima presa a um suporte carregado pode diferir
daquele apresentado pela enzima livre, mesmo que os efeitos difusionais estejam ausentes.
Este comportamento pode ser atribuído ao fato de que a concentração de espécies químicas
(substrato, íons, produto,...) nas proximidades da enzima é diferente daquela do resto da
solução, devido às interações eletrostáticas daqueles elementos com as cargas do suporte. O
efeito de partição pode ser tido como um exemplo dos efeitos da circunvizinhança.
ψ)
(ψ
A linha tracejada verde representa a fronteira entre a
E região dentro da qual as moléculas de enzima (E) estão
próximas ao suporte eletricamente carregado (ψ) e o seio
da solução. As grandezas representadas em vermelho
referem-se àquelas relacionadas ao ambiente
(microambiente) dentro do qual as moléculas de enzima
se encontram e as representadas em azul àquelas
relacionadas ao seio da solução. Os círculos
amarelos representam a espécie química (íons
hidrônio e/ou moléculas de substrato
ionizadas)
Apoio:
74
Apoio:
75
5.2. Desvantagens
a) União aleatória do suporte com a enzima;
b) Inexistência de um método geral de imobilização;
c) Alto grau de pureza da enzima a ser imobilizada;
O importante a destacar é o fato de que quando a imobilização funciona bem,
consegue-se reduzir o custo global de um processo industrial em até 50%.
6. APLICAÇÕES
6.1. Reatores Enzimáticos
6.1.1. Introdução
Define-se biorreator como sendo um reator químico convencional adaptado para
operar com biocatalisadores (células, enzimas, organelas). O reator enzimático, portanto, é um
biorreator onde a reação é catalisada por uma enzima.
A primeira questão que surge ao se pensar em empregar um biorreator em um
determinado processo é avaliar a conveniência de se utilizar a enzima isolada no lugar da
célula da qual a enzima foi obtida. Para tanto, devem ser considerados os aspectos: a)
formação ou não de subprodutos pelas células; b) o produto de interesse ser ou não
consumido pela célula; c) os custos relacionados com o isolamento, produção e, eventual
imobilização da enzima; d) a origem da enzima, se extracelular (mais barata e disponível em
Apoio:
76
Apoio:
77
RA (Kg/h)
So
VB S M
RS (Kg/h)
Sejam:
Integrando:
t = (x.S0/Vmax) – (KM/Vmax). Ln (1 – x) (11) (Equação de processo)
Apoio:
78
x’e x’S
x’ (x’+dx’)
Sejam:
RA – RS – RC = 0 (12)
Sabendo que:
RA = A. XS - A.x’
RS = A.XS - A. (x’+ dx’)
RC = v. dVR
E substituindo na Eq. (12):
(dVR / A) = dx’/ v
x'
VR / A = ∫ dx' / v (13) (Eq. de projeto)
0
Integrando:
tr = (x.S0 / Vmax ) – (KM / Vmax). Ln (1 – x) (15) (Equação de processo)
Apoio:
79
Apoio:
80
Sem dúvida alguma o advento dos eletrodos enzimáticos é uma das mais notórias
aplicações da técnica de imobilização. Porém, a despeito dos grandes avanços alcançados nos
dias de hoje, sobretudo no que se refere à vertente eletrônica do dispositivo, ainda, existem
vários problemas a serem contornados, a saber, custo elevado das enzimas puras; enzimas que
requerem cofatores são de uso limitado; falta de sensores eletroquímicos adequados para a
maioria das substâncias; vida útil curta do eletrodo; os eletrodos de pH são muito sensíveis às
variações do tamponamento do sistema em reação e à presença de cátions monovalentes; e, os
eletrodos sensíveis ao oxigênio podem não funcionar bem, nos casos em que a pO2 não é
saturante no decorrer do processo.
Sensor eletroquímico
Superfície sensível do
Enzima imobilizada
S Membrana
semioermeável
P
6.3. Enzimaimunoensaio
Esta técnica explora a já conhecida reação antígeno-anticorpo, onde a enzima é
utilizada como marcador. O teste torna-se quantitativo devido à distribuição da enzima entre a
forma combinada (Anticorpo-enzima-antígeno) e a livre (anticorpo-enzima ou antígeno-
enzima). Este método é análogo a outros testes de imunoensaio (radioimunoensaio,
imunofluorescência, etc.), apresentando as seguintes vantagens: a) ensaio sensível e
específico; b) reagentes estáveis durante o armazenamento; c) manipulação simples; d)
ensaios rápidos; e) uma etapa de separação pode ser desnecessária; f) como há variedade de
marcadores, podem ser feitos ensaios simultâneos; g) automatização.
