Optimización de la expresión de rSIP en Pichia pastoris

X-33 utilizando la Metodología de Superficie de

Respuesta con Diseño Box-Behnken.

Composición de los medios de cultivo, para la levadura Pichia pastoris X-33 transfectada con
pPICZαA:SIP (capaz de expresar la proteína SIP de S. agalactiae):

- Medio de crecimiento BMGY: 1% Extracto de levadura; 2% Peptona; 100mM amortiguador

Fosfato de potasio pH 6; 1.34% medio YNB con Sulfato de amonio; 1% Glicerol.

- Medio de inducción BMMY: 1% Extracto de levadura; 2% Peptona; 100mM amortiguador

Fosfato de potasio pH 6; 1.34% medio YNB con Sulfato de amonio; 1% Metanol.

La expresión de la proteína recombinantes consiste en:

1. Se hacen crecer las levaduras Pichia pastoris X-33 transfectadas en medio de

crecimiento BMGY hasta alcanzar una OD600 de 2 – 2.5 (se logra en 16 hrs.
aproximadamente). Este crecimiento se realiza en un matraz aforado en relación 1:10
del total del volumen del matraz con respecto al volumen del medio de cultivo.
2. Las células (pellet) es lavado con agua purificada y autoclavada para eliminar el Glicerol.
3. Las células (pellet) son inducidas en medio de inducción BMMY por 24 hrs. En un matraz
en relación 1:10 del volumen del matraz con el volumen del medio de cultivo. Esta
relación permite la captación de oxígeno, necesario para activar la ruta metabólica
asociada a la utilización de metanol.
4. Se continua con las etapas de cuantificación y purificación de proteínas.

Las variables seleccionables para optimizar la expresión de proteínas recombinantes son:

1) Crecimiento celular: cuantificable por OD600nm. No se seleccionó esta variable, porque

Pichia pastoris X-33 flocula lo que genera un error muy alto en la medición de OD.
Actualmente se inicia la expresión de la proteína recombinante desde una OD600nm de 2
– 2,5, el medio de crecimiento utilizado es el medio BMGY.
2) Temperatura de inducción: actualmente se utiliza una temperatura constante de 30°C
para expresar la proteína recombinante.
3) Agitación: se utiliza una agitación constante de 250 rpm. Los matraces con medio de
cultivo de inducción BMMY se encuentran en una relación de 1:10 entre el volumen del
matraz y el volumen de medio de cultivo.
4) pH: se requiere un pH de 6 para reprimir las proteasas secretadas (extracelularmente)
por Pichia pastoris X-33, estas son capaces de digerir las proteínas recombinantes de
interés. Por lo tanto, es indispensable ajustar el pH del medio para inhibir estas
proteasas.
 5) Metanol: fuente de carbono e inductor de la proteína recombinante de interés. La
proteína recombinante solo será expresada por Pichia pastoris X-33 transfectada en un
medio con Metanol (inductor).
6) Sorbitol: fuente de carbono. Es posible añadir sorbitol junto con el metanol al medio de
inducción, para generar una mayor tasa de crecimiento de Pichia pastoris X-33 con la
finalidad de lograr expresar mayor cantidad de proteínas recombinante.

La aireación no es posible de cuantificar, por lo tanto, no se añadió como posible variable para el
diseño Box-Behnken.

Condición Variables Niveles

-1 0 1
A Sorbitol (%p/v) 0 1 2
B Metanol (%p/v) 0,5 1,25 2
C pH 6 6,75 7,5
Fig. 1. Valores de las variables y de los niveles utilizados para el diseño Box-Behnken. Nivel 0
corresponde a los puntos medios: Sorbitol 1%; Metanol 1.25%; pH 6.75.

Razones por las que se seleccionaron estas variables:

- Sorbitol: porque se ha demostrado que al utilizarlo como co-sustrato, junto con el metanol
en el medio de cultivo de inducción (medio de cultivo “BMMY”), se logra una mayor tasa de
crecimiento de levaduras Pichia pastoris X-33. Por lo tanto, en presencia de sorbitol, se logra
una mayor cantidad de levaduras en el medio generando así una mayor expresión de la
proteína recombinante de interés (por acción del inductor metanol). El sorbitol es utilizado
en bioreactores para aumentar la tasa de crecimiento de Pichia pastoris X-33 sin generar
una represión del gen AOX1 (necesario para expresar la proteína recombinante) y sin
generar condiciones toxicas en el medio de cultivo.

- Metanol: porque es utilizado como inductor del promotor AOX1, necesario para iniciar la
expresión de la proteína recombinante, lo que vuelve al metanol indispensable en la
optimización de la expresión de la proteína recombinante. El metanol es metabolizado por
la levadura Pichia pastoris X-33 como fuente de carbono, es decir, no solo actúa como
inductor de la proteína recombinante, sino que también es consumido por la levadura. Sin
embargo, concentraciones altas de metanol en el medio de cultivo resulta toxico para las
levaduras, por lo tanto, no es recomendable utilizar altas cantidades de metanol al expresar
proteínas recombinantes.

