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Alejandro Urzúa
Santiago - Chile
2017
© PAMELA SANTOS QUISPE, 2017
Algunos derechos reservados. Esta obra está bajo Licencia Creative Commons.
Atribución-NoComercial-Chile.
IDENTIFICACION ESTRUCTURAL DE LOS METABOLITOS
SECUNDARIOS DE FABIANA DENUDATA MIERS Y EVALUACIÓN
DE SU ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA
Este trabajo fue elaborado bajo la supervisión del Dr. Javier Echeverría Morgado y Dr.
Alejandro Urzúa Moll, de la Facultad de Química y Biología, de la Universidad de
Santiago de Chile, aprobado por la comisión de seguimiento.
Doy fe de que esta Tesis no incorpora material de otros autores sin identificar
debidamente la fuente
Nombre del Alumno:
Fecha:
RESUMEN
El altiplano de Chile se caracteriza por condiciones ambientales muy extremas; las especies
vegetales que allí habitan contienen una gran variedad de metabolitos secundarios que
contribuyen con su supervivencia. Muchas de estas plantas han despertado el interés de los
pobladores quienes las han utilizado como remedio medicinal, alimenticio, ritual y combustible.
Fabiana denudata Miers es una planta nativa que se encuentra distribuida en las zonas áridas
del Norte de Chile. Esta especie es utilizada como etnomedicina: la resina se usa para
hinchazón, quebraduras y dolor de huesos, los vahos para resfríos y dolor de huesos, la
infusión para dolores estomacales y resfríos, el sahumerio para ritos y mal de aire. El presente
estudio se centró en la caracterización de metabolitos secundarios en el aceite esencial,
extracto de humos y de resina de F. denudata mediante métodos cromatográficos
(cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) y cromatografía líquida
de ultra alta presión con detector de diodos y acoplada a espectrometría de masas de alta
resolución (UHPLC-DAD-HRMS)). La determinación estructural de los flavonoides y terpenos
aislados se realizó por resonancia magnética nuclear (RMN) de 1D y 2 D. Adicionalmente se
determinó la actividad antibacteriana de extractos y compuestos puros, para validar así, en
parte, su uso tradicional.
El exudado resinoso de F. denudata se extrajo con diclorometano, posteriormente los
compuestos fueron separados por cromatografía en columna, y luego se purificaron mediante
cristalización y/o cromatografía en placa preparativa. Se aislaron y caracterizaron seis
flavonoides: 3,7,4'-trimetilkaempferol, 3,7,3',4'-tetrametilquercetina, 7,4´-dimetilquercetina, 7,3'-
dimetilquercetina, 3'-metiluteolina, 3-metilquercetina y un sesquiterpeno del tipo-murolano (metil
éster del ácido pernético. Se determinó la actividad antibacteriana de la resina, del extracto de
humo, del aceite esencial y de los compuestos aislados. Ellos, resultaron ser activos frente a las
cepas de bacterias Gram positivo: Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis e inactivos frente a
las cepas Gram negativo: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa.
i
ABSTRACT
The Chilean Altiplano is characterized by very extreme environmental conditions; the plant
species that inhabit there contain a great variety of secondary metabolites that contribute to
their survival. Many of these plants have aroused the interest of the inhabitants who have used
them as a medicine, food, ritual and fuel.
Fabiana denudata Miers is a Chilean native plant distributed in the arid and arid zones of
northern Chile. This species is used as ethnomedicine: the resin is used for swelling, breaks
and bone pain, in vapors for colds, the infusion for stomach pains and colds, as incense for rites
and bad air. The present study focused on the identification of secondary metabolites in the
essential oil, smoke extract and resin of F. denudata by chromatographic (GC-MS and UHPLC-
DAD-HRMS) and spectroscopic (NMR) methods and their antibacterial activity to partially
validate their traditional use.
The resinous exudate of F. denudata was extracted with dichloromethane; subsequently the
compounds were separated by column chromatography, and subsequently purified by repeated
crystallization and/or preparative thin layer chromatography. The structures were elucidated by
mono and bidimensional NMR. From the resin, six flavonoids were isolated and identified:
3,7,4'-trimethylkampherol, 3,7,3',4'-tetramethylquercetin, 7,4'-dimethoxychristacetin, 3',7-
dimethylquercetin, 3'-methoxyluteoline, 3-methylquercetin and one muurolene-type
sesquiterpene (pernetic acid methyl ester). The antibacterial activity of the resin, the smoke
extract, the essential oil and the isolated compounds were determined. These were found to be
active against the Gram-positive strains: Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis and
inactive against the Gram-negative strains: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and
Pseudomonas aeruginosa.
ii
DEDICATORIA
A mis padres
Mis hermanos
iii
AGRADECIMIENTOS
A Dios por darme las fuerzas para seguir adelante en todo momento.
A mis padres por su constante apoyo, aliento y valores de ser una persona de bien a través de
sus consejos y ejemplo, el cual les debo la vida. A mis hermanos porque siempre he contado
con ellos, alentándome para ser mejor cada día y entregándome comprensión.
A mi tutor Dr. Javier Echeverría por su apoyo profesional, paciencia y la orientación necesaria
para culminar este trabajo.
A mi tutor Dr. Alejandro Urzúa por sus buenas ideas y tiempo que se tomó, además por
permitirme formar parte de su laboratorio.
A la Dra. Marcela Wilkens, por abrirme las puertas de su laboratorio de microbiología y
permitirme realizar una parte importante de mi tesis y apoyarme con sus conocimientos
profesionales.
A mi comisión Hermann Niemeyer y Susan Lühr por aportar con sus ideas, correcciones y
sugerencias para el desarrollo de esta tesis y el tiempo que se tomaron.
A Carolina Mendoza y Benjamín Thielemann por apoyarme con los análisis de las muestras por
GC-MS.
A la Vicerrectoría Académica de la Universidad de Santiago de Chile por financiar mis estudios
del Magister a través de la beca arancel.
A Hermann Niemeyer por hacer posible con el apoyo económico de la beca LANBIO y por
permitirme trabajar en el laboratorio de Química Ecológica de la Universidad de Chile.
A mis amigos de laboratorio de Química Ecológica de la USACH: María José, Benjamín, Cata
con los cuales compartí gratos e inolvidables momentos en laboratorio, por su ayuda
desinteresada y de alguna forma colaboraron con el desarrollo de esta tesis.
A mis amigos de laboratorio de Química Ecológica de la UChile, por haber compartido buenos y
agradables momentos.
¡Muchísimas Gracias!
iv
TABLA DE CONTENIDOS
RESUMEN ................................................................................................................................. i
ABSTRACT ............................................................................................................................... ii
DEDICATORIA ......................................................................................................................... iii
AGRADECIMIENTOS .............................................................................................................. iv
CAPÍTULO I ..............................................................................................................................1
Introducción ...............................................................................................................................1
2.1 Extracción del exudado resinoso, el aceite esencial y el extracto de humos ...............13
2.3.1 Análisis por cromatografía en capa fina de compuestos presentes en la resina ...16
2.3.2 Fraccionamiento por CC del extracto resinoso de F. denudata .............................17
2.3.3 Cristalización y purificación de los compuestos aislados .......................................17
v
2.3.3.1 Purificación de fracciones de la resina de F. denudata obtenidas del proceso de
cromatografía en columna ......................................................................................................17
3.2 Identificación de los principales compuestos del aceite esencial y extracto de humos
de F. denudata mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas ....20
vi
3.4.2 Análisis estructural del flavonoide 3,7,4'-trimetilkaempferol (Fr7-Flav) ........................47
3.4.8 Análisis estructural del sesquiterpeno identificado como metil éster del ácido pernético
(Fr7-Terp) ................................................................................................................................60
CAPÍTULO IV ..........................................................................................................................66
Conclusiones ...........................................................................................................................66
Referencias Bibliográficas.......................................................................................................67
Anexos ……………………………………………………………………………………………..74
vii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 3.1 Resultados cuantitativos de los distintos extractos obtenidos de F. denudata ....... 20
Tabla 3.2 Compuestos identificados mediante GC-MS en el aceite esencial de F. denudata 21
Tabla 3.3 Compuestos identificados mediante GC-MS en el extracto de humos de F.
denudata ………………………………………………………………………………………………22
Tabla 3.4 Fragmento de masas de algunos derivados de ácido pernético ............................. 26
Tabla 3.5 Fragmentación de masas de derivados de pernetilo ............................................... 27
Tabla 3.6 Identificación e identificación tentativa de metabolitos secundarios de F. denudata
por HPLC-DAD-HRMS ................................................................................................................. 33
Tabla 3.7 Datos de espectros UV reportados en literatura ...................................................... 38
Tabla 3.8 Patrones de fragmentación de alta resolución reportados en literatura para los
flavonoides identificados en el exudado resinoso de F. denudata .............................................. 39
Tabla 3.9 Referencias de iones másicos de baja resolución para los flavonoides del
exudado resinoso de F. denudata ............................................................................................... 40
Tabla 3.10 Asignaciones de las señales de los espectros de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) y
RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) para el compuesto 3,7,4'-trimetilkaempferol (Fr 7-Flav) ............ 48
Tabla 3.11 Asignaciones de las señales de los espectros de RMN de-1H (400 MHz, CDCl3) y
RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) del compuesto 3,7,3',4'-tetrametilquercetina (199-218 Flav) .... 50
Tabla 3.12 Asignaciones de las señales de los espectros de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-
d6) y RMN de 13C (100 MHz, DMSO-d6) para 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav) ................ 53
Tabla 3.13 Datos de espectros COSY, DEPT 135, HSQC y HMBC del compuesto 7,4´
dimetilquercetina (270-273 Flav) ................................................................................................. 54
Tabla 3.14 Asignaciones de señales de los espectros de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) y
13C (100 MHz, DMSO-d6) del compuesto 7,3'-dimetilquercetina (330-337 Flav). ....................... 55
Tabla 3.15 Asignaciones de señales de los espectros de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) y
de RMN de 13C (100 MHz, DMSO-d6) para 3'-metiluteolina (345-349 Flav). .............................. 57
Tabla 3.16 Asignaciones de señales de los espectros de RMN de 1H (400MHz, DMSO-d6) y
RMN de 13C (100 MHz, DMSO-d6) para 3-metilquercetina (378-381 Flav) ................................. 58
viii
Tabla 3.17 Datos de espectros COSY, HSQC y HMBC del compuesto 3-metilquercetina
(378-381 Flav) …………………………………………………………………………………………..59
Tabla 3.18 Asignaciones de señales de los espectros de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) y
RMN de 13C (100 MHz, DMSO-d6) para sesquiterpeno aislado (Fr7-Terp). ............................... 60
Tabla 3.19 Datos de espectros COSY, HSQC y HMBC del compuesto metil éster del ácido
pernético (Fr7 terp). .................................................................................................................... 61
Tabla 3.20 Resultado de la CMI y CaMI de la resina, el extracto de humos, el aceite esencial
y los compuestos aislados de F. denudata .................................................................................. 63
Tabla 3.21 Resultado de los halos de inhibición de la resina, el extracto de humo, el aceite
esencial y los compuestos aislados evaluados a una concentración de 1 mg/mL ...................... 64
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1 Estructuras de algunos de los metabolitos secundarios aislados de especies
altiplánicas del género Fabiana ..................................................................................................... 2
Figura 1.2 Compuestos químicos identificados en algunos inciensos .................................... 9
xi
ANEXOS
Figura A.1 Espectro RMN-1H del compuesto de 3, 7,4’-trimetilkaempferol (Fr7) .................. 74
Figura A.2 Espectro RMN-13Cdel compuesto de 3,7,4'-trimetilkaempferol (Fr7-Flav) .......... 75
Figura A.3 Espectro RMN-1H del compuesto de 3,7,3',4'-tetrametilquercetina (199-218 Flav)
……………………………………………………………………………………………76
Figura A.4 Espectro RMN-13C del compuesto de 3,7,3',4'-tetrametilquercetina (199-218 Flav)
……………………………………………………………………………………………77
Figura A.5 Espectro RMN-1H del compuesto de 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav) ....... 78
Figura A.6 Espectro RMN-13C del compuesto de 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav) ..... 79
Figura A.7 Espectro COSY H-H del compuesto 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav)........ 80
Figura A.8 Espectro HSQC C-H del compuesto 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav) ....... 81
Figura A.9 Espectro DEPT 135 del compuesto 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav)......... 82
Figura A.10 Espectro HMBC C-H del compuesto 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav) ....... 83
Figura A.11 Espectro RMN-1H del compuesto de 3',7-dimetilquercetina (330-337 Flav) ....... 84
Figura A.12 Espectro RMN-13C del compuesto de 3',7-dimetilquercetina (330-337 Flav) ...... 85
Figura A.13 Espectro RMN-1H del compuesto de 3'-metiluteolina (345-349 Flav) ................. 86
Figura A.14 Espectro RMN-13C del compuesto de 3'-metiluteolina (345-349 Flav) ................ 87
Figura A.15 Espectro RMN-1H del compuesto de 3-metilquercetina (378-381 Flav) .............. 88
Figura A.16 Espectro RMN-13C del compuesto de 3-metilquercetina (378-381 Flav)............. 89
Figura A.17 Espectro RMN 2D COSY del compuesto 3-metilquercetina (378-381 Flav) ....... 90
Figura A.18 Espectro HSQC C-H del compuesto 3-metilquercetina (378-381 Flav) .............. 91
Figura A.19 Espectro HMBC C-H del compuesto 3-metilquercetina (378-381 Flav) .............. 92
Figura A.20 Espectro RMN-1H del compuesto metil éster del ácido pernético (Fr7-Terp)..... 93
Figura A.21 Espectro RMN-13C del compuesto metil éster del ácido pernético (Fr7-Terp) ... 94
Figura A.22 Espectros COSY H-H del compuesto metil éster del ácido pernético (Fr7-Terp) 95
Figura A.23 Espectro HSQC C-H del compuesto metil éster del ácido pernético (Fr7-Terp) . 96
Figura A.24 Espectro HMBC C-H del compuesto metil éster del ácido pernético (Fr7-Terp) . 97
Figura A.25 Espectro DEPT 135 del compuesto metil éster del ácido pernético (Fr7-Terp) . 98
Figura A.26 A. Espectros UV a 254 nm, B. espectro de masas obtenidos del UHPLC-DAD-
MS ………………………………………………………………………………………….105
xii
CAPÍTULO I
Introducción
El Altiplano de Chile se extiende de norte a sur, desde los 18°S hasta los 28°S, a una
altura promedio de 4000 m.s.n.m., limitando por el este con la Cordillera de Los Andes y por el
oeste con la Cordillera de Domeyko. Esta zona presenta condiciones ambientales muy
extremas (gran amplitud térmica y sequedad) y sus suelos se caracterizan por ser arenosos,
rocosos, con escasa materia orgánica y con contenido salino variable (Trivelli y Valdivia, 2009).
