Manual​ ​de​ ​microbiología​ ​aplicada

Microbiología
Grupo​ ​2

“Bioremediación,​ ​biología​ ​sintética​ ​y​ ​producción​ ​de​ ​fármacos”

Sebastián​ ​Alejos
Daniela​ ​Ortiz
Regina​ ​Sánchez
Sharon​ ​Lustenberger
E.​ ​Fernando​ ​Sánchez
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1) Biología​ ​sintética:

Artículo:

“Diseño basado en biología sintética para mostrar un antígeno de un

rotavirus​ ​de​ ​18kDa​ ​en​ ​una​ ​partículas​ ​modulares​ ​como-virus.”​ ​[2]

1.​ ​Antecedentes:

La biología sintética es el diseño y creación de nuevos sistemas biológicos no

naturales y el rediseño de sistemas biológicos naturales ya existentes para lograr
desarrollar​ ​aplicaciones​ ​útiles​ ​(2).

Hasta el momento, la biología sintética solamente es capaz de construir un genoma

que realiza la función para la cual fue creada. El gran reto es crear un sistema
complejo en el cual insertar el genoma. Hoy en día se utilizan huéspedes como
bacterias​ ​ya​ ​existentes​ ​para​ ​eso.

Actualmente sus aplicaciones son muy variadas, y con el paso del tiempo se van a ir
incrementando a la lista nuevas aplicaciones conforme se vayan realizando nuevos
descubrimientos en el área. Hoy en día se utiliza la biología sintética para combatir
la resistencia a antibióticos de bacterias, tratamiento de tumores, modificación del
microbioma​ ​para​ ​combatir​ ​problemas​ ​metabólicos​ ​y​ ​generación​ ​de​ ​vacunas.

2.​ ​Desarrollo:
a)​ ​Introducción:

Las partículas como-virus ​(VLPs) son una nueva y excitante forma de vacunas que
tienen un gran potencial debido a su juego de propiedades atractivas como
seguridad, auto-adyuvanticidad, desarrollabilidad, economicidad y la habilidad de
ser formulada con estabilidad sin una cadena de frío. Sus efectos en la salud
humana ya han sido demostrados en vacunas para hepatitis B y E, y para
papilomavirus​ ​humano.
Debido a esto, una cantidad enorme de investigación está siendo apuntada hacia la
creación de VLPs de siguiente generación, que presentan partes de patógenos
muertos, alrededor o dentro, de una partícula formada por un virus sin relación a
éstos.

Sin embargo, el campo de los VLPs es intelectualmente inmaduro; las reglas para el
diseño modular de éstos no existe como tal, que pudiera permitir un diseño “a priori”
de una nueva vacuna. Es claro que se requerirá un vasto esfuerzo para determinar
los principios que permitirían tener un diseño de VPLs fidedigno y no uno
“serendípico”.
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La biología sintética y la ingeniería de biología molecular proveen de herramientas

tales como simulaciones dinámicas moleculares y procesos de diseño que
revolucionarán​ ​el​ ​campo​ ​de​ ​las​ ​vacunas​ ​con​ ​VLPs​ ​en​ ​los​ ​años​ ​por​ ​venir.
También cabe mencionar que el costo de producción de vacunas basadas en VLPs
es muy asequible, y significarán un atractivo muy grande para países de bajos
ingresos.

VLPs basados en el virus enteros, comprenden de múltiples proteínas,

convirtiéndolos difíciles de caracterizar y procesar. Los VLPs modulares que
presentan subunidades de rotavirus son un enfoque prometedor que presenta una
manufactura​ ​más​ ​simple.

Polyomavirus ha sido probado como un anfitrión remarcablemente versátil para la

presentación de un antígeno eficaz de estilo modular. Se demostró que el
Poliomavirus murino ​tiene una ventaja particular como una plataforma modular
puesto que la proteína VP1 puede ser expresada a un alto rendimiento en células
bacterianas, y luego, ésta proteína es armada, fuera de la célula, en un proceso
controlado, de manera que puede ser elevado a una escala mayor. Por lo tanto, el
resultado es un costo de manufactura extremadamente bajo para una VLP que
puede ser formulada para ser termoestable, presentando módulos protectores en
contra​ ​de​ ​patógenos​ ​virales​ ​y​ ​bacterianos.

Una limitación en el diseño de vacunas VLPs basadas en poliomavirus es debido al

tamaño del módulo antigénico presentado. Antigénicos peptídicos han sido
rutinariamente introducidos aunque dominios enteros se han demostrado como más
complejos. Gleiter et al. introdujo una enzima larga en ​Poliomavirus murino, ​aunque
los rendimientos de expresión soluble fueron bajos y la función enzimática fue
reducida, presumiblemente debido una incorrecta conformación de la enzima. El
método preferido para presentar antígenos de gran tamaño en ​Poliomavirus ​a
evolucionado de ser uno basado en conjunción a una ya formada VLPs, por
interacción electrostática o por conjunción química. El “darle la vuelta” a la
conjunción incrementa la complejidad y reduce la competitividad del ​Poliomavirus
como una plataforma para el desarrollo de vacunas, pero es necesario cuando no se
conocen​ ​los​ ​principios​ ​para​ ​el​ ​diseño​ ​confiable​ ​de​ ​una​ ​vacuna.
En esta investigación se presenta al dominio 18kDa VP8 de rotavirus en una
plataforma VLP ​Poliomavirus murino, ​por la expresión de una sola proteína modular.
Usando simulación molecular se encontraron dos principios clave para el diseño que
serán habilitadores para el campo de las VLPs en general. Se muestra que el diseño
de enlazadores es crucial para habilitar la separación del módulo de gran tamaño
insertado de la proteína VLP, para que la estructura de ambos se mantenga
independiente. También se muestra que la incorporación de gran cantidad de
antígeno en la superficie de un capsómero, puede inhibir la formación del VLP,
porque mucho antígeno trata de entrar al VLP. Esta “barrera estérica” para el
ensamblaje del VLP se superó co-expresando la proteína VP1 con gran cantidad de
antígeno junto con proteína VP1 sin modificar. En esta investigación se utilizó una
plataforma​ ​de​ ​expresión​ ​de​ ​células​ ​de​ ​insectos.
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b)​ ​Planteamiento​ ​del​ ​problema:

El costo de algunas vacunas esenciales para las poblaciones humanas son

increíblemente altos, es de suma importancia abaratar los precios. Acorde a una
publicación en línea de el periódico el universal, bajo la administración actual se han
invertido​ ​más​ ​de​ ​30​ ​mil​ ​millones​ ​de​ ​pesos.​ ​[1]

Por ejemplo, acorde al CDC, la vacuna contra el virus del papiloma humano (VPH)
puede llegar a costar $204.87 dólares/dosis en medios privados [4], ésto tal vez no
sea demasiado para un gobierno como para el de estados unidos, pero para uno
como el nuestro, o aún más débil, el de países donde el PIB sea menor a 30, ésto
se traduce en una gran falta de suministros médicos. La tasa de muerte por cáncer
cérvico uterino relacionado al VPH es de 16.85 mujeres por cada 100 mil (2006)[5],
mientras que en Jamaica no existe un suministro por parte del gobierno y hay un
índice​ ​de​ ​muertes​ ​de​ ​185​ ​por​ ​cada​ ​100​ ​mil​ ​[6].

Es de suma importancia desarrollar vacunas a costos mucho menores para que

países subdesarrollados como Jamaica tengan una mayor posibilidad de costear
éstas​ ​vacunas​ ​que​ ​por​ ​el​ ​momento​ ​son​ ​virtualmente​ ​imposibles​ ​de​ ​alcanzar.

c) Equipos, materiales y métodos: Descripción de los procedimientos

empleados.

1) Modelado​ ​de​ ​homología​ ​de​ ​capsómeros:

Modelos de homología fueron creados usando ​Accelrys Discovery Studio® 3.0. ​Un
modelo de cada proteína modular VP1-VP8* se construyó primero usando el modelo
1SID para VP1 del ​Poliomavirus murino, ​la cepa VP8* del rotavirus DS-1, y la
glicoproteína PDB del virus Hendra modelo 2 x 9 para las estructuras enlazadoras
Q25 y P6. Un monómero fue modelado dentro de un capsómero sin modificar para
mantener la estructura auténtica VP1 y la barrera estérica para la presentación del,
antígeno ya que VP1 existe naturalmente como un capsómero. El modelo VP1-VP8*
fue modelado dentro del capsómero usando PBD 1SID como modelo de capsómero.
El modelo homologado de VP1-VP8* titulado se construyó utilizando dos monómero
VP1-VP8* y tres monómeros sin modificar VP1, usando PBD 1SID como modelo de
capsómero.

