Programa de pós-graduação em análises clínicas

Roteiro de práticas
de microbiologia básica

Profª Me. Viviane Karolina Vivi

Sinop-MT
2018
 23 DE NOVEMBRO DE 2018 – NOTURNO (Laboratório
multidisciplinar)
Amostra: Urina, Aspirado Traqueal e Lavado Alveolar
Pesquisa: Microrganismos patogênicos que possam estar associados à infecção, não
colonizadores.
Semeadura: Quantitativa
Meios: CPS (urina); Sangue, Chocolate e MacConkey (Aspirado traqueal e Lavado
alveolar).

Diluições

1. Aspirado traqueal

1° 2°

2° tubo = Homogeneizar amostra no vortex e adicionar 500µL da amostra + 500µL do

cloreto de sódio a 0,9 %. Homogeneizar no vortex.

1° tubo = Adicionar 5mL de cloreto de sódio 0,9 %

1° tubo = Retirar 50µL do cloreto de sódio 0,9 % e acrescentar 50µL da diluição

realizada no 2°tubo.

 Deverá ser realizada a semeadura a partir da diluição do 1°tubo

 Ágar Sangue, Ágar Chocolate e Ágar MacConkey
 Deve levar a estufa os meios Sangue e chocolate na Jarra de Gaspak
 A diluição do tubo 1° deverá ser armazenada em geladeira e as demais
descartadas
 2. Lavado Alveolar

1°

Adicionar 1000µL de cloreto de sódio 0,9 %

Retirar 100µL e adicionar 100µL da amostra

 Deve-se realizar semeadura em Ágar Sangue, Chocolate e MacConkey

 Deve levar à estufa: Sangue e Chocolate em jarra de Gaspak
 Deve-se guardar a amostra diluída em geladeira

Amostra: Líquido Pleural

Pesquisa: meningite bacteriana e tuberculose (Neisseria meningitidis, Streptococcus
pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis ou Haemophilus influenzae).
Semeadura: Esgotamento
Meios: Sangue, Chocolate, MacConkey e Caldo Tioglicolato com indicador

Procedimento

 Realizar semeadura da amostra nos meios e adicionar no Caldo

 Realizar Lâmina para BK e Bacterioscopia (é necessário centrifugar amostra por
20 min. e retirar o sobrenadante).

Amostra: Fezes
Pesquisa: Salmonella sp. e Shigella sp.
Meios: MacConkey, Caldo Selenito e SS
Semeadura: Esgotamento

Procedimento

 Semear amostra em Ágar MacConkey e Caldo Selenito

 Incubar por 24hrs.por 35 +/- 2 °C
 Semear do Caldo Selenito para Ágar SS
 Se houver crescimento de Salmonella sp. realizar a tipagem por soro-aglutinação
(somática ou flagelar).
Amostra: Swab Nasal
Pesquisa: MRSA (Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina)
Semeadura: Esgotamento
Meios: Caldo Tioglicolato com indicador e Ágar Sangue

Procedimento

 Semear amostra do tubo de transporte em Ágar Sangue

 Passar para o Caldo Tioglicolato com indicador
 Caso suspeita de Staphylococcus aureus, confirmar em Manitol
 Com a confirmação realizar antibiograma para verificação de resistência

Amostra: Swab Anal

Pesquisa: Cultura de vigilância epidemiológica / Microrganismos VRE e KPC
Semeadura: Esgotamento
Meios: CPS e MacConkey, Caldo Tioglicolato com indicador
Discos de antibióticos: Vancomicina, Meropenem e Imipenem

Procedimento

 A amostra deve ser passada do tubo de transporte para o Caldo Tioglicolato com
indicador
 Deve-se aguardar turvação (no mínimo 4hrs.)
 Semear nos meios CPS e MacConkey
 Adicionar o disco de Vancomicina no segundo estriamento no Ágar CPS
 Adicionar Meropenem no segundo estriamento e Imipenem no terceiro
estriamento no Ágar MacConkey
 Após incubação por 24hrs. Em 35 +/- 2 °C
 Verificar crescimento de colônias próximas ao disco
 Se houver, semear em Ágar KPC e VRE ou realizar antibiograma manual para
observar resistência

