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BIOTECNOLOGIA VEGETAL

CASE 1. MISSION ON A NEW


PLANET
BIOTRANSFORMATION OF HYOSCYAMINE INTO SCOPOLAMINE IN TRANSGENIC
TOBACCO CELL CULTURES TRANSFORMED BY AGROBACTERIUM TUMEFACIENS.

Carmen Fidalgo
Agustí Gonzalez
Alba Martínez
Alejandro Guillén
ÍNDICE

PRESENTACIÓN DEL CASO .......................................................................................... 2

BIOTECHNOLOGY LABORATORY EQUIPMENT ..................................................................... 2


BIOLOGICAL MATERIAL ....................................................................................................... 2

RESOLUCIÓN DEL CASO ............................................................................................... 3

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 3

OBJETIVOS .......................................................................................................................... 3

PROTOCOLO ........................................................................................................................ 4
1. Transformación de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 por el método triparental mating ............... 4 Formatted: Font: 9 pt
(REFERENCI

2. Transformación de suspensiones celulares BY2 de tabaco con Agrobacterium tumefaciens LBA4404 .. 6

3. Cultivos de células inmovilizadas en perlas de alginato...................................................................... 7

4. Bioconversión a escopolamina y cuantificación por HPLC .................................................................. 7

5. Escalado de la producción de escopolamina en biorreactores ............................................................ 8

REFERENCIAS ................................................................................................................ 9

1
PRESENTACIÓN DEL CASO

A HUMAN COLONY IS ESTABLISHED ON A NEW, RECENTLY DISCOVERED PLANET. AFTER A SHORT TIME OF LIVING
THERE, PEOPLE BEGIN TO FEEL DIZZY AND SICK, AND PART OF THE POPULATION BECOMES BED-RIDDEN. THEY

CONTACT EARTH AND EXPLAIN THE SYMPTOMS TO A DOCTOR, WHO TELLS THEM THEY SHOULD TAKE 1 MG

SCOPOLAMINE DAILY. UNFORTUNATELY, WHEN THE FIRST AID KIT WAS PACKED, SCOPOLAMINE WAS CONFUSED

WITH ANOTHER ALKALOID, HYOSCYAMINE, WHICH HAS A SIMILAR STRUCTURE BUT DIFFERENT THERAPEUTIC

EFFECTS.

AFTER CONTACTING BASE CAMP AGAIN, THE COLONISTS ARE INFORMED BY THE DOCTOR THAT HYOSCYAMINE HAS
SOME UNDESIRABLE SECONDARY EFFECTS, AND THAT THE BIOTECHNOLOGY LABORATORY WOULD INSTRUCT

THEM HOW TO TRANSFORM HYOSCYAMINE INTO SCOPOLAMINE. IN THE NEW PLANET, THERE IS A LABORATORY

EQUIPPED WITH EVERYTHING THEY NEED TO PERFORM THIS BIOCONVERSION.

BIOTECHNOLOGY LABORATORY EQUIPMENT

 20 L Stirred and airlift bioreactors.


 Autoclave.
 Laminar flow cabinet.
 PCR equipment.
 HPLC.
 Petri plates
 All types of general material for the laboratory and in vitro culture
 Mineral salts of MS medium (Murashige-Skoog) and other components of plant cell culture media.
 All the components to prepare bacterial culture media.
 Sucrose
 Vitamins
 Amino acids
 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (0, 5 µM).
 Myo-inositol.
 Kanamycin.
 Claforam.
 Acetosyringone. Commented [agh1]: Ar

BIOLOGICAL MATERIAL

 Tobacco BY2 cell line


 Agrobacterium tumefaciens LBA4404
 Several strains of E. coli
 Plasmid pHY8: this plasmid contains the gen of hyoscyamine-6β-hydroxylase under the control of
the 35SCaMV promoter and the nopaline synthase terminator, together with the gen npII for
kanamycin resistance in eukaryotic cells.

2
RESOLUCIÓN DEL CASO
INTRODUCCIÓN

El caso plantea la resolución de una misión en un nuevo planeta. Esta misión consiste
en proporcionar las instrucciones necesarias para la transformación del compuesto
hiosciamina en escopolamina, el fármaco requerido en el nuevo planeta.