2) Simulación​ ​de​ ​dinámica​ ​molecular​ ​de​ ​capsómero​ ​modular​ ​VP1-VP8*:

Simulaciones de dinámica (MD) molecular para los capsómeros fueron realizadas
utilizando GROMACS versión 4.6 con el campo de fuerza Gromos96 43a1 y el
modelo de carga de punto simple (CPS) del agua. Cada sistema molecular
construido consistía de un solo capsómero solvatado en un cubo de 18 nm cúbicos,
con moléculas de solvente añadidas aleatoriamente alrededor del polipéptido. El
sistema fue solvatado usando el modelo del agua CPS y neutralizado utilizando
iones de sodio. Se utilizó el método de Benson para controlar la temperatura a 298
K con una constante de tiempo 0.1pS y presión de 1 atm con una constante de
acoplamiento de 1.0ps. Se utilizó el algoritmo MD con un paso de tiempo de
integración de 2 fs. El algoritmo de conjunción de partículas Ewald (PME) se utilizó
para llevar cuenta de las interacciones electrostáticas. Los cortes de la lista de
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átomos vecinos, potencial de Coulomb y las energías potenciales de Lennard-Jones

fueron establecidas a 1.0nm. Las velocidades iniciales de partículas se generaron
de acuerdo a la distribución de Maxwell a 298.15 K. Después se realizaron 5000
pasos​ ​de​ ​abrupta​ ​disminución​ ​de​ ​energía​ ​seguidos​ ​de​ ​un​ ​equilibrio​ ​de​ ​100ps.

3) Construcción​ ​del​ ​plásmido

El vector de transferencia pBAC​TM​-1 (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) cargando el virus
modificado ​Poliomavirus murino VP1 entre las zonas de restricción BamHI y XhoI fue
construido para generar el plásmido pBACVP1. La secuencia (M34958) del virus
Poliomavirus murino VP1 fue modificada por mutagénesis en sitio para insertar las enzimas
de​ ​restricción​ ​NaeI​ ​y​ ​AfeI​ ​en​ ​las​ ​posiciones​ ​86​ ​y​ ​293​ ​de​ ​VP1.

4) Generación​ ​de​ ​baculovirus​ ​recombinante

Se generaron baculovirus usando el sistema ​flashBACULTRA​TM ​. ​Células de Spodoptera
frugiperda Sf9 en Sf-900​TM ​II SFM (Life Technologies, California, USA) fueron plantadas a
2.4×10​5 ​células/pozo en una ​Placa TC de 24 ​pozos. Se incubó por 30 min a temperatura
ambiente antes de ser vaciadas en células Sf9. Se incubó la placa a 27°C por 5 hrs antes
de reemplazar con Sf-900​TM ​II SFM fresco adicionado con antibióticos-antimicóticos e
incubado​ ​a​ ​27°C​ ​por​ ​7​ ​días.​ ​El​ ​medio​ ​gastado​ ​se​ ​recogió​ ​por​ ​centrifugación.

5) Expresión​ ​de​ ​proteína

Se infectaron las células SF9 para la producción de proteína VP1 y VP1 modular.
Para investigar la coexpresión y la coinfección se infectaron varios cultivos. Todos
los cultivos infectados se incubaron a 27°C y 120 rpm por 72 Hrs. Para cosecar las
células​ ​se​ ​utilizó​ ​centrifugación​ ​a​ ​8000​ ​x​ ​g​ ​por​ ​20​ ​min​ ​a​ ​4°C.

6) Purificación​ ​del​ ​VLP

La purificación se realizó mediante ultracentrifugación. para los VLPs VP1 se usó la
solución​ ​amortiguadora​ ​de​ ​lisis​ ​MOPS.

7) SDS-Page​ ​y​ ​Western​ ​blotting

Se analizó la expresión y purificación de proteínas usando Western Blotting y
electroforesis por gel. Para la electroforesis se siguieron las indicaciones del
proveedor para su utilización. Para el análisis Western se transfirió el gel a una
membrana PVDF y fue sondeado con anticuerpo anti-VP1. Seguido por anticuerpo
anti-ratón​ ​de​ ​cabra​ ​con​ ​peroxidasa​ ​de​ ​rábano.

8) Dot​ ​Blot
Se aplicaron antígenos en un membrana de nitrocelulosa, bloqueados con polvo de
leche 5% descremada en una solución amortiguadora PBST al .1%. y sondeado con
anticuerpos​ ​contra​ ​VP1​ ​de​ ​ratón.

9) Immunogold​ ​Labelling
Muestras de VLPs purificado fueron aplicadas a una malla Formvar-recubierta, y
después de 2 minutos enjuagadas por una solución amortiguadora por un minuto.
Se bloqueó la malla por 5 minutos con gelatina de piel de pescado al .2%. Se aplicó
anti VP8* de ratón diluido 10 veces y fue incubado por 30 min a temperatura
ambiente. Se lavó cuatro veces después de la incubación. Se aplicó anticuerpo
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anti-ratón de cabra con oro y fue incubado por 30 min a temperatura ambiente. Se
tiñó​ ​con​ ​2%​ ​acetato​ ​de​ ​uranilo​ ​antes​ ​de​ ​ver​ ​en​ ​el​ ​microscopio​ ​electrónico.

10)Análisis​ ​de​ ​VLPs

Células infectadas se procesaron para el análisis TEM como describen Lua et al.
Para las células VLPs purificadas se aplicaron 2 micras a una malla
Formvar-recubierta,​ ​teñida​ ​y​ ​visualizada.

d) Descripción del microorganismo(s): características generales (morfología,

taxonomía, metabolismo, hábitat, crecimiento, técnicas de aislamiento y/o
detección,​ ​si​ ​se​ ​asocia​ ​a​ ​otros​ ​procesos​ ​o​ ​patologías)

El​ ​microorganismo​ ​usado​ ​para​ ​el​ ​modelado​ ​de​ ​la​ ​VLP​ ​fue​ ​el​ ​Poliomavirus​ ​murino.

Morfología:

La​ ​proteína​ ​de​ ​VP1​ ​de​ ​la​ ​cápside​ ​está​ ​ensamblada

en​ ​una​ ​forma​ ​icosahedral,​ ​que​ ​comprende​ ​de
72​ ​capsómeros.

Taxonomía:
Grupo: Grupo​ ​I​ ​(dsDNA)
Familia: Polyomaviridae
Género: Alphapolyomavirus
Especie: Poliomavirus​ ​murino

Metabolismo:
No​ ​tiene​ ​metabolismo​ ​debido​ ​a​ ​que​ ​es​ ​un​ ​virus.

Hábitat:
Células​ ​hospederas,​ ​originalmente​ ​fue​ ​descubierto​ ​en​ ​un​ ​extracto​ ​oncogénico​ ​de
leucemia​ ​de​ ​ratón,​ ​por​ ​ende​ ​el​ ​nombre​ ​murino.​ ​Está​ ​principalmente​ ​localizado​ ​en​ ​la
vía​ ​intranasal​ ​de​ ​los​ ​ratones​ ​y​ ​es​ ​evacuado​ ​en​ ​la​ ​orina.
 6

Técnicas​ ​de​ ​aislamiento:

Se​ ​usa​ ​un​ ​sustrato​ ​basado​ ​en​ ​tejidos​ ​del​ ​hospedero.​ ​(glándula​ ​parótida​ ​de​ ​ratones)

Patología:
Los​ ​principales​ ​signos​ ​de​ ​infección​ ​son​ ​tumores​ ​en​ ​la​ ​glándula​ ​parótida​ ​de​ ​ratones,
aunque​ ​no​ ​es​ ​común​ ​que​ ​se​ ​presenten​ ​ya​ ​que​ ​es​ ​un​ ​virus​ ​oportunista,​ ​afectando
sólo​ ​a​ ​ratones​ ​recién​ ​nacidos​ ​e​ ​inmunodeprimidos.