Apoio:
81
Ei H Ea H
H
H
O primeiro ensaio deste tipo consistiu no uso da lisozima (EC.3.2.1.17) para dosar morfina. A
lisozima foi modificada pela introdução em sua estrutura de um hapteno [H], que era um
análogo estrutural da morfina, sendo, a seguir, posta em contato com o Ac normal da morfina.
Apoio:
82
7. BIBLIOGRAFIA
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sucrose processing. Annals of the New York Academy of Sciences, v.542, p.346-350, 1988.
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GODFREY, T., WEST, S. Industrial Enzymology. 2nd Ed., New York, MacMillan Publishers Ltd., 1996.
Apoio:
84
CAPITULO 8
ENZIMAS NA MODIFICAÇÃO DE MATERIAIS AMILÁCEOS E PROTÉICOS
Doutor Michele Vitolo
1. MATERIAIS AMILÁCEOS
1.1. INTRODUÇÃO
Quando se deseja modificar um material amiláceo por via química ou enzimática,
deve-se lembrar que é o grânulo de amido o componente a ser modificado.
O grânulo de amido possui como características: a) composição: os principais
componentes são a amilose (15-30%) e a amilopectina (70-85%), que estão intimamente
ligadas através de pontes de hidrogênio, dando estrutura compacta ao grânulo. A amilose é
um polímero formado por moléculas de glicose dispostas linearmente e ligadas entre si
através de ligações osídicas do tipo α-1,4. Uma solução de amilose em presença de iodo
adquire cor azul. A amilopectina, por sua vez, é um polímero ramificado da glicose. A cadeia
principal é formada por moléculas de glicose unidas por ligações osídicas α-1,4, ao passo que
nos pontos de ramificação – que se sucedem, em média, a cada vinte moléculas de glicose da
cadeia linear – a ligação osídica é do tipo α-1,6. Uma solução de amilopectina na presença de
iodo adquire cor avermelhada; b) bi-refringência; c) forma e tamanho dependentes da origem
do cereal.
O amido pode ser modificado com menor ou maior intensidade, dependendo do
produto final desejado. Na panificação procura-se modificar o amido ligeiramente, enquanto
que na produção de xaropes o amido é modificado intensamente.
1.2.2. ENZIMAS
1.2.2.1. Amilases
1.2.2.1.1. α-amilase
Apoio:
85
1.2.2.2. Proteases
Fontes: B.subtilis, A. oryzae, A. niger
Atividade Proteolítica (Anson Unit, AU): 1AU é a quantidade de enzima que sob condições
do teste libera 1 µmol/min de aminoácidos Folin-positivos (tirosina).
1.2.2.3. Outras
1.2.2.3.1. Lipoxidase: usada para branquear o miolo do pão. Usualmente usa-se a farinha de
soja desengordurada (0,5% de farinha desengordurada em relação ao peso total de farinha
usada para fazer a massa).
Apoio:
86
-Farinha + água
“Before Baking”
-levedura (2,5%)
-enzimas - Farinha + água (40%)
- sal (20%)
- açúcar (8%)
- gordura/manteiga
massa
1. Sovar(kneading) Fermentar: 20´
2. Fermentar 30°C/3-5h
55´a 42ºC
massa Subdivisão
moldagem Forno
enformar
“Baking”
HS - S---S
S---S
S---S
S---S
-SH
Apoio:
87
P4/4
2.Baking
180 Roasting products
Crust formation
160
Caramel formation
140
Light browning (reação de Mailard)
120 (sabor/aroma aparecem)
100 Evaporation of water
T (oC)
Crumb formation
Evaporation of ethanol
80 Gelatinization of starch
Denaturation of enzymes
60 Inactivation of yeast
40
Fermentation of the dough
20
0 Retarted dough
Frozen dough
-20
1.2.3.2. α-amilases
1.2.3.2.1. Efeitos desejáveis a serem conseguidos
a) Formação de açúcar e velocidade de fermentação
Apoio:
88
18 100 90 90 70
42 141 125 130 73
66 190 155 162 75
90 240 175 183 79
114 240 220 218 80
Apoio:
89
600
400
200
0
0 1 2 3 4 5
Extensibilidade
Protease bacteriana (1x104HU)
Protease fúngica (1x105 HU)
Massa sem protease
Protease fúngica(1x106 HU)
1.2.3.3. Proteases
Usadas com o objetivo de influir na extensibilidade da massa, tornando-a adequada
para uso em laminadores. A adição é obrigatória porque o pH da massa sendo em torno de
7,0 não é o mais adequado para a atividade das proteases originalmente presentes na farinha
(pH= 4,0). Além disso, nos pães salgados costuma-se usar 3% de sal, que inibe as proteases
naturais da farinha.
Apoio:
90
1.2.5. PERSPECTIVAS
Espera-se um aumento na intensidade de uso das proteases, devido ao fato de que as
farinhas disponíveis no mercado estão cada vez mais ricas em proteínas. O aparecimento de
pentosanases em grandes quantidades é, também, uma perspectiva nesta área, pois o “staling”
é um fenômeno danoso para os produtos de panificação.