La enzima Hyosciamine-6beta-hidroxilasa (H6H)


cataliza esta conversión en una reacción de dos pasos
(Hashimoto et al., 1993). En el presente documento se
presenta un protocolo adaptado a las circunstancias del
caso para el establecimiento de cultivos de células BY2 de
tabaco que llevan gen H6H bajo el control del promotor
CaMV 35S. Los cultivos celulares serán obtenidos a través
de la infección con Agrobacterium tumefaciens
genéticamente modificado con el plásmido pHY8. Para la
biotransformación, el precursor hiosciamina será
proporcionado al medio de cultivo y el proceso deberá
escalarse en biorreactores para garantizar una
producción del fármaco en cantidades suficientes.

Figura 1. Transformación de Hiosciamina


a escopolamina por la enzima
Hyosciamine-6beta-hidroxilasa (H6H).
OBJETIVOS

Los objetivos a tener en cuenta en el diseño del protocolo se resumen en 3 puntos:

1. Obtención de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 modificado genéticamente


con el plásmido Phy8 que contiene el gen H6H.
2. Transformación de las células vegetales con Agrobacterium tTumefaciens y
obtención de cultivos in vitro de células transformadas altamente productivas
para la expresión del trangen.
3. Escalado del proceso en biorreactores y extracción/purificación del fármaco
escopolaminea.

3
PROTOCOLO
1. Transformación de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 por el método triparental
mating (REFERENCIAdescrito por Hoekema et al., 1983).

El método triparental mating permite transformar Agrobacterium tumefaciens (cepa


receptora) gracias a la conjugación con una cepa de E.coli donadora con el plásmido de
interés y una cepa de E.coli movilizadora con un plásmido Helper que permite la
movilización del plásmido con el trangen de la cepa de E.coli donadora a la cepa de
Agrobacterium aceptora (Hoekema et al. 1983). Formatted: Font: Italic

1.1 Obtención de células E.coli DH5α competentes. Protocolo descrito por Sambrook Formatted: Font: Italic, Font color: Background 2,
Spanish (Spain)
et al., 1989.
Formatted: Font: Italic, Font color: Background 2,
Spanish (Spain)
● Inocular una sola colonia bacteriana en 5 ml de LB durante unala noche a 37 ° C con
agitación vigorosa.
● Transferir 1 ml del cultivo del cultivo generado en 100 ml de LB e incubarción a 37 ° C
con agitación vigorosa hasta que el OD600 alcance 0,4.
● Enfriar los cultivos a 0 ° C durante 10 min y recuperar las células por centrifugación a
4500 rpm durante 10 min a 4 ° C. Decantar el medio del sedimento celular.
● Resuspender el sedimento por agitación o vórtex suave en 30 ml de la solución de
MgCl2-CaCl2 enfriado y recuperar las células por centrifugación a 4500 rpm durante 10
min a 4 ° C. Decantar el medio.
● Resuspender el Pellet por agitación o vórtex suave en 1 ml de CaCl2 0,1 M y 1 ml de
glicerol al 40%.

1.2 Introducción del plásmido pHY8 en la cepa donadora E.coli DH5α mediante el
método conde CaCl2. (Protocolo de Vadawale, A. et al., 2011).

● Mezclar en un tubo estéril en agitación 100-200 µl de células tratadas con CaCl2 con
hasta 5 µl del plásmido. Enfriar el tubo 30 min en hielo.
● Incubar a 42ºC en un bañnyo de agua 90 segundos exactos y rápidamente enfriar en
hielo 2 min.
● Añadir 400-800 µl de LB al tubo e incubar durante 45 min a 37 ° C.
● Sembrar las células en placas con LB líquido con 50 μg/ml de kanamicina.

4
● Incubar a 37 ° C durante 16-18 horas.

1.3 Triparental mating con E. coli DH5a con pHY8 (kanR) como cepa donante, E. cColi Formatted: Font: (Default) +Headings (Calibri Light),
Italic, Font color: Background 2, Spanish (Spain)
DH5a con pRK2013 (kanR) como la cepa ayudante y Agrobacterium tTumefaciens
Formatted: Font: (Default) +Headings (Calibri Light),
LBA4404 (RifR, TetR) como cepa receptora. El procedimiento fue está descrito por Italic, Font color: Background 2, Spanish (Spain)

Hoekema et al., 1983.

● Sembrar en una placa de agar Luria (sin ningún antibiótico) una colonia de estaba
preparado una colonia de cada cepa en posiciones separadas como se muestra en la Commented [B2]: Esta frase no tiene sentido

figura 2.
● Mezclar las tres cepas bacterianas y dejar a 30 ° C durante 12-18 horas. Por
● Suspender las bacterias deen la placa de agar Luria en 1 ml de LB. Hacer una dilución en
serie de 0,1 ml de suspensión bacteriana en 0,9 ml de LB seguida de otras diluciones de
hasta 10-4 -10-5.
● Mezclar100 µl de cada dilución en medio de agar de Luria con los antibióticos
Kanamicina, TetraciclinaTet y RifampicinaRif y esparcir uniformemente en las placas.
● Incubar las placas durante 4-5 días.