e)​ ​Resultados
Las estructuras capsoméricas de los modelos homólogos VP1-G4S-VP8*-G4S y
VP1-Q25-VP8*-P6 fueron simuladas usando Gromacs molecular dynamics software
por 20 ns. La Fig. 1 muestra estas estructuras antes y después de la simulación,
demostrando el cambio en la estructura al final de la simulación. El módulo superior
del capsómero VP1-G4S-VP8*-G4S es observado colapsando hacia el capsómero,
con el antígeno de 18.1 kDa VP8* doblándose desde la parte superior hacia abajo y
a un lado del capsómero, potencialmente interactuando con la estructura VP1,
resultando en una perturbación de estructura del capsómero y por ende, una
inestabilidad significativa. Mientras tanto el capsómero VP1-Q25-VP8*-P6 mantiene
una presentación del módulo encima del antígeno VP8* sin la interacción prevista
entre el antígeno y las estructura del capsómero, gracias a los enlazadores
idóneamente​ ​diseñados.
 7

Cultivos Sf9 fueron infectados con baculoviruses recombinantes, cargando VP1,

VP1-G4S-VP8*-G4S ó VP1-Q25-VP8*-P6, por separado, para determinar la
expresión de cada proteína. La Fig. 2 muestra la expresión sin modificaciones de la
proteína VP1 de 42.5 kDa como se predecía. Por la densidad celular y por la
morfología celular post-infección se sugiere que hubo una buena infección en todos
los cultivos, esto observaciones confirman que el diseño de los enlazantes tiene un
efecto​ ​en​ ​la​ ​expresión​ ​de​ ​la​ ​proteína​ ​modular​ ​VP1-VP8*.
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Secciones ultra delgadas de células fueron procesadas y vistas debajo de un

microscopio electrónico de transmisión para examinar si VLPs podían ser
observadas núcleo de células. Como se muestra en la Fig. 3 A y B, las VP1 de los
VLPs se acumularon cerca del núcleo, similar a reportes previos. No obstante,
ningún VLP modular fue observado en células infectadas con el baculovirus
recombinante VP1-Q25-VP8*-P6 aunque la expresión proteica fue confirmada.
Parece una expresión exitosa de una proteína VP1-VP8* con enlazantes no se
tradujo​ ​en​ ​un​ ​ensamblaje​ ​exitoso​ ​de​ ​VLPs.
Fue hipotetizado que la alta densidad de antígenos modulares grandes en la
superficie de cada capsómero hayan causado una barrera estérica, y por lo tanto,
previniendo​ ​el​ ​ensamblaje​ ​de​ ​VLP.

Las Fig.4 A y B muestran el modelo de homología especulado después de disminuir

gradualmente la titulación del número total de antígenos presentes en cada
capsómero ensamblado, como se esperaba. La interacción estérica inversa entre
antígenos VP8* fue significativamente reducida por la reducción en el número de
módulos de VP8* por capsómero, potencialmente haciendo más estable a el
capsómero.

Ésta hipótesis fue probada mediante la adopción de la co-expresión de VP1 and

VP1-Q25-VP8*-P6. Un cultivo de células Sf9 fue co-infectada con ambos de los
baculovirus recombinantes (VP1 and VP1-Q25-VP8*-P6) en una proporción MOI
(multiplicidad de infección) de 1:5 para compensar por la expresión disminuida de
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VP1-Q25-VP8*-P6. Ambas proteínas (VP1 and VP1-Q25-VP8*-P6) fueron

detectadas en el cultivo co-expresado. Debajo de un TEM se observaron VLPs
ensamblados dentro del núcleo de células co-infectadas, similares en tamaño y
morfología​ ​a​ ​las​ ​VLPs​ ​VP1​ ​observado​ ​en​ ​la​ ​Fig.​ ​3​ ​A​ ​y​ ​B.
Se realizaron diferentes intentos para purificar los VLPs de cada cultivo de
expresión (VP1, VP1-Q26-VP8*-P6 y la co-expresión VP1:VP1-Q26-VP8*-P6. La
Fig. 5 muestra el patrón de las bandas, una banda para VPL fue observado en el
tubo para VP1. En comparación a del VP1 y la co-expresión
VP1:VP1-Q26-VP8*-P6, ninguna banda para VLP fue observada para
VP1-Q26-VP8*-P6 in la densidad gradiente del tubo. Esta observación soporta la
hipótesis de que el ensamblaje de VLP es obstaculizado cuando hay una densidad
alta de antígenos grandes en la superficie del capsómero. VLPs modulares
co-expresados (VLP-VP8*) fueron purificados de células usando una
ultracentrifugación con un gradiente de cloruro de cesio y fue analizado en un TEM
(Fig. 6A). Se realizó inmunomarcaje con oro con anticuerpos anti-VP8* y se
confirmó que módulos antigénicos se presentaron en la superficie de de éstos VLPs
purificados. (Fig. 6B). Como se mostró en el análisis Dot Blot (Fig. 6C), los
anticuerpos reconocen solamente módulos VP8* y no la base VP1. Tanto como el
análisis de inmunomarcaje con oro y el análisis Dot Blot con el anticuerpo
neutralizante de rotavirus específico de VP8* sugiere que los VP8* modularizados
se conforman en las superficie de VLPs modulares. Ambos los VP1 VLPs
VLPs-VP8 eran similares en tamaño, fueron medidos por un campo de flujo
asimétrico acoplado con una dispersión multi ángulo de la luz Fig. 6D. Los radios
medido​ ​de​ ​los​ ​VP1​ ​VLP​ ​y​ ​VLP-VP8*​ ​fueron​ ​22.4​ ​nm​ ​y​ ​22.2​ ​nm.

4.​ ​Referencias​ ​(formato​ ​Vancouver)

1. Miranda P. Aplican más de 400 millones de vacunas en México: José Narro

[Internet]. El Universal. 2017 [cited 27 November 2017]. Available from:
http://www.eluniversal.com.mx/articulo/nacion/sociedad/2017/07/31/aplican-mas-de-
400-millones-de-vacunas-en-mexico-jose-narro

2.Lua L, Fan Y, Chang C, Connors N, Middelberg A. Synthetic biology design to

display an 18kDa rotavirus large antigen on a modular virus-like particle. Vaccine
[Internet]. 2015 [cited 7 November 2017];33(44):5937-5944. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X1501275X

3. Alonso C, Soto M. BIOLOGÍA SINTÉTICA: ASPECTOS CIENTÍFICOS Y

SOCIALES [Internet]. 2014 [cited 25 November 2017]. Available from:
http://arbor.revistas.csic.es/index.php/arbor/article/view/1950/2267

4. VFC | Current CDC Vaccine Price List | CDC [Internet]. Cdc.gov. 2017 [cited 27
November 2017]. Available from:
 10

https://www.cdc.gov/vaccines/programs/vfc/awardees/vaccine-management/price-list
/index.html#f5

5. Mortalidad por Cáncer Cérvico-uterino y de Mama [Internet].

www.dgis.salud.gob.mx. 2017 [cited 27 November 2017]. Available from:
http://www.dgis.salud.gob.mx/descargas/pdf/IB_2006.pd​f

6.​ ​Citar​ ​un​ ​sitio​ ​web​ ​-​ ​Cite​ ​This​ ​For​ ​Me​ ​[Internet].​ ​Hpvcentre.net.​ ​2017​ ​[cited​ ​27
November​ ​2017].​ ​Available​ ​from:​ ​http://www.hpvcentre.net/statistics/reports/JAM.pdf
 11

2)​ ​Producción​ ​de​ ​fármacos

Artículo:
“Estudios​ ​sobre​ ​el​ ​potencial​ ​de​ ​curación​ ​de​ ​heridas​ ​del​ ​pigmento​ ​rojo
aislado​ ​de​ ​bacterium​ ​Vibrio​ ​sp.”