De um modo geral, o uso de enzimas em panificação tende a aumentar, por causa dos
rigores da legislação alimentícia no que se refere ao uso de farinhas modificadas por via
química (remoção de pigmentos, por exemplo).
Apoio:
91
AMIDO
Gelatinização
PASTA DE AMIDO
MALTO-DEXTRINAS
OLIGOSSACARÍDEO
(Sacarificação)
Xp de Xp Misto
Maltose
Xp de Glicose
(Isomerização)
Xp de Frutose
Na Tabela 1 são indicados os usos mais comuns dos produtos oriundos da hidrólise do
amido.
Apoio:
92
Merece destaque que as maltodextrinas – além dos usos apontados na Tabela 1 – estão
sendo usadas para microencapsular sais de ferro para incorporação no sal de cozinha,
tornando este produto, que já é enriquecido com iodo, também uma fonte adicional de íon
ferroso para o organismo, com o objetivo de reduzir a incidência da anemia, sobretudo, em
crianças mal-nutridas do terceiro mundo (MARTINDALE, 2008).
H2O
misturar
Aquecimento*
1.3.2.2. Liquefação
A liquefação pode ser feita por via ácida (solução aquosa de HCl à 75o C) ou por via
enzimática (α-amilase bacteriana termoresistente).
O grau de liquefação do amido é expresso em Equivalente em Dextrose (DE), que
consiste em se comparar o poder redutor do amido liquefeito frente à uma solução de dextrose
pA (tomada como 100%).
1.3.2.3. Sacarificação
É a etapa que se segue à liquefação, sendo executada com glicoamilase de A.niger e/ou
α-amilase fúngica.
Apoio:
93
1.3.2.4. Isomerização
É a última etapa do processamento do amido, quando se deseja obter um xarope
contendo frutose. A isomerização é um processo contínuo no qual se emprega a
glicoseisomerase imobilizada.
A produção de xaropes contendo frutose teve início nos anos 70, permitindo aos países
não produtores de sacarose a partir da cana-de-açúcar ou beterraba, disporem de um adoçante
comparável ao açúcar invertido e, proveniente, em última análise, de materiais amiláceos.
A glicoseisomerase (GI) atua conforme o esquema:
k1 kp
GI + GLICOSE GLICOSE-GI GI + FRUTOSE
k-1 k-p
GI-FRUTOSE
Apoio:
94
1.3.4. PERSPECTIVAS
Neste setor as perspectivas resumem-se nos aspectos: Melhoramento das
características da GI imobilizada; Disponibilidade de α-amilase termoestável (T > 105o C);
Disponibilidade de glicoamilase imobilizada; e Disponibilidade de enzimas desramificantes
mais puras e termoresistentes
2.1. Introdução
As proteínas são polímeros de aminoácidos e que podem ser hidrolisadas pelas
proteases.
A modificação enzimática de proteínas é feita pelo homem há milhares de anos,
considerando-se a fabricação do couro a partir da pele de animais (curtume).
A modificação de proteínas objetiva o aumento do valor agregado da proteína animal e
vegetal, e o aproveitamento de resíduos industriais ricos em proteínas.
Apoio:
95
2.4. FONTES
As proteases são obtidas a partir de microrganismos, animais e vegetais.
Apoio:
96
P2/4
Proteases vegetais
N°lig
Enzima Fonte Tipo pH* T** (°C)
rompidas ***
5-7
Ficina F. glabrata Sulfidril. 50 4
5-7
Bromelina abacaxi Sulfidril. 50 -
P3/4
Proteases animais
N°lig
Enzima Fonte Tipo pH* T** (°C)
rompidas ***
3,5-6,5
Quimosina Bezerro Ácida 45 2
Apoio:
97
Neutra 4,5-7
A. oryzae ? 45 9
fúng.
Alkal.
A. oryzae ? 8-9 45 5
Fúng.
Rennet M. mighei ? - 55 2
Neutra
B. subtilis metaloprotease 5-7,5 50 6
bact.
B.
Alkal. Bact. serínica 8-9 55 7
liguiniformis
*Nesta faixa de pH a enz. apresenta mais de 80% da ativ. hidrolítica.
**A esta T a ação da enz foi mantida por no máximo 4h.
*** Ação hidrolítica sobre a cadeia β oxidada da insulina
Apoio:
98
Apoio:
99
pH 4,5 pH 8,0
(1)
1.inat.enzim 1.inat.enz.