Amostra: Líquor
Pesquisa: Meningites bacterianas
Semeadura: Esgotamento
Meios: CPS, Sangue, Chocolate e MacConkey, Caldo Tioglicolato com indicador

Procedimento

 Semear amostra em Ágar Sangue, chocolate e MacConkey e Caldo Tioglicolato

com indicador
 Centrifugar amostra por 20 min. (é muito importante que se tenha feio a
separação da amostra para cada setor)
 Realizar lâmina (Gotejar sobre a lâmina o material sem esfregar)
Amostra: Fragmentos ósseos
Pesquisa: Microrganismos Patológicos Variados
Semeadura: Esgotamento
Meios: Caldo Tioglicolato com indicador, Sangue, Chocolate e MacConkey

Procedimentos

 Deve-se adicionar o Caldo Tioglicolato com indicador na amostra para pré-

enriquecimento
 Levar a estufa por 24hrs. Em 35 +/- 2 °C
 Semear no Ágar Sangue, Chocolate e MacConkey

Amostra: Secreções em geral

Pesquisa: Microrganismos variados
Semeadura: Esgotamento
Meios: Caldo Tioglicolato com indicador, Sangue, Chocolate e MacConkey

Procedimentos

 Acrescentar o Caldo Tioglicolato com indicador na amostra

 Levar a estufa por 24hrs. Em 35 +/- 2 °C
 Semear em Ágar Sangue, Chocolate e MacConkey

Amostra: Sangue
Pesquisa: Bacteremia ou infecção por cateter
Semeadura: Esgotamento
Meios: Sangue

Procedimento

 Após positividade da garrafa com amostra, realizar a retirada da amostra com

seringa de insulina
 Semear em Ágar Sangue
 Preparar lâmina
 Considerar positividade de todas as garrafas com até 20hrs.
 Após incubação não obter crescimento, realizar leitura do Gram e aguardar mais
24hrs.
 Após crescimento, realizar antibiograma
 Amostra: Ponta de Cateter
Pesquisa: Possíveis infecções
Semeadura: Rolamento
Meios: Sangue

Procedimento

 Derrubar a amostra no Ágar Sangue

 Com bisturi realizar rolamento para todos os lados
 Voltar à amostra no coletor e descartá-la

Pesquisa de Streptococcus agalactiae

Amostra: Swab Vaginal e Anal

Pesquisa: Streptococcus agalactiae em gestantes
Semeadura: Esgotamento
Meios: CPS e Sangue

Procedimentos

 Realizar semeadura da amostra presente em Caldo Bifásico por esgotamento em

Ágar CPS e Sangue
 Levar a estufa por 24hrs por 35 +/- 2°C
 Observar a presença de hemólise no Ágar Sangue
 Realizar Camp Test para confirmação
 Realizar ATB com os discos de CLI, ERI, AMP, PEN e CRO.

Pesquisa de Enterobacteriaceae

Amostra: urina, fezes, alimentos

Pesquisa: bacilos gram negativos fermentadores
Semeadura: Esgotamento
Meios: Enterokit

Procedimentos

Enterokit ®
 Composto de cinco tubos com os seguintes meios:
Tubo nº 1: Meio de EPM (sólido cor verde)
 Tubo nº 2: Meio de Lisina (caldo cor púrpura)
Tubo nº 3: Meio de MIO (semi-sólido cor púrpura)
Tubo nº 4: Meio de Citrato de Simmons (sólido cor verde)
Tubo nº 5: Meio de Rhamnose (caldo cor verde)

1- Escolher uma colônia isolada e com auxílio de agulha bacteriológica flambada com a
extremidade dobrada, recolher metade desta colônia.
2- Inocular no primeiro tubo por picada e estria na superfície inclinada do meio, deixando a
tampa frouxa.
3- Sem flambar, semear o segundo tubo por dissolução, selar com óleo mineral estéril e fechar
bem a tampa.
4- Ainda sem flambar, semear o terceiro tubo, com picada central única, deixando a tampa do
tubo frouxa.
5- Recolher a outra metade da colônia e semear no quinto tubo através de dissolução. Selar
com óleo mineral estéril e fechar bem a tampa.
6- Voltar ao quarto tubo com a agulha bacteriológica e estriar a superfície. Este tubo deverá
ser deixado por ultimo pois o mesmo deverá receber inóculo leve, assim como deverá ser
evitado arrastar nutrientes do meio original com a agulha, uma vez que estes nutrientes
poderão dar reações falso – positivas. A tampa do tubo deverá permanecer frouxa.