1. Antecedentes
El objetivo de la microbiología aplicada en la producción de fármacos radica
principalmente en el desarrollo de vacunas y elementos biológicos benéficos para el
uso humano. Mediante la utilización de medios de esterilidad, límites microbianos,
recuento de aerobios mesófilos, pruebas endotoxinas y pruebas de control, busca
evidenciar el equilibrio entre microorganismos patógenos y no patógenos dentro de
una muestra, el cultivo de las bacterias en un medio nutritivo no riguroso y la fuerza
bactericida, entre otros, para su aplicación en la elaboración de productos para el
tratamiento​ ​y​ ​la​ ​prevención​ ​de​ ​enfermedades.​ ​[1]

2.​ ​Desarrollo:​ ​Ejemplo​ ​de​ ​una​ ​aplicación​ ​REAL​ ​(Artículos​ ​académicos,​ ​libros)

a. Introducción

La mayoría de las discapacidades físicas causadas por insultos ambientales

tales como lesiones mecánicas y químicas son heridas. La curación de las heridas
es un proceso interactivo de sistema de cascada complejo entre las acciones
celulares y bioquímicas, que implica interacciones continuas célula-célula y célula
matricial que permiten que el proceso proceda en diferentes fases superpuestas.
Hay varios factores que retrasan el proceso de cicatrización de la herida. El factor
externo que puede retrasar de manera efectiva el proceso de cicatrización de la
herida es la infección bacteriana, lo que significa que la protección de la herida
contra la infección bacteriana por parte de cualquier agente puede promover un
aumento en la tasa de curación. Los productos naturales siempre han desempeñado
un papel importante en la medicina y en metabolitos marinos meticulosos han
resultado​ ​ser​ ​cada​ ​vez​ ​más​ ​beneficiosos​ ​en​ ​el​ ​descubrimiento​ ​reciente​ ​de​ ​fármacos.
La biodiversidad marina es el ecosistema más rico y complejo; sus duras
condiciones ambientales son las fuerzas impulsoras para la producción de diversos
productos naturales con características únicas; se informó que la flora microbiana
marina produce una amplia variedad de metabolitos secundarios bioactivos como
antimicrobianos, y los agentes citotóxicos y las sustancias bioactivas incluyen
alcaloides, policétidos, péptidos cíclicos, polisacáridos, florotaninos, diterpenoides,
pigmentos, esteroles, quinonas, lípidos y glicerol, la utilización de los pigmentos
naturales en los procesos de fabricación farmacéutica han aumentado en los últimos
años. Este artículo trata sobre un pigmento rojo aislado de la cepa microbiana
marina que se investigó por su actividad de curación de heridas junto con la
propiedad antimicrobiana para comprender su papel como actividad antimicrobiana
que​ ​asistía​ ​al​ ​proceso​ ​de​ ​curación​ ​de​ ​heridas.
 12

b. Planteamiento del problema: datos crudos, estadísticas, importancia

económica.
En los últimos años, los microorganismos patógenos humanos han
desarrollado mecanismos de resistencia para los antibióticos disponibles
comercialmente. Los costos de producción de los antiobióticos son demasiado altos
y causan efectos secundarios adversos en comparación con los fármacos bioactivos
naturales obtenidos. Esta resistencia a los antibióticos ha creado varias
complicaciones en la industria de la salud. A nivel mundial, 480 000 personas
desarrollan TB resistente a múltiples medicamentos cada año, y la resistencia a los
medicamentos también está empezando a complicar la lucha contra el VIH y la
malaria. Resistencia a los medicamentos de primera línea para tratar las infecciones
causadas por ​Staphlylococcus aureus​, una causa común de las infecciones en los
establecimientos de salud y en la comunidad están muy extendidas. Se estima que
las personas con SARM (​Staphylococcus aureu​s resistente a la meticilina) tienen un
64% más de probabilidades de morir que las personas con una forma no resistente
de​ ​la​ ​infección.
Sin embargo, a pesar de que los océanos cubren más del 70% de la
superficie terrestre, la exploración de los ecosistemas marinos solo comenzó a
mediados de la década de 1970, por lo que existe poca información sobre el uso de
microbios​ ​marinos​ ​en​ ​la​ ​industria​ ​farmacéutica.

c. Equipos, materiales y métodos: Descripción de los procedimientos

empleados.

Materiales:
Muestras​ ​de​ ​agua​ ​de​ ​mar
Materiales​ ​de​ ​caracterización​ ​bioquímica​ ​estándar
Árbol​ ​filogenético
50​ ​ml​ ​de​ ​caldo​ ​marino​ ​Zobell
Matraz​ ​de​ ​250​ ​ml
Matraz​ ​Erlenmeyer
Metanol
Papel​ ​de​ ​filtro​ ​Whatman
Cloroformo-agua​ ​líquida
Columna​ ​de​ ​gel​ ​de​ ​sílice
Ratas​ ​Wistar​ ​albino
Jaulas​ ​de​ ​polipropileno
Grasa de lana, parafina dura, alcohol cetosterílico, parafina blanda blanca
(ingredientes​ ​de​ ​pomada)
40%​ ​de​ ​etanol
Ketamina
Contenedor​ ​de​ ​boca​ ​ancha
Cuchilla​ ​quirúrgica​ ​aséptica
Papel​ ​cuadriculado
Alcohol​ ​deshidratado
Solución​ ​de​ ​formalina​ ​tamponada​ ​al​ ​10%
hematoxilina​ ​y​ ​eosina
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Equipo:
Equipos​ ​de​ ​caracterización​ ​bioquímica​ ​estándar
Máquina​ ​de​ ​PCR
BDT​ ​v3.1​ ​Cycle​ ​sequencing​ ​kit
Analizador​ ​genético​ ​ABI​ ​3730xl
Incubadora
Espectrofotómetro​ ​UV-Visivle.
Sanco​ ​Rotavapor
microscopio​ ​óptico​ ​(Olympus​ ​BX51)

Método:

Productos​ ​químicos

Todos los productos químicos y disolventes que se utilizaron en el estudio eran de

grado​ ​analítico​ ​y​ ​se​ ​compraron​ ​en​ ​Merck​ ​Millipore.

Aislamiento​ ​de​ ​bacterias​ ​marinas

Se tomaron muestras de agua de mar en localidades costeras de Nellor

Krishnapatnam, India. Las muestras se extendieron por toda la superficie de placas
de agar marino que consistían en (g / l): peptona 5.0, extracto de levadura1.0, citrato
férrico 0.1, cloruro de sodio 19.45, cloruro de magnesio 8.8, sulfato de sodio 3.24,
cloruro de calcio 1.8, cloruro de potasio 0.55 , bicarbonato de sodio 0,16, bromuro
de potasio 0,08, cloruro de estroncio 0,034, ácido bórico 0,022, silicato de sodio
0,004, fluoruro de sodio 0,0024, nitrato de amonio 0,0016, fosfato disódico 0,008,
agar 15,0. Las muestras se incubaron a 25 ° C durante 48 h, se seleccionaron todas
las​ ​colonias​ ​y​ ​se​ ​aislaron​ ​las​ ​que​ ​tenían​ ​pigmentación​ ​y​ ​morfología​ ​diferentes.

Caracterización​ ​Bioquímica

Varias pruebas, incluyendo aquellas para establecer la tolerancia a la temperatura,

la tolerancia al pH y la respuesta a las concentraciones de NaCl, y muchas otras se
realizaron para caracterizar las propiedades bioquímicas de las cepas aisladas. Se
realizaron pruebas específicas para tinción de Gram, tinción de esporas, motilidad,
producción de indol, producción de catalasa, reducción de nitratos, entre otros, de
acuerdo con la metodología estándar. La capacidad de fermentar azúcares también
se​ ​evaluó​ ​para​ ​las​ ​cepas​ ​aisladas.

Caracterización​ ​molecular

La identificación molecular del rRNA 16S se realizó en IMTECH, Chandigarh, India.

El ADN se extrajo del cultivo y su calidad se evaluó mediante electroforesis en gel
de agarosa (1,2%). Se amplificó un fragmento del ADN mediante PCR y se purificó,
después se llevaron a cabo las reacciones de secuenciación de ADN directa e
inversa. Las búsquedas de BLAST de nucleótidos estándar usando la secuencia de
ARNr 16S identificada como una consulta se realizaron contra la base de datos de
 14

secuencias de ARN ribosómico 16S de NCBI (Bacteria y Archaea). Las secuencias

se alinearon usando la versión en línea de MAFFT. La alineación de secuencia
múltiple se recortó y se ajustó manualmente cuando fue necesario. Un árbol
filogenético que muestra las relaciones evolutivas entre secuencias se obtuvo con el
método​ ​de​ ​máxima​ ​verosimilitud​ ​implementado​ ​en​ ​RaxML.