2.pH 7,0 2.pH 7,0 (ajuste) ultrafiltrado
3.spray-drying 3.spray-drying
(1) Lavado 3x
c/água
acidulada
Derivado hidrolisado de soja
Tradicional Membrana
Apoio:
100
•(S)=8%
Hidrólise •E/S= 0,02 (Alcalase®)
Tanque agit. •50-55°C; pH 8,0
•GH=10;
Inativação enzimática •t~2h;
Centrifugação •Ác. Orgânico (pH 4,2)
Resíduo Sobrenadante
NEUTRASE
GORDURA.............20%
(0,5% p/V)
CONC. DE SOJA....15% EMULSÃO
PÓ DE SORO..........55% pH 6,6
CASEINATO DE Na...9%
SAIS MINERAIS......1%
Apoio:
101
Homogeinado
de levedura
30°C/ pH 9,0
Centrifugação Resíduo
Sobrenadante
70°C/min; pH 6,0
Centrifugação Sobrenadante
Massa de levedo
Protease
pH8,0; 50°C; 30 min
1. Inativação 80°C/5 min;
2. Ajustar pH a 7,0;
3. Secar
Proteína funcional de levedura
Tratamento de colágeno
1g alcalase/L
(~200% p/p)
pH 9,0
Agitação a 25°C
por 6 e 24h
decantar
Extração da gelatina
70°C (pH 6-7)
Apoio:
102
Separação I Spray-drying
Torta I
Água Separação II Sangue descolorido
Torta II
Porção colorida
H 2O
0SS0S MOÍDOS HIDROLISADO
Decantar
o R
60 C/4h Alcalase
(0,3% em relação ao peso Total)
SOBRENADANTE
98O C/10min
PRODUTO FINAL
Apoio:
103
Macerado Hidrolisado
(pH 6,5) ↓ Fosfo-protéico
GH=5%
Lavagem com
H2O:2x
H2O H2O
Isopropanol
Centrifugação Centrifugação 50°C, 5´ (1:1)
↓Fosfo-protéico ↓Fosfo-protéico
Ajustar pH 7,0 desengordurado lavado
Spray-drying
Suspensão aquosa
concentrado ↓Fosfo-protéico Proteína de peixe
desengordurado
Apoio:
104
Apoio:
105
k- Quimosina
caseína
Ca+2 Ca+2
PO43-
(Micela)
octapeptíd
eo
p-k-caseína coágulo
Apoio:
106
2.10.2.3. Proteases
As proteases são usadas com o objetivo de influir nas propriedades organolépticas
(aroma e sabor) do queijo (tipo curado), que por sua vez dependem das quantidades relativas
de aminoácidos e de ácidos graxos na massa do produto.
2.10.2.4. Lípases
As lípases, também, influem nas características finais do produto.
2.10.2.5. Lactase
A lactase é uma enzima que hidrolisa a lactose do leite em glicose e galactose. As
principais fontes são as leveduras (Kluyveromyces fragilis, K.lactis) e os fungos (A.niger,
A.oryzae). Dependendo da origem a lactase tem aplicações diferenciadas, pois a de levedura,
cujo pHótimo está entre 6,0 e 7,0, é útil para deslactosar o leite (pH ≅ 6,8), enquanto que a
fúngica (4,0 ≤ pHótimo ≤ 5,0) é adequada para deslactosar o soro de leite (pH ≅ 4,5).
Algumas das aplicações da hidrólise da lactose em derivados do leite são:
a) A deslactosação do leite líquido ou em pó permite que o mesmo seja ingerido por
pessoas deficientes em lactase. Além disso, no caso de leite aromatizado aumenta o
índice de dulçor e realça o sabor deste produto;
b) Reduzir o tempo de fermentação de produtos lácteos fermentados;
c) Evitar a cristalização da lactose em sorvetes e leite condensado. Lembra-se que a
lactose na concentração da ordem de 12% em relação aos sólidos totais do leite (por
ex., desnatado) cristaliza com facilidade. Ao se reduzir em 50% o teor de lactose do
leite desnatado, este pode ser usado em maior quantidade nas formulações,
possibilitando a redução na quantidade de estabilizantes a serem adicionados, já que
esta função pode ser desempenhada pelas proteínas do próprio leite. Além disso,
estando a lactose hidrolisada o leite tem o número de moléculas livres aumentado, o
que colabora no abaixamento crioscópico da solução, quando o mesmo é usado em
formulações de sorvetes;
Apoio:
107
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A. Biotecnología Industrial: Biotecnología na
Produção de Alimentos. São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol. 4. 523p.
BON, E.P.S., FERRARA, M.A., CORVO, M.L. Enzimas em Biotecnologia. Rio de Janeiro, Editora
Interciência LTDA, 2008.
BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E. Biotecnología Industrial: Fundamentos.
São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol. 1. 251p.
Apoio:
108
FOGARTY, W.M. & KELLY, C.T. Microbial enzymes and biotechnology. 2nd Ed., New York, Applied
Science Publishers, 1990.
GODFREY, T. & WEST, S. Industrial enzymology. 2nd Ed., New York, MacMillan Publishers Ltd., 1996.
LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W. Biotecnología Industrial: Processos
Fermentativos e Enzimáticos. São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol. 3. 593p.
MARTINDALE, D. Uma pitada de nutrição. Scientific American Brasil, v.6, n.69, p.13-14, 2008.
NAGODAWITHANA, T. & REED, G. Enzymes in food processing. 3rd Ed., San Diego, Academic Press,
1993.
SAID, S., PIETRO, R.C.L.R. Enzimas como agentes biotecnológicos. Ribeirão Preto, Leggis Summa, 2004.
SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W. Biotecnología Industrial: Engenharia
Bioquímica. São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol. 2. 541p.
Apoio:
109
CAPÍTULO 9
ENZIMAS EM BEBIDAS ALCOÓLICAS E NÃO ALCOÓLICAS
Doutor Michele Vitolo
O grande avanço neste tipo de indústria se deu quando microrganismos selecionados foram
cultivados em arroz cozido (processo koji). Aliás, em 1890 as enzimas presentes no koji
Apoio:
110
foram precipitadas por Takamine, surgindo, daí, o primeiro preparado enzimático comercial
(representa o marco inicial da Enzimologia Industrial).
Quando o substrato for o açúcar, então sua conversão a etanol implica, apenas, no uso
do microrganismo adequado. No entanto, para aproveitar os materiais amiláceos, o amido
deve ser transformado em açúcares fermentescíveis, para posterior ocorrência da fermentação
(Figura 1).
Destilação
Bebida
Apoio:
111
[FIGURA 2]
α-amilase**
(0,35-0,7kg/ton)
Etanol
* Suficiente para permitir agitação;
** Reforço para cont. liquefação
(neste ponto, os grânulos são Vapor
completamente susceptíveis à
hidrólise , ocorrendo ↓ n Condensado
[FIGURA 3]
H2 O
H2O
5 atm 32°C
60 min Álcool
100h
H2O
Vapor Mash tub
Fermentador
Vapor
cooker
H2O
Destilador
Apoio:
112
[FIGURA 4]
Mash cooler
80°C H2O Fermentador
α-amilase Cooker
Etanol vapor
Destilador
H2O
Água
germinação
Grãos de
Malte germinado
cevada
(10º -22º C/6-7 dias)
secage
m
Malte seco
(2% de umidade)
Apoio:
113
1.2.1.2. Koji
Arroz Fermentação
Vapor (sob pressão)/1h
Arroz cozido
Moído e
(6 dias)
microrganismo
1.3. VINHO
Sem dúvida, em enologia as enzimas pectinolíticas são as mais importantes, já que
participam da clarificação e do melhoramento da extração de substâncias naturalmente
presentes na uva macerada.
A qualidade da pectinase é muito importante, porque deve ser apta a hidrolisar
substâncias pécticas altamente esterificadas, e, por isso, deverá ter baixíssima atividade
saponificante (evitar uma concentração de metanol que possa ser danosa à saúde do
consumidor).
As vantagens do tratamento enzimático são verificadas em três pontos: a) Prensagem:
redução do “splashing”, extração mais eficiente do suco tanto em volume quanto nos
constituintes (açúcares, aromas, etc.); b) Fermentação: melhoramento da clarificação,
Apoio:
114
1.4. CERVEJARIA
1.4.1. Introdução
A produção de cerveja é um processo tradicional, sendo executado há séculos. As
enzimas entram no processo através do malte, um dos principais ingredientes do mosto para a
produção desta bebida.
As principais enzimas do malte são: α-amilase, β-amilase, β-glucanase e
carboxipeptidase, sendo as temperaturas-limites de estabilidade 68º C, 64º C, 62º C e 58º C,
respectivamente.
Para a transformação do material amiláceo em açúcares fermentescíveis, usando as
enzimas naturalmente presentes no malte, o cervejeiro deve realizar o cozimento programado
da pasta (“mashing”), que servirá de mosto para a fermentação (Figura 4).
Apoio:
115
[FIGURA 7]
100
90
T (°C) 80
70
60
50
40
0 60 120 180 240 300
Minutes
Apoio:
116
1.4.3.1.2. Uso de Auxiliares Amiláceos não Malteados: O cervejeiro os emprega por duas
razões básicas, a saber, para reduzir custos e por razões técnicas (o controle de taninos e de
proteínas em cervejaria é fundamental para evitar a turvação do produto final. Daí o uso do
material amiláceo auxiliar adequado. A ocorrência de glico-proteínas - permitem a
espumação da cerveja - provém de auxiliares amiláceos do tipo: farinha de trigo ou cevada).
O processamento destes materiais implica nas etapas (tal como já estudado): gelatinização
liquefação sacarificação açúcares fermentescíveis.
