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13 de febrero de 2002
En el primer grupo(o tipo I)además de efectuar un control microbiológico diferente según la carga
demicroorganismos inicial, se actuaría sobre la fosfatasa alcalina, lalactoperoxidasa y la gamma glutamil-
transpeptidasa.
Según el tratamiento térmicopodríamos clasificar los procesos en: termización que no tendría
actividadsobre ninguna de las enzimas y la pasteurización LTST, es decir, ?bajatemperatura corto
tiempo?, que mantendría activas la lactoperoxida y lagamma-glutamil-transpeptidasa, el resto de los
tratamientos inactivarian todaslas enzimas.
Un buen indicador térmico, debeser aquel que sea estable y no se degrade en la vida comercial del
producto yes particularmente importante enproductos de larga duración como la leche esterilizada, bien
clásica o UHT directa o indirecta, y cualquier tipo deleche en polvo.
En cuanto al 2º grupo o (TipoII) los procesos pueden alterar cualquiera de los componentes de la leche y
enespecial uno de los componentes más importantes, las proteínas.
Dietas deficitarias en este tipode aminoácidos no permiten un crecimiento adecuado y pueden ser
responsables deun aumento de la morbilidad y la mortalidad, así como alteraciones cerebralescon
dificultades en el lenguaje, Cheftel (1993).
Pompei (1987) clasifica lasalteraciones de los componentes de la leche por los tratamientos térmicos en:
1º
Interacciones entre los gruposlaterales de los aminoácidos (aa) que dan lugar a la formación de
enlacespseudopeptídicos y de lisinoalanina. Las reacciones de este tipofavorecidas por un pH alcalino,
originaaa no naturales como lantionina,aminoalanina, ornitina, ornitinoalanina, ácido diaminopropiónico
ylisinoalanina.
3º
4º
Insolubilización de proteínasdel suero por desnaturalización: las interacciones dan lugar a agregados
pocosolubles. La medida de la desnaturalización puede utilizarse para evaluar laintensidad del tratamiento
térmico. Resmini (1989).
5º
6º
7º
Interacciones de carbohidratoscon proteínas: reacción de Maillard, que se inicia con la reacción entre
ungrupo amino y un compuesto carbonilo. La lisina (aa esencial) es él masafectado por su doble grupo
amino.
La reacción de Maillard ha sidoobjeto de especial interés en el estudio del efecto del tratamiento
térmicosobre la calidad proteica de la leche y de las fórmulas de alimentos paralactantes, bien sean en
forma líquida o en polvo, porque afecta al valornutritivo de las proteínas, puede dar lugar a compuestos
antinutritivos ytóxicos y provoca cambios organolépticos y funcionales; por otra parte en lacomposición
del producto, la elevada relación lactosa/proteínas y lostratamientos térmicos aplicados, favorecen la RM,
ya que necesitan en esteproceso un elevado aporte de energía de activación, Palombo (1984) y
Cheftel(1993). La RM también se produce durante el almacenamiento prolongado (vida comercial),en
condiciones adversas de humedad y temperatura en leches en polvo, otemperaturas inadecuadas cuando
setrata de leches líquidas. Por tanto los almacenamientos relativamenteprolongados a que se somete la
leche en polvo, favorecen este proceso, aunqueel almacenamiento con atmósferas modificadas o con
Nitrógeno disminuyen estosefectos. Varnam (1994). Pellegrino (1995).
Las premelanoidinas sepolimerizan para formar melanoidinas solubles e insolubles, que son
lasresponsables del pardeamiento de los alimentos. Como la RM provoca la formaciónde lisinoalanina
con el consiguiente bloqueo de lisina y la reducción del valornutritivo, la Sociedad Europea de
Gastroenterologia y Nutrición en Pediatría(ESPGAN, 1987), estableció los contenidos mínimos en lisina
disponible ymáximos de lisina bloqueada.
Los diferentes tratamientostérmicos a que se somete la leche, conducen a diferentes etapas de la RM.