Proceso​ ​de​ ​fermentación

Se transfirió un bucle de cultivo a caldo marino Zobell previamente esterilizado de

50 ml en un matraz de 250 ml. El matraz se incubó en estado estacionario a 28 ° C
durante 16-18 h o hasta que la absorbancia del cultivo alcanzó una densidad óptica
de 1,0 a 600 nm. Se transfirió un ml del inóculo al medio de producción en un
matraz​ ​Erlenmeyer​ ​de​ ​250​ ​ml,​ ​que​ ​se​ ​incubó​ ​a​ ​28​ ​°​ ​C​ ​durante​ ​72​ ​h.

Extracción​ ​y​ ​medición​ ​del​ ​pigmento​ ​producido

Se retiraron 10 ml del cultivo del caldo y se centrifugaron a 100x100 g durante 10

minutos. La extracción del pigmento se realizó añadiendo metanol al sedimento e
incubando a 60 ° C durante 20 min, seguido de centrifugación. El sobrenadante
coloreado​ ​se​ ​analizó​ ​en​ ​un​ ​espectrofotómetro​ ​UV-Visivle.

Purificación​ ​y​ ​caracterización

El pigmento producido por la bacteria se purificó, el pigmento microbiano de los

extractos de metanol en bruto se filtró para eliminar cualquier biomasa residual y
luego se concentró usando un evaporador rotatorio. La extracción líquido-líquido de
cloroformo / agua se llevó a cabo para eliminar las impurezas hidrófilas. La fase
orgánica, que contiene el pigmento, se concentró mediante un evaporador rotatorio.
El extracto seco se disolvió en cloroformo y se aplicó a una columna de gel de sílice
de 18 cm de altura y 20 mm de ancho. La muestra concentrada obtenida se colocó
en la parte superior de la columna y la separación se inició con la adición de
disolvente.

Espectroscopía​ ​NMR

Se​ ​analizó​ ​la​ ​espectroscopia​ ​H-RMN​ ​del​ ​pigmento​ ​rojo​ ​purificado.

Actividad​ ​de​ ​curación​ ​de​ ​heridas

1.​ ​Experimentar​ ​en​ ​animales

Se usaron ratas Wistar albinas que pesaban 150-250 g. Las ratas que se
alimentaron con pellets de roedores estándar murieron y se alojaron en jaulas de
polipropileno mantenidas en condiciones estándar. Los animales se dejaron durante
diez días en condiciones estándar para la aclimatación. Se utilizó un mínimo de seis
animales​ ​en​ ​cada​ ​grupo.

2.​ ​Preparación​ ​de​ ​la​ ​pomada

 15

Para la evaluación de la actividad de curación de heridas por el modelo de herida de

escisión, se formuló el extracto en forma de ungüento. La pomada se preparó por
método de fusión. Los ingredientes utilizados para preparar la pomada incluyen:
grasa de lana, parafina dura, alcohol cetoestearílico, parafina blanda blanca que se
calentaron de acuerdo con un orden creciente de su punto de fusión y se mezclaron
suavemente con agitación seguido de enfriamiento y envasado en un recipiente de
boca ancha. De la misma manera, se preparó una pomada al 10% de pigmento rojo
y​ ​se​ ​envasó​ ​en​ ​un​ ​recipiente​ ​de​ ​boca​ ​ancha.

3.​ ​Actividad​ ​de​ ​curación​ ​de​ ​heridas​ ​in​ ​vivo

El modelo de escisión cutánea se usó para evaluar la actividad de curación de la

herida del pigmento rojo. Las ratas experimentales se anestesiaron por
administración intraperitoneal de ketamina (70 mg / kg) y se rasuró el pelaje en el
lado dorsal de los animales usando una cuchilla quirúrgica aséptica y se
desinfectaron con 40% de etanol, después se infligió la herida en el lado dorsal en
las ratas. Se creó una herida de escisión circular de 300 mm2 y 0,2 cm de
profundidad con una cuchilla quirúrgica en la superficie dorsal en la región
toracolumbar de cada una de las ratas experimentales, en condiciones estériles. Se
aplicaron un 10% de ungüentos de pigmento rojo a cada animal de experimentación
tópicamente dos veces al día sobre la herida hasta que se curó por completo. Los
cambios progresivos en la herida se controlaron planimetricamente mediante el
trazado del margen de la herida en papel milimetrado cada día alterno. El tiempo de
epitelización se notó como el número de días después de que se requirió la herida
para que la cicatriz se desprendiera y no dejara atrás la herida. A partir de la herida
cicatrizada, se aísla una muestra de tejido de cada grupo de ratas o un examen
histopatológico.

4.​ ​Dosis​ ​utilizada​ ​en​ ​los​ ​estudios​ ​de​ ​curación​ ​de​ ​heridas

El efecto del pigmento rojo sobre la actividad de curación de la herida se estudió en

ratas Wistar machos. Se seleccionaron aleatoriamente un total de 24 ratas que
pesaban 150-200 g y se dividieron en cuatro grupos que consistían en seis ratas en
cada grupo. Ratas en cada uno de los diferentes experimentos, varios grupos
recibieron tópicamente una aplicación de 10% de crema que contenía los siguientes
compuestos​ ​de​ ​prueba:
Los animales se dividen en cuatro grupos, cada grupo consiste en de 6
ratas
Grupo​ ​I:​ ​grupo​ ​de​ ​control​ ​sin​ ​tratamiento
Grupo​ ​II:​ ​Base​ ​de​ ​pomada​ ​Aplicar​ ​base​ ​de​ ​pomada
Grupo​ ​III:​ ​Estándar​ ​tratado​ ​con​ ​ungüento​ ​de​ ​framicetina​ ​al​ ​2%
Grupo IV: grupo de prueba tratado con 10% de extracto de pigmento
rojo​ ​ungüento

5.​ ​Medición​ ​del​ ​índice​ ​de​ ​la​ ​herida

 16

Los índices de la herida se midieron después de cada 2 días de formación de la

herida siguiendo un sistema de puntuación aleatorio. La propiedad de curación se
evaluó como el porcentaje de contracción de la herida, midiendo la longitud y el
tamaño de la herida con pinzas digitales siguiendo la fórmula de Walker y Mason. La
importancia en la cicatrización de heridas de los grupos de ensayo se obtuvo al
comparar el área cicatrizada de la herida en los días respectivos, con el área
cicatrizada​ ​de​ ​la​ ​herida​ ​del​ ​grupo​ ​de​ ​control.

d. Descripción del microorganismo(s): características generales (morfología,

taxonomía, metabolismo, hábitat, crecimiento, técnicas de aislamiento y/o
detección,​ ​si​ ​se​ ​asocia​ ​a​ ​otros​ ​procesos​ ​o​ ​patologías)

Vibrio​ ​sps

Morfología:

Taxonomía:

Vibrio​ ​sps.
- Dominio:​ ​Bacteria
-​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​Filo:​ ​Proteobacteria
-​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​Clase:​ ​Gammaproteobacteria
-​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​Orden:​ ​Vibrionales
-​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​Familia:​ ​Vibrionaceae
-​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​Género:​ ​Vibrio

Metabolismo:
El metabolismo puede ser respiratorio y fermentativo. Son organismos
heterotróficos que obtienen nutrientes de sus relaciones mutualistas, parasitarias o
patogénicas​ ​con​ ​otros​ ​organismos

Hábitat:
Son bacterias halófilas​, ​más comúnmente se encuentran en ambientes
 17

marinos o estuarinos, en aguas templadas o subtropicales, sin embargo, también

se​ ​pueden​ ​encontrar​ ​en​ ​ambientes​ ​de​ ​agua​ ​dulce.
Cuando habitan en el cuerpo humano causan, septicemia resultando en
lesiones secundarias graves en las extremidades. Sin embargo, estos casos son
específicos de género y se encuentran rutinariamente en hombres mayores de 50
años. Esto se debe a que el estrógeno está protegido contra la endotoxina de V.
vulnificus.

Crecimiento:
Los vibrio crecen entre 5° y 43°C, con una temperatura óptima de 37°C. En
su temperature óptima se multiplica muy rápidamente, consiguiendo tiempos
generacionales en 8-10 minutos. No son muy resistentes al calor y se destruyen
fácilmente con la cocción. Son sensibles a valores de pH inferiores a 6, requieren la
presencia​ ​de​ ​cloruro​ ​sódico​ ​para​ ​su​ ​crecimiento​ ​(por​ ​lo​ ​menos​ ​3%).

