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CTESP

2018_2019

Escola Superior de Tecnologia de Barreiro

Nome do Trabalho

Doseamento de proteínas por espetrofotometria de UV/Vis

O presente relatório insere-se no âmbito da unidade curricular Métodos


Instrumentais de Análise C, do curso de Tecnologias de Laboratório Químico e
Biológico, do Instituto Politécnico de Setúbal e teve como objetivo o
doseamento de proteínas por espetrofotometria de UV/Vis.

Durante a realização deste trabalho experimental procedeu -se:

 Diluição de soluções (Leite magro e BSA -Albumina de soro bovino);


 Quantificação de proteínas por espetrofotometria UV-Visível através de
um método direto (absorção a 280 nm) e método indireto ou
colorimétricos (método do BCA).

Este trabalho experimental permitiu aplicar tratamentos estatísticos como a


determinação da curva de calibração que correlacionam a absorvância com
a concentração de proteína para cada método utilizado, determinação por
regressão linear a constante de correlação entre a absorvância e a
concentração de proteína para cada método, determinação da
concentração de proteínas totais nas amostras de leite analisadas,
determinação do valor da média arimética e o valor do desvio padrão.

Nome dos elementos do grupo:

Ana Carvalho Nº 2543

Inês Pereira Nº 2550

Rute Borges Nº 2562

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CTESP

2018_2019

Instituto Politécnico de Setúbal

Escola Superior de Tecnologia do Barreiro

CTeSP TLQB – Bioquímica e Análises Bioquímicas

Trabalho Prático Nº2

Trabalho realizado por:

 Ana Carvalho Nº 2543


 Inês Pereira Nº 2550
 Rute Borges Nº 2562

Sines, 11 de junho de 2018


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Índice Geral

Índice de Tabelas

Não foi encontrada nenhuma entrada do índice de ilustrações.


Índice de Figuras

Figura 1 Estrutura dos aminoácidos .................................................................................... 1


Figura 2 Formação da proteína a partir de aminoácidos .......................................... 1
Figura 3 Níveis estruturais das proteínas ..............................Error! Bookmark not defined.
Figura 4 Métodos baseados na técnica de espetrofotometria de UV-VisívelError!
Bookmark not defined.
Figura 5 Etapas do método de Lowry modificado ..........Error! Bookmark not defined.
BAB – TP2 – Doseamento de proteínas por espetrofotometria de UV/Vis

1. Introdução

2.1. Proteínas

Os seres vivos são constituídos por macromoléculas responsáveis pela maioria


das funções vitais. Uma delas é a proteína, cujo nome é derivado do grego
protos que significa a mais importante ou a primeira.

As proteínas, macromoléculas orgânicas, têm os α-aminoácidos como


subunidades estruturais básicas os quais possuem um grupo amino (H2N), grupo
carboxilo (COOH) e o radical (R) ligados ao átomo de carbono (α).

Os α-aminoácidos diferenciam-se pela cadeia lateral e apresentam a seguinte


estrutura mencionada na Figura 1.

Figura 1 Estrutura dos aminoácidos

O radical (R) define as propriedades do aminoácido de acordo com o grupo


funcional, dimensão, carga e solubilidade.

Para formar proteínas, os aminoácidos (unidade estrutural das proteínas) ligam-


se através das ligações peptídicas, ligação do grupo amino de um aminoácido
e o grupo carboxilo de outro aminoácido, com eliminação de uma molécula
de água (reação de condensação), tal como mostra a Figura 2.

Figura 2 Formação da proteína a partir de aminoácidos

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As proteínas podem ter propriedades e atividades totalmente diferentes pelas


diversas combinações e sequências dos 20 aminoácidos existentes. Basta uma
única mudança em qualquer dos aminoácidos de uma sequência para se ter
uma nova proteína.

Pode-se descrever a estrutura da proteína em quatro níveis estruturais, tal como


mostra o esquema mencionado abaixo.

Estrutura Primária
• Sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica.

Estrutura Secundária
• Refere-se à configuração espacial da cadeia polipeptídica, como ela se
enrola ou forma camadas.
Estrutura Terciária
• Especifíca a forma na qual a α-hélice, a folha plissada β e outras regiões
estão dobradas.
Estrutura Quaternária
• Associação entre proteínas individuais para formar um arranjo específico.