Apoio:
117
Decantador Dorna
Cozedor
Tanque
coletor
Resfriador
Preparo do
mosto Fervedor
(Cobre)
Apoio:
118
Apoio:
119
galacturônicas estão livres) e ácido pectínico (as carboxilas das unidades galacturônicas
encontram-se esterificadas (ex., pectina).
Nas substâncias pécticas, além do ácido galacturônico, encontram-se oses do tipo: L-
ramnose, arabinose, galactose, xilose.
Além das substâncias pécticas, acham-se na parede celular, também, a celulose
(cristalina na parede secundária e amorfa na parede primária) e hemiceluloses. Dentre estas
últimas tem-se as xiloglicanas, cuja cadeia principal é formada por glicoses ligadas por
ligações osídicas β,1-4 e com ramificações de D-xilopiranose, através de ligação osídica do
tipo α.
É interessante destacar que uma malha celulose-xiloglicana está inserida numa matriz
constituída de substâncias pécticas, determinando a força da parede celular e, talvez, a
porosidade da mesma.
Frutas Observações
Maçã, pera, A concentração de substâncias pécticas tende a
pêssego, ser cte durante o crescimento, e corresponde a ≅
1% do peso total bruto do fruto. A distribuição
ameixa entre substâncias pécticas insolúveis
(protopectina) e as solúveis (pectina, ác.pectínico
e ác. Péctico) depende:
• do amadurecimento;
• armazenamento.
No fruto verde predomina a protopectina,
enquanto que no maduro predominam as
subst.pécticas solúveis.
Durante o armazenamento ocorre a
solubilidade da pectina, sendo lenta a 0oC e
rápida para T≥15oC.
Apoio:
120
[TABELA 7]
[TABELA 8]
Pectina
Fruta GM EP pH Acidez
(% p/p)
2.5. ENZIMAS
2.5.1. Pectinases
As pectinases são classificadas em dois grandes grupos: Saponificantes
(pectinoesterases) e Despolimerizantes. As despolimerizantes, por sua vez, se sub-dividem
em:
Apoio:
121
DESPOLIMERIZANTES
AGEM SOBRE O
AGEM SOBRE ÁCIDO PÉCTICO
A PECTINA
ENDO-PL EXO-PL
PECTATO POLIGALACTURONASE
LIASE (PAL) (PG)
ENDO-PMG EXO-PMG
Apoio:
122
2.5.2. Hemicelulases
Existem várias enzimas diferentes com o nome genérico de hemicelulase. As mais
importantes são as galactanases (hidrolisam a arabino-1,4-β-D-galactanas e a arabino-1,3-1,6-
linked-β-D-galactanas), xilanases, xiloglucanases e mananases.
2.5.3. Celulases
São sistemas multienzimáticos, que atuam sinergisticamente. As enzimas constituintes
são: endo-glucanase (Cx) (hidrolisa ligações osídicas β-1,4 ao acaso); exo-glucanase
(hidrolisa ligações β-1,4 a partir da extremidade redutora da cadeia do polissacarídeo);
celobiohidrolase (CBH)(atua após a ação da Cx, hidrolisando as ligações a partir da
extremidade não redutora da cadeia, resultando a celobiose) e celobiase (também chamada de
β-glicosidase; hidrolisa a celobiose em glicose).
2.5.4. Amilases
São usadas para evitar a turvação do produto final pela precipitação do amido
naturalmente presente na fruta, sobretudo não madura. Em geral, utilizam-se a
amiloglicosidase (pHotimo = 4,3 e temperatura entre 55 – 60o C) e a α-amilase ácida (pHótimo
entre 3,0 e 4,0; temperatura entre 70o C e 75o C).
2.6. PROCESSAMENTO
Na planta de processamento do suco de fruta (Figura 9), as enzimas são adicionadas
no tanque auxiliar (3-20g de PectinexR /100 Kg de fruta e 0,2-2g de CelluclastR/100 Kg de
fruta ; temperatura: 30-50o C) e no tanque de clarificação (1,5-3,0g de PectinexR/100 Kg de
fruta e 0,5-2,0g de Amylase AGR/100 Kg de fruta; temperatura: 25-45o C). A adição de
enzimas no tanque auxiliar visa à eliminação da pectina insolúvel, enquanto que no tanque de
Apoio:
123
Separador
[TABELA 9A]
P1/5
Aspectos da produção do suco de maçã
Aspecto Observações
Mercadológico Formas comerciais de suco:
• “natural” (não filtrado e não clarificado);
• macerado com polpa bem densa;
• alto grau de turbidez (mat. Centrifugado e
não filtrado);
• suco límpido
Apoio:
124
[TABELA 9B]
P2/5
Aspectos da produção do suco de maçã
Aspecto Observações
Clarificação Objetivo do uso de pectinases:
[TABELA 9C]
P3/5
Aspectos da produção do suco de maçã
Clarificação (cont.)