Laoptimización de los procesos permitirá controlar y limitar en lo posible estareacción, a fin de que el
contenido en lisina del producto final sea similar aldel producto crudo (Finot, 1993).
De esto se deduce el interés dedisponer de indicadores químicos del deterioro de la leche que
permitancontrolar las modificaciones que se producen durante la recogida, elaboración yalmacenamiento
de misma y de las fórmulas infantiles de base láctea que seemplean para alimentación de recién nacidos.
Su determinación permitirádetectar los procesos a los que ha sido sometido el producto y estudiar
losefectos de su almacenamiento sobre su calidad. Los indicadores del deterioro dela leche se pueden
clasificar en:
1º
Lisinoalanina (LAL).
Histidinoalanina (HAL).
Furfurales.
Melanoidinas.
2º
Galactosa
Lactulosa
Desnaturalización de Proteínas
FUROSINA
Para determinarlactulosil.lisina Möller (1977) ha propuesto una hidrólisis enzimática quepermite liberar
lisina y lactulosil.lisina. (Henle 1991).
La muestra se trata con unserie de enzimas (tripsina, pronasa,aminopeptidasa y prolinasa), que
liberan lisina y lactulosil.lisina, que posteriormente se determina con unautoanalizador de aminoácidos
por Cromatografía de Intercambio Iónico (CII), sise aplica la hidrólisis ácida, lalactulisil.lisina y la
fructosil.lisina se descomponen dando lugar a tres aa:furosina, piridoxina y lisina. Si se admite que la
furosina es constante, sucontenido será indicador del grado en que ha ocurrido la RM y por tanto la
intensidaddel tratamiento térmico, sería controlable.
Este parámetro nos da unaposible clasificación como se puede observar en la tabla de la transparencia.No
solo para productos lácteos sino también para otros alimentos con baseláctea.
LISINOALANINA(LAL)
Uno de losindicadores más sensibles del deterioro térmico de las proteínas es elcontenido en LAL. Se
forma por el tratamiento térmico y/o alcalinización.Walter (1994) observó que este tipo de tratamientos
puede provocar undesplazamiento transversal de las proteínas, que a su vez pueden dar lugar a
laformación de dehidroalanina. Ladehidroalanina reacciona fácilmente conaa nucleófilos (reacción de
Michael) para dar lugar a diferentes compuestos, enla leche es especialmente importante la LAL que se
forma al unirse el grupoe-amino de la lisina a la dehidroalanina, así el contenido en LAL es unparámetro
indicador de la calidad de los derivados lácteos.
La formación de LAL reduce elvalor nutritivo de los alimentos al disminuir la disponibilidad de los aa y
ladigestibilidad de las proteínas.
Klostermeyer (1977) estudió laformación de dehidroalanina, lantionina y LAL durante el procesado
térmico dela Beta-lactoglobulina.
Para la determinación de LAL, lamuestra se somete a hidrólisis ácida [HCl 6M/110ºC, 23 horas], y se
separa por Cromatografía deIntercambio Ionico (por detección fruorimétrica o con ninhidrina). No
sedetecta LAL en leche cruda, y en la pasteurizada o UHT, se determinan de 10 a40 microgramos/g. de
proteína. En leche evaporada y condensada hay entre150-200 microgramos/g de proteína.
La LAL también se detecta enproductos lácteos esterilizados en autoclave: leche, crema para café y
formulasinfantiles para lactantes cantidades entre 200 y 1160 microgramos/g de proteína.
Con este método se detectaron 50microgramos/g de proteína en leche UHT, cuando ha tenido un
tratamientosuperior a 145ºC/10´.
HISTIDINOALANINA(HAL).
La N-N-2 amino2 carboxil-etil-L- histidina (HAL) fuemencionada la primera vez por Henle (1993), que
después de hidrolizar muestrasde leche tratadas térmicamente y analizar aa por CII (ninhidrina), detectó
unpico entre la fenil-alanina y la piridosina, cuya formación no estabarelacionada con las temperaturas y
los tiempos de calentamiento sino con eltipo de tratamiento sufrido. Se podía relacionar con la LAL que
se detectabasimultáneamente. Paralelamente determinaron pérdidas de serina e histidina.