A perda das estruturas secundária e terciária da proteína ou rompimento de


ligações peptídicas é denominada desnaturação da proteína.

Os fatores que provocam a desnaturação são, nomeadamente:

 Calor;
 Radiações eletromagnéticas de certos comprimentos de onda;
 Ácidos e bases;
 Solventes orgânicos;
 Iões de metais pesados.

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2.2. Métodos bioquímicos para estudo das proteínas

No estudo de proteínas podem ser realizados métodos com diversos e diferentes


objetivos, tal como mostra o esquema representado abaixo.

•Quantificação

•Separação e purificação da
proteína
Métodos

•Determinação da
composição e sequência dos
aminoácidos

•Estudo da estrutura
tridimensional

•Caracterização da
funcionalidade

2.3. Quantificação de proteínas

Existem diversos métodos para determinação da concentração de proteína em


solução, nenhum destes testes é específico para uma proteína em particular.

Os métodos mais utilizadas são os de espetrofotometria no ultravioleta e no


visível.

No esquema estão representados os métodos espetrofotométricos de


doseamento de proteínas.

Absorção de Método do
Reagente Método de
proteínas no BCA
de Bradford Biureto Lowry
ultravioleta

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A escolha do método a utilizar depende de cinco critérios principais,


nomeadamente:

1. Quantidade de proteína disponível para a determinação;


2. Concentração da proteína;
3. Especificidade do ensaio;
4. Presença de reagentes que poderão interferir com o ensaio;
5. Facilidade e reprodutibilidade.

2.4. Espetrofotometria de absorção de UV/Vis

A técnica de espetrofotometria de absorção de UV/Visível pode ser usada


como uma técnica quantitativa, para o doseamento de compostos que
absorvem radiação (luz) na gama do ultravioleta-visível.

•Efetua medições de absorvância de luz


Espetrofotómetro
a um comprimento de onda definido.

Esta técnica baseia-se nos seguintes princípios básicos:

 A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução


por ela atravessada.

 A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida


pelo feixe luminoso através das amostras.

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Juntando os dois princípios básicos desta técnica, tem-se a lei de Beer-Lambert


que é expressa pela seguinte expressão matemática.

𝐴𝑏𝑠 = 𝜀 × 𝐶 × 𝑙

Em que:

Abs - Absorvância;

ε - Coeficiente de absortividade molar (M-1cm-1);

C - Concentração da solução absorvente (mg/ml);

l - Distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra (cm).

Normalmente usam-se cuvettes com 1 cm de comprimento, de modo que a


expressão fica, nomeadamente:

𝐴𝑏𝑠 = 𝜀 × 𝐶 ⇔ 𝐶 =

Ou seja, a absorvância da luz a cada comprimento de onda (λ) n é diretamente


proporcional à concentração da solução. Esta linearidade deixa de acontecer
em concentrações muito elevadas, sendo nesses casos necessário diluir
previamente a amostra a medir.

2.5. Quantificação de proteínas por espetrofotometria UV-Visível

A quantificação de proteínas é um ponto muito importante no tratamento de


amostras para caracterização, isolamento e um pré-requisito antes de as
submeter a análises cromatográficas, eletroforéticas, imunoquímicas e de
separação.

As proteínas têm em geral um pico de absorção máxima ao comprimento de


onda de 280 nm. Esta absorção deve-se à presença de aminoácidos com
cadeias laterais que absorvem a este comprimento de onda, nomeadamente
os aminoácidos aromáticos – triptofano, tirosina, fenilalanina e também a
cisteína. O coeficiente de absortividade molar de cada proteína vai diferir de
acordo com o número de resíduos destes aminoácidos que esta contiver.

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A maioria dos métodos de doseamento de proteínas baseia-se na técnica de


espetrofotometria de UV-Visível.

No esquema está representado os dois métodos baseados na técnica de


espetrofotometria de UV-Vis.

