INMOVILIZACIÓN DE

ENZIMAS

Prof. J
Prof J.M.Sánchez-Montero
M Sánchez-Montero
Grupo de Biotransformaciones
Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica. Fac. Farmacia
 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

DEFINICIÓN
DEFINICIÓN:
•CONFINAMIENTO FÍSICO DE UNA ENZIMA O CÉLULA EN
UNA DETERMINADA REGIÓN DEL ESPACIO, ESPACIO DE MANERA
QUE SU ACTIVIDAD CATALITICA SE RETENGA, Y PUEDA SER
REUTILIZADA.
•1971, 1er Enzyme Engineering Conference, Henniker, New Hampshire,
USA.

POSTERIOR SIMPLIFICACIÓN DEL TÉRMINO:

BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
•ENZIMAS, CÉLULAS ENTERAS U ORGÁNULOS CELULARES
(O BIEN COMBINACIONES DE ELLOS) QUE SE ENCUENTRAN
EN UN ESTADO TAL QUE SE PERMITE SU REUTILIZACIÓN

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PARA UNIFICAR CRITERIOS A LA HORA DE CARACTERIZAR
UN CATALIZADOR INMOVILIZADO,
INMOVILIZADO EL WORKING PARTY ON
APPLIED BIOCATALYSIS, ENCUADRADO DENTRO DE LA
FEDERACIÓN EUROPEA DE BIOTECNOLOGÍA DEFINIÓ
UNAS LÍNEAS MAESTRAS (GUIDELINES) CON OBJETO DE
RESPONDER A PREGUNTAS TIPO:

•¿¿ QUÉ CANTIDAD DE ENZIMA LIBRE SE NECESITA PARA

PREPARAR UN BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO ACTIVO?

•¿ QUÉÉ PARÁMETROS
Á GOBIERNAN UNA REACCIÓN
Ó
BIOCATA LIZA DA ?
•¿ QUE RENDIMIENTO COMPARADO PRESENTA UNA
REACCION BIOCATALIZADA POR ENZIMAS O CÉLULAS
LIBRES FRENTE A SISTEMAS INMOVILIZADOS?
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REQUISITOS MÍNIMOS PARA PODER CARACTERIZAR UN
BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO
0.- DESCRIPCIÓN GENERAL.

0.1.-
0 1 ESQUEMA DE REACCIÓN
0.2.- ENZIMA Y MICROORGANISMO
0 3 - TIPO DE SOPORTE
0.3.-
0.4.- MÉTODO EMPLEADO PARA LA INMOVILIZACIÓN

1.- PREPARACIÓN DEL CATALIZADOR INMOVILIZADO.

1.1.- MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN, CONDICIONES DE

REACCIÓN.
1.2.- RENDIMIENTO POR PESO SECO, ACTIVIDAD DEL
SOBRENADANTE.

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2.- CARACTERIZACION FISICO- QUIMICA.

 2.1.-FORMA DEL BIOCATALIZADOR

 2 2 DIÁMETRO MEDIO DE PARTÍCULA HÚMEDA
2.2.-DIÁMETRO
 2.3.-CAPACIDAD DE HINCHAMIENTO
 2.4.-COMPORTAMIENTO EN COLUMNAS
(COMPRESIBILIDAD)
 2.5.-ABRASIÓN EN REACTORES AGITADOS
 2.5.-ABRASIÓN
Ó EN REACTORES DE LECHO
FLUIDIZADO.

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3.-CINETICA DEL BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO.