Pese a estas adversidades ambientales, en el altiplano se desarrolla una vegetación de baja
altura conformada principalmente por arbustos pequeños, los cuales están expuestos a factores
bióticos (baja humedad, alta salinidad del suelo, deshidratación, exceso de luminosidad,
radiación ultravioleta, bajas temperaturas, etc.) y abióticos (insectos, hongos, bacterias,
plantas, herbívoros, etc.) (Martin et al., 2002) muy extremos. Por estas razones dichas
especies vegetales han desarrollado mecanismos para la producción de resinas compuestas
por metabolitos secundarios que contribuyen a su supervivencia. Algunas plantas resinosas
distribuidas en el Altiplano se utilizan tradicionalmente como combustible, forraje, alimentos,
medicinas y en actividades rituales. Dentro de los principales representantes de plantas
resinosas, en el altiplano están, entre otras, especies de los géneros Baccharis, Parastrephia y
Fabiana (Villagrán et al., 1998).
1
Tabla 1.1 Antecedentes fitoquímicos de especies del género Fabiana
En lo que respecta a las actividades biológicas de especies del género Fabiana, existen
para F. bryoides dos estudios independientes, uno utilizó el extracto acuoso y demostró el
2
efecto antibacteriano (Zampini et al., 2009), mientras que en el otro se emplearon los extractos
acuoso y etanólico mostrando capacidad antioxidante, actividad antiinflamatoria y genotóxica
(Cuello et al., 2011). F. imbricata es la especie más estudiada del género, dentro de los estudios
se ha demostrado que el extracto hidroetanólico presentó actividad hipotensiva (Schmeda-
Hirschmann et al., 1992), algunos de sus metabolitos secundarios aislados mostraron efecto
insecticida (Schmeda- Hirschmann et al., 1995), el ácido oleanóico y algunos sesquiterpenos
aislado de F. imbricata mostraron actividad gastroprotectora (Astudillo et al., 2002, Reyes et al.,
2005). Por otro lado, los extractos acetónicos y acuosos mostraron actividad diurética (Álvarez
et al., 2002), mientras que los extractos metanólicos y etanólicos presentaron actividad
antifúngica (Vio-Michaelis et al., 2012). Por último, un estudio demostró que el extracto
hidrometanólico no presentó actividad anti-Trypanosoma cruzi (Muñoz etal., 2013). Por su parte,
en dos estudios independientes de F. punensis para los extractos acuosos se demostró
actividad antibacteriana (Zampini et al., 2009) y para los extractos acuosos y etanólicos la
capacidad antioxidante, antiinflamatoria y genotóxica, respectivamente (Cuello et al., 2011). Se
ha demostrado la actividad antibacteriana en los dos diterpenos aislados de F. ramulosa (Erazo
et al., 2002), así como también para los mismos compuestos se demostró actividad analgésica
y antiinflamatoria (Ramírez F., 2002), sus extractos acuosos presentaron capacidad
antibacteriana (Zampini et al., 2009) y antioxidante (Rojo et al., 2009). Un único estudio en F.
squamata mostró que el extracto acuoso presenta propiedades antioxidantes (Rojo et al., 2009).
Para finalizar, los extractos acuosos y etanólicos de F. patagónica, una especie que crece en
Argentina y Bolivia, mostraron actividad antioxidante, antiinflamatoria y genotóxica (Cuello et al.,
2011).
A continuación, se realiza una descripción de la especie en estudio de esta tesis:
3
1.2.3 Descripción botánica de F. denudata
Arbusto verdoso que puede superar un metro de alto, carece de hojas o si existe son muy
diminutas, de aspecto brillante, con tallos erectos; casi áfilos, con ramas marcadamente
flexuosas, amarillentas, resinosas y algo glutinosas. (Trivelli y Valdivia 2009; Alara y Peralta
2013).
1
Limpia: Purificación para anular fuerzas negativas (Villagrán y Castro 2004).
2
Mal de aire: Se dice que es “mal viento”, un mal espíritu o un muerto que anda en el aire. La persona decae
rápidamente, empezando a tomar síntomas de enfermedades como: dolores de cabeza, escalofríos, dificultad para
dormir, vómitos, diarrea, fiebre, dolores musculares, parálisis facial y dolor de oídos. (Porzecanski 2008; Pezzi et
al., 1996; López 2006).
4
subtropicales (Modak et al., 2009; Langenheim, 2003). Desde el punto de vista ecológico, los
exudados resinosos actúan en las plantas como una barrera de protección frente a factores
abióticos (baja humedad, alta salinidad del suelo, deshidratación, exceso de luminosidad,
radiación ultravioleta, bajas temperaturas, etc.) y factores bióticos (insectos, hongos, bacterias,
plantas, herbívoros, etc.) (Martin et al., 2002). Actúan como una barrera mecánica protectora
atrapando a depredadores a través de sus propiedades pegajosas y también como defensa
química debido a la presencia de metabolitos secundarios (Rodríguez et al., 2003; Modak et al.,
2002; Langenheim, 2003). La presencia de metabolitos secundarios (diferentes tipos de
terpenos, flavonoides, cumarinas, etc.) en la resina le confiere un amplio espectro de
propiedades biológicas, dentro de las que se destacan actividades antimicrobianas, insecticidas,
antioxidantes, antifúngicos, antimutagénicas y citotóxica (Hoffman et al., 1983; Vilela et al.,
2011).
Los diversos estudios químicos realizados en las resinas informan principalmente el
aislamiento de flavonoides, terpenos y cumarinas.
Los flavonoides corresponden a un grupo muy amplio de compuestos polifenólicos que
están ampliamente distribuidos en el reino vegetal en forma de agliconas o glicósidos. Son muy
importantes para el desarrollo y buen funcionamiento de las plantas, como agentes protectores
contra la luz UV o contra el ataque de organismos fitopatógenos (Cartaya 2001). En un estudio
realizado en especies del género Heliotropium, se ha demostrado que los componentes de la
resina presentan propiedades químicas y biológicas de interés, tales como: actividad
antimicrobiana, antiviral y antifúngica, incrementando así la resistencia de la planta frente a
agentes patógenos (Ollis 1995). Por ejemplo, para la resina de la especie Heliotropium
stenophyllum se aislaron flavonoides mayoritarios como: pinocembrina, naringenina, galangina,
sakuranetina, 4'-O-acetilsakuranetina, 7-O-metieriodictiol, 3-O-metilgalangina y 5,3´-di-O-
metilquercetina (Torres et al., 1994).
5
compuestos presentes comúnmente en los humos junto a sus principales propiedades y
funciones.
Tabla 1.2 Algunos compuestos químicos comunes en los humos y alguna de sus
actividades/funciones:
Compuesto
Grupo de compuestos químico Propiedad/Función Referencia
Compuestos carbonílicos Formaldehido Antimicrobiano Ogbadu, 2004
Compuestos hidroxilados Alcoholes Depresor, tóxico Ogbadu, 2004
Fenoles Antioxidante Ogbadu, 2004
Guayacol Antimicrobiano, antioxidante Ogbadu, 2004
Formación de película
Syringol superficial Ogbadu, 2004
Eugenol Potenciador de aroma Ogbadu, 2004
Compuestos fenólicos Isoeugenol Potenciador de sabor Ogbadu, 2004
Acetosiringona Colorante Ogbadu, 2004
Siringaldehído Efectos neuroprotectores Bozkurt et al., 2014
Vanillina Potenciador de sabor y aroma Walton et al., 2003
6
Algunos ejemplos de componentes de AEs, usados medicinalmente son el alcanfor y eucaliptol,
mientras que como repelentes de insectos se puede mencionar el citronelal (Anderson y
Martínez, 2013).
1.4.1 El uso del humo y vahos de plantas en el Altiplano del norte de Chile
La inhalación del humo y vahos, es una práctica de especial relevancia en las culturas
andinas. Se produce por la combustión de plantas, generalmente aromáticas y resinosas, que
se emplea con fines terapéuticos para curar enfermedades y dolencias y/o utilizadas en rituales
que buscan el bienestar de las personas (Villagrán y Castro 2004). La inhalación de humos y
vahos de plantas con fines medicinales, también se ha utilizado ampliamente al nivel global por
diversos grupos culturales para el tratamiento de diversas afecciones, destacando las
enfermedades pulmonares y respiratorias, trastornos neurológicos y desórdenes urinarios, entre
otros (Mohagheghzadeh, 2006).
Entre los Aymaras y Atacameños, el humo y los vahos de plantas son particularmente
relevantes en el tratamiento de dolencias físicas (calambres, torceduras articulares, etc.), en la
cura de enfermedades y en los procesos de purificación y ofrendas simbólicas (Villagrán y
Castro, 1998; 2003). Amplios estudios etnobotánicos han reportado especies de plantas
utilizadas para su aplicación como sahumerios y vahos por las comunidades que actualmente
habitan las tierras altas del norte de Chile (Aldunate et al., 1981, 1983; Cárdenas 1998; Castro
et al., 1982; Mostny 1954; Munizaga y Gunckel 1958; Villagrán et al., 1998, 1999; 2003;
Villagrán y Castro 2004). A continuación, se detallan especies nativas del norte de Chile
agrupadas por familia donde destacan las plantas aplicadas como sahumerios:
Tabla 1.3 Especies vegetales usadas como sahumerios y vahos en el Altiplano de Chile
Plantas usadas como sahumerios
Familia Especies vegetales
Anacardiaceae Schinus molle L. var. molle
Apiaceae Azorella compacta Phil.