Al hidrolizar una muestra deN-acetil-histidina y dehidroalanina, y analizar los aa por CII, se obtenían tres
picos que dabanpositivo a la ninhidrina; la histidina,LAL y el no identificado: el N-2-amino-2-
carboxietil- L- histidina (HAL).
Los compuestos HAL y LAL están directamenterelacionados con la intensidad del tratamiento térmico.
Estas dos determinaciones sonútiles para el control de derivados lácteos en los procesos de elaboración.
Furfural (F)
Furilmetilcetona (FMC)
Metilfurfural (MF).
Hidroximetilfurfural (HMF),
es un compuesto intermediario deformación de pigmentos en las etapas más avanzadas en la RM, por lo
que seutiliza como indicador del dañotérmico. Durante el tratamiento térmico y el almacenamiento a
temperaturas inadecuadaspueden formarse derivados del furfural que son indicadores de la fase que se
haefectuado de la RM.
En el contenido de HMF influyela temperatura, la intensidad del tratamiento térmico, así como su
contenido enagua y el tiempo de almacenamiento.
De ahí que este índice seaválido para controlar el daño provocado por el tratamiento térmico en
productosque hayan sido almacenados.
La presencia de HMF en lechestratadas térmicamente puede relacionarse con otros indicadores como
laturbidez, la destrucción de vitaminas y los contenidos en lactulosa,lisinoalanina, furosina y beta-
lactoglobulina entre otros, Morales (1994).
Al estudiar diferentes tiemposde tratamiento a 100ºC se observó que aparecía un compuesto, que se
denominópico alfa, que manifestaba una respuesta mas que notable; este compuesto seidentificó gracias a
la colaboración de la Profesora Anna Arnoldi de laUniversidad de Milán, como Galactosil-isomaltol.
En la siguiente diapositiva seven los resultados de HMF obtenidos en leches comerciales españolas y
alemanas,tanto determinadas por métodos colorimétricos como cromatográficos.
Melanoidinas (color/pardeamiento)
Las melanoidinas son pigmentospardos de elevado peso molecular que se forman en la etapa final de la
RM.
El color debido a lasmelanoidinas está relacionado con las características y tiempo dealmacenamiento de
la leche y es independiente de la intensidad del tratamientotérmico.
Rossi (1991) observó que elcolor se mantenía constante durante 600 días en fórmulas para
lactantes,almacenadas a 4º y 20ºC, mientras que a 38ºC antes de 200 días, aparecía elcambio de color.
disponible.
Al ser la Lys el substrato de laRM, el contenido en Lys disponible es útil para evaluar el efecto de
estareacción durante el tratamiento térmico y el almacenamiento. La Lys como aaesencial, es de gran
valor nutricional y la determinación de la cantidaddisponible en el alimento a analizar es de mucho
interés.
Hay métodos espectrofotométricos,cromatográficos y otros:
1º
Posati (1972), Hall (1973, 1975 y 1979) yJames (1986), modificaron el método de manera que pueda ser
utilizado enproductos con cantidades elevadas de Hidratos de carbono.
2º
En los cromatográficos, Albalá (1997) propuso una determinación parafórmulas en leches infantiles
líquidasy en polvo con una hidrólisis [a 160ºC, 2h 30´derivatizando con 1 fluoro-2-4-
dinitrobenceno(FDNB) ], y detección a 362 nm.
3º Otros métodos:
También este indicador nos sirvepara obtener una clasificación de leche pasteurizada, leche UHT y
lecheesterilizada en botella o esterilización clásica, por la cantidad de Lysperdida como se puede observar
en la tabla.