Técnicas​ ​de​ ​aislamiento​ ​y/o​ ​detección:

Prueba bioquímica oxidasa: usando la enzima bacteriana citocromo C
oxidasa.​ ​Diferenciación​ ​entre​ ​los​ ​no-fermentadores​ ​(reacción​ ​+,​ ​color​ ​azul-morado)

Asociación​ ​a​ ​otros​ ​procesos​ ​o​ ​patologías:

Varias especies de ​Vibrio, incluyendo ​V. cholerae​, V. parahaemolyticus y V​.
vulnificus, causan enfermedades transmitidas por mariscos como septicemia e
infecciones de heridas. ​V. vulnificus es responsable del 95% de las muertes
relacionadas​ ​con​ ​mariscos.
Cólera:​ ​V.​ ​cholerae​ ​coloniza​ ​el​ ​intestino​ ​delgado​ ​y​ ​libera​ ​enterotoxinas.

e.​ ​Resultados

1.​ ​Estudios​ ​de​ ​irritación​ ​de​ ​la​ ​piel

Los tres (base de ungüento, 10% de pomada de pigmento rojo y 2% de framicetina)

mostraron​ ​resultados​ ​negativos​ ​para​ ​los​ ​estudios​ ​de​ ​irritación​ ​de​ ​la​ ​piel

2​.​ ​ ​Actividad​ ​de​ ​curación​ ​de​ ​heridas

La actividad de cicatrización de heridas del pigmento se evaluó usando el modelo de

herida de escisión. Se observó que la pomada de pigmento rojo y el control positivo
mostraron actividad significativa de curación de la herida. De la tabla se observó que
tanto la pomada de pigmento rojo como la pomada de framicetina mostraron un 50%
de curación de la herida dentro de los seis días de la aplicación. La observación
adicional reveló que se observó curación completa de la herida después de 14 días
para framycetin y 16 días para pomada de pigmento rojo. Se observó una
cicatrización parcial de la herida para el grupo de control y el grupo de base del
ungüento​ ​solo​ ​después​ ​de​ ​la​ ​incubación​ ​durante​ ​25​ ​días
 18

3.​ ​Evaluación​ ​de​ ​propiedad​ ​de​ ​antibióticos

El pigmento rojo extraído producido por ​Vibrio ​marino aislado sp. se evaluó su
actividad antibacteriana usando el método de la placa de copa usando
estreptomicina como estándar de referencia. Los estudios antibacterianos revelaron
que el pigmento mostraba una actividad antibacteriana significativa contra las
bacterias​ ​gram​ ​positivas​ ​y​ ​gram​ ​negativas.

3. Conclusión y perspectivas personales de cada miembro del equipo (1

general)

DANI- En conclusión, el desarrollo de los productos farmacéuticos mediante la

investigación de microbios marinos representa un amplio campo de trabajo y
oportunidad para la microbiología y la medicina, ya que los microorganismos de las
profundidades marinas y los océanos representan aproximadamente el 62.2% de la
 19

biomasa de la tierra. Es de suma importancia invertir en el sector marino para

impulsar el desarrollo de nuevas estrategias para la prevención y el combate de
enfermedades.
 20

3)​​ ​Microbiología​ ​ambiental:

Artículo:

“Bioremediation of Crude Oil-Polluted Soil Using Bacteria and Poultry Manure

Monitored​ ​through​ ​Soybean​ ​Productivity”

1. Antecedentes:

La microbiología ambiental es el estudio de la fisiología y la composición de las

comunidades microbianas en el medio ambiente (1). Históricamente, la
microbiología ambiental ha sido utilizada en el tratamiento y eliminación de
desechos municipales, sin embargo, debido a que los microorganismos que se
encuentran en el medio ambiente impactan numerosos aspectos en diversas áreas
de la vida, el campo de la microbiología ambiental interactúa con varias
subespecialidades diferentes y se ha expandido al estudio de sistemas de tierra,
agua y aire, incluida la interacción de microbios con otros organismos y
contaminantes orgánicos o inorgánicos, comportamientos de patógenos y la
aplicación de nuevos microbios y sus productos en beneficio de la salud humana y
el​ ​bienestar​ ​social​ ​(2).

Es esto último justamente lo que marca la diferencia entre el campo de estudio de la

ecología microbiana y la microbiología ambiental, ya que la microbiología ambiental
es un campo aplicado en el que la pregunta principal es: ¿cómo podemos utilizar
nuestra compresión del rol de los microorganismos en el medio ambiente para
beneficiar​ ​a​ ​la​ ​sociedad?

Hacer esto es una tarea compleja, ya que un gramo promedio de suelo contiene
aproximadamente mil millones de microorganismos, los cuales representan varios
miles de especies (3). Dicho esto, imagine el desafío que conlleva desarrollar
estrategias​ ​para​ ​aprovechar​ ​y​ ​manipular​ ​sus​ ​actividades​ ​para​ ​beneficio​ ​humano.

Afortunadamente,​ ​en​ ​los​ ​últimos​ ​años​ ​han​ ​surgido​ ​tecnologías,​ ​como​ ​es​ ​el​ ​caso​ ​de
las metodologías de base molecular, que ahora nos permiten detectar, definir y
comprender mejor la ecología, no solo de hábitats naturales como el suelo y el
agua,​ ​sino​ ​también​ ​de​ ​entornos​ ​antropológicos​ ​como​ ​desechos​ ​municipales​ ​(2).
La biología molecular ha revolucionado el estudio de los microorganismos en el
medio ambiente y ha mejorado nuestra comprensión de la composición, la filogenia
y la fisiología de las comunidades microbianas. La caja de herramientas moleculares
actual abarca una gama de tecnologías basadas en ADN y nuevos métodos para el
estudio de ARN (PCR, pruebas de genes, secuenciación de ADN, metagenómica) y
proteínas extraídas de muestras ambientales (proteómica). Actualmente hay un gran
énfasis en la aplicación de enfoques "ómicos" para determinar las identidades y
funciones de los microbios que habitan en diferentes entornos (4). Esta nueva
evolución del estudio del entorno microbiano también ofrece enfoques innovadores
para el descubrimiento de productos "verdes" de gran valor que podrían utilizarse en
medicina,​ ​agricultura​ ​e​ ​industria.
 21

Entre las aplicaciones de la microbiología ambiental destacan el control de la calidad

del agua, control de infecciones y seguridad alimentaria de productos agrícolas por
identificación y control de microorganismos patógenos, biotratamiento de desechos,
biodegradación de compuestos aromáticos, biorremediación, entre muchas otras
(5). En el presente trabajo, analizaremos esta última aplicación mencionada, la
biorremediación.

2. Desarrollo:

a) Introducción:

El interés en la biodegradación de contaminantes a partir de microorganismos se ha

intensificado en los últimos años a medida que la humanidad se esfuerza por
encontrar formas sostenibles de limpiar los ambientes contaminados. Estos métodos
de biorremediación se esfuerzan por aprovechar la asombrosa capacidad
metabólica de diversos microorganismos para degradar una amplia gama de
compuestos que incluyen hidrocarburos, bifenilos policlorados, hidrocarburos
poliaromáticos,​ ​sustancias​ ​farmacéuticas,​ ​radionucleidos​ ​y​ ​metales​ ​(6).

A continuación, analizaremos un trabajo de investigación realizado por la doctora

Alfreda O. Nwadinigwe, investigadora del Departamento de Ciencia de Plantas y
Biotecnología​ ​de​ ​la​ ​Universidad​ ​de​ ​Nigeria​ ​en​ ​el​ ​2011.