3. 1.-ESTUDIO DE LA VARIACIÓN DE LA VELOCIDAD INICIAL

DE REACCIÓN FRENTE A LA VARIACIÓN DE LAS
CONCENTRACIONES DE ENZIMA Y DE SUSTRATO.
SUSTRATO
3.2.- EFECTO DEL TIPO DE BUFFER Y DEL pH.
3.3.- LIMITACIONES DIFUSIONALES EN EL SISTEMA (EFECTO
(
DEL TAMAÑO DE PARTÍCULA Y LA CARGA ENZIMÁTICA)
3.4.- GRADO DE CONVERSIÓN FRENTE A TIEMPO DE
RESIDENCIA.
RESIDENCIA
3.5.- ESTABILIDAD DEL BIOCATALIZADOR EN EL
ALMACENAMIENTO
C N N O (V
(VELOCIDAD
OC INICIAL
NC RESIDUAL
S U TRAS
S EL
ALMACENAMIENTO A DIFERENTES TIEMPOS EN DIFERENTES
CONDICIONES.)
3 6
3.6.- ESTABILIDAD OPERACIONAL (VELOCIDAD INICIAL
RESIDUAL DESPUÉS DE DIFERENTES CICLOS CATALÍTICOS)..
OBJETIVO: MAYOR REPRODUCIBILIDAD
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 VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIÓN
PUNTO DE VISTA BIOQUÍMICO

VENTAJAS:

1.- Disminución de problemas de autolisis (proteasas) o de

agregación,
g g , al estar limitados los movimientos rotacionales y
translacionales.
2.- Se ralentizan los cambios conformacionales, por lo que se
pueden
d estudiar
t di las
l relaciones
l i estructura-función.
t t f ió
3.- Se pueden simular reacciones in vivo.
4.-
4. Se pueden simular sistemas estructuralmente asimétricos (ej.
estudios de membranas).
5.- En sistemas entrecruzados, se pueden fijar interacciones con
f f l id polisacáridos...
fosfolípidos, li id para simular
i l orgánulosl celulares.
l l
6.- La unión multipuntual a soportes deformables permite
estudiar la deformación de proteínas globulares.
globulares
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VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIÓN

PUNTO DE VISTA BIOQUÍMICO

Q

DESVENTAJAS:

1.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimática al

inmovilizar.
2.- Si la preparación enzimática no es homogénea, se dificulta la
interpretación de los datos.
3.- A veces, se pueden originar contactos proteína-proteína
indeseados.

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 VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIÓN
PUNTO
PUNTO DE VISTA APLICADO

VENTAJAS:

1.- Se produce un gran aumento de la estabilidad de la enzima o

célula inmovilizada.
inmovilizada
2.- Se aumenta de gran manera la productividad enzimática por
la capacidad de reutilización.
3.- Se aumenta la facilidad de recuperación y purificación de los
productos.
4 Se puede elegir entre una gran variedad de diseños
4.-
ingenieriles
5.- Se aumenta la facilidad de operación y control del proceso,
al trabajar en condiciones más suaves.

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 VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIÓN

PUNTO DE VISTA APLICADO

DESVENTAJAS:
DESVENTAJAS

1.-
. Ge
Generalmente,
e e e, se d
disminuye
s uye la actividad
c v d d eenzimática.
c .
2.- Se aumentan los problemas difusionales.
3.- Se aumenta el costo del proceso.
4 El intervalo
4.- i l ded pH H de
d trabajo
b j puede d ser distinto
di i all del
d l
biocatalizador nativo.

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MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN:

Existen varias metodologías.

1 RETENCIÓN QUÍMICA
1.-
1.1.- Enlaces covalentes
1.2.- Enlaces no covalentes. Adsorción.
1.3.- Reticulado (cross-linking)

2 RETENCIÓN
2.- C Ó FÍSICA
ÍS CA = ATRAPAMIENTO
A A A O
2.1.- Atrapamiento en matrices.
2 1 1 - En geles o polímeros.
2.1.1.- polímeros
2.1.2.- Micelas reversas.
2.2.- Atrapamiento
p en membranas.
2.2.1.- En fibras huecas.
2.2.2.- En reactores de membrana.