Método indireto Método do BCA

Espetrofotometria
UV-Vis

Método direto Absorção a 280 nm

Estes métodos baseiam-se na referida Lei de Beer-Lambert. Quando se


quantifica uma solução de uma proteína pura, pode-se utilizar o seu coeficiente
de absortividade molar (ε), previamente determinado. Contudo, o mais comum
é tratar-se de misturas de proteínas em que cada uma terá um ε diferente e/ou
que os coeficientes de absortividade molar (ε) sejam desconhecidos.

Assim, estes métodos são sempre feitos através de comparação com uma
amostra de concentração proteica bem definida, tipicamente uma solução da
proteína BSA (Albumina do Soro Bovino) cuja concentração não é dada em
mol/dm3, mas sim em mg/ml. Efetua-se uma curva de calibração utilizando
amostras com concentrações sucessivamente menores de BSA, de modo a
obter uma expressão matemática que corresponde a uma resposta linear entre
a concentração de proteína e a leitura de absorvância ao comprimento de
onda especificado no método.

Em termos simples, efetuam-se curvas de calibração com diferentes


concentrações de uma solução padrão de analito, neste caso a proteína BSA,
para verificar qual o intervalo de concentrações em que a resposta é linear.

Se a amostra apresentar um valor de absorvância fora do intervalo da curva de


calibração, deve ser efetuada uma diluição da amostra e quantificação da
amostra diluída.

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2.6. Método direto

Este método é particularmente utilizado em separação de proteínas por


cromatografia – como método de deteção semi-quantitativa das amostras
recolhidas. É também usado como diagnóstico na avaliação de contaminação
de amostras de ácidos nucleicos.

Algumas proteínas apresentam grupos cromóforos, como é o caso da


hemoglobina que contém grupos hemos de cor vermelha. Essas proteínas
podem ser quantificadas pela absorvância máxima nessa região do espetro
visível, quando conhecido o ε.

Um dos maiores inconvenientes deste método é a necessidade de cuvettes


especiais (de quartzo ou plástico especial – UVettes) que absorvam pouco na
região UV, para além de muito mais suscetíveis à presença de outros compostos
que também absorvam neste comprimento de onda, originando leituras
superiores ao verdadeiro conteúdo proteico.

2.7. Método indireto

Para efetuar a quantificação de proteínas totais numa solução existem diversos


métodos colorimétricos que se baseiam em reações químicas com as cadeias
polipeptídicas em que o reagente altera a sua cor. Nestes métodos, o
desenvolvimento de cor – formação do composto cromóforo - é proporcional
à concentração de proteína e é quantificável pela absorção a um dado
comprimento de onda, característico do método. Tanto as amostras a
quantificar como a curva de calibração com proteína BSA (Bovine serum
albumine ou Albumina do Soro Bovino) a concentrações crescentes, sofrem o
mesmo tratamento para se dar a reação química.

2.8. Método BCA

O método do BCA, sigla que designa o reagente principal – o ácido


bicinconínico.

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É um método colorimétrico para doseamento de proteínas muito comum.


Este método baseia-se também na redução de Cu2+ a Cu1+ pelas proteínas,
quando em meio alcalino, sendo o ácido bicinconínico o reagente
responsável pela deteção colorimétrica, sensível e seletiva, dos iões Cu1+
formados.

Este método envolve duas etapas, tal como mostra o esquema representado
abaixo.

Primeira etapa (reação de biureto)

• Ocorre a quelatação dos iões cobre pelas proteínas, em meio alcalino e


na presença de tartarato de sódio e potássio, formando-se um complexo
azul claro (de iões Cu1+).

Segunda etapa (desenvolvimento de cor)

• O ácido bicinconínico reage com os iões Cu1+ formados, dando origem


a um complexo de 2 moléculas de BCA a quelatar cada ião cuproso. Este
complexo BCA/cobre é soluvel em água, apresenta uma intensa cor roxa,
e absorve linearmente a 562 nm em proporção a quantidades crescentes
de proteína.