En dicha investigación, titulada, “Bioremediation of Crude Oil-Polluted Soil Using

Bacteria and Poultry Manure Monitored through Soybean Productivity”, la doctora
llevó a cabo la biorremediación de suelo contaminado con petróleo crudo utilizando
bacterias endógenas degradadoras de petróleo, las cuales fueron aisladas de tierra
y estiércol de ave contaminados deliberadamente. Las bacterias aisladas de estas
muestras se sometieron a pruebas morfológicas, fisiológicas y bioquímicas, y se
identificaron como Pseudomonas sp. y Bacillus sp. El objetivo de este estudio, fue
investigar la eficacia de la bioaumentación (utilizando bacterias) y la bioestimulación
(utilizando estiércol de aves de corral) en la biorremediación de suelos
contaminados con petróleo crudo, ya que estos son dos enfoques orientados a
mejorar y acelerar el proceso de la biorremediación. La bioaumentación implica la
adición de una población microbiana externa (endógena o exógena) al sitio
contaminado, mientras que la bioestimulación implica la adición de nutrientes
microbianos apropiados a un sitio contaminado para aumentar las actividades
metabólicas de la flora microbiana autóctona. Para monitorear la eficiencia de estos
dos factores en la biorremediación se utilizó como parámetro la germinación, el
crecimiento​ ​y​ ​la​ ​productividad​ ​de​ ​plantas​ ​de​ ​soja​ ​(7).
 22

b) Planteamiento​ ​del​ ​problema:

El consumo de las sociedades contemporáneas de combustibles fósiles ha

resultado
perjudicial desde el punto de vista ecológico debido a que la contaminación
ambiental causada por el petróleo es un problema global en aumento. En México
existen extensas áreas de suelos contaminados por hidrocarburos, debido a las
tareas de exploración, refinación, falta de mantenimiento y robo de combustible. En
nuestro país existen extensas áreas contaminadas con hidrocarburos procesados
del petróleo, debido principalmente a derrames, así como a las actividades propias
de la industria petrolera. Se estima que en los últimos 20 años han provocado
pérdidas por más de 50 mil millones de dólares, con mayor impacto en el aspecto
ambiental​ ​y​ ​agrícola​ ​(8).

De acuerdo con la Comisión Nacional de Hidrocarburos, de 2006 hasta 2012,

Puebla es el cuarto estado con mayor número de derrames de petróleo a nivel
nacional, con un total de 6.91 de billones de barriles de petróleo derramados. Se
estima que 42 % del total de las emergencias ambientales entre 1993 y 2002
estuvieron​ ​relacionadas​ ​con​ ​siniestros​ ​por​ ​escapes​ ​de​ ​hidrocarburos​ ​(9).

El suelo contaminado con petróleo crudo tiene grandes impactos en la flora y fauna,
ya que afecta la fertilidad de los suelos, el crecimiento de las plantas, y, por lo tanto,
la supervivencia de los animales que se alimentan de éstas (7). Además, estos
derrames también tienen un gran impacto en el ámbito social, que incluye los
sistemas de producción, la salud, la economía y las formas de vida de las
poblaciones cercanas. La afectación más importante sucede cuando estos derrames
dañan suelos agrícolas, provocando un perjuicio económico y social debido a la
inutilización de estos suelos para la producción de cultivos o ganadería, los cuales
contribuyen​ ​a​ ​los​ ​requisitos​ ​nutricionales​ ​y​ ​económicos​ ​de​ ​nuestro​ ​país​ ​(9).
Por ello, la restauración de la fertilidad en tierras agrícolas contaminadas por
petróleo es de gran importancia. Lamentablemente, la rehabilitación natural de los
suelos contaminados con petróleo crudo lleva tiempo y debido a la gran demanda
de tierra, puede ser difícil o imposible permitir que los suelos contaminados se
rehabiliten​ ​de​ ​manera​ ​natural​ ​(7).

Consiguientemente, la biorremediación es importante para las naciones productoras

de petróleo donde el derrame de petróleo es desenfrenado y, a menudo provoca
devastadores desastres naturales. La biorremediación puede ser de gran ayuda
para aliviar a naciones afectadas, los propietarios de tierras agrícolas,
ambientalistas​ ​y​ ​otras​ ​partes​ ​interesadas.
 23

c) Equipos, materiales y métodos: Descripción de los procedimientos

empleados.

Primera etapa​: Aislamiento de bacterias, pruebas bioquímicas, caracterización e

identificación.

Las bacterias utilizadas en este

trabajo se aislaron del suelo arenoso
del Jardín Botánico de la Universidad
de Nigeria, Nsukka, el cual había sido
contaminado de forma deliberada con
petróleo​ ​crudo.

Cuatro gramos del suelo contaminado

se introdujeron en 20 ml de caldo
nutritivo estéril. La esterilización se
llevó a cabo en un autoclave a 121 °
C durante 25 minutos. Se incubaron
durante 24 horas a 37 ° C. El estriado
se realizó en agar nutritivo sólido, en
placas de Petri y se incubaron durante
18 horas a 37 ° C. Se aislaron
colonias de organismos con
características distintas y se
subcultivaron en placas estériles de
agar nutritivo, repetidamente, hasta
que se obtuvieron colonias puras. Las
placas​ ​se​ ​colocaron​ ​en​ ​una​ ​incubadora​ ​durante​ ​18​ ​horas​ ​a​ ​37°C.

Para identificar a los microorganismos aislados con la capacidad de metabolizar

hidrocarburos, se añadió 1 ml de petróleo crudo (como única fuente de carbono) a 4
ml de medio sintético. Los cultivos se incubaron a 27 ° C durante cinco días y se
observaron diariamente para la producción de biosurfactantes. Dos de ocho de los
distintos microorganismos aislados mostraron la capacidad de utilizar hidrocarburos,
por lo que estos dos fueron utilizados posteriormente para la caracterización e
identificación. Para su identificación se analizó su morfología, se realizaron pruebas
de tinción de Gram, exámenes microscópicos, pruebas de motilidad, pruebas
bioquímicas y se observó su crecimiento a 41 ° C y 4 ° C. Finalmente, los dos
microorganismos fueron identificados como Pseudomonas sp. y Bacillus sp. Entre
ellos​ ​se​ ​destacaron​ ​Pseudomonas​ ​aureofasciens​ ​y​ ​Bacillus​ ​mendocina​ ​(7).
 24

Segunda​ ​etapa​:​ ​Trabajo​ ​de​ ​campo.

Primero se llenaron 56 bolsas negras de polietileno con tierra de la capa superior

(0-15 cm de profundidad) del jardín botánico de la Universidad de Nigeria, cada
bolsa de tierra pesaba 8 kg y se contaminó con 200 ml de petróleo crudo, excepto el
control. A una de las bolsas de tierra contaminada con petróleo crudo se le agregó 1
litro de cultivo de Pseudomonas. Esto se repitió utilizando Bacillus, consorcio
(combinación de Bacillus y Pseudomonas), caldo nutritivo y dos gramos de
excremento de aves de corral. Una bolsa de tierra contaminada con petróleo crudo
se dejó sin ningún tratamiento, y además se dejó una bolsa sin contaminar y sin
ningún otro tratamiento (control mencionado anteriormente). Cada bolsa se mezcló
manualmente y el experimento se llevó a cabo en 8 repeticiones. Las bolsas se
mantuvieron bajo el sol y se regaron por la lluvia. Después de dos semanas, se
sembraron tres semillas de soja en cada bolsa después de probar la viabilidad de
las semillas. La germinación comenzó 4 días después de la siembra. La altura
máxima y mayor área foliar se registraron a los 60 días. El recuento de brotes de
haba de soya comenzó a los 80 días. Se observaron cambios de color en las
plantas y muerte. El suelo utilizado fue analizado para arcilla, limo, arena fina, arena
gruesa, carbono orgánico, materia orgánica, nitrógeno, sodio, calcio, potasio,
magnesio, fósforo, pH y capacidad de intercambio catiónico, antes y después del
experimento. Finalmente, los resultados fueron sometidos a análisis de varianza
(ANOVA) y se utilizó el análisis multivariado para probar las diferencias entre los
medios​ ​(7).

d) Descripción​ ​del​ ​microorganismo(s):

A continuación, se mencionan algunas características importantes de los

microorganismos aislados en la primera etapa de esta investigación, los mismos que
fueron utilizados para llevar a cabo la biorremediación de la tierra contaminada con
petróleo​ ​crudo.