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1.- RETENCIÓN QUÍMICA
1.1.- Enlaces covalentes
1.2.- Enlaces no covalentes. Adsorción.
1 3 Reticulado (cross-linking)
1.3.- (cross linking)

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2.- RETENCIÓN FÍSICA = ATRAPAMIENTO
2.1.- Atrapamiento en matrices.
2.1.1.- En geles o polímeros.
2.1.2.- Micelas reversas.
2 2 Atrapamiento en membranas.
2.2.- membranas
2.2.1.- En fibras huecas.
2.2.2.- En reactores de membrana.

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 Métodos q
químicos Métodos físicos

E E
E
E
E E
E E E
E
Enlace covalente E E
Entrecruzamiento Adsorción
Atrapamiento en
Intramolecular (no covalente) Atrapamiento en
gel polimérico
fibras
E+ E+
E E
E - - - - E
E
E Microencapsulación Adsorción Atrapamiento en
E iónica
E liposomas
Entrecruzamiento
Entrecr amiento E
Intramolecular
E E E E

Copolimerización de la Atrapamiento
p en
enzima
i modificada
difi d con un láminas de un
monómero insaturado en polímero
un gel 3D semipermeable Atrapamiento en
fibras huecas

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ELECCIÓN DEL MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN:
C O M P AR A C IÓ N D E LO S M É TO D O S

IN C L U S IÓ N U N IÓ N
M ÉT O D O AT R AP A M IEN T O R ET IC U L AD O AD SO R C IÓ N
M E M B R AN AS C O VAL EN T E

PR EP AR A C IÓ N IN T ER M ED IA D IF ÍC IL IN T ER M ED IA SEN C IL L A D IF ÍC IL

F U ER Z A D E L A U N IÓ N D ÉB IL M ED IA D EB IL -M ED IA M ED IA F U ER T E

AC T IV ID AD
M ED IA-AL T A B AJ A B AJ A M ED IA-AL T A AL T A
EN Z IM ÁT IC A

R EG EN ER AC IÓ
ÓN
PO SIB L E IM PO S IB L E IM PO S IB L E PO SIB L E D IF ÍC IL
D EL SO PO R T E

C O ST E M ED IO -AL T O M ED IO M ED IO B AJO AL T O

EST AB IL ID AD M ED IA AL T A AL T A B AJ A AL T A

VAL ID EZ G EN ER AL G EN ER AL L IM IT AD A G EN ER AL L IM IT AD A

R ES IST EN C IA A
SI SI SI NO NO
C O N T AM IN A C IÓ N

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 REQUISITOS LÓGICOS MÍNIMOS
La enzima o célula debe ser estable en las condiciones experimentales empleadas.
Si se emplean agentes entrecruzantes, éstos no deben afectar al centro activo. Si pudieran interferir
con éste, se debe utilizar un agente entrecruzante lo más grande posible.
Si es posible, se debería proteger el centro activo:
 existen grupos -SH, éstos
si é deben hacerse reaccionar con cisteína
í o glutation, para reactivarse
posteriormente tras la inmovilización.
se puede realizar la inmovilización en presencia de concentraciones saturantes de sustrato.
El proceso de lavado no debe afectar negativamente a la enzima.
enzima
Coherencia con la posterior biotransformación.
si soporte = polianión, la conversión de un sustrato aniónico será muy difícil (repulsión)
enzima atrapada en un gel: si el sustrato presenta un alto peso molecular,
molecular el resultado será
malo.
Gran importancia de las propiedades mecánicas (estabilidad del soporte, forma física del mismo)
El soporte
p debe p presentar una alta superficie
p específica,
p , p
para minimizar los p problemas de
transferencia de materia.
 El soporte debe conferir al derivado inmovilizado una buena resistencia a la contaminación
microbiana.
El soporte debe permitir que se inmovilice una alta cantidad de biocatalizador (alto "loading").
El soporte debe ser comercialmente accesible:
bajo precio

buena disponibilidad

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