Figura 2. Triparental mating. A: Agrobacterium


tumefaciens (RifR TetR); D: Donor pHY8 (KanR) y H:
Helper strain (KanR).
1.
1.4 Selección de las colonias de Agrobacterium tumefaciens transformadas.
2. La selección de las colonias ds cálleles de Agrobacterium tumefaciens transformadas se Commented [B3]: ¿COLONIAS??

r realiza por los marcadores de resistencia a antibióticos de las distintas cepas (tabla 1). Sólo las Formatted: Font: 11 pt, Highlight

células de Agrobacterium transformadas pueden crecer en un medio con rifampicina, Formatted: Font: 11 pt, Italic
Formatted: Font: 11 pt, Italic
tetraciyclinae y kanamiciyna, de manera que las colonias que crezcan s obteniden esas

5
condiciones as pasados los 4-5 días, serán las colonias generadas de las células de
Agrobacterium tumefaciens correctamente transformadas, es decir laos que contengan los tres Formatted: Font: 11 pt, Italic

genes de resistencia. Estas colonias se deberán emplearusados para infectar las células s cálleles
vegetales en procesos posteriores.
Para asegurar que estas colonias son de Agrobacterium transformado se puede realizar una
validación de la transformación mediante PCR y electroforesis.Para validar que las colonias de
Agrobacterium tumefaciens seleccionadas están transformadas, se puede realizar una PCR para Formatted: Font: (Default) +Body (Calibri), 11 pt, Italic,
Font color: Auto, Spanish (Spain)
la detección del plásmido pYH8, seguida de una electroforesis en gel de Agarosa al 0,8%.

Tabla 1. Resistencias a antibióticos de las distintas cepas usadas en el Triparental Mating.

kan Rif-Tet Kan-Rif-Tet


pHy8 (trangen)  - -
Prk2013 (helper)  - -
A. tumefaciens LBA4404 -  -
A. tumefaciens LBA4404 transformado   

2. Transformación de suspensiones celulares BY2 de tabaco con Agrobacterium


tumefaciens LBA4404 transformado.

Para llevar a cabo la transformación del gen H6H en la Línea BY2 de tabaco, se transfiere la
bacteria a suspensiones celulares y se hace una selección positiva basándonos en el trabajo
realizado por Ketchum et al. (2007).

 Seleccionar una colonia de Agrobacterium tumefación LBA4404 en una placa con medio
YM y kanamicina 50 mg/L. Transferir y crecer durante 2 días a 28ºC en agitación a 250rpm
en 2mL de medio líquido YM con kanamicina.
 Coger 250 μL del cultivo de A. tumefaciens en medio líquido y transferir a 25 mL de medio
YM suplementado con kanamicina 50 mg/L y acetosiringona 50 μM. Incubar overnight a
28ºC en agitación a 250 rpm. (OD600 ~ 1.3).
 Centrifugar este último cultivo de A. tumefaciens a 3000 g durante 15 min. Descartar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 40 mL del cultivo celular de 7 días de la línea BY2
de tabaco.
 La suspensión celular con A. tumefaciens se incuba 24 h a 23º C y 125 rpm.

6
 Una vez transcurridas las 24 h, aspiramos el medio con una pipeta de 5 mL y
resuspendemos el cultivo celular transformado con medio MS con vitaminas y 300mg/L
claforam. Incubar durante 15 minutos en agitación (125 rpm) y 23ºC.
 Repetir este proceso de lavado tres veces.
 Una vez realizado el cuarto lavado, repartir 2 g de células potencialmente transformadas
a 4 placas de Petri (150mm) que contienen 25 mL de medio MS con vitaminas y 300mg/L
claforam. Dejar creciendo durante 2 semanas a 23ºC.
 Después de dos semanas de crecimiento, las células se transfieren a un medio de selección
compuesto por MS con vitaminas y 300 mg/L claforam y 2.5mg/L de kanamicina.
 Comprobación de la presencia del gen H6H por qPCR.

3. Cultivos de células inmovilizadas en perlas de alginato.

Con el fin lograr un mayor rendimiento, aumentando la secreción de escopolamina al


medio, y de evitar la ruptura celular en el proceso de extracción, se formarán cultivos de
perlas de alginato en suspensión. Procedimiento descrito por Gillet et al., 2000.

