TECNICAS DE HIBRIDACIÓN MOLECULAR

Las técnicas de hibridación molecular se basan en el estudio de secuencias

especificas del DNA o RNA, tanto para su identificación como para su eventual
cuantificación. Para realizarlas se parte de sondas que son secuencias de DNA o
RNA, complementarias a aquellas que se quieren detectar. La hibridación de la
secuencia diana se puede reconocer con métodos radioactivos y colorimétricos. En
general se usan sondas previamente marcadas con sustancias radiactivas o
fluorescentes.
Proceso básico

Hibridación por filtración

Consiste en la desnaturalización de DNA o RNA, inmovilizándolo en un soporte
inerte como la nitrocelulosa, para hibridarlo posteriormente con una sonda marcada
y asi facilitar su detección. Estas técnicas se conocen con los nombres de Southern
blot y Northen blot, y sirven para analizar las cadenas de DNA y RNA,
respectivamente.
Hibridación in situ (HIS)
Consiste en utilizar una sonda marcada de DNA o RNA y unirla al DAN o al RAN de
una preparación citológica o histológica. Se usa fluorescencia, lo que permite
detectar alteraciones puntuales y anomalías cromosómicas tanto en interface como
metafase, tras hacer crecer previamente las células in vitro.
Consiste en desnaturalizar el DNA cromosómico por calor (95°C) y posteriormente
añadir una solución que contiene la sonda con el DNA o RNA marcado, que
hibridará con sus secuencias complementarias. El marcado de las sondas se puede
hacer por radiactividad con P32, S35 o I125 y posteriormente detectarse por autor
radiografía. Se usa en patología tumoral y en el estudio de infecciones.
Hibridación in situ con fluorescencia (FISH)
Se utilizan sondas específicas para determinados cromosomas o secuencias de
ellos. Consiste en desnaturalizar el DNA con calor, incubar las muestras con
fornamida y tampón salino para mantener las cadenas desnaturalizadas e
hibridarlas posteriormente con sondas específicas de determinados fragmentos de
DNA que se quieren estudiar. Si la sonda no estaba marcada con fluorescencia se
añade un intermediario que haga de puente, marcado con una sustancia
fluorescente que a su vez reconozca la sonda.
Southern blot
Se basa en tratar el DNA con enzimas de restricción y separar los fragmentos con
electroforesis en un gel de agarosa. Para su realización se parte de DNA aislado
del tejido en las mejores condiciones posibles. El DNA, tras cortarlo con enzimas de
restricción, se desnaturaliza para obtener fragmentos de cadena sencilla que se
transfieren del gel de agarosa a un filtro de nitrocelulosa sobre el cual quedan
inmovilizados. Esta transferencia es necesaria para que pueda realizarse la
reacción de hibridación. El DNA queda atrapado en la nitrocelulosa y es entonces
cuando se puede hibridar con la sonda radiactiva o colorimétrica. Cada secuencia
complementaria da lugar a una banda marcada que adquiere una posición
determinada por el tamaño del fragmento del DNA. La reacción se puede detectar
por autor radiografía, ya que las sondas se pueden marcar radiactivamente.

 Ventajas: 1) tiene una alta especificidad y reproducibilidad. 2) Permite la

valoración del estado físico del ADN. 3) es un buen método para detectar perdidas
homocigotas.
 Desventajas: Es una técnica de alta duración, precisa una cantidad de ADN
relativamente alta y estudia una pequeña región del genoma con cada sonda.
Northen blot
Es la técnica Southern blot aplicada a RNA. En este caso, para transferir RNA desde
el gel de agarosa a un medio adecuado para la hibridación es necesario realizar
algunas modificaciones, pero el fundamento del método es el mismo. El hecho de
que el RNA se degrade fácilmente es una limitación que obliga a que todas las
manipulaciones haya que hacerlas de forma rápida y evitando el contacto de la
muestra con ARNasas. Con esta técnica se detecta la amplificación de expresión
génica, y es parcialmente cuantitativa.
 Ventajas: detecta hasta los más pequeños cambios de expresión del gen y se
puede hacer Northen blot inverso.
 Desventajas: Menos sensibles que retrotranscripcion por PCR, fragilidad del
ARN durante el proceso y muy poco especifico ante contaminaciones muy
leves con ARNasas.
Western blot
Tecnica usada para detectar y cuantificar proteínas basada en la especificidad de
reconocimiento entre un antígeno y un anticuerpo. Se da en varias etapas:
1. Electroforesis en gel para separar las proteínas (peso molecular, estructura,
hidrofobicidad)
2. Transferencia de las proteínas de interés desde el gel a la membrana
3. Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos remanentes en la membrana
4. Incubación del anticuerpo
5. Revelado con sustrato quimioluminiscente y detección con placas
radiográficas

Aplicaciones: Determinar la ausencia o presencia de una proteína, determinar

niveles de una proteína en el organismo, diganostico de enfermedades

Dot blotting
Representa una simplificación de las técnicas anteriores. En un dot blot las
biomoléculas para ser detectados no son separados por cromatografía. En cambio,
una gota que contiene la molecula para ser detectada se aplica directamente sobre
una membrana. Esto es seguido por la detección por sondas de nucleótidos
(Southern y northern) o anticuerpos (western).
La técnica ofrece importantes ahorros de tiempo. Sin embargo, no ofrece
información sobre el tamaño de la biomolecula blanco. ADmeas, si dos moléculas
de diferentes tamaños son detectados , se seguirá viendo como un punto. Por lo
tanto, esta técnica solo puede confirmar la presencia o ausencia de una biomolécula
o biomoléculas que pueden ser detectados por las sondas de ADN o el anticuerpo.
1. ASO dot blot: Este método consiste en amplificar el ADN de interés, por
PCR, y fijarlo directamente a la membrana de trabajo, para luego añadir
oligonucleótidos específicos del alelo que quiere detectarse. Estos oligo son
marcados previamente con radiactividad, fluoroforos o cualquier otro tipo de
marcaje. Se pueden identificar presencia de mutaciones o detectar
efermedades genéticas.

2. ASO dot blot inverso: Se basa en el mismo procedimiento , pero los alelos
de las moléculas son fijados a la membrana, mientas que el ADN del paciente
es el que hace el papel de sonda.