A grande vantagem deste método é que é 100 vezes mais sensível (limite de
deteção inferior) do que a reação inicial do “biureto”, em que se forma a ténue
cor azul. A reação do BCA é muito influenciada pela presença de 4 tipos de
resíduos de aminoácidos (cisteína ou cistina, tirosina e triptofano) na sequência
de aminoácidos da proteína. No entanto, ao contrário de métodos à base do
corante Coomassie, o esqueleto da proteína também contribui para o
desenvolvimento de cor, tornando-o menos suscetível a variabilidade por
composições proteicas muito distintas.

O método do BCA é também experimentalmente muito simples, pois usa-se um


único reagente que é preparado na altura, por mistura de duas soluções
estáveis – o reagente A e o reagente B, em proporção 50:1. O método
apresenta ainda uma elevada reprodutibilidade.

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2. Descrição Experimental

A temperatura do laboratório registada no início do trabalho experimental foi


de 22ºC.

5.1 Material

 Tubos de ensaio
 Suporte para tubos de ensaio
 Copos de 50 mL
 Cuvettes de quartzo
 Cuvettes normais
 Micropipetas P1000 e P200
 Pontas descartáveis azuis e amarelas

b. Equipamento

As tabelas seguintes listam os equipamentos e reagentes utilizados no trabalho


experimental, bem como descrevem as suas características.

Tabela 1 Especificações equipamentos

Equipamento Marca Modelo

Espetrofotómetro de UV/Vis Unicam UV 2

c. Reagentes

Tabela 2 Especificações reagentes

Pureza
Nome Fórmula Química Marca Pictograma
(%)

Mínimo
Cloreto de Sódio NaCl Merck N.P
99,5

Mínimo
Hidróxido de sódio NaOH JNGS
99,14

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d. Soluções

Data de
Solução Concentração
preparação
Solução padrão de BSA 2 mg/mL 16/11/2018
Leite magro S.I 16/11/2018
S.I – Sem informação

e. Segurança

Tabela 3 Especificações dos equipamentos de proteção individual

Equipamento de Proteção Individual – EPI Proteção


Bata de segurança Tronco
Óculos de segurança Olhos
Luvas de latex Pele (mãos)

f. Preparação de soluções

i. Amostra de Leite

Pipetou-se rigorosamente 1,000 mL de leite e adicionou-se água desionizada até


perfazer o volume final de 100 mL, apontando a água para as paredes do balão
volumétrico de para evitar a formação de bolhas de ar.

Rolhou-se o balão volumétrico de 100 mL e homogeneizou-se a solução


invertendo-o alternadamente. Rotulou-se o balão volumétrico de 100 mL
constando o composto da solução, a concentração, o número dos elementos
do grupo, a turma e a data de preparação.

Método direto por UV a 280 nm

Preparou-se em 4 microtubos de 500 µL as soluções para a curva de calibração


de BSA da seguinte forma:

 Ensaio em branco (0 µg/mL): pipetou-se para o microtubo 500 µL de água


desionada.
 BSA 100 µg/mL: pipetou-se para o microtubo 25 µL de solução padrão e 475 µL
de água desionada.

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BAB – TP2 – Doseamento de proteínas por espetrofotometria de UV/Vis

 BSA 500 µg/mL: pipetou-se para o microtubo 125 µL de solução padrão e 500 µL
de água desionada.
 BSA 1000 µg/mL: pipetou-se para o microtubo 250 µL de solução padrão e 250
µL de água desionada.

Amostras do método direto por UV

 Diluição 1/2: pipetou-se para o microtubo 150 µL de solução proteica e 150


µL de água desionada.
 Diluição 1/5: pipetou-se para o microtubo 60 µL de solução proteica e 240 µL
de água desionada.
 Diluição 1/10: pipetou-se para o microtubo 30 µL de solução proteica e 270
µL de água desionada.
 Diluição 1/20: pipetou-se para o microtubo 15 µL de solução proteica e 285
µL de água desionada.

Método do BCA a 560 nm

Preparou-se o reagente BCA num frasco de vidro previamente lavado com


água desionizada. Misturou-se 50 volumes de solução A de BCA com um volume
de solução B de BCA. Agitou-se suavemente a mistura para homogeneizar a cor
(verde).