- pH: el pH del medio es necesario para reprimir la acción de proteasas secretadas por Pichia
pastoris X-33 capaces de degradar la proteína recombinante de interés. Por esta razón
regular el pH del medio de inducción es fundamental para expresar proteínas de forma
extracelular utilizando a P. pastoris X-33.
Además, estas variables fueron seleccionadas por su fácil manipulación, ya que dependen de la
forma en que se elabore el medio de inducción (medio BMMY) y se pueden colocar todos los
tratamientos experimentales dentro de un shaker (porque se utilizaría la misma temperatura).

Razones por las que se seleccionaron estos niveles:

- Sorbitol 0% (-1): tratamiento experimental que no utiliza Sorbitol, con la finalidad de

comparar el efecto de este co-sustrato.
- Sorbitol 1% (0): cantidad moderada de co-sustrato.
- Sorbitol 2% (1): alta cantidad de co-sustrato para observar si existe mayor expresión de SIP.

- Metanol 0,5% (-1): concentración mínima recomendada por bibliografía para expresar
proteínas recombinantes.
- Metanol 1,25% (0): concentración moderada de metanol.
- Metanol 2% (1): alta concentración de metanol.

- pH 6.0 (-1): pH recomendado necesario para inhibir la acción de proteasas secretadas por
P. pastoris X-33.
- pH 6.75 (0): ninguna razón destacable, es posible que a mayor pH se obtenga mayor
estabilidad de la proteína recombinante secretada al medio de cultivo.
- pH 7.5 0% (1): ninguna razón destacable es posible que a mayor pH se obtenga mayor
estabilidad de la proteína recombinante secretada al medio de cultivo.

Fig.2. Matriz de Diseño Box-Behnken bibliográfica con 13 tratamientos experimentales. “Runs”

corresponde a los tratamientos experimentales, 13 en total. Los factores A, B y C corresponden a
las variables seleccionadas en el diseño Box-Behnken. -1 corresponde al menor nivel de una variable,
0 corresponde al nivel o punto medio de una variable, 1 corresponde al mayor nivel de una variable.
Tratamiento experimental Sorbitol (%p/v) Metanol (%p/v) pH
1 0 0,5 6,75
2 2 0,5 6,75
3 0 2 6,75
4 2 2 6,75
5 0 1,25 6
6 2 1,25 6
7 0 1,25 7,5
8 2 1,25 7,5
9 1 0,5 6
10 1 2 6
11 1 0,5 7,5
12 1 2 7,5
13 1 1,25 6,75
Fig. 3. Matriz de diseño Box-Behnken para la expresión de rSIP en Pichia pastoris X-33. Utilizando
las variables y niveles que se muestran en la figura 1.

La respuesta que se buscará optimizar corresponde al porcentaje de rendimiento producción de la

proteína rSIP (% Rendimiento rSIP) especifica de forma extracelular, por Pichia pastoris X-33 en los
13 tratamientos experimentales descritos en la figura 3, con respecto a la cantidad de proteínas
totales secretadas (extracelulares) por esta levadura.

Para cuantificar el porcentaje de rendimiento de producción de rSIP, se realizará la siguiente

operación matemática:
µg
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑟𝑆𝐼𝑃 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎 (mL)
% Rendimiento rSIP = µg
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎𝑠 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟𝑒𝑠 (mL)
 Tratamiento Sorbitol Metanol pH Proteínas rSIP especifica % Rendimiento
experimental (%p/v) (%p/v) totales [µg/ [µg/𝐦𝐋] rSIP [%]
𝐦𝐋]
1 0 0,5 6,75 - - -
2 2 0,5 6,75 - - -
3 0 2 6,75 - - -
4 2 2 6,75 - - -
5 0 1,25 6 - - -
6 2 1,25 6 - - -
7 0 1,25 7,5 - -
8 2 1,25 7,5 - - -
9 1 0,5 6 - - -
10 1 2 6 - - -
11 1 0,5 7,5 - - -
12 1 2 7,5 - - -
13 1 1,25 6,75 - - -
Fig.4. Matriz de diseño Box-Behnken para la expresión de rSIP en Pichia pastoris X-33. Utilizando las
variables y niveles que se muestran en la figura 1 junto con la respuesta (% Rendimiento rSIP). La
concentración de proteínas totales secretadas por Pichia pastoris X-33 se cuantificará por el método
de Bradford o por el kit BCA; y la concentración especifica de rSIP se cuantificará por ELISA Sandwich
(utilizando una curva patrón generada por una muestra purificada y cuantificada por HPLC).