Todos os meios possuem fórmulas adaptadas e rigorosamente controladas para fornecer leituras
ótimas após incubação a 36ºC por 18 a 24 horas.

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA)

Objetivos
 Testar diferentes antimicrobianos no controle do crescimento de micro-
organismos.

Materiais
 Cultura de bactérias em ágar BHI (Brain Heart Infusion)
 Placas de Petri contendo ágar Mueller-Hinton
 Agentes antimicrobianos em discos
 Pinças estéreis
 Swabs
 Tubos com solução salina esterilizada
 Estufa de cultura a 37 °C

Procedimentos
 Retirar as placas e os frascos com os discos da geladeira cerca de 20-30 minutos ara
que adquiram a temperatura ambiente antes da execução da prova.
 Com uma alça bacteriológica em platina devidamente flambada e resfriada, tocar na
colônia recente (18-24h).
 Suspender as colônias em solução salina até se obter uma turvação compatível com
o grau 0,5 da escala MacFarland (1x106 UFC/mL). Para este passo deve ser
utilizado um tubo aferido na escala 0,5 de MacFarland como comparativo.
 Umedecer em condições assépticas um swab no tubo de solução salina esterilizada
e semear toda a superfície da placa de Petri, visando obter um crescimento
confluente.
 Marcar de forma equidistante a disposição dos discos no fundo da placa.
 Colocar os discos sobre a superfície do ágar, pressionando levemente com auxílio
da pinça.
 Incubar as placas em estufa de cultura pelo mínimo de 24 horas e máximo de 48
horas.

Interpretação dos resultados

 Observar a placa verificando a presença ou ausência de halos de inibição do
crescimento em torno dos discos.
 A zona clara de inibição ao redor de cada disco é mensurada em milímetros com
auxílio de uma régua. Monte uma tabela com todos os resultados obtidos.
 Comparar os agentes baseando-se nos halos mensurados discutindo qual foi mais
eficaz e por que.
 Em poucas palavras, argumente qual a importância do controle da população
microbiana.
 24 DE NOVEMBRO DE 2018 – MATUTINO (Laboratório de
multidisciplinar/microbiologia)

Confecção dos meios de cultura

MEIOS DE CULTURA

Nos ambientes naturais, os micro-organismos encontram-se quase sempre na forma de

populações mistas. Para que seja possível estudar as características de cada espécie, torna-se
necessário fazer o isolamento em cultura pura. É sabido que todos os micro-organismos
necessitam de uma fonte de energia para seu desenvolvimento, podendo esta ser química (seres
quimiotróficos) ou luminosa (fototróficos). Além disso, há fatores físicos (temperatura, pH,
pressão osmótica) e químicos (água, fonte de carbono, nitrogênio, fósforo, enxofre, sais
minerais, dentre outros). Quando o carbono é de fonte orgânica, temos seres heterotróficos e
quando inorgânica, autotróficos.
O material nutriente preparado em laboratório para o crescimento de micro-organismos
é denominado meio de cultura. O crescimento nos diferentes meios de cultura utilizados fornece
as primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer o potencial de
crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material.

TIPOS DE MEIOS
1- Ágar nutriente (AN)
Meio relativamente simples, de fácil preparo e barato, muito usado nos procedimentos do
laboratório de microbiologia.
Utilidade: análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras
submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras,
conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente, como método opcional para os
laboratórios que não dispõem do método da criopreservação (congelamento das cepas em
freezer à - 70ºC) e observação da esporulação de espécies de bacilos Gram positivos.
Interpretação:
Cor original do meio: branco opalescente
Positivo: Crescimento na superfície do ágar;
Negativo: Ausência de crescimento.