Preparou-se em 6 microtubos de 50 µL as soluções para a curva de calibração


de BSA da seguinte forma:

 Ensaio em branco (0 µg/mL): pipetou-se para o microtubo 50 µL de água


desionada;
 BSA 100 µg/mL: pipetou-se para o microtubo 2,5 µL de solução padrão e 47,5 µL
de água desionada;
 BSA 250 µg/mL: pipetou-se para o microtubo 6,25 µL de solução padrão e 43,70
µL de água desionada (1);

 BSA 500 µg/mL: pipetou-se para o microtubo 12,5 µL de solução padrão e 37,5
µL de água desionada;
 BSA 750 µg/mL: pipetou-se para o microtubo 18,75 µL de solução padrão e 31,25
µL de água desionada;
 BSA 1000 µg/mL: pipetou-se para o microtubo 25 µL de solução padrão e 25 µL
de água desionada.

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BAB – TP2 – Doseamento de proteínas por espetrofotometria de UV/Vis

Após a preparação dos microtubos foi adicionado a cada um deles um 1 mL do


reagente BCA. Homogeneizou-se os microtubos levemente e foi a incubar a 37ºC
durante 30 minutos. Após o arrefecimento leu-se a absorvância.

Amostras do método BCA

 Diluição 1/2: pipetou-se para o microtubo 25 µL de solução proteica e 25 µL


de água desionada (em duplicado);
 Diluição 1/5: pipetou-se para o microtubo 10 µL de solução proteica e 40 µL
de água desionada (em duplicado).

Após a preparação dos microtubos foi adicionado a cada um deles um 1 mL do


reagente BCA. Homogeneizou-se os microtubos levemente e foi a incubar a 37ºC
durante 30 minutos. Após o arrefecimento leu-se a absorvância.

3. Resultados Experimentais

Para a preparação do reagente de BSA, com as respetivas concentrações de


0, 100, 500 e 1000 µg/mL, a partir de uma solução padrão de BSA com 2 mg/mL,
foi necessário recorrer à conversão das unidades da solução padrão.

Figura 3 Tabela de conversão de unidades

Exemplo de cálculo: Obtenção das unidades de concentração da solução


padrão.

0, 002mg   g
1, 0 106  1 g   2000 g

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Em que:

x: Quantidade da solução padrão (µg)

Na tabela 4 está representado os dados para a curva de calibração.

Tabela 4 Método Direto UV - Concentrações/Volumes

Tubo BSA (µg/ml) VBSA(µL) VH2O(µL) Vtotal(µL)


1 0 0 500 500
2 100 25 475 500
3 500 125 375 500
4 1000 250 250 500

Na tabela 5 está representado os dados para as amostras do método direto.

Tabela 5 Preparação de amostra para o método UV

Tubo Proteína Vsproteica(µL) VH2O(µL) Vtotal(µL)


(µg/ml)
5 ½ 150 150 300
6 1/5 60 240 300
7 1/10 30 270 300
8 1/20 15 285 300

Na tabela 6 está representado os dados para a curva de calibração.

Tabela 6 Método do BCA

Tubo BSA (µg/ml) VBSA(µL) VH2O(µL) Vtotal(µL)


1 0 0 50 50
2 100 2,5 47,50 50
3 250 6,25 43,70 49,95(1)
4 500 12,50 37,50 50
5 750 20 30 50
6 1000 25 25 50
(1) alteração do volume total foi devido ao tipo de micropipetas existentes no laboratório.

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Na tabela 7 está representado os dados para as amostras do método BCA.

Tabela 7 Preparação das amostras pelo método BCA

Tubo Proteína Vsproteica(µL) VH2O(µL) Vtotal(µL)


(µg/ml)
1 1/5 10 40 50
2 1/5 10 40 50
3 ½ 25 25 50
4 ½ 25 25 50

A obtenção do volume de BSA (solução padrão) para a construção das


soluções de BSA (µg/mL) foi realizada através da fórmula das diluições.