Artemisia copa Phil. var. copa, Baccharis boliviensis (Wedd.) Cabrera var.
boliviensis, B. santelicis Phil. ssp. santelicis, B. calliprinos Griseb., B. tola
Phil. ssp. tola, Chuquiraga atacamensis Kuntze, Diplostephium cinereum
Cuatrec., Parastrephia lucida (Meyen) Cabrera, P. quadrangularis (Meyen)
Asteraceae
Cabrera, P. teretiuscula (Kuntze) Cabrera, Senecio atacamensis Phil., S.
eriophyton J. Remy, S. nutans Sch. Bip. y S. puchii Phil., Tessaria
absinthioides (Hook. & Arn.) DC., Xenophyllum poposum (Phil.) V.A. Funk
y X. weddellii (Phil.) V.A. Funk.
Burseraceae Copal (Bursera sp.)
Fabaceae Errazurizia multifoliolata (Clos) I.M. Johnst.
Montiaceae Cistanthe celesioides (Phil.) Carolin ex Hershkovitz
Solanaceae Fabiana bryoides Phil., F. denudata, F. ramulosa (Wedd.) Hunz. & Barboza
y F. squamata Phil.
Verbenaceae Junellia minima (Meyen) Moldenke, Lampaya medicinalis F. Phil.
Plantas usadas como vahos
Familia Especies vegetales
Amaranthaceae Atriplex madariagae Phil.
7
Anacardiaceae Schinus molle L. var. molle
Asteraceae Artemisia copa Phil. var. copa, Baccharis boliviensis (Wedd.) Cabrera var.
boliviensis, Chuquiraga atacamensis Kuntze, Haplopappus rigidus Phil.,
Parastrephia teretiuscula (Kuntze) Cabrera, P. quadrangularis (Meyen)
Cabrera y Sonchus asper (L.) Hill
Ephedraceae Ephedra americana Humb. & Bonpl. ex Willd.
Fabaceae Adesmia minor (Hook. & Arn.) Burkart var. minor
Poaceae Cortaderia speciosa (Nees & Meyen) Stapf
Solanaceae Fabiana denudata
Verbenaceae Lampaya medicinalis F. Phil.
1
Incienso: es una preparación de resinas aromáticas vegetales que desde la antigüedad tenía fines curativos
además de rituales (Cordero 2012).
2
Sahumerio: quemar hierbas (Gomez et al., 2011).
8
mayoría de los compuestos abundantes fueron salicilato de metilo (12,28 %), detectado en el
humo de las hojas de Gaultheria fragrantissima, cadineno (15,58%) presente en el humo de
Juniperus squamata y α-pineno en el humo de Cupressus funebris Ramas (9,16 %) y Pistacia
weinmanniifolia con un (19,52 %). Todos estos compuestos son fragantes y comunes en los
aceites esenciales. Las especies que produjeron los olores de humos más agradables fueron
Cupressus Funebris, Gaultheria fragrantissima, madera de Juniperus squamata y Pistacia
weinmanniifolia (Staub et al., 2011).
Un estudio de la Universidad Tecnológica del Sur de China, concluyó que el humo del
incienso es potencialmente más tóxico que del tabaco ya que contiene compuestos químicos
aromáticos, irritantes y tóxicos, se analizaron en dos tipos o variantes, incienso con agar y con
sándalo (Santalum álbum de Australia e Indonesia y Aquilaria agallocha de Malasia y del
sureste de China). Se produjeron varios compuestos altamente volátiles comunes en las cuatro
muestras como ser: monoterpenos, fenóles metoxilados, dos compuestos de deshidratación de
hexosa, así como otros compuestos volátiles, como por ejemplo: farnesol y 2-metoxifenol que
se encuentra en el incienso de la especie de Aquilaria agallocha y 5-hidroximetilfurfural en
sándalo. El autor recomienda que es imprescindible realizar un estudio químico y biológico de
cada especie y tipo de inciensos que son utilizadas por la sociedad (Zhou et al., 2015).
9
sido reportada en África (Kokwaro, 2009; Togola et al., 2005), América (Luziatelli et al., 2010 y
Ross, 2002), Europa (Pieroni et al., 2002) y Asia (Gilman y Zhou, 2004).
Como es el caso particular de especies vegetales habitantes en el altiplano. Se han
realizado varios estudios químicos de aceites esenciales de especies vegetales altiplánicas,
que son usadas en medicina tradicional como vahos. Se han reportado monoterpenos y
sesquiterpenos para especies del género Baccharis, Senecio y Parastrephia. Dentro de los
compuestos químicos identificados en los vahos de plantas, se destaca que para la especie
Baccharis salicifolia se encontraron: germacreno (9%) (Sosa et al., 2012) y cadinol (9.4 %)
(Zunino et al., 1997). Para la especie Parastrephia quadrangularis se encontró α-pineno (19 %)
(Loayza et al., 1992).
10
sus efectos antimicrobianos, además de presentar potenciales aplicaciones en productos
alimenticios (Bakkali et al. 2008; Granados et al., 2015).
1.5 Problemática
Las resinas, los humos y los vahos de plantas han sido ampliamente utilizados por muchas
culturas alrededor del mundo. En particular, estas fracciones de la especie Fabiana denudata
han sido utilizadas por los pueblos del altiplano de Chile para tratar diversas dolencias y
también para fines rituales. Existe escasa información sobre la composición química y la
actividad farmacológica de estas fracciones. Esta carencia ha impedido la validación del uso
tradicional de esta especie por comunidades Aymaras y Atacameñas del norte de Chile. Esta
tesis busca cimentar esta validación y también entregar conocimiento sobre nuevas moléculas
con potencial farmacológico.
1.7 Objetivos
Objetivo general
Identificar metabolitos secundarios del aceite esencial, el extracto de humos y la resina de F.
denudata y caracterizar sus propiedades antibacterianas.
Objetivos específicos
12
CAPÍTULO II
Parte Experimental
2.1 Extracción del exudado resinoso, el aceite esencial y el extracto de humos
13
Figura 2.1 Equipo de extracción de humos condensados (Sadgrove et al., 2016)
14
longitudes de onda de detección fueron de 254, 280 y 320 nm, y el detetector de arreglo de
fotodiodos (PDA) se registró de 200 a 800 nm para la caracterización de los picos
cromatográficos. Las fases móviles fueron, una solución al de ácido fórmico al 1% (A) y
acetonitrilo (B). El programa de gradiente [tiempo (min], % B) fue: (0.00, 5); (5.00, 5); (10.00,
30); (15.00, 30); (20.00, 70); (25.00, 70); (35.00, 5) y 12 minutos para el equilibrio de la
columna antes de cada inyección (ver Tabla 2.1). El caudal fue de 1.00 mL/min y el volumen
de inyección fue de 10 μL. Los patrones y extractos disueltos en metanol se mantuvieron a 10
°C durante el almacenamiento en el inyector automático.
Tabla 2.1 Gradientes de la fase móvil utilizada en el análisis cromatográfico
Parámetros espectrométricos
La resina se analizó por cromatografía en capa fina (CCF) para identificar cualitativamente
los tipos de compuestos presentes. Para ello, se utilizaron cromatofolios de gel de sílice con
base de aluminio GF254 (Merck). El análisis de dichas placas se realizó observando la
separación de los compuestos bajo una lámpara de radiación UV a 254 y 365 nm.
Los cromatofolios se revelaron con el reactivo revelador NP-PEG [difenilboriloxietilamina
(NP) y polietilenglicoletanólico 4000 (PEG)] para observar flavonoides y p-anisaldehído/H2SO4
(calentamiento a 100° C) para identificar los terpenos y flavonoides (Figura 2.2). En la figura 2.3
la resina analizada por cromatografía en capa fina, donde se utilizó como eluyentes: éter de
petróleo (EP): acetato de etilo (AcOEt), en una proporción de (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8
,1:9 y 0:1) aumentando la polaridad. Posteriormente se utilizó acetato de etilo (AcOEt): metanol
(MeOH) de (1:9, 2,8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1 y 0:1), en estas mismas proporciones de
eluyentes se utilizó para la cromatografía en columna (CC), en el cual se generaron resultados
que se muestran en las Figura 3.19 y 3.20.
Figura 2.2 Análisis del exudado resinoso de F. denudata en CCF revelado con (A) p-
anisaldehido y (B) NP-PEG
16
Figura 2.3 Análisis del exudado resinoso de F. denudata utilizando mezclas de eluyentes
EP:AcOEt y AcOEt:MeOH. Revelado con p-anisaldehído
17
casos se volvió a realizar el proceso de cristalización hasta obtener cada uno de los
compuestos con mayor pureza y mejor rendimiento.
19
CAPÍTULO III
Resultados y discusiones
Una vez obtenidos los cromatogramas de gases del aceite esencial y el extracto de humos,
se realizó la integración de los 100 picos cromatográficos mayoritarios, utilizando el modo de
integración automática. La cuantificación se realizó según porcentajes de áreas relativas,
obtenidas de la integración de picos cromatográficos. Del conjunto total de picos, se eliminaron
algunos picos basados en dos criterios: i) picos correspondientes a sangrado de la columna
(compuestos desprendidos de la fase estacionaria) y ii) picos con un área cromatográfica
relativa menor al 1%. Para la identificación de los compuestos basados en el criterio
cromatográfico, los tiempos de retención fueron transformados a índice de retención,
específicamente se utilizaron los índices de Kovats (IK), que fueron obtenidos usando los datos
de tiempo de retención de hidrocarburos alifáticos saturados entre C 8-C26. Posteriormente los IK
experimentales fueron comparados con los IK reportados en literatura. Para la identificación
estructural de los compuestos usando el criterio espectrométrico, los espectros de masas fueron
comparados con los espectros de masas de la base de datos NIST 14, Adams 2004, WebNIST
(www.webbook.nist.gov) y/o Pherobase (www.pherobase.com).
En la Figura 3.1 se muestra el cromatograma del aceite esencial de F. denudata. Se
observan 12 picos, de los cuales se identificaron 6 compuestos: 4 sesquiterpenos y 2 ésteres.
El componente más abundante fue identificado como acetato de octilo con un 31,7 %, también
se destacan otros compuestos tal como el metil éster del ácido pernético con un 15% y su
derivado con un 8.87 %, y otros tales como epicubenol, isocalameneno y acetato de decilo. En
la Tabla 3.2 se consigna la identificación de compuestos ordenados por tiempo de retención.
20
Figura 3.1 Cromatograma de GC-MS del aceite esencial de F. denudata
21
En la Figura 3.2 se observa el cromatograma obtenido del extracto de humo, se
identificaron 4 compuestos y 2 compuestos tentativamente: 4 sesquiterpenos, un éster y un
misceláneo, se detalla en la Tabla 3.3.
TR: Tiempo de retención, IK: índice de Kovats, M+: ion molecular, MS: Identificación por espectrometría de masas
NIST14: base de datos de índice de retención y espectrometría de masas en el equipo de GC-MS, Pherobase: base de
datos de IK en www.pherobase.com, RMN: identificación estructural de compuesto mediante resonancia magnética
nuclear.
22
Comparando los cromatogramas del extracto de humos y el aceite esencial, se aprecian
similitudes entre ellos, como acetato de octilo, derivado de isocalameneno, derivado de
pernetilo y metil éster del ácido pernético.
3.2.1.1 Epicubenol
(A)
(B)
Figura 3.3 (A) Espectro de masas del epicubenol (tiempo de retención 30.718 minutos)
identificado en el aceite esencial. (B) espectro de masas del epicubenol obtenido de la base de
datos de Pherobase.
23
Figura 3.4 Patrón de fragmentación sugerido para el sesquiterpeno epicubenol
Para los picos 4 y 5 del extracto de humos solo se pudo confirmar que son sesquiterpenos
oxidados debido a la presencia del ion molecular m/z 222 y 204 respectivamente, así como
también por el tiempo de retención. No se encontraron referencia con la base de datos NIST14
para estos compuestos. En la Figura 3.5 y 3.6, se observan los 2 espectros que son similares y
solo difiere en la abundancia de iones, por lo tanto, es más probable que sea el mismo
compuesto o sean isómeros.