2- Ágar MacConkey (MC)

O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente
enterococos e estafilococos. A concentração de sais de bile é relativamente baixa em
comparação com outros meios, por isso não é tão seletivo para Gram negativos como, por
exemplo, o ágar SS.
Utilidade: isolar bacilos Gram negativos (enterobactérias e não fermentadores) e verificar a
fermentação ou não da lactose.
Interpretação:
Cor original do meio: rosa avermelhado.
Crescimento de bacilos Gram negativos.
Colônias cor de rosa: fermentadoras de lactose.
Colônias incolores: não fermentadoras de lactose.
Não há crescimento de cocos Gram positivos.

3- Ágar Salmonella-Shigella (SS)

Possui componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem microrganismos
Gram positivos. A incorporação de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo é
lactose positiva (bactérias que fermentam a lactose produzem ácido que na presença do
indicador vermelho neutro resultando na formação de colônias de cor rosa), e bactérias que não
fermentam a lactose formam colônias transparentes. Tissulfato de sódio e o citrato férrico
permitem a detecção de H²S evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro.
Utilidade: selecionar e isolar espécies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes,
alimentos e água.
Interpretação:
Cor original do meio: vermelho alaranjado.
Colônias com centro negro (H²S) ou colônias incolores: suspeita de Salmonella.
Colônias incolores: suspeita de Shigella spp.
Colônias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp.
As bactérias não fermentadoras de lactose são incolores.
As bactérias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa.

4- Ágar Cystine Lactose Electrolyte Deficient (CLED)

Usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras urina. A
deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus.
Utilidade: isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras.
Interpretação:
Cor original do meio: azul claro.
Colônias lactose positiva: cor amarela.
Colônias lactose negativa: cor azul.

5- Ágar Saboraud (AS)

Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos leveduriformes e
filamentosos.
Utilidade: cultivo e crescimento de espécies de Candidas e fungos filamentosos,
particularmente associados a infecções superficiais e caracterização macroscópica do fungo
filamentoso (colônia gigante).
Interpretação:
Cor original do meio: amarelo claro opalescente.
Após o crescimento, deve-se seguir a identificação do microrganismo que cresceu.

6- Ágar Mueller-Hinton (MH)

Meio padronizado por Kirby e Bauer e pelo CLSI que oferece condições de crescimento das
principais bactérias.
Utilidade: realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelos métodos de
difusão em disco e E-test para enterobactérias, não fermentadores, Staphylococcus,
Enterococcus sp.
Interpretação:
Cor original do meio: amarelo palha.
A zona do diâmetro é particular para cada antibiótico e organismo, sendo comparado com
diâmetros padronizados pelo CLSI, que determina cada microrganismo sendo sensível,
intermediário ou resistente.

7 - Caldo Tioglicolato com indicador

O meio de Tioglicolato dá suporte para o crescimento de vários microrganismos. O potencial
de oxidação e redução baixo do meio neutraliza efeitos antibacterianos das espécies preservadas
com mercúrio. A resazurina e o azul de metileno são indicadores da posição de oxidação de
aeróbios e a dextrose incluída na fórmula é para os microrganismos que tem crescimento
vigoroso na presença do carboidrato.
Utilidade: usado para o cultivo de microrganismos aeróbios, microaerófilos e anaeróbios.
Usado também para controle de esterilidade bacteriana de diversos materiais.
Interpretação:
Cor original: amarelo claro. ƒ
Presença de crescimento: turvação do meio. ƒ
Ausência de crescimento: meio permanece inalterado. ƒ
Crescimento de microrganismos anaeróbios: crescimento na profundidade do meio. ƒ
Crescimento de microrganismos aeróbios: crescimento na superfície do meio.

8- Caldo Tioglicolato sem indicador

As substâncias redutoras tioglicolato, cisteína e sulfito de sódio produzem uma anaerobiose
suficiente para microrganismos anaeróbios exigentes.
Utilidade: usado para o cultivo de microrganismos anaeróbios.
Interpretação:
Cor original: amarelo claro. ƒ
Presença de crescimento: turvação do meio. ƒ
Ausência de crescimento: meio permanece inalterado.

9- Ágar - Ágar (HH)

É um meio de cultura obtido a partir de algas marinhas vermelhas e formado por uma
combinação de agarose e agaropectina.
Utilidade: devido a sua elevada concentração de carboidratos e sua estrutura química rica em
nutrientes, o Agar é um excelente meio de cultura para o crescimento de vários tipos de fungos,
leveduriformes e filamentosos.
obs: É um meio de suplementação,de qualquer outro meio. Podem ser também adicionados
para enriquecer.