Apoio:
125
[TABELA 9D]
P4/5
Aspectos da produção do suco de maçã
Clarificação (cont.)
T (°C ) t c la rif. (m in )
10 200
20 93
30 50
40 34
50 24
[TABELA 9E]
P5/5
Turbidez pós-clarificação
Turbidez amídica
Apoio:
126
[TABELA 10]
Pectinases comerciais
Empresa Enzima
Celluclast
NOVO Pectinex
Ultrazym
Spark-L-HPG
MILES
Clarex-L
BIOCON Biopectinase
3. BIBLIOGRAFIA
FOGARTY, W.M. & KELLY, C.T. Microbial enzymes and biotechnology. 2nd Ed., New York, Applied
Science Publishers, 1990.
NAGODAWITHANA, T. & REED, G. Enzymes in food processing. 3rd Ed., San Diego, Academic Press,
1993.
GODFREY, T. & WEST, S. Industrial enzymology. 2nd Ed., New York, MacMillan Publishers Ltd., 1996.
UENOJO, M., PASTORE, G.M. Pectinases: Aplicações industriais e perspectivas. Química Nova, v.30, n.2,
p.388-394, 2007.
Apoio:
127
CAPÍTULO 10
APLICAÇÃO DE PECTINASES NA CLARIFICAÇÃO DE SUCOS REGIONAIS
Doutora Maria Francisca Simas Teixeira
As enzimas pectinolíticas sintetizadas tanto por vegetais como por inúmeras espécies
de bactérias e fungos. Na comercialização mundial de biocatalisadores alimentares essas
enzimas ocupam 25% do mercado.
Estudos mostram que dos integrantes do Reino Fungi, Aspergillus, Penicillium,
Botrytis, Rhizopus, Erwinia, Fusarium e Saccharomyces são os mais citados enquanto
Aspergillus niger e Rhizopus oryzae já estão sendo utilizados na produção comercial de
pectinases, enzimas que atuam de forma sinérgica nos polímeros pécticos.
Embora, os fungos filamentosos já estejam sendo utilizados por mais de 50 anos na
produção de enzimas para processos industriais e a maioria deles excretem enzimas
simultaneamente, as leveduras tornam-se uma fonte alternativa para a produção em larga
escala de enzimas comerciais porque são unicelulares, além disso, têm crescimento
relativamente simples e comumente não secretam pectinesterase (PME), mas as pectinas liase
que podem ser usadas na clarificação de suco de fruta e vinho sem que haja formação de
metanol no produto final.
Nas últimas décadas diversas investigações demonstram a ação de pectinases no
processo de clarificação, maceração e extração de sucos, na preparação de néctares e purês
vegetais, assim como, na extração de óleo, melhoramento de fibras têxteis e também como
uma ferramenta analítica na estimativa de produtos fitofarmacêuticos.
Nas plantas superiores, as pectinases são responsáveis durante o crescimento pelo
elongamento celular e participam do processo inicial da patogênese vegetal. Além disso, são
importantes na interação de microrganismos parasita e simbiótico com plantas superiores, na
digestão de alimentos de origem vegetal, nos processos de amadurecimento e deterioração de
frutos e demais estruturas vegetais.
Na célula vegetal, as pectinases ou outras enzimas degradam a pectina presente na
lamela proporcionando a desintegração do tecido vegetal promovendo a separação celular,
processo designado de maceração. Na parede celular primária, a degradação promovida por
essas enzimas ocorre de forma diferente ao da lamela média devido à existência da rede
Apoio:
128
Figura 1 - Modo de ação das pectinases: (a) R=H para PG e CH3 para PMG; (b) PE; e (c)
R=H para PGL e CH3 para PL. As setas indicam o local de reação das enzimas nas
substâncias pécticas. PMG=polimetilgalacturonases; PG=poligalacturonases;
PE=pectinesteases; PGL= Pectatoliase; PL= pectina liase. FONTE: Gummadi e Panda, 2003.
SUBSTÂNCIAS PÉCTICAS
Substâncias pécticas são designações de heteropolissacarídeos com peso molecular
variando de 30.000 daltons a 300.000 daltons, embora que em certos frutos, ocorram de
tamanho menor. Esses polímeros são responsáveis pela manutenção da integridade dos
tecidos vegetais e participam da organização estrutural dos outros componentes da parede
celular, tais como celulose e hemicelulose, principalmente na lamela média e parede celular
primária das plantas superiores, mantendo a integridade e coesão entre as células dos tecidos
vegetais, como citado a seguir.