Figura 3.5 Espectro de masas del sesquiterpeno oxigenado (tiempo de retención 29.955
minutos) identificado en el extracto de humo.
Figura 3.6 Espectro de masas del sesquiterpeno oxigenado (tiempo de retención 30.447
minutos) identificado en el extracto de humos.
Basados en el análisis de GC-MS (Figura 3.7) y en los análisis de los espectros de RMN-
24
1H, RMN-13C y del espectro bidimensional, se determinó que la estructura corresponde al metil
éster del ácido pernético en el extracto de humos y aceite esencial. Este compuesto es un
sesquiterpeno de esqueleto cadinano, similar a los sesquiterpenos identificados en la especie
del mismo género, Fabiana imbricata Ruiz & Pav. (Brown, 1994). En la Figura 3.8, se observa el
patrón de fragmentación de masas propuestas para el compuesto metil éster del ácido pernético
de F. denudata. Este compuesto y los derivados del ácido pernético han sido reportados en F.
imbricata Ruiz & Pav. y Gaultheria insana (Molina) D.J. Middleton (ex-Pernettya furens (Hook. &
Arn.) Klotzsch) por Brown (1994) y Hosozawa (1985) (Tabla 3.4), donde los iones principales
m/z: 107, 191, 206 y 234 coinciden entre los espectros de masas de metil éster del ácido
pernético y el ácido pernético. Las principales diferencias estructurales residen en la presencia
del grupo metil éster en vez del grupo ácido carboxílico del ácido pernético.
Figura 3.7 Espectro de masas del metil éster del ácido pernético (tiempo de retención 38.864
minutos) identificado en el aceite esencial y (tiempo de retención 38.812 minutos) en el extracto
de humo.
Figura 3.8 Patrón de fragmentación sugerida para el metil éster del ácido pernético de F.
denudata
25
Tabla 3.4 Fragmento de masas de algunos derivados de ácido pernético
m/z UV
Nº Compuesto Estructura Referencia
(Ión / abundancia relativa %) (nm)
1 Ácido pernético 234.1637 (39) [M-H2O]+, - Brown, 1994
206 (24), 191 (37),107
(100).
3 Metil éster del 266 (3.9) [M]+, 248 (1.9), 223 Hosozawa,
ácido pernético 234 (47.3), 206 (39), 191 1985
(53.9), 139 (47.3), 107
(100), 43 (29).
Los cromatogramas del extracto de humo (pico 13) y aceite esencial (pico 11) (Figura 3.1 y
3.2) muestran un pico mayoritario correspondiente al derivado de pernetilo. El espectro de
masas que se muestra en la Figura 3.9 se comparó con los espectros de masas de literatura.
Figura 3.9 Espectro de masas del compuesto identificado como derivado de pernetilo
presente en el extracto de humos (tiempo de retención 38.547 minutos) y el aceite esencial
(tiempo de retención 38.532 minutos).
La semejanza entre los principales fragmentos m/z: 220, 177, 159 y 134 sugiere que
este compuesto es un derivado de pernetilo (Figura 3.10) (Brown, 1994 y Hosozawa, 1985),
con una cadena adicional en la posición 15.
26
Figura 3.10 Esqueleto de pernetilo
Estos iones principales están presentes en los espectros de masas (Tabla 3.5) de:
malonato de pernetilo, trans-cinamato de pernetilo, cis-cinamato de pernetilo, 4-murolano-
7,15-diol-15(2-fenilacetato) éster de la especie F. imbricata Ruiz & Pav. (Brown 1994) y en
pernetol de la especie Pernettya furens (Hosozawa, 1985).
27
Figura 3.11 Patrón de fragmentación sugerido para el compuesto derivado de pernetilo
3.2.1.5 Iso-calameneno
(B)
Figura 3.12 (A) Espectro de masas del isocalameneno (tiempo de retención de 28.185
minutos) identificado en el aceite esencial, (B) Espectro de masas del isocalameneno obtenido
desde la base de datos de NIST14.
28
C14H19+ C12H15+ C10H11+ C8H9+
C15H22 m/z: 159 m/z: 105
m/z: 187 m/z: 131
m/z: 202
Figura 3.13 Patrón de fragmentación sugerido para el iso-calameneno
(B)
Figura 3.14 (A) Espectro de masas del derivado de isocalameneno (tiempo de retención de
35.041 minutos) identificado en el extracto de humo, (B) Espectro de masas del derivado de iso-
calameneno obtenido desde la base de datos de NIST14.
29
3.3 Identificación de los principales compuestos presentes en el exudado resinoso de
F. denudata mediante cromatografía líquida de ultra alta eficiencia (UHPLC) acoplada a
espectrometría de masas de alta resolución (HR-MS) y arreglo de fotodiodos (DAD)
30
UV, así como en el patrón de fragmentación utilizando experimentos ESI-MS-MS (Tabla 3.6)
comparados con la información previamente reportada en literatura, que se detallan
posteriormente (sección 3.3.1)
Dos compuestos fueron identificados como sesquiterpenos derivados del cadinano tal como
el ácido pernético con un Uvmax: 219 nm (pico 39, C15H23O3-) y derivado de dehidro ácido
pernético reducido (Uvmax 223 nm) (pico 46, C15H21O2-) y su isómero (pico 45).
Varios compuestos fueron determinados como flavonoides. El pico 5 con un ión de
331.04588 fue asignado como 3´-metoximircetina (C16H11O8-) y el pico 12 como 3´,5´-
dimetoximircetina (C17H13O8-). El pico 16 con un ión de 285.04074 fue asignado como
kaempferol (C15H9O6-), el pico 19 como isoramnetina (315.05157), mientras que el pico 23 como
apigenina (C15H9O4-) y el pico 24 como 7-metiluteolina (C16H11O6-). El pico 27 con un ión de
315.05118 fue identificado como 7-metilquercetina, el pico 28 como 3'-metiluteolina (C16H11O6-),
el pico 29 como 7,3'-dimetilquercetina (C17H13O7-), el pico 32 como 4’-metilquercetina, el pico 34
como 7,4´-dimetilquercetina y el pico 37 como 7,3'-dimetiluteolina (C17H13O6-), por último, el pico
39 fue identificado como 7,4'-dimetiluteolina (C17H13O6-). Para finalizar, el pico 40 fue
identificado como 7,3,3’-trimetilquercetina (C18H15O7-), el pico 46 como un dehidro derivado del
ácido pernético y el pico 50 fue identificado tentativamente como estigmatellina B (C30H41O7-).
Se propusieron relaciones biosintéticas para identificar los flavonoides y sesquiterpeos.
N° R1 R2 R3 R4 R5
pico
5 OH OH OCH3 OH OH
12 OH OH OCH3 OH OCH3
16 OH OH H OH H
19 OH OH OCH3 OH H
23 OH H H OH H
24 OCH3 H OH OH H
27 OCH3 OH OH OH H
28 OH H OCH3 OH H
29 OCH3 OH OCH3 OH H
32 OH OH OH OCH3 H
34 OCH3 OH OH OCH3 H
37 OCH3 H OCH3 OH H
40 OCH3 OCH3 OCH3 OH H
31
Figura 3.17 Pico 39: ácido pernético, pico 46: derivado dehidro ácido pernético reducido
32
Tabla 3.6 Identificación e identificación tentativa de metabolitos secundarios de F. denudata por HPLC-DAD-HRMS
2 11.24 208 Desconocido Sesquiterpeno C15H23O5- 283.15510 283.15576 203.14322 (C14H19O-; -CO2-
OH-H2O)
5 12.48 225, 294 3´-metoximircetina Flavona C16H11O8- 331.04594 331.04588 303.05098 (C15H11O7-)
15 14.67 202, 289 Desconocido Sesquiterpeno C13H21O5- 257.13945 257.13950 125.09628 (C8H13O-);
195.13869 (C12H19O2-) 33
16 15.01 207, 254, kaempferol Flavonol C15H9O6- 285.04046 285.04074 253.14465
347 239.09208
19 16.19 255-356 Isoramnetina (378- Flavonol C16H11O7- 315.05103 315.05157 271.02444 (C14H7O6-);
381) 300.02744 (C15H8O7-)
30 19.86 285, 344 Desconocido Sesquiterpeno C15H23O4- 267.16018 267.15982 135.04439 (C8H7O2-);
34
191.14403 (C13H19O-)
36 21.03 214, 282, Desconocido Sesquiterpeno C16H25O3- 265.14453 265.14486 149.09660 (C10H13O-);
337 113.02373 (C5H5O3-)
41 22.49 203, 260, Desconocido Sesquiterpeno C15H19O4- 263.12888 263.12926 161.02388 (C9H5O3-);
370 135.04449 (C8H7O2-)
42 23.22 206, 246, Desconocido Sesquiterpeno C15H19O3- 247.13397 247.13358 165.01868 (C8H5O4-);
362 107.01292 (C6H3O2-)
35
44 24.05 225 Desconocido - - - 627.46266
36
3.3.1 Métodos de identificación de los compuestos químicos en la resina analizada por
HPLC-DAD-HRMS
OH O OH O OH O OH O
Pico 23 nd Pico 24 Pico 37
C15H9O5- C15H9O6- C16H11O6- C17H13O6-
Exact Mass: 269,04555 Exact Mass: 285,04046 Exact Mass: 299,05611 Exact Mass:313,07176
+CH3
+OH +CH3
OH O
OH OH
O
HO O HO O
HO O
OH
OH O OH O
OH O
Pico 16 nd Pico 28
C15H9O6- C16H11O6- C16H11O6-
Exact Mass: 285,04046 Exact Mass: 299,05611 Exact Mass: 299,05611
+OH
OH OH
OH OH O
OH
O O +CH3 O O
HO O +CH3
OH OH
OH OH O OH O
OH O
Pico 27 +CH3 Pico 34
nd C16H11O7- C17H13O7-
C15H9O7- +CH3Exact Mass: 315,05103 Exact Mass: 329,06668
Exact Mass: 301,03538
+CH3 O OH O
OH O OH
HO O HO O O O
OH OH OH
OH O OH O OH O
Pico 19 Pico 32 Pico 29
C16H11O7- C16H11O7- C17H13O7-
Exact Mass: 315,05103 Exact Mass: 315,05103 Exact Mass: 329,06668
OH O O
OH OH OH
HO O HO O HO O O
OH +CH3 OH
+CH3
OH OH OH
OH O OH O OH O
nd Pico 5 Pico 12
C15H9O8- C16H11O8- C17H13O8-
Exact Mass: 317,03029 Exact Mass: 331,04594 Exact Mass: 345,06159
Figura 3.18 Propuesta de la ruta biosintética para los flavonoides del exudado resinoso
de F. denudata
37
+CH3 -H2 -H2
O OH HO HO
OH HO OH
O O OH O
O
nd Pico 39 nd nd
C16H25O3- C15H23O3- C15H21O3- C15H19O3-
Exact Mass: 265,18092 Exact Mass: 251,16527 Exact Mass: 249,14962 Exact Mass: 247,13397
+H2 -OH
+H2
HO OH
O OH HO O
O O
nd nd nd
C16H23O3- C15H25O3-
C15H23O2-
Exact Mass: 263,16527 Exact Mass: 253,18092
Exact Mass: 235,17035
-H2
+H2
+H2
+CH3
HO HO O
O OH O O O
O
nd Pico 46 nd nd
C16H23O3- C15H21O2- C15H19O2- C16H21O2-
Exact Mass: 263,16527 Exact Mass: 233,15470 Exact Mass: 231,13905 Exact Mass: 245,1547
Figura 3.19 Propuesta de ruta biosintética para sesquiterpenos dele xudado resinoso de
F. denudata
38
34 7,4'-dimetilquercetina * 256-355 - -
(Ombuina)
37 7,3'-dimetiluteolina 250-343 - -
39 Ácido pernético 224 219 Hosozawa et al., 1985
40 7,3,3'- 254-355 254-355 Mabry, 1970
trimetilquercetina
45 Isómero del ácido 224 224 Hosozawa et al., 1985
dehidro pernético
46 Ácido dehidro 223 223 Hosozawa et al., 1985
pernético
Tabla 3.8 Patrones de fragmentación de alta resolución reportados en literatura para los
flavonoides identificados en el exudado resinoso de F. denudata
Tabla 3.9 Referencias de iones másicos de baja resolución para los flavonoides del
exudado resinoso de F. denudata
40
3.3.1.4 Patrones de fragmentación propuestos para los compuestos identificados
en la resina mediante HPLC-DAD-HRMS
41
42
Figura 3.20 Patrones de fragmentación propuestos de los flavonoides identificados por HPLC-
DAD-HRMS
43
Figura 3.21 Resumen de las fracciones reunidas mediante CCF reveladas con p-
anisaldehído.