PROCEDIMENTOS GERAIS

PREPARAÇÃO E DISTRIBUIÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

􀂃 Os meios comerciais devem ser hidratados em pequena quantidade de água até que todo o
meiofique úmido e só depois deve-se acrescentar o restante da água.
􀂃 Os meios preparados não comerciais, devem ser pesados separadamente em papel manteiga
oupapel alumínio e adicionados em um único frasco (normalmente em béquer), hidratar em
pequenaquantidade de água até que todo o meio fique úmido e só depois deve-se acrescentar o
restanteda água.
􀂃 Sempre que for necessário levar o meio para fundir, usar vidro Pyrex, aquecer sobre a tela
deamianto ou similar e tripé, no bico de Bunsen.
􀂃 Usar sempre luvas térmicas apropriadas para laboratório para manipular vidrarias quentes;
􀂃 Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave", o tempo de esterilização é de
15minutos e a temperatura de 121ºC.
􀂃 Sempre que for usado o termo "esterilizar por filtração", usar o filtro com porosidade de
0,22micra, recomendado para partículas bacterianas.
􀂃 Quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados;
􀂃 Quando distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias
oumateriais auxiliares obrigatoriamente devem ser estéreis.
􀂃 Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas, para que a esterilização seja
porigual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor.

CONTROLE DE QUALIDADE DE ESTERILIDADE E CRESCIMENTO

􀂃 Para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10% do lote preparado na estufa 35
±1°C por 24 horas para o controle de esterilidade.
􀂃 Não deve haver mudança de cor nem crescimento de qualquer colônia.
􀂃 Para o controle de crescimento, sempre que possível usar cepas ATCC, que são cepas
dereferências de origem e padrão definido de provas para a sua caracterização.
􀂃 Se não for possível o uso de cepas ATCC , usar cepas 100% positivas para os controles
dequalidade de crescimento realizados.

RECOMENDAÇÕES GERAIS
􀂃 Evitar usar meios vencidos (liofilizados e prontos para uso); se usar, certificar-se com o
controlede crescimento de que realmente está funcionando.
􀂃 Não usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados.
􀂃 Observar com atenção para as instruções de alguns inóculos que são específicos para
algunsmeios de cultura.
􀂃 Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento rápido do
meio(tamanho dos tubos utilizados geralmente são de 11 por 100 mm).
􀂃 As placas de Petri são de 50, 90 ou 150 mm de diâmetro.
􀂃 Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome, data
defabricação, data de validade e tipo de armazenamento.
􀂃 Todos os meios de placa devem ser embalados em filme plástico PVC transparente para
evitar oressecamento.
􀂃 Evitar o uso de sacos plásticos para embalar as placas, pois a água de condensação
formadafacilita a proliferação de fungos; para meios de cultura em tubos, colocar em sacos
plásticos,procurando tirar o excesso de ar.

Objetivos
 Desenvolver a habilidade de manipular materiais estéreis
 Preparar meios de cultura para a rotina laboratorial
 Compreender todo o processo envolvido na prática laboratorial

Materiais
 Placas de Petri esterilizadas
 Tubos de ensaio
 Meio de cultura sólido
 Água destilada
 Bico de Bunsen
 Autoclave
 Balança analítica
 Proveta
 Pipeta
 Pera
 Balões de fundo chato/Erlenmeyers
 Tripé com tela de amianto