La lactosapuede degradarse durante el procesado térmico de la leche por dos vías; porisomerización a
lactulosa y a continuación por degradación de ésta a galactosa,ácido fórmico y compuestos C5 y C6, y por
interacción de la lactosa conresiduos de lisina de la proteína paraformar lactulosil.lisina ligada a la
proteína, que se degrada dando galactosa,ácido fórmico como señala van Boekel , (1991).
Los contenidos en galactosa hansido determinados por Olano (1986), estudiando la galactosa en sistema
demodelos, observa que el contenido en galactosa aumenta en función del pH y deltiempo de
calentamiento. El almacenamiento también da lugar al aumento de lagalactosa procedente de otros
azúcares diferentes de la lactosa pero encantidades insignificantes.
Los resultados de galactosaobtenidos por nosotros con un método enzimático preparado por la
firmaBoeringher Manheim, nos dieron una posible clasificación de leche, como puedeobservarse en esta
diapositiva.
Lactulosa.
Se forma por isomerización de lalactosa durante el tratamiento térmico de la leche y se utiliza como
indicadordel deterioro de la leche durante el tratamiento térmico, Olano (2001).Discurso de ingreso en
esta Academia y publicado en sus anales nº 9, 2001.
Sustanciasreductoras en la proteína.
Este índice depende de losgrupos sulfhidrilo (-SH) y disulfuro (-S-S), por lo que se considera un índicedel
daño térmico experimentado en el producto, aunque su valor puede procederde la reestructuración de
estos grupos en la RM. Pompei, (1987). Para sudeterminación se emplea el método de laAOAC (1990),
modificado para fórmulas de leches infantiles líquidas y en polvo.
Las muestras se liofilizan y seextraen con éter de petróleo durante 8 horas. El residuo desengrasado
sedisuelve en agua, se acidifica a pH 4,6 con ácido acético (al 5%) y sedetermina espectrofotmétricamente
a 619 nm.
Realizamos determinaciones yestudios cinéticos de grupos ?SH libres como índices de calentamiento y se
consideraron de posible interés parala categorización y clasificación de leches comerciales. Estos estudios
fueronel trabajo de tesis de Carmen Romero (1991).
El tratamientotérmico influye en la estructura de las proteínas. Dos son los parámetrosutilizados para
evaluar el deterioro en la leche: la digestibilidad de lasproteínas y la desnaturalización de las proteínas del
suero.
Se utilizan métodos dedigestibilidad ?in vitro?´, que consisten en la digestión enzimática de lasmuestras
en determinadas condiciones.Hsu (1977), propuso un método basado en la medida del pH; este
procedimiento esrápido, sensible y capaz de determinar el efecto del tratamiento térmico sobrela
digestibilidad.
Se prepara una suspensión demuestra a analizar, que se somete a digestión multienzimática con
tripsina,quimotripsina y peptidasa, durante 10 minutos y se registra la disminución delpH provocada por
la digestión.
Paralelamente se determina ?invivo? la digestibilidad aparente,
mediante la fórmula:
Nitrógeno de la dieta
Pompei (1987) empleó este métodoen fórmulas infantiles líquidas para determinar ?in vivo? la
digestibilidadaparente de la proteína.
A partir de aa esenciales de lamuestra y la digestibilidad proteica ?in vitro? Método de Hsu (1977),
secalcula el coeficiente de eficiencia proteica (C-PER) Satterlee (1982), este método es el adoptado por la
AOACoficialmente en 1990.
El valor C-PER, es relativo enel caso de los lactantes, puesto que no contempla ni Histidina ni Metionina
queson aa esenciales para el recién nacido, pero aun así es un parámetro útil paracomparar muestras.
Desnaturalizaciónde proteínas.
Hay diferentes métodos paradeterminar las proteínas del suero. En nuestro caso se ha determinado
porelectroforesis SDS-page y por Clae siguiendo el método Resmini (1989)modificado.
Morales (1998), estudió el gradode proteolisis por el tratamiento térmico a 130ºC UHT-d, UHT-i y
esterilizaciónclásica en leche y en sistema de modelos, analizando la fracción soluble a pH4,6, en ácido
tricloroacético (40-120g/l), por medio de Clae en fase reversa con detecciónfluorométrica, identificando
dos péctidos solubles P21 y P25 cuya concentración aumentaba con laseveridad del tratamiento.