Figura 3.22 Resumen de las fracciones reunidas mediante CCF reveladas con p-
anisaldehído.
44
Resina
F. denudata
60 g
Cromatografía en columna
Cromatografía en
EP: AcEt 114
columna
AcEt: MeOH Fracciones
453
CCF
Fracciones
Fracciones
CCF reunidas
43 Fracciones
reunidas CCF
Cristalización
22 Fracciones CCF
Cromatografía en placa
preparativa (CPP)
RMN GC-MS
Figura 3.23 Resumen del fraccionamiento y purificación por cristalización y CPP del exudado
resinoso de F. denudata.
45
Del exudado resinoso F. denudata se aislaron e identificaron 6 flavonoides y un
sesquiterpeno de tipo cadinano (Figura 3.24). Sus estructuras corresponden a: 3,7,4'-
trimetilkaempferol (Fr7); 3,7,3',4'-tetrametilquercetina (199-218 Flav): 7,4´-
dimetilquercetina (270-273 Flav); 7,3´-dimetilquercetina (330-337 Flav); 3'-metiluteolina
(345-349 Flav); 3-metilquercetina (378-381 Flav) y metil éster del ácido pernético (Fr7
Terp). En el cual los compuestos 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav), 3'-metiluteolina (345-
349 Flav) y 3',7-dimetilquercetina (330-337 Flav) coinciden con el análisis de la identificación de
compuestos mediante HPLC-DAD-HRMS.
46
3.4.2 Análisis estructural del flavonoide 3,7,4'-trimetilkaempferol (Fr7-Flav)
El compuesto obtenido es un sólido de color amarillo en forma de agujas y soluble en
CHCl3. Identificado como 3,7,4’-trimetilkaempferol (Figura 3.25), en la Tabla 3.10 se muestran
los resultados del análisis de RMN-1H y RMN-13C del compuesto Fr7-Flav.
En el espectro de RMN-1H se observaron 10 señales que integran para 16 hidrógenos.
Además, se visualizaron tres singuletes a 3.86, 3.87 y 3.90 ppm, cada uno de ellos integrando
para tres hidrógenos, atribuibles a grupos metoxilos. En el anillo A se presentaron dos dobletes
con un desplazamiento químico de 6.35 ppm (d, J = 2 Hz) y 6.44 ppm (d, J=2.05 Hz),
correspondientes a H-6 y H-8 que presentan integración para dos hidrógenos en la posición
meta distintivo de un sistema tetrasustituido. Las señales atribuidas para el anillo B tuvieron en
común una multiplicidad de dobletes a 7.02 y 8.07 ppm con constantes de acoplamiento de 8.92
y 8.91 Hz respectivamente, asignadas para un sistema orto en un anillo aromático, integrando
cada una de ellas para los hidrógenos H-5´, H-6´, H-2´ y H-3´, respectivamente. Por último, el
singulete de la señal en 12.65 ppm que integró para un hidrógeno se debe a la presencia de un
hidroxilo.
El espectro de RMN-13C muestra un total de 18 señales, tres de estas confirmaron la
presencia de grupos metoxilos a 55.32, 55.68 y 60.03 ppm, mientras que a 138.76 ppm se
observó un metoxilo que da cuenta de la sustitución en la posición C3 del anillo C, así como
también se encontró un carbono oxopirano típico ubicado a 161.93 ppm. La ausencia de
carbonos de metileno (CH2) nos reafirmó que la molécula es una flavona o flavonol. El resto de
las señales pertenecen a grupos funcionales de doble enlace conjugados característicos de los
anillos aromáticos. Lo anterior permitió realizar las asignaciones completas del compuesto Fr7-
Flav.
O 4´
2´ 3´ 4´
7 1´
B5´
O 8
O 6´
7 9 2
6
A 10 3
5 4
O
OH O 3
Del análisis conjunto de los espectros de RMN-1H, RMN-13C, espectro de masas de baja
resolución y la comparación de los datos espectroscópicos del compuesto reportado en la
literatura (Sutthanut et al., 2007) permitió determinar que corresponde al flavonoide 3,7,4’-
trimetilkaempferol, previamente identificado en la especie Kaempferia parviflora (Sutthanut et
al., 2007).
47
Tabla 3.10 Asignaciones de las señales de los espectros de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) y
RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) para el compuesto 3,7,4'-trimetilkaempferol (Fr 7-Flav)
δ 1H
(ppm, multiplicidad,
δ 1H Grupo δ 13C δ 13C
Posición constante de
(ppm)* funcional (ppm) (ppm)*
acoplamiento Hz e
integración)
2 - - C=C 156.64 156.6
3α 3.86 (s, 3H) 3.86 (s, 3H) C-OCH3 55.31 55.3
3 - - C=C 138.76 138.7
4 - - C=O 178.67 178.7
5 12.65 (s, 1H) 12.65 (s, 1H) Ar-OH 161.92 161.8
6 6.35 (d, J = 2Hz, 1H) 6.32 (d, J = 2 Hz, 1H) C=CH 97.7 97.7
7α 3.87 (s, 3H) 3.86 (s, 3H) C-OCH3 55.68 55.7
7 - C=C 165.29 165.3
8 6.44 (d, J = 2.05 Hz, 1H) 6.42 (d, J = 2 Hz, 1H) C=CH 92.05 92
9 - - C=C 155.84 155.8
10 - - C=C 105.95 105.9
1´ - - C=C 122.72 122.7
2´ 8.07 (d, J = 8.91 Hz, 1H) 8.06 (d, J = 9 Hz, 1H) C=CH 130.05 130.1
3´ 7.02 (d, J = 8.92 Hz, 1H) 7.01 (d, J = 9 Hz, 1H) C=CH 113.95 113.9
4´ - - C=C 161.57 161.6
4´α 3.90 (s, 3H) 3.89 (s, 3H) C-OCH3 60.03 60
5´ 7.02 (d, J = 8.92 Hz, 1H) 7.01 (d, J = 9 Hz, 1H) C=CH 113.95 130.1
6´ 8.07 (d, J = 8.91Hz, 1H) 8.06 (d, J = 9 Hz, 1H) C=CH 130.05 113.9
* (Sutthanut et al., 2007)
El espectro de masas de baja resolución en modo positivo (Figura 3.27) mostró un ión
molecular de m/z 328 (100%) consistente con la fórmula molecular C18H16O6. La presencia de
un -OCH3 en C-3 fue confirmada por la m/z 285 (55%) correspondiente a la pérdida de un grupo
-COCH3 característico de flavonoides metoxilados en esta posición (Fabre et al., 2001). Otra
fragmentación visualizada fue (2,6A) que mostró la m/z 135 (31%) consistente con la fórmula
molecular C8H7O2+ correspondiente a la presencia de -OCH3 en el anillo B (Modak, 1998) y al
ión 1,3A-O (Fabre et al., 2001) de m/z 150 (32%) consistente con la fórmula molecular C8H6O3+
confirmando la presencia de los sustituyentes -OH y -OCH3 en el anillo A. Dado que la literatura
sólo hace mención de los fragmentos más comunes, a continuación en la Figura 3.26 se
muestra una propuesta del esquema de fragmentación en detalle del 3,7,4'-trimetilkaempferol.
48
Figura 3.26 Patrón de fragmentación propuesto para el 3,7,4'-trimetilkaempferol (Fr7-
Flav) (Fabre et al. 2001, Modak 1998)
Figura 3.27 Espectro de masas de baja resolución obtenido del análisis por GC-MS del
3,7,4'-trimetilkaempferol
49
3´
4´
O
O
3´
2´ 4´
1´ 6´ 5´
7 O O
8 2
7 9
6 10 4 3
5
O 3
OH O
En la Tabla 3.11 se muestran los resultados del análisis de RMN-1H y RMN-13C del
compuesto 3,7,3',4'-tetrametilquercetina (199-218 Flav).
Tabla 3.11 Asignaciones de las señales de los espectros de RMN de-1H (400 MHz, CDCl3) y
RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) del compuesto 3,7,3',4'-tetrametilquercetina (199-218 Flav)
δ 1H
δ 1H
(ppm, multiplicidad, Grupo δ 13C δ 13C
Posición (ppm) *
constante de acoplamiento funcional (ppm) (ppm)*
e integración)
2 - C=C 156.22 156.1
3α 3.87 (s, 3H) 3.81 (s, 3H) C-OCH3 60.59 60.6
3 - C=C 139.39 137
4 - C=O 179.14 175.7
5 12.64 (s, 1H) 12.60 (s, 1H) Ar-OH 162.45 160.9
6 6.36 (d, J = 2.16 Hz,1H) 6.38 (s,1H) C=CH 98.22 98.1
7α 3.88 (s, 3H) 3.85 (s,3H) C-OCH3 56.4 56.4
7 C=C 165.85 163
8 6.45 (d, J = 2.16 Hz, 1H) 6.79 (s,1H) C=CH 92.62 93.3
9 - C=C 157.12 157.2
10 - C=C 106.45 104
1´ - C=C 123.34 121.9
2´ 7.69 (d, J = 2.05 Hz, 1H) 7.65 (s,1 H) C=CH 111.27 115.1
3´ α 3.97 (s, 3H) 3.85 (s,3 H) C-OCH3 56.21 56.2
3´ - C=C 151.79 147.7
4´ α 3.97 (s, 3H) 3.85 (s,3 H) C-OCH3 56.47 56.5
4´ - C=C 149.18 149.6
5´ 6.99 (d, J = 8.57 Hz, 1H) 7.15 d (J = 8.15 Hz) , 1H C-CH 111.71 115.9
7.74(dd, J = 8.56 Hz; J = 1.8 7.72 dd (J = 8.5 Hz, 1.9)
6´ Hz, 1H) , 1H C-CH 122.57 119.9
* (Al-Oqail et al., 2012)
El espectro de RMN-1H mostró 2 señales a 6.36 y 6.45 ppm, las cuales integran para dos
protones, cada uno de las cuales se encuentran en las posiciones 6 y 8 del anillo A. En el anillo
50
B se observa un doblete a 6.99 ppm y un doble doblete a 7.74 ppm con constantes de
acoplamientos típicas de posición orto entre H-5´ y H-6´, y un doblete a 7.69 ppm con constante
de acoplamiento de 2.05 Hz típico de la posición meta entre H-2´ y H-5´.
El espectro de RMN-13C mostró en total 19 señales pertenecientes principalmente al grupo
de un anillo bencénico, grupos metoxilos y carbonos unidos a un átomo de oxígeno. Cuatro de
estas confirman la presencia de grupos metoxilos a 56.21, 56.40, 56.47 y 60.59 ppm, mientras
que a un desplazamiento de 139.39 ppm se comprobó la sustitución en el anillo C en la posición
C3. Adicionalmente se visualizó la presencia de un carbono típico de cetona a 179.14 ppm. La
ausencia de carbonos de metileno (CH2) confirmó que la molécula es una flavona o flavonol, así
como el resto de señales pertenecen al grupo funcional características de los anillos aromáticos
para las asignaciones del compuesto 199-218 Flav.
Del análisis de los espectros de RMN-1H, RMN-13C, espectro de masas y la comparación de
los datos espectroscópicos y espectrométricos de este compuesto reportado en la literatura (Al-
Oqail et al., 2012) se confirmó que corresponde al flavonoide 3,7,3',4'-tetrametilquercetina,
previamente identificado en Solanum schimperianum Hochst (Al-Oqail et al., 2012).