Procedimentos gerais
 Meio líquido: pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante.
Distribuir em tubos com auxílio de pipetas. Acondicionar em recipientes
adequados e esterilizar por 15 minutos, 121ºC, 1 atm em autoclave. Deixar
esfriar para realizar a inoculação.
 Meio sólido (placa de Petri): pesar e hidratar o meio conforme instruções do
fabricante. Levar ao Bico de Bunsen até que o meio passe de turvo para
translúcido. Vale ressaltar que o ágar NÃO pode atingir fervura! Tampar o
recipiente com um tampão de algodão limpo e esterilizar por 15 minutos,
 121ºC, 1 atm em autoclave. Verter em placas secas e esterilizadas. Aguardar
solidificar.
 Meio sólido (tubo inclinado): seguir as recomendações acima quanto à pesagem
e fundição do meio. Distribuir em tubos com auxílio de pipetas. Acondicionar
em recipientes adequados e esterilizar por 15 minutos, 121ºC, 1 atm em
autoclave. Deixar esfriar para realizar a inclinação em bancada com auxílio de
um suporte.
 Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o
nome e data de fabricação. As placas devem ser embaladas em filme plástico
PVC transparente para evitar o ressecamento.
 Mais informações estão disponíveis em:
<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_4_2004.pdf>

http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/guia_procedimentos_tecnicos_corticosteroid
es_hanseniase.pdf
 24 DE NOVEMBRO DE 2018 – VESPERTINO (Laboratório
multidisciplinar/microbiologia)

Identificação de Candida sp. pelo método de tubo germinativo

Objetivos
 Desenvolver a habilidade de manipular materiais estéreis
 Observar a presença de tubos germinativos, pseudo-hifas, blastoconídios.
 Realizar identificação rápida e econômica da Candida.

Materiais
 Pequenos tubos de ensaio
 Substrato de plasma
 Organismos para identificação
 Filmes plásticos para cobrir os tubos
 Pipetas de Pasteur descartáveis
 Lâminas de vidro e lamínulas
 Banho maria 37°C

Procedimentos
 Etiquete os tubos de ensaio.
 Toque a colônia que será testada com a ponta de uma pipeta de Pasteur esterilizada.
Introduza a ponta da pipeta no tubo do substrato e gire-a, gentilmente, para
transferir as células de levedura da pipeta para a suspensão. Deixe a pipeta no tubo!
 Enrole filme plásticos em torno da pipeta e da boca dos tubos e incube-os num
banho maria, a 37º C por 2 a 3 horas, incubação por tempo maior podem produzir
resultados falso-positivos.
 Depois da incubação, use a pipeta de Pasteur para transferir 1 ou 2 gotas do
“desconhecido” para uma lâmina de vidro etiquetada. Ponha sobre a mistura e
deixe-a de lado por alguns poucos minutos, até que os movimentos braunianos
tenham cessado. Retorne a pipeta para o tubo.
 Examine as lâminas com as lentes de pequeno e grande aumento, de um
microscópio de campo brilhante, como faria com qualquer preparação molhada.
Procure por tubos germinativos nas lâminas.

Interpretação dos resultados

 Tubos germinativos, pseudo-hifas, blastoconídios, todos podem formar-se no

substrato, durante o período de incubação. Os tubos germinativos são mais longos
do que as células progenitoras e apresentam, aproximadamente, metade da largura,
com lados paralelos. Eles não apresentam constrições quando emergem das células
progenitoras. Pseudo-hifas são blastoconídios que ainda não se separaram das
células de origem. Os lados das pseudo-hifas não são paralelos a elas apresentam
constrições onde emergem das células de origem. Os resultados não podem ser
quantificados, mas você pode ver numerosos tubos germinativos na preparação,
antes que você classifique como Candida albicans. Se apenas uma ou duas células
apresentarem tubos germinativos, considere a necessidade de repetir o teste ou de
confirmar os resultados, pela produção de clamidósporos ou pelos testes de
assimilação.

Baciloscopia de BAAR

Microscopia de fungos filamentosos e leveduriformes

Cultura de Vigilância Epidemiológica

Segue abaixo algumas situações para as quais pode se indicar a coleta de amostras de
culturas de vigilância:

1. Pacientes transferidos de outros serviços com internação superior à 48 horas ou em

uso de dispositivos invasivos (cateter venoso central, cateter vesical ou intubação
orotraqueal)

2. Pacientes provenientes de home care em uso de dispositivos invasivos (cateter

venoso central, cateter vesical ou intubação orotraqueal) e/ou antimicrobianos

3. Pacientes em tratamento em hemodiálise

4. Paciente com histórico de MR identificado em cultura

 MRSA coloniza mais frequentemente o vestíbulo nasal e a pele, VRE e

enterobactérias colonizam o 3 trato gastrintestinal6,7 e os bacilos Gram
negativos não fermentadores colonizam a via aérea de pacientes
entubados/traqueostomizados assim como outras portas de saída (e.g, feridas
cirúrgicas e outras ostomias).