Ci  Vi  C f  V f

Em que:

Ci – Concentração inicial (µg/mL)

Vi - Volume inicial (mL)

Cf - Concentração final (µg/mL)

Vf - Volume final (mL)

2000 Vi  100  300  Vi  15 L

A obtenção do volume de H2O para a construção das soluções de BSA (µg/mL)


foi realizada através da diferença entre o volume total e o volume de BSA
(solução padrão) obtida anteriormente,

VH 2O  VTotal  VBSA

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Em que:

VH2O – Volume de água a adicionar (µL)

VTotal – Volume Total da solução (µL)

VBSA – Volume da solução padrão de BSA (µL)

VH 2O  300  15  VH 2O  285 L

No gráfico 1 está representado a curva de calibração do método direto UV.

0.35
0.3 y = 0.0003x + 0.0195
R² = 0.9888
0.25
0.2
ABS

0.15
0.1
0.05
0
0 200 400 600 800 1000 1200
Concentração (µ/mL)

Gráfico 1 Curva de calibração de método direto UV

No gráfico 2 está representado a curva de calibração do método de BCA.

0.6

0.5

0.4
y = 0.0004x + 0.1059
ABS

0.3 R² = 0.992

0.2

0.1

0
0 200 400 600 800 1000 1200
Concentração (µ/mL)

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Gráfico 2 Curva de calibração do método BCA

Obtida a reta de regressão linear entre a absorvância e a concentração de


proteína, nos distintos métodos, calculou-se a concentração de proteínas totais
nas amostras de leite analisadas.

Na tabela 8 está representado a concentração das amostras.

Tabela 8 Concentração das proteínas pelo método UV

Amostra Absorvância Camostra (µg/mL)


1 0,027 25
2 0,150 435
3 0,295 918

Na tabela 9 está representado a concentração das amostras.

Tabela 9 Concentrações das proteínas pelo método BCA

Amostra Absorvância Camostra (µg/mL)


1 0,110 10,25
2 0,108 5,25
3 0,169 157,75
4 0,151 112,75

Coeficiente de correlação = 0,992

Equação da reta:

y = mx + b

y = 0,0003x + 0,0195 em que:

x - concentração em µg/mL

y - absorvância

y  0, 0003x  0, 0195  0, 027  0, 0003x  0, 0195  x  25 / ml

Através desta equação calculou-se as concentrações das amostras acima


mencionadas nas tabelas 8 e 9.

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4. Análise dos Resultados

De acordo com a Lei de Lamber-Beer, existiram desvios a nível do coeficiente


de correlação nas duas curvas de calibração, ocorreram valores de 0,9888 e
de 0,992. Estes valores podem ter resultado de interferências a nível do feixe de
UV emitido pelo espectrofotómetro, visto que o método de UV é muito sensível.

Contudo, as concentrações proteicas das várias amostras, por ambos os


métodos de UV e BCA, através das respetivas retas de regressão linear y= 0,0003x
+ 0,0195 e y= 0,0004x + 0,1059.

5. Conclusão
Diversos fatores devem ser analisados antes da escolha de uma metodologia
para a determinação de proteínas totais, porém, um deles é essencial: o
conhecimento, o mais preciso possível, da natureza dos constituintes da
amostra e de suas concentrações aproximadas. Isto facilitará a identificação
dos possíveis interferentes e consequentemente ajudará na escolha do método
mais apropriado para cada situação.

Nesta atividade laboratorial, foi possível testar dois métodos o UV e BCA com
níveis de sensibilidade diferentes, contudo foi possível observar as
concentrações proteicas das amostras.

6. Bibliografia

 D. A. Skoog, “Principles of Instrumental Analysis, 4th Edition, Sauders


 “Pierce´s Modified Lowry Protein Assay Kit – PRODUCT INFORMATION SHEET”,
Pub.No. MANN0011229. Ver.A.00. Doc.Part No.0389.6 © 2011 Thermo Fisher
Scientific Inc.,Usa.
 “Protocolo f the Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay” Pub.No.064PR-02, ©
2016,G-Biosciences
 http://www.cdcc.usp.br/exper/medio/quimica/7bioquimi_2e3.pdf
 D. A. Skoog, “Principles of Instrumental Analysis, 4th Edition, Sauders

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 “Protocolo f the Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay” Pub.No.064PR-02, ©
2016,G-Biosciences
 http://www.cdcc.usp.br/exper/medio/quimica/7bioquimi_2e3.pdf

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