El espectro de masas de baja resolución mostró un ión molecular de m/z 358 (100%)
consistente con la fórmula molecular C19H18O7 (Figura 3.29). La presencia de un OCH3 en C-3
fue confirmada por la señal de m/z 315 (48%) correspondiente a la pérdida de un grupo CH 3CO
característico de flavonoides metoxilados en esta posición (Fabre et al., 2001). La
fragmentación (2,6A) (Modak, 1998) mostró iones en m/z 165 (31%) consistente con la fórmula
molecular C9H9O3+, que corresponde a la presencia de dos grupos metoxilos en el anillo B. La
ruptura 1,3A-O (Fabre et al., 2001) originó la m/z 149 (12%) consistente con la fórmula molecular
C8H5O3+ que confirmó la presencia de los sustituyentes OH y CH3CO en el anillo A.
Figura 3.29 Espectro de masas de baja resolución obtenido del análisis por GC-MS para 3,
7,3',4'-tetrametilquercetina (199-218 Flav).
Dado que la literatura sólo hace mención de los fragmentos más comunes, a continuación,
se muestra una propuesta del esquema de fragmentación en detalle:
51
Figura 3.30 Patrón de fragmentación propuesto para el 3,7,3',4'-tetrametilquercetina (199-218
Flav).
4´
OH
O
3´
2´ 4´
1´ 6´ 5´
7 O O
8 2
7 9
6 10 4 3
5
OH
OH O
52
Tabla 3.12 Asignaciones de las señales de los espectros de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6)
y RMN de 13C (100 MHz, DMSO-d6) para 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav)
δ 1H
(ppm, multiplicidad, δ 1H Grupo δ 13C δ 13C
Posición
constante de acoplamiento e (ppm)* funcional (ppm) (ppm)*
integración)
2 - - C=C 147.88 147.0
3 - - C=C-OH 136.96 136.7
4 - - C=O 176.81 176.3
5 12.41 (s, 1H) 12.4 (s, 1H) Ar-OH 161.16 160.6
6.33 (d, J= 1.61
6 6.31 (d, J= 2.18 Hz,1H) Hz, 1H) C-CH 98.34 97.8
7α 3.84 (s, 3H) 3.85 (s, 3H) C-OCH3 56.85 56.3
7 - - C=C 165.75 165.2
6.70 (d, J= 1.4Hz,
8 6.73 (d, J=2.28 Hz, 1H) 1H) C-CH 92.90 92.92
9 - - C=C 156.91 156.4
10 - - C=C 104.85 104.3
1´ - - C=C 122.82 123.6
2´ 7.76 (d,J=2.11 Hz,1H) 7.70 (s, 1H) C-CH 112.62 115.0
3´ - - C=C 148.25 146.4
4´ - - C=C 149.78 149.7
4´ α 3.84 (s, 3H) 3.84 (s, 3H) C-OCH3 56.91 55.9
7.07 (d (J=8.3 Hz,
5´ 6.92 (d, J=8.44 Hz, 1H) 1H) C-CH 116.36 112.0
7.71 (dd, J= 2.07 Hz, 8.55 Hz, 7.68 (dd, J=8.4 Hz,
6´ 1H) 1H) C-CH 122.73 120.0
*(Chaves et al., 2004)
En la Tabla 3.13 se observan los datos de los espectros COSY, DEPT 135, HSQC y HMBC.
El espectro HSQC, de correlación heteronuclear, permitió reconocer correlaciones de cada
hidrógeno con un solo carbono. El espectro COSY contiene señales de diferentes
acoplamientos de hidrógeno que confirma las posiciones de H-5´, H-6´, H-2´, H-6 y H-8. La
ausencia de 10 señales en los espectros DEPT 135 confirma que estos carbonos son de tipo
cuaternario, apreciándose 7 en total (Ver Anexos).
53
Tabla 3.13 Datos de espectros COSY, DEPT 135, HSQC y HMBC del compuesto 7,4´
dimetilquercetina (270-273 Flav)
La posición de los sustituyentes (OCH3) sobre el esqueleto del flavonol fue confirmada vía
HMBC (Figura 3.32). El carbono C-7 (δC 165.76) del sistema aromático, muestra correlación a
dos enlaces con el protón H-7α (δH 3.84) y H-6 (δH 6.31), confirmando la posición del grupo
metoxilo en la posición C-7. El protón a δH 3.84 (H-4´α) exhibe correlación a tres enlaces con C-
3 (δc 148.25) y dos enlaces con C-4´ (δC 149.79), confirmando la presencia de un segundo
grupo metoxilo en la posición C-4´.
54
Del análisis de los espectros de RMN-1H, RMN-13C, HMBC, HSQC, COSY, DEPT 135 y la
comparación del mismo compuesto reportado en la literatura (Chaves et al., 2004) permitió
determinar que corresponde al flavonoide 7,4´-dimetilquercetina, el cual ya ha sido aislado de la
especie Porcelia macrocarpa (Chaves et al., 2004).
O
3´
OH
2´ 4´
7 5´
1´
O 8
O 6´
7 9 2
6 10
5 4 3
OH
OH O
La Tabla 3.14 muestra los resultados del análisis de RMN-1H del compuesto 330-337 Flav.
La estructura presenta 7 señales en el espectro de 1H equivalentes a 14 protones, las que se
puede deducir algunas en particular entre 6 y 8 ppm atribuidos al grupo funcional de un anillo
aromático típicas de un flavonoide. No se realizó el análisis de RMN-13 C, ya que no se pudo
observar las señales en el espectro, debido a que se obtuvo 9 mg, que es muy poca cantidad
para este tipo de análisis por RMN.
Tabla 3.14 Asignaciones de señales de los espectros de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) y
13C (100 MHz, DMSO-d6) del compuesto 7,3'-dimetilquercetina (330-337 Flav).
δ 1H (ppm)
Posición (multiplicidad, constante de δ 1H Grupo
acoplamiento e integración) (ppm) * funcional
2 - - C=C
3 α - - -
3 - - C=C
4 - - C=O
5 - - Ar-OH
6 5.73 (s, 1H) 6.17 (d, J=2 Hz, 1H) C-H
7α 3.73 (s, 3H) 3.92 (s, 3H) C-OCH3
7 - -
55
8 5.92 (s, 1H) 6.38 (d, J=2 Hz, 1H) C-H
9 - - C=C
10 - - C=C
1´ - - C=C
2´ 7.53 (s, 1H) 7.53 (s, 1H) C-H
3´ α 3.80 (s, 3H) 3.92 (s, 3H) C-OCH3
3´ - - -
4´ α - - -
4´ - - -
5´ 6.86 (d, J=8.32 Hz, 1H) 6.86 (d, J=8.3Hz , 1H) C-H
6´ 7.46 (d, J=8.42Hz, 1H) 7.46 (d, J=8.4Hz, 1H) C-H
* (Umbetova et al., 2004)
Del análisis de los espectros de RMN-1H y la comparación del compuesto reportado en la
literatura (Umbetova et al., 2004), permitió determinar que corresponde al flavonoide 7,3'-
dimetilquercetina, previamente identificado en las especies Tamarix elongata Ledeb y T. laxa
Willd. (Umbetova et al., 2004).
3.4.6 Análisis estructural del flavonoide 3'-metiluteolina (345-349 Flav)
El compuesto aislado es un sólido de color amarillo, soluble en DMSO identificado como 3'-
metiluteolina (chrysoeriol) (Figura 3.34).
3´
O
OH
2´ 3´ 4´
1´ 5´
HO O 6´
7 8 9 2
6 10 4 3
5
OH O
En la Tabla 3.15 se muestran los resultados del análisis de RMN-1H y RMN-13C del
compuesto 345-349 Flav.
56
Tabla 3.15 Asignaciones de señales de los espectros de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) y
de RMN de 13C (100 MHz, DMSO-d6) para 3'-metiluteolina (345-349 Flav).
δ 1H
(ppm, multiplicidad,
δ 1H Grupo δ 13C δ 13C
Posición constante de
(ppm) * funcional (ppm) (ppm)*
acoplamiento e
integración)
2 - - C=C 164.58 163.7
3 6.87 (s, 1H) 6.88 (s,1H) C=CH 103.84 103.2
4 - C=O 182.54 181.8
5 12.95 (s, 1H) 12.96 (s,1H) Ar-OH 162.18 161.5
6 6.18 (d, J=2 Hz, 1H) 6.19 (d, J=2 Hz, 1H) C-CH 99.71 98.9
7 - C-OH 164.88 164.2
8 6.50 (d, J=2 Hz, 1H) 6.50 (d, J=2 Hz, 1H) C-CH 94.76 94.1
9 - - C=C 158.15 157.4
10 - - C=C 104.58 103.7
1´ - - C=C 122.45 121.5
2´ 7.54 (m, 1H) 7.54(m, 1H) C-CH 110.22 110.2
3´ - C=C 148.63 148.1
3´ α 3.87 (s, 3H) 3.89 (s, 3H) C-OCH3 57.24 56
4´ - - C-OH 151.28 150.8
6.93 (d, J=8.88 Hz,
5´ 6.92 (d, J=8.89 Hz, 1H) 1H) C-CH 116.42 115.8
7.55(dd, J=2, 8.9 Hz,
6´ 7.54 (m, 1H) 1H) C-CH 120.97 120.4
* (Park et al., 2007)
En el espectro de RMN-1H se observaron 8 señales equivalentes a 12 protones, cuya
multiplicidad corresponde a dobletes con un desplazamiento químico de 6.18, 6.50 y 6.92 ppm
ubicados en el anillo A y B, además se observó un multiplete a 7.54 ppm que integró para dos
hidrógenos ubicados en la posición 2´ y 6´ del anillo B. También se evidenció un singulete a
3.54 ppm asignado al hidrógeno de la posición 3´ de la estructura del flavonoide. En el espectro
de RMN-13C se observaron 16 señales pertenecientes principalmente al grupo de un anillo
bencénico, grupos metoxilos y carbonos unidos a un átomo de oxígeno. La señal de 57.24 ppm
corresponde a un grupo metoxilo, mientras que la señal de 182.54 ppm se asignó al carbonilo
del flavonoide. Por último, la señal de 158.15 ppm se atribuyó a un carbono con un sustituyente
hidroxilado ubicado en la posición 4´del anillo B.
Del análisis de los espectros de RMN-1H y RMN-13C y la comparación de los datos
espectroscópicos del compuesto reportado en la literatura (Park et al., 2007) permitió
determinar que corresponde al flavonoide 3'-metiluteolina.
57
3.4.7 Análisis estructural del flavonoide 3-metilquercetina (378-381 Flav)
El compuesto aislado es un sólido de color amarillo, soluble en DMSO, identificado como 3-
metilquercetina (Figura 3.35).
OH
OH
2´ 3´ 4´
1´ 5´
HO O 6´
7 8 9 2
6 10 3
5 4
O
3
OH O
Figura 3.35 Estructura química del compuesto 3-metilquercetina (378-381 Flav)
En la Tabla 3.16 se muestran los resultados del análisis RMN-1H, RMN-13C. El espectro de
resonancia de RMN-1H presentó 8 señales equivalentes a 12 protones, mientras que en el
espectro de RMN-13C se observó un total de 16 señales pertenecientes principalmente al anillo
bencénico, grupos metoxilos y carbonos unidos a grupos oxigenados.
δ 1H
(ppm, multiplicidad,
δ 1H δ 1H Grupo δ 13C δ 13C
Posición constante de
(ppm)* (ppm) ** funcional (ppm) (ppm)*
acoplamiento e
integración)
2 - - - C=C 146.06 155.8
3α 3.76 (s, 3H) 3.78 (s, 3H) 3.77 (s, 3H) C-OCH3 60.47 59.8
3 - - - C=C 138.5 137.8
4 - - - C=O 178.73 178.4
5 12.67 (s, 1H) 12.71 (s, 1H) 12.70 (s, 1H) Ar-OH 162.1 161.4
6.20 (d, 6.18 (d, J=
6 6.17(d, J= 2.11, 1Hz) J=2 Hz, 1H) 1.58 Hz, 1H) C-CH 99.36 93.7
7 - - - C=C 164.94 164.3
6.41 (d, J=2.1 6.39 (d, J=
8 6.38 (d, J=2.09 Hz, 1H) Hz, 1H) 1.5 Hz, 1H) C-CH 94.46 98.7
9 - - - C=C 157.17 156.5
10 - - - C=C 105.02 104.3
1´ - - - C=C 121.46 121
7.56 (d, J= 7.53 (d, J=
2´ 7.53 (d, J=2.26 Hz, 1H) 2.2 Hz, 1H) 2.15 Hz, 1H) C-CH 116.26 115.6
3´ - - - C=C 149.53 145.4
4´ - - - C=C 156.45 148.9
6.92 (d,J=8.5 6.89 (d,
5´ 6.88 (d, J=8.43 Hz, 1H) Hz, 1H) J=8.45 Hz) C-CH 116.56 115.9
6´ 7.42 (dd, J= 2.24, 8.44 7.40 (dd, 7.44 dd (aJ= C-CH 121.65 120.7
58
Hz, 1H) J=2.3, 8.4 Hz, 2.08, 2.18 Hz,
1H) 1H)
* (Wang et al., 2010), **(Smolarz et al., 2003), a Error encontrado en el artículo: uno de los J es
aproximadamente 8 Hz debido a la posición orto.