Pesquisa MRSA

 S. aureus com resistência intrínseca a meticilina, oxacilina, cefalosporinas,

imipenem e aos aminoglicosídeos. É relacionado a infecções de corrente
sangüínea - relacionada a cateteres e infecções de pele e partes moles – e é
também um dos agentes mais freqüentes de pneumonias associadas à ventilação
mecânica.
 Na maioria das situações infecções por microrganismos multirresistentes
manifestam-se de forma similar a infecções causadas por agentes multisensíveis.
Entretanto as opções terapêuticas são extremamente limitadas, onerosas e com
maior risco de toxicidade. São considerados com maior risco para colonização:
Os diabéticos e imunossuprimidos. Os portadores de doença dermatológica
extensa. o Os pacientes com tempo de internação prolongada). Os pacientes com
história de internação prévia. o Pacientes que tenham sido submetidos à
antibioticoterapia múltipla ou de amplo espectro. Os pacientes em uso de
dispositivos invasivos.
 O principal modo de transmissão do MRSA dentro dos hospitais é a
disseminação do microorganismo de um paciente para outro, através das mãos
da equipe de saúde e de equipamentos de uso coletivo com desinfecção
inadequada.
TÉCNICA DE COLETA

Cultura das narinas identificam a maior parte dos pacientes colonizados por MRSA.
Culturas de material perianal e de feridas identificam outros carreadores. O swab
combinado de dois sítios (narinas e perianal) aumenta significativamente a chance de
isolamento do microrganismo.

Técnica recomendada:

1. Separar o material necessário e higienizar as mãos com álcool 70%. Calçar

luvas de procedimento.
2. Umidificar o swab com água estéril tendo cuidado para não o contaminar.
3. No período neonatal: realizar a coleta com o swab na região do coto umbilical,
cuidadosamente inserir o mesmo swab na porção anterossuperior de uma das
narinas com movimento giratório delicado e deslizá-lo lateralmente pela asa
nasal interna.
4. Repetir o procedimento na outra narina com o mesmo swab.
5. Finalmente colher material da região perianal (mesmo swab) e inserir o swab no
invólucro especial ou no meio de transporte.
6. No alojamento conjunto (adultas e/ou lactentes): colher material de narinas
conforme técnica descrita acima.

Procedimento Laboratorial

 Semear amostra do tubo de transporte em Agar Sangue

 Passar para o Caldo Tioglicolato com indicador
 Caso suspeita de Staphylococcus aureus, confirmar em Manitol
 Realizar antibiograma para verificação de resistência (CFO + OXA).

Pesquisa de VRE e KPC

A sigla de VRE significa “Vancomycin-resistence enterococcus”, e pode ser

traduzida para o português como sendo “enterococo resistente à vancomicina”

Os pacientes com maior risco para aquisição de infecção ou colonização por VRE
são:
• Pacientes com doença de base severa (neoplasias, hepatopatas, nefropatas) ou
imunossupressão (pacientes submetidos a transplantes ou em quimioterapia).
• Pacientes submetidos à cirurgia abdominal ou cardiotorácica.
• Pacientes submetidos à sondagem vesical ou cateterismo venoso central.
• Pacientes com internação prolongada ou que receberam múltiplos antibióticos,
incluindo vancomicina.
As culturas de vigilância em ambiente hospitalar são realizadas a partir de swab
retal. Utiliza-se meios de cultura líquido e sólido, que permitem a inibição do
crescimento de bactérias sensíveis a Vancomicina, proporcionando a seletividade de
bactérias resistentes a este. O procedimento se dá da seguinte forma:
As amostras semeadas em meio líquido BHI-vanco são analisadas após incubação
por 24 horas em estufa bacteriológica.
Após este período, se houver turvação no tubo, semeia-se em meio Bea-vanco.
Após mais 24 horas, se houver mudança de colocação do meio para preto,
indicando consumo da bile esculina presente no meio, semeia-se em Ágar Sangue. Se
não houver crescimento, deve-se aguarda até 48 horas para liberar o exame.
Se houver crescimento de colônias acinzentadas, realiza-se o teste PYR. Se este
for negativo, o exame é liberado como negativo para VRE. Se positivo, faz-se a
identificação automatizada ou série bioquímica com telurito, arabinose, bile esculina e
NaCl 0,5%.
Se o resultado for E. faecalis ou E. faecium, deve-se verificar o MIC
(concentração mínima inibitória) de Vancomicina, com fita de E-test. Se o MIC for
maior que 256 mcg/mL, solta-se o resultado positivo para VRE, com a identificação e
MIC do microrganismo. Para isso, deve-se fazer um inóculo na escala 0,5 de McFarland
e deve-se depositar 10µl na superfície do meio Mueller-Hinton.