Apoio:
129
Apoio:
130
Apoio:
131
CAMU-CAMU
SELEÇÃO Refugo
LAVAGEM
Água
Extrato enzimático
bruto
TRATAMENTO CLARIFICANTE
50 oC/30 minutos
Inativação
enzimática
FILTRAÇÃO Resíduo
polposo
Determinação
Suco com do Resíduo
extrato
Suco com
enzimático Determinação
do Teor de
DETERMINAÇÕES
A B
Apoio:
134
ATIVIDADE DE PECTINESTERASE
50 oC/2 horas
Uma unidade de pectinesterase (U) foi definida como a quantidade de enzima que libera um
microequivalente de grupos carboxílicos em uma hora de reação, nas condições descritas.
Apoio:
135
ATIVIDADE DE
ENDOPOLIGALACTURONASE
50 oC/10 min
% V is c d.e.
mL =
Atividade viscosimétrica ×
(U/mL) 50 t
d.e.=diluição da enzima t=t empo de incubação a 50oC
Uma unidade viscosimétrica (UV)= a quantidade de enzima necessária para diminuir em 50% a viscosidade inicial
da solução do substrato em um minuto de reação, nas condições definidas
Apoio:
136
ATIVIDADE DE
EXOPOLIGALACTURONASE
(Método do ácido dinitrosalicílico - DNS)
imediata agitação
incubação em água
fervente/5 min
Espectrofotômetro Diluir
575 nm (5 mL de água destilada)
t = tempo de incubação a 50 oC
A = absorvância da amostra
d.e.=diluição da enzima
F= absorvância correspondente a 1µmol de ácido monogalacturônico
Apoio:
137
BIBLIOGRAFIA
Bravo, C. E., C.; Carvalho, E.P.; Schwan, R. F., Gómez, R. J. H. C.; Pilon, L. Determinação de condições
ideais para produção de poligalacturonase por Kluyveromyces marxianus. Ciênc. agrotec., v.24 (Edição
Especial), p.137-152, 2000.
Cordeiro, C. A. M.; Martins, M. L S. Produção de poligalacturonase, pelo termofílico Bacillus sp. e algumas de
suas propriedades. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, v.29, n. 1, p. 135-141, 2009.
Gummadi, S. N.; Panda, T. Purification and biochemical properties of microbial pectinases -/a review. Process
Biochemistry , v. 38, p. 987-996, 2003.
Lima, A. R. Produção de pectinases por Aspergillus e clarificação de suco de camu-camu com
poligalacturonases e pectinesterases. Dissertação, 86p., 2006.
Lima, A. R.S.; Machado, M.L.; Castillo, T.A., Fernandes, O. C.C., Britto, E. N.; Peixoto, J.C.C.; Teixeira, M. F.
S. e Porto, A. L. F. Produção de endopoligalacturonases por Aspergillus tubingensis Luc 40 F4C1 por
fermentação submersa e semi-sólida. SINAFERM, 2005.
Peixoto, J. C. C.; Britto, E. N.; Castillo, T. A.; Silva, A.B.; Machado, M. L.; Fernandes, O.C.C.; Lima, A. S.; Caldas,
W. R.; Teixeira, M.F.S.; Porto, A. L. F. Partição de endopectinase de Aspergillus tubingensis Luc 40 F4C1 em sistema
de duas fases aquosas utilizando peg-sais de fosfato. SINAFERM, 2005.
Pinelo, M.; Zeuner, B.; Meyer, A. S. Juice clarification by protease and pectinase treatments indicates new roles
of pectin and protein in cherry juice turbidity. Food and bioproducts processing, 2009.
Teixeira, M. F. S. ; Lima Filho, J. L. ; Durán, N. . Carbon sources effect on pectinase production from
Aspergillus japonicus 586. Brazilian Journal of Microbiology, Brasil, v. 31, p. 286-290, 2000.
Teixeira, M. F. S. Otimização da produção de enzimas pectinolíticas por Aspergillus japonicus 586. Tese, 172p.,
1997.
Silva, E. G.; Borges, M. F.; Medina, C.; Piccoli, R. H.; Freitas, R. S. Pectinolytic enzymes secreted by yeasts
from tropical fruits. FEMS Yeast Research, v.5, p. 859–865, 2005.
Apoio:
138
MEIOS DE CULTURA
1)Celulases
Composição do ágar Celulase - CMC
NaNO3………………………..0,2%
K2HPO4.....................................0,1%
MgSO4......................................0,05%
KCl............................................0,05%
Carboximetilcelulose ...............0,2%
Peptona......................................0,02%
Ágar............................................1,7%g
NH4H2PO4………………………..1,0g
MgSO4.7H2O.................................0,1g
KCl.................................................0,5g
Pectina cítrica..................................1,0g
Ágar................................................12g
Água destilada...............................1000 mL
Apoio:
139
Leite em pó desnatado...................5,0g
Ágar nutriente................................1,0g
Água destilada.............................100mL
REFERENCIAS
CHEN, Lu Shi ; HECK, J. X. ; JESUS, Kátia Regina de ; RIZZATTO, Márcia ; SILVA, Dênis ; SILVA, Flávio
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