En la Tabla 3.17 se detallan los datos de los espectros COSY, HSQC Y HMBC del
compuesto 378-381 Flav. La asignación de las señales de los carbonos protonados se llevó a
cabo tomando en consideración sus desplazamientos químicos y fueron confirmados mediante
el espectro HSQC (ver Anexos). El espectro COSY mostró el acoplamiento de los protones H-5´
con H-6´, H-6´ con H-2´ y H-6 con H-8 (Ver Anexos).
Tabla 3.17 Datos de espectros COSY, HSQC y HMBC del compuesto 3-metilquercetina (378-
381 Flav)
6´ C-6´, H-6´
H-6´,H-5´; H-6´,H-2´
Del análisis de los espectros de RMN-1H, RMN-13C, COSY, HSQC, HMBC y la comparación
del mismo compuesto reportado en la literatura (Wang et al., 2010 y Smolarz et al., 2003)
permitieron determinar que corresponde al flavonoide 3-metilquercetina, previamente
identificado en Halimodendron halodendron (Wang et al., 2010).
En la figura 3.36 se muestran algunas correlaciones HMBC más sobresalientes, que definen
la estructura del compuesto. La señal del carbono C-3 (δC 138.5) se relaciona con el protón H-3
α (δH 3.8) a dos enlaces, lo que confirma la presencia del grupo metoxilo en la posición 3. El
protón H-2´ centrado a 7.53 ppm se correlaciona con C-3´ (δC 149.53) y C-4´ (δC 156.45) a 2 y 3
enlaces, respectivamente. El protón H-5´ se correlaciona con C-6´ a dos enlaces.
59
Figura 3.36 Correlación HMBC observada en el compuesto 3-metilquercetina (378-381 Flav).
3.4.8 Análisis estructural del sesquiterpeno identificado como metil éster del ácido
pernético (Fr7-Terp)
En la Tabla 3.18 se informa los resultados analizados de los espectros obtenidos:
Figura 3.37 Estructura del sesquiterpeno identificado metil éster del ácido pernético
Tabla 3.18 Asignaciones de señales de los espectros de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) y
RMN de 13C (100 MHz, DMSO-d6) para sesquiterpeno aislado (Fr7-Terp).
δ1H
δ 1H
Posición (ppm, multiplicidad, constante de δ 13C (ppm) Grupo funcional
(ppm)*
acoplamiento e integración)
60
3β 2.20 (m, 1H) 2.2 21.26 C-CH2
3α 2.29 (m, 1H) 2.3 21.26 C-CH2
4 - - 130.73 C=C
5 7.26 (s, 1H) 7.25 140.69 C=CH
6 2.61 (dp, J = 2.27, 4.54 Hz, 1H) 2.6 43.70 C-CH
7 - 75.31 C-OH
8β 1.28 (td, J = 3.57, 13.01 Hz, 1H) 1.28 32.38 C-CH2
8α 1.70 (q, J = 3.32 Hz, 1H) 1.70 32.38 C-CH2
9β 1.67 (m, 1H) 1.63 30.53 C-CH2
1.07 (tdd, J = 3.25, 10.91, 13.38 Hz,
9α 1.09 30.53 C-CH2
1H)
10 1.41 (m, 1H) 1.42 28.45 C-CH
2,12 (qq, J
11 2.12 (m, J = 7.7 Hz, 1H) 30.41 C-CH
= 7.7 Hz)
12 0.91 (m, 3H) 0.92 16.38 CH3-
13 0.91 (m, 3H) 0.92 16.23 CH3-
14 0.91 (m, 3H) 0.90 19.58 CH3-
15 - - 168.30 C=O
16 3.73 (s, 3H) 3.72 51.79 C-OCH3
*(Hosozawa, 1985)
En la Tabla 3.19 se detallan los datos de los espectros COSY, DEPT 135, HSQC y HMBC.
El análisis HSQC representa δ 1H y δ 13 C, interacción C-H a un enlace de distancia. De
acuerdo al experimento DEPT-135, el esqueleto de carbonos está compuesto por 3 átomos de
carbono cuaternario (C), 5 grupos metino (CH), 4 grupos metileno (CH 2) y 3 grupos metilo
(CH3).
Tabla 3.19 Datos de espectros COSY, HSQC y HMBC del compuesto metil éster del ácido
pernético (Fr7 terp).
DEPT
Posición COSY HSQC HMBC-H HMBC-C
135
0.91, H-5, H-2α, H-2 β,
1 - CH C-1,H-1 C-7, C-9, C-14
H-10, H-3α
C-7, C-1, C-8, C-10,
2β H2,H3 CH2 C-2 ,H-2 β H-10, H-1, H-3β
C-14
2α H2,H3 CH2 C-2,H-2 α H-10, H-1, H-3β C-4, C-6, C-1, C-3
3β H3,H2 CH2 C-3,H-3 β H-2α, H-2β C-5, C-4, C-2
3α H3,H2 CH2 C-3,H-3 α H-2α, H-2β C-5, C-4, C-1
H-5,H-16, H-3α, H-11,
4 - C - -
H-2α
C-15, C-4, C-7, C-1,
5 H-5,H-6 CH C-5,H-5 H-16, H-3β, H-3α
C-3
6 H-6,H-5 CH C-6,H-6 H-5, H-2α, H-8β -
0.91, H-8β, H-1, H-5,
7 - C -
H-11
61
8β - CH2 C-8,H-8 β H-1, 0.91 C-10, C-11, C-6
8α - CH2 C-8,H-8 α H-1, 0.91 C-9, C-7
9β - CH2 C-9,H-9 β H-8β, 0.91 C-7, C-1, C-10, C-12
9α - CH2 C-9,H-9 α H-8β, 0.91 C-7, C-1, C-10, C-12
H-10,H-
10 CH C-10,H-10 H-8β, 0.91 C-1
14
H-11,H-
11 CH C-11,H-11 H-8β, 0.91 C-7, C-12
12
H-12,H- C-7, C-1, C-11, C-10,
12 CH3 C-12,H-12 H-11, H-9α, 0.91
11 C-12
13 CH3 C-13,H-13 H-11, H-9α, 0.91 C-7, C-1, C-11, C-10
H-14,H-
14 CH3 C-14,H-14 H-9α, H-1 C-7, C-1, C-11, C-10
10
15 - C - H-5, H-16 -
16 - CH3 C-16,H-16 - C-15, C-5, C-4
El experimento de RMN por HMBC, mostró las correlaciones a larga distancia entre los
protones y átomos de carbono de la molécula, lo que permitió determinar las posiciones de los
grupos metoxilos, metilos y metil éster del compuesto. En la Figura 3.38 se muestra las
correlaciones más importantes de HMBC. El protón H-16 correlacionó con C-15 (grupo cetona)
y C-4 (carbono cuaternario) a 3 y 4 enlaces de distancia. El protón de la posición 14
correlacionó con C-10 y C-1, lo que confirma la posición del grupo metilo. Además, H-12 y H-13
correlacionan entre sí a tres enlaces de distancia con el C-13 y C-12. El protón H-9
correlaciona con C-7, un grupo cuaternario, lo que confirma la presencia del grupo hidroxilo en
esa posición.
Figura 3.38 Correlaciones de HMBC más importantes de metil éster del ácido pernético
62
3.5 Evaluación de la actividad antibacteriana del aceite esencial, extracto de humos,
exudado resinoso y los principales compuestos aislados de F. denudata
Microorganismos
Metil éster del ácido CMI (μg/mL) 250 500 (-) (-) (-)
pernético (Fr7 Terp) CaMI (μg) 1.25 2.5 (-) (-) (-)
3,7,3',4'- CMI (μg) 750 1000 (-) (-) (-)
tetrametilquercetina CaMI (μg/mL)
(199-218 Flav) 3.75 5 (-) (-) (-)
CMI (μg/mL)
7,4´- (-) (-) (-) (-) (-)
dimetilquercetina
CaMI (μg)
(270-273 Flav) (-) (-) (-) (-) (-)
En la Tabla 3.21 se muestran los tamaños de los halos de inhibición, obtenidos al ensayar
las muestras de resina, extracto de humos, aceite esencial y compuestos aislados a una
concentración de 1 mg/mL comparados con un control positivos tal como kanamicina,
tetraciclina y ampicilina sobre las 5 cepas bacterianas. Para las pruebas de actividad
antibacteriana con Bacillu subtilis, se observa que el aceite esencial, la resina, 3,7,4´-
63
trimetilkaempferol, metil éster del ácido pernético, 3,7,3´,4´-tetrametilquercetina y 3
metilquercetina presentaron una buena actividad con respecto a kanamicina y ampicilina. Para
S. aureus, presentan buena actividad: el aceite esencial, metil éster del ácido pernético,
3,7,3´,4´-tetrametilquercetina y 3-metilquercetina, comparado con kanamicina y ampicilina.
Tabla 3.21 Resultado de los halos de inhibición de la resina, el extracto de humo, el aceite
esencial y los compuestos aislados evaluados a una concentración de 1 mg/mL
tetrametilquercetina
Extracto de humo
3-metilquercetina
dimetilquercetina
Aceite esencial
199-218 Flav
270-273 Flav
378-381 Flav
Kanamicina
Tetraciclina
Ampicilina
Fr7 Flav
3,73',4'-
Resina
3,7,4'
7,4´-
Bacillus subtilis 5 ±1 0 7±1 7±1 9±1 8±1 0 10±3 6±0.6 13±0.6 4 ±1.5
Staphylococcus
(-) (-) 7±0.6 (-) 6±1.2 3±0.6 0 7±1.5 6±0.6 14±1.5 7±1
aureus
Klebsiella
(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
pneumoniae
Escherichia coli (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Pseudomonas
(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
aeruginosa
La resina presentó una CMI de 1000 µg/mL y 5000 µg/mL, frente a B. subtilis y S. aureus,
respectivamente. Para la especie F. ramulosa se ha reportado la actividad antibacteriana contra
S. aureus presentando una CMI de 200 µg/mL (Erazo et al., 2002).
El extracto de condensados de humos mostró una actividad antibacteriana de 2500 µg/mL
y 5000 µg/mL frente a B. subtilis y S. aureus, respectivamente. Existen pocos estudios respecto
a la actividad antibacteriana de extractos de humos. Se encontró que el extracto de humo
condensado de Eremophila longifolia presentó una CMI mayor contra S. aureus y B. subtilis de
3900 y 5200 µg/mL. El humo de esta especie es usado en las prácticas indígenas australianas
para ceremonias de curación (Sadgrove et al., 2014).
El aceite esencial de F. denudata presentó una CMI de 750 µg/mL y 1000 µg/mL frente a B.
subtilis y S. aureus, respectivamente. No hay estudios de aceites esenciales del género
Fabiana, solamente se han encontrado actividad antibacteriana en aceite esencial de otras
especies. De acuerdo con Benitez et al., 20011, el aceite esencial de Senecio atacamensis, una
especie altiplánica, presentó una buena actividad contra S. aureus (CMI: 260.7 μg / mL). Los
aceites esenciales de Eucaliptus y Rosemary evidenciaron un elevado efecto antibacteriano
sobre B. subtilis (CMI: 97 μg / mL) y S. aureus (CMI: 390 y 195 μg / mL) (Bosnic et al., 2006).