 Hacer subcultivos con los positivos en 250 mL de medio MS con vitaminas y 2.5mg/L de
kanamicina. Dejar durante 15 días en agitación de 125rpm y 23ºC.
 Añadir 20 mL de la suspensión celular a 80mL de una solución de alginato de sodio estéril
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,USA).
 Añadir gota a gota la solución anterior a 100 mL de una solución de cloruro de calcio estéril
para formar las perlas biocatalíticas de alginato. El cloruro de calcio ayuda a que el alginato
gelifique.

4. Bioconversión a escopolamina y cuantificación por HPLC.

Al añadir hiosciamina al medio las células transformadas serán capaces de llevar a cabo la
bioconversión a escopolamina como se ha hecho en estudios como Gillet et al., 2000,
Moyano et al. 2007:
 Transferir las perlas a un medio MS suplementado con 11.5 μM de ácido 2,4-
diclorofenoxiacético y 1μM de kinetina.
 Diluir hiosciamina en agua y añadir esta disolución al medio MS con las perlas de alginato de
manera que la concentración final sea de 200mg/L.

7
 Cuantificar los niveles de escopolamina de cultivos celulares de 3, 7, 10 y 14 días por HPLC
como se ha hecho por Guillet et al. (2000).
 Una vez se han obtenido los resultados, seleccionar las condiciones óptimas para comenzar
el escalado.

5. Escalado de la producción de escopolamina en biorreactores.

En los tanques de producción se lleva a cabo el proceso de la bioconversión de la hiosciamina


en escopolamina. Esta bioconversión está mediada por las células BY2 de tabaco previamente
transformado. Originalmente la biotransformación se deberá producir en tanques agitados de
5 litros con las siguientes condiciones de cultivo (Adaptado de Moyano, E. et al., 2007 y
Cuisidó, RM. et al., 2002):

 volumen de medio de cultivo: 3L


 flujo de aire: 0,8 - 1,5 L /min
 medio de cultivo: Murashige and Skoog
 inóculo: 80 g células BY2 de tabaco / L medio cultivo
 [hiosciamina]medio: 200 mg/L medio cultivo
 temperatura: 25ºC
 condiciones de luz: oscuridad
 tiempo: 4 semanas

En estas condiciones se espera una producción de 35 mg escopolamina/L lo que implica


una biotransformación de aproximadamente el 18% de hiosciamina en escopolamina
(Cuisidó, RM. et al., 2002).
Los tanques disponibles en el planeta son de 20 L con lo que podría ser necesario ajustar
los parámetros del escalado en un futuro para optimizar el proceso.
La recuperación del producto de interés se hace por filtración de la parte celular i
posterior secado y trituración así como concentración de la fase liquida por evaporación.
A continuación se procede a la extracción de los alcaloides por el método Plank y
Wagner, 1985 (extracción con CHCl3 en medio básico) y cuantificación por HPLC.

8
REFERENCIAS
Cusido RM, Palazon J, Bonfill M, Navia-Osorio A, Morales C, Pinol MT. (2002). Improved
paclitaxel and baccatin III production in suspension cultures of Taxus media. Biotechnol Prog
18:418–423.

Hashimoto, T., Yukimune, Y., & Yamada, Y. (1989). Putrescine and putrescine N-
methyltransferase in the biosynthesis of tropane alkaloids in cultured roots of Hyoscyamus
albus. Planta, 178(1), 123-130.

Hoekema A, Hirsch P, Hooykass P. (1983). A binary plant vector strategy based on separation of
the vir and TDNA regions of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid, Nature 303: 179-180.

Moyano, E., Palazón, J., Bonfill, M., Osuna, L., Cusidó, R. M., Oksman-Caldentey, K. M., & Piñol,
M. T. (2007). Biotransformation of hyoscyamine into scopolamine in transgenic tobacco cell
cultures. Journal of plant physiology, 164(4), 521-524.

Plank KH and Wagner G. (1986). Determination of Hyoscyamine and Scopolamine in Datura


innoxiaPlants by High Performance Liquid Chromatography. Z. Naturforsch. 41c, 391—39.

Sambrook J, Fritsch E. F, Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.181.

Vadawale, A., Mihani, R., Mathew, A., & Robin, P. (2011). Transformation of Agrobacterium
Tumifascience LBA 4404 with a Cholin Oxidase-Cox Gene Conferring Salinity Tolerance. In
Proceedings of 2011 second International Conference on Agricultural and Animal Science IPCBEE
vol. 22 (2011) IACSIT Press, Singapore pp (Vol. 175).

Ketchum et al. (2007


Gillet et al. 2000