Ou através de outro procedimento laboratorial:

 A amostra deve ser passada do tubo de transporte para o Caldo Tioglicolato com
indicador
 Deve-se aguardar turvação (no mínimo 4hrs.)
 Semear no meio CPS
 Adicionar o disco de Vancomicina no segundo estriamento no Agar CPS
 Se houver crescimento de colônias sugestivas de enterococos próximas ao disco,
realizar semeadura da mesma em AGAR CROMOGÊNICO VRE

KPC- Klebsiella pneumoniae, faz parte de um grupo de enterobactérias produtora

da enzima carbapenemase (associou-se o nome da enzima ao microrganismo de
onde foi isolada pela primeira vez e onde há maior prevalência), que inativam os
carbapenêmicos (Ertapenem, Imipenem, Doripenem e Meropenem) e outros
Betalactâmicos.

A propagação da bactéria se dá pelo contato intra-hospitalar. Não existe outro meio de

disseminação da bactéria que não seja através da transmissão cruzada pelo manuseio de
pacientes, equipamentos utilizados pela equipe multidisciplinar e objetos contaminados.
Os pacientes de setores fechados (CTI, UTI, etc.), clínica cirúrgica, transplantados,
imunossuprimidos e submetidos á antibioticoterapia por longos períodos, são os mais
propensos a serem infectados.

Procedimento Laboratorial
  A amostra deve ser passada do tubo de transporte para o Caldo Tioglicolato com
indicador
 Deve-se aguardar turvação (no mínimo 4hrs.)
 Semear no MacConkey
 Adicionar Meropenem no segundo estriamento e Imipenem no terceiro
estriamento no Agar MacConkey
 Após incubação por 24hrs. Em 35 +/- 2 °C
 Verificar crescimento de colônias próximas ao disco
 Se houver, semear em Agar KPC ou realizar antibiograma manual (Ertapenem,
Meropenen e Imipenem).

Procedimento

 Semear amostra em Agar Sangue, chocolate e MacConkey e Caldo Tioglicolato

com indicador
 Centrifugar amostra por 20 min. (é muito importante que se tenha feio a
separação da amostra para cada setor)
 Realizar lâmina (Gotejar sobre a lâmina o material sem esfregar)
 Se não houver crescimento microbiano na placa, o Caldo deve-se apresentar sem
turvação.
Anexo

RASTREAMENTO E PREVENÇÃO DE DISSEMINAÇÃO DE MRSA. Disponível

em: < http://www.me.ufrj.br/images/pdfs/protocolos/ccih/rotina_de_coleta_mrsa.pdf>.

PLANO DE PREVENÇÃO E CONTROLE DE BACTÉRIAS

MULTIRRESISTENTES (BMR) PARA OS HOSPITAIS DO ESTADO DE SÃO
PAULO. Disponível em: <
ftp://ftp.cve.saude.sp.gov.br/doc_tec/ih/projeto/doc/ih16_bmr_vigilancia_epidem.pdf>.

AGAR CROMOGÊNICO VRE. Disponível em: <

http://www.probac.com.br/Anexos/Bulas/Seletivos/Agar%20Cromog%C3%AAnico%2
0VRE%20rev.05.pdf>.

AGAR CROMOGÊNICO KPC. Disponível em: <

http://www.probacbrasil.com/Anexos/Bulas/Seletivos/Agar%20Cromog%C3%AAnico
%20KPC-%20Rev%2004.pdf>.