Proteínas delsuero.
Las proteínas del sueropresentan diferente estabilidad térmica por orden la mas estable es laAlfa-
lactalbumina, después la Beta-lactoglobulina, le sigue la seroalbuminabovina (BSA) y por último las
inmunoglobulinas (IgG). Las proteosas peptonas(P-P) no son sensibles térmicamente. Las proteínas del
suero individualmente oen grupo pueden ser usadas como indicadores del deterioro, pero su empleo
puedeser discutido. Sirve para la separación de la leche pasteurizada en tres clasesI. Leche recién
pasteurizada de alta calidad, II Leche recién pasteurizada y III leche pasteurizada.
En leche en polvo sirve paraclasificar en pequeñas diferencias en leche en polvo obtenido por un proceso
deultra bajo calentamiento y un tratamiento térmico de bajo calentamiento.
Los valores encontrados pornosotros están reflejados en la tabla y nos sirven para clasificar la lechesegún
el tratamiento térmico sufrido.
Valor pH.
Rossi en 1991estudió la variación del pH a 4º, 20º y 38ºC durante 600 días en fórmulas paralactantes y
comprobó que a 4ºC permanecía constante, que disminuíaligeramente a 20ºC (de 7 a 6,7) y bastante a
38ºC (de 7 a 5,9).
Van Boekel (1994), atribuyó estavariación del pH al ácido fórmico, tanto por la isomerización de la
lactosacomo por la RM.
Viscosidad.
Es un índice que refleja elestado de agregaciones proteicas, como consecuencia del tratamiento
térmico.Las modificaciones causadas en la leche por estos procesos pueden darvariaciones en la
viscosidad como resultado de la integración entre losagregados de polisacáridos y la fracción proteica.
Rossi 1991, determinó viscosidadesen fórmulas para lactantes en muestras sometidas a diferentes
tratamientosindustriales, mediante un viscosímetro capilar a 40ºC, no encontrandodiferencias
significativas. Sí se presentaron variaciones al cabo de 600 díaspero éstas fueron irregulares.
Rossi 1991 también estudió AGLen fórmulas para lactantes, utilizando el método de Mathieu (1984). Se
observóque disminuían en los 100-120 primeros días y que después al cabo de 531 díasaumentaban, a
diferencia de los parámetros antes mencionados no variaban deforma regular aunque al final de los
almacenamientos tendían a disminuir.
Conclusiones.
Ninguno de losíndices por si sólo sirve para determinar la calidad de la leche ni paraverificar el procesado
sufrido ya que cubren un rango térmico muy amplio y serecomienda el empleo de dos o más índices, uno
que cubra los rangos depasteurización y otro que sea más sensible a los rangos de esterilización
quepermitan conocer mejor el estado de la leche procesada.
Los estudios realizados sobrecalentamientos de leche han contribuido a mejorar objetivamente la calidad
delas leches comerciales. Desde 12 años hasta hoy la calidad de la lechecomercial en todas sus
presentaciones ha mejorado sensiblemente.
Algunos de estos índices sonútiles y sirven para mejorar y controlar las leches infantiles, y sobre todo
lacalidad de los componentes que entran a formar parte de la composición de lasfórmulas de las leches
infantiles.
Proyectos de investigación tantonacionales como subvencionados por la UE para el estudio de este tipo
dealimentos podrían mejorar mucho la calidad de los mismos. Sería bueno que setuviera en cuenta esta
línea de investigación para el futuro; se ha trabajado yse seguirá trabajando en estos alimentos, pero quizá
de una manera indirecta.
Pienso por último que se deberíahacer un esfuerzo mayor y dar un gran impulso a este tipo de
investigaciones opor lo menos yo desde aquí quisiera transmitir esta inquietud.
Muchas gracias.
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