64
Debido a sus complejidad y variabilidad, es difícil correlacionar la actividad antimicrobiana del
aceite esencial a un componente específico; la actividad se ha explicado principalmente a
través de la presencia de terpenos C10 y C15 con anillos aromáticos y un grupo hidroxílico
fenólico que son capaces de formar enlaces de hidrógeno con sitios activos de enzimas.
Además, terpenos activos como alcoholes, aldehídos y ésteres pueden contribuir con un efecto
antimicrobiano en los aceites esenciales (Valarezo et al., 2013).
Por otro lado, la actividad antibacteriana de los flavonoides aislados: 3,7,4'-
trimetilkaempferol (Fr7 Flav), 3,7,3',4'-tetrametilquercetina (199-218 Flav), 3-metilquercetina
(378-381 Flav) fueron activos contra B. subtilis y S. aureus, con un rango de CMI de 250-1000
µg/mL (CaMI 1.25-5 µg), mientras que el compuesto 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav) fue
inactivo. La mayor inhibición en el desarrollo antibacteriano la presentó el compuesto 3-
metilquercetina (378-381 Flav), estructura con mayor número de grupos hidroxilos. Los
flavonoides, por presentar en su estructura hidroxilos fenólicos, penetran fácilmente a través de
la membrana celular bacteriana, lo podría ser responsable de su actividad (Ruitón et al., 1998,
Echeverría et al., 2017).
El sesquiterpeno metil éster del ácido pernético fue activo frente a B. subtilis y S. aureus.
Presentó una CMI de 250 µg/mL (1.25 µg) y de 500 µg/mL (CaMI 2.5 µg). En la especie
Pilgerodendron uviferum, se encontraron sesquiterpenos similares de tipo cadinano como: 15-
copaenol, cubenol y epicubenol que resultaron ser activos frente a las bacterias B. cereus y S.
aureus, el sesquiterpeno torreyol con un grupo hidroxilo terciario resultó ser inactivo frente a
ambas cepas. Estos sesquiterpenos hidroxilados produjeron mayor inhibición de crecimiento
que los sesquiterpenos hidrocarbonados (Espinoza, 2016). Por otra parte, se encontraron
sesquiterpenos de tipo cadinano con grupos hidroxilos como 15-copaenol, cubenol y torreyol,
resultaron tener una mayor actividad antibacteriana contra B. subtilis y S. aureus. Estos datos
sugieren que la presencia de un grupo OH crea inestabilidad y rompe las interacciones
fosfolípido-esterol de la membrana plasmática bacteriana (Solís et al., 2004). De acuerdo a la
literatura es la primera vez que se observa la actividad antibacteriana de este sesquiterpeno
metil éster del ácido pernético.
Todos los extractos probados no presentaron actividad frente a bacterias Gram negativo,
posiblemente, probablemente porque estas contienen mayor porcentaje de lípidos (11-22%)
que las bacterias Gram positivo (1-4%). Por otro lado, las bacterias Gram negativo tienen un
extremo hidrofílico que opera como bomba de expulsión de diversas sustancias, por lo cual, el
compuesto antibacteriano es expulsado de manera inmediata, sin lograr un efecto (Berdy,
1995).
65
CAPÍTULO IV
Conclusiones
En este capítulo se dan a conocer las conclusiones y recomendaciones a las que se llegaron a
partir del análisis de los resultados obtenidos en el presente proyecto.
La resina se usa para enyesar quebraduras de huesos, para la hinchazón y dolor de huesos, el
extracto de humo se utiliza como sahumerio para desinfectar el ambiente y el aceite
esencial para tratar resfríos y dolor de huesos. Los compuestos aislados mostraron una
menor concentración mínima inhibitoria comparada con la resina. Por tanto, se valida el
uso contra bacterias Gram positivo ya que Staphylococcus aureus está relacionada con
infecciones de la piel, dolor de huesos, resfríos y dolores estomacales. Bacillus subtilis a
menudo es usado como el equivalente Gram positivo de Escherichía coli en intoxicación
alimentaria. Confirmando con el presente trabajo, la validación del uso popular, se contribuye a
valorar el conocimiento y dar valor agregado a la flora de la región.
73
Anexos
Fr7-Flav
74
Fr7-Flav
75
F199-218 Flav
76
F199-218 Flav
77
270-273 Flav
78
270-273 Flav
79
Figura A.7 Espectro COSY H-H del compuesto 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav)
80
Figura A.8 Espectro HSQC C-H del compuesto 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav)
81
Figura A.9 Espectro DEPT C 135 del compuesto 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav)
82
Figura A.10 Espectro HMBC C-H del compuesto 7,4´-dimetilquercetina (270-273 Flav)
83
330-337 Flav
84
330-337 Flav
85
345-349 Flav
86
345-349 Flav
87
378-381 Flav
88
378-381 Flav
89
Figura A.17 Espectro RMN 2D COSY del compuesto 3-metilquercetina (378-381 Flav)
90
Figura A.18 Espectro HSQC C-H del compuesto 3-metilquercetina (378-381 Flav)
91
Figura A.19 Espectro HMBC C-H del compuesto 3-metilquercetina (378-381 Flav)
92
Fr7 Terp
Figura A.20 Espectro RMN-1H del compuesto metil éster del ácido pernético (Fr7-Terp)
93
Fr7 Terp
Figura A.21 Espectro RMN-13C del compuesto metil éster del ácido pernético (Fr7-Terp)
94
Figura A.22 Espectros COSY H-H del compuesto metil éster del ácido pernético (Fr7-Terp)
95
Figura A.23 Espectro HSQC C-H del compuesto metil éster del ácido pernético (Fr7-Terp)
96
Figura A.24 Espectro HMBC C-H del compuesto metil éster del ácido pernético (Fr7-Terp)
97
Figura A.25 Espectro DEPT 135 del compuesto metil éster del ácido pernético (Fr7-Terp)
98
Pico 1. Tiempo de retención: 9.74 min Pico 5. Tiempo de retención: 12.48 min
FDresina_1_Extracted_Scan_12.48_3745
FDresina_1_Extracted_Scan_9.74_2923
294
200
225
249
Pico 2. Tiempo de retención: 11.24 min Pico 6. Tiempo de retención: 12.60 min
FDresina_1_Extracted_Scan_11.24_3373
208 FDresina_1_Extracted_Scan_12.60_3780
204
324 345
278 358 296
280
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
Pico 4. Tiempo de retención: 12.25 min Pico 8. Tiempo de retención: 12.92 min
FDresina_1_Extracted_Scan_12.92_3877
FDresina_1_Extracted_Scan_12.25_3674
230 206 293
345
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
99
Pico 9. Tiempo de retención: 13.09 min Pico 13. Tiempo de retención: 14.24 min
FDresina_1_Extracted_Scan_14.24_4273
FDresina_1_Extracted_Scan_13.09_3928
214 209
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
Pico 10. Tiempo de retención: 13.46 min Pico 14. Tiempo de retención: 14.53 min
FDresina_1_Extracted_Scan_14.53_4358
FDresina_1_Extracted_Scan_13.46_4037 221
224
267
293 364
Pico 11. Tiempo de retención: 13.66 min Pico 15. Tiempo de retención: 14.67 min
FDresina_1_Extracted_Scan_13.66_4097
254 FDresina_1_Extracted_Scan_14.67_4402
202
332
289
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
Pico 12. Tiempo de retención: 13.93 min Pico 16. Tiempo de retención: 15.01 min
FDresina_1_Extracted_Scan_13.93_4180
354 FDresina_1_Extracted_Scan_15.01_4502
207
215
347
279 254
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
100
Pico 17. Tiempo de retención: 15.23 min Pico 21. Tiempo de retención: 17.33 min
FDresina_1_Extracted_Scan_15.23_4569
202
FDresina_1_Extracted_Scan_17.33_5199
201
345
257 373 280
294
Pico 18. Tiempo de retención: 15.68 min Pico 22. Tiempo de retención: 17.90 min
FDresina_1_Extracted_Scan_15.68_4703
251
FDresina_1_Extracted_Scan_17.90_5369
200
335
314
202
200 300 400 Wavelength (nm)
200 300 400 Wavelength (nm)
Pico 19. Tiempo de retención: 16.19 min Pico 23. Tiempo de retención: 18.18 min
FDresina_1_Extracted_Scan_18.19_5456
FDresina_1_Extracted_Scan_16.19_4858
202 200
255
356
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
297
200 300 400 Wavelength (nm)
200 300 400 Wavelength (nm)
101
Pico 25. Tiempo de retención: 18.68 min Pico 29. Tiempo de retención: 19.42 min
FDresina_1_Extracted_Scan_19.42_5825
FDresina_1_Extracted_Scan_18.68_5605
208 203
254
355
347
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
Pico 26. Tiempo de retención: 18.85 min Pico 30. Tiempo de retención: 19.86 min
FDresina_1_Extracted_Scan_18.85_5656 FDresina_1_Extracted_Scan_19.86_5959
229 285
344
292
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
FDresina_1_Extracted_Scan_20.03_6008
241
370
256
Pico 28. Tiempo de retención: 19.25 min Pico 32. Tiempo de retención: 20.14 min
FDresina_1_Extracted_Scan_19.25_5776
193 FDresina_1_Extracted_Scan_20.14_6043
202
371
267 351 272
102
Pico 33. Tiempo de retención: 20.34 min Pico 37. Tiempo de retención: 21.32 min
FDresina_1_Extracted_Scan_20.34_6101 FDresina_1_Extracted_Scan_21.32_6397
207
228 343
250
268
282 339
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
Pico 34. Tiempo de retención: 20.48 min Pico 38. Tiempo de retención: 21.44 min
FDresina_1_Extracted_Scan_21.44_6433
FDresina_1_Extracted_Scan_20.48_6145 202
204
256
355 255 369
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
Pico 35. Tiempo de retención: 20.60 min Pico 39. Tiempo de retención: 21.56 min
FDresina_1_Extracted_Scan_20.60_6179
205 FDresina_1_Extracted_Scan_21.55_6466
224
259
358
280
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
Pico 36. Tiempo de retención: 21.03 min Pico 40. Tiempo de retención: 21.72 min
FDresina_1_Extracted_Scan_21.03_6309
214 FDresina_1_Extracted_Scan_21.72_6515
203
337
282
254
355
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
103
Pico 41. Tiempo de retención: 22.49 min Pico 45. Tiempo de retención: 24.25 min
FDresina_1_Extracted_Scan_22.49_6748 FDresina_1_Extracted_Scan_24.25_7274
203 224
370
260
317
309
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
Pico 42. Tiempo de retención: 23.22 min Pico 46. Tiempo de retención: 24.38 min
FDresina_1_Extracted_Scan_23.22_6966 FDresina_1_Extracted_Scan_24.38_7314
206 223
362
317
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
Pico 43. Tiempo de retención: 23.64 min Pico 47. Tiempo de retención: 24.70 min
FDresina_1_Extracted_Scan_23.64_7092 FDresina_1_Extracted_Scan_24.70_7410
250
301
273
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
Pico 44. Tiempo de retención: 24.05 min Pico 48. Tiempo de retención: 24.91 min
FDresina_1_Extracted_Scan_24.05_7216 FDresina_1_Extracted_Scan_24.91_7472
225 221
281
200 300 400 Wavelength (nm) 200 300 400 Wavelength (nm)
104
Pico 49. Tiempo de retención: 25.54 min
FDresina_1_Extracted_Scan_25.54_7662
255
105
Pico 1. Tiempo de retención: 9.75 min
106
Pico 5. Tiempo de retención: 12.48 min
107
Pico 9. Tiempo de retención: 13.09 min
108
Pico 13. Tiempo de retención: 14.24 min
109
Pico 17. Tiempo de retención: 15.23 min
110
Pico 21. Tiempo de retención: 17.33 min
111
Pico 25. Tiempo de retención: 18.68 min
112
Pico 29. Tiempo de retención: 19.42 min
113
Pico 33. Tiempo de retención: 20.34 min
114
Pico 37. Tiempo de retención: 21.32 min
115
Pico 41. Tiempo de retención: 22.49 min
116
Pico 45. Tiempo de retención: 24.25 min
117
Pico 49. Tiempo de retención: 25.54 min
118