I. Bacillus​ ​pumilus:

- Dominio:​ ​Bacteria
- Filo:​ ​Firmicutes
- Clase:​ ​Bacilli
- Orden:​ ​Bacillales
- Familia:​ ​Bacillaceae
- Género:​ ​Bacillus
- Especie:​ ​pumilus

Bacillus pumilus es una bacteria Gram-positiva en forma de bastón. Es mesófila,

aeróbica obligada, degradadora de biomasa (quimioheterótrofo organótrofo) y
formadora de endosporas. Se puede aislar de una amplia variedad de suelos,
plantas y superficies ambientales, incluso del interior de desiertos áridos. Algunas
colonizan en el área de la raíz de algunas plantas donde B. pumilus tiene actividad
 25

antibacteriana y antifúngica. Las esporas de B. pumilus y sus células vegetativas

muestran una resistencia, significativamente más alta que la de otras especies de
Bacillus, a ambientes oligotróficos, radiación UV y H2O2, desinfección química y
otras condiciones adversas que es significativamente más alta que la de otras
especies​ ​de​ ​Bacillus​ ​(10).

La morfología colonial es variable. Las colonias pueden ser arrugadas e irregulares

y no están pigmentadas, la mayoría son opacas o lisas y se tornan de color marrón
amarillento​ ​y​ ​la​ ​hemólisis​ ​es​ ​variable.

Varios ensayos bioquímicos que se encuentran en el Indice de Perfil Analítico (API)

se han utilizado en la búsqueda de su clasificación; B. pumilus es amilasa, lipasa y
proteasa positiva. Tiene una variedad de mecanismos de reducción de nitrato,
producción de gas a partir de glucosa y producción de ácido a partir de una variedad
de​ ​fuentes​ ​de​ ​carbono,​ ​como​ ​arabinosa,​ ​manitol,​ ​xilosa,​ ​glucosa​ ​y​ ​lactosa.

Bacillus pumilus participa en una amplia gama de asociaciones simbióticas, ya que

puede funcionar como una rizobacteria promotora del crecimiento de plantas de
importancia agrícola como el pimiento rojo y el trigo. En el trigo, B. pumilus también
induce la resistencia de las plantas al Take-all (Gaeumannomyces graminis), una
enfermedad​ ​fúngica​ ​que​ ​puede​ ​dañar​ ​significativamente​ ​los​ ​cultivos​ ​de​ ​trigo.

La infección humana por Bacillus pumilus es rara, sin embargo en 2007 se publicó
un informe que resume 3 estudios de casos, concluyendo que una cepa de Bacillus
pumilus fue responsable del desarrollo de lesiones cutáneas morfológicamente
similares​ ​a​ ​las​ ​causadas​ ​por​ ​Bacillus​ ​anthracis​ ​(11).

II. Pseudomonas​ ​mendocina:

- Dominio:​ ​Bacteria
- Filo:​ ​Proteobacteria
- Clase:​ ​Gammaproteobacteria
- Orden:​ ​Pseudomonadales
- Familia:​ ​Pseudomonadaceae
- Género:​ ​Pseudomonas
- Especie:​ ​mendocina

Pseudomonas mendocina es una bacteria Gram negativa, polar monotrómica

flagelada, aeróbica obligada, con forma de bastón (10). P. mendocina está
documentado como capaz de sobrevivir en más de setenta y cinco sustratos
diferentes. Se ha recuperado con éxito tanto de muestras de suelo superficial como
de muestras de cuerpos acuíferos, ya que las respectivas cepas han desarrollado
estrategias metabólicas divergentes para explotar estos nichos únicos. La bacteria
puede crecer a temperaturas que oscilan entre 25ºC y 42ºC. La temperatura óptima
de​ ​crecimiento​ ​es​ ​de​ ​30ºC​ ​y​ ​la​ ​acidez​ ​óptima​ ​del​ ​ambiente​ ​sería​ ​un​ ​pH​ ​de​ ​6.

Su impacto ambiental más importante es su capacidad desnitrificadora que tiene

implicaciones ecológicas en el ciclo del nitrógeno. Además, se ha demostrado que
 26

P. mendocina es un buen candidato para la biorremediación de ecosistemas

dañados por contaminantes creados por el hombre. Se ha encontrado que una cepa
de​ ​P.​ ​mendocina​ ​es​ ​capaz​ ​de​ ​degradar​ ​el​ ​disolvente​ ​orgánico​ ​tolueno.

Aunque P. mendocina rara vez se presenta como un patógeno, puede causar

síntomas graves en humanos que requieren hospitalización y regímenes de
tratamiento intensivo. Afortunadamente, dada la infrecuencia relativa de la infección
humana, la bacteria es susceptible a una gran variedad de antibióticos. En la
sangre, la infección por P. mendocina causa la lisis de los eritrocitos. La lisis de los
glóbulos rojos causa síntomas como fiebre, endocarditis y malestar junto con una
respuesta​ ​inmune​ ​saludable​ ​(12).

e) Resultados​ ​de​ ​la​ ​investigación:

Los resultados de los parámetros vegetativos (Tabla 2), mostraron que el control, el
consorcio, el tratamiento con Pseudomonas y el tratamiento con Bacillus, dieron la
mayor cantidad media de germinación, altura media de la planta y área foliar media,
mientras que los tratamientos con caldo nutritivo, estiércol de aves y petróleo crudo
(solamente)​ ​produjeron​ ​los​ ​resultados​ ​más​ ​bajos​ ​de​ ​estos​ ​parámetros.

Las plantas de soja cultivadas en suelo tratado solo con petróleo crudo mostraron
amarillamiento de hojas dos semanas después de la germinación y produjeron la
mortalidad más alta de 14 plantas, mientras que las otras plantas mostraron
amarillamiento de la hoja 3 meses después de la germinación y tenían números de
mortalidad​ ​más​ ​bajos.
 27

Los resultados de los parámetros

reproductivos (Tabla 3) mostraron
que el control produjo la mayor
cantidad promedio de flores por
planta. Esto fue seguido por el
tratamiento del consorcio. El
petróleo crudo (solo) produjo el
número medio más bajo de flores
por​ ​planta.

Las plantas cultivadas en el suelo

tratado solo con petróleo crudo
comenzaron a florecer después de
9 a 10 semanas, mientras que el
resto comenzó a florecer más
temprano,​ ​de​ ​7​ ​a​ ​8​ ​semanas.

3. Conclusión:

La presente investigación demostró que el uso de bacterias (bioaumentación) y

estiércol de aves (bioestimulación) era remediativo al suelo contaminado con
petróleo crudo. Además, la bioaumentación realizó una mejor biorremediación que
la bioestimulación. La biorremediación con un cultivo mixto de Pseudomonas y
Bacillus (consorcio) fue más eficiente que un solo cultivo de Pseudomonas o
Bacillus.

4. Referencias:

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https://colsa.unh.edu/mcbs/grad/environmental-microbiology

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from:
http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0325-754120110001000
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5. Ratledge C, Kristiansen B. Basic biotechnology. 3rd ed. Cambridge: Cambridge

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6. La bioremédiation : un procédé qui prend de l'ampleur pour la dépollution des sols

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Etats-Unis [Internet]. France-science.org. 2012 [cited 23 November 2017]. Available
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8. Mauricio-Gutiérrez A, Pérez-Armendáriz B, Cavazos-Arroyo J. Afectaciones y

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13. Abdelkarim G. What is a bioactive compound? Science Publishing Group. 2014.

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http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.826.6781&rep=rep1&type=
pdf

14.​ ​Pabba​ ​Shiva​ ​Krishna.​ ​Studies​ ​on​ ​wound​ ​healing​ ​potential​ ​of​ ​red​ ​pigment​ ​isolated
from​ ​marine​ ​Bacterium​ ​Vibrio​ ​sp.​ ​Saudi​ ​Journal​ ​of​ ​Biological​ ​Sciences​ ​2017.​ ​[cited
27​ ​November​ ​2017]​ ​https://​www.sciencedirect​.com/science/article/pii/S1319562X
17303091
 29

​ ​Conclusión​ ​general​ ​de​ ​la​ ​microbiología​ ​aplicada:

Daniela: El desarrollo y el uso de la microbiología es de suma importancia para el

mundo globalizado al que nos enfrentamos hoy en día. Su constante investigación
brindará nuevos métodos y procesos sustentables para el buen aprovechamiento de
nuestros recursos naturales y de los microorganismos que habitan en nuestro
entorno. Esta ciencia ha abierto las fronteras a un nuevo panorama de innovación
en un ámbito extenso como lo es la medicina, la tecnología, la industria, el sector
agropecuario y la elaboración de productos alimenticios, entre otros. Los artículos
previamente analizados (bioremediación, biología sintética y producción de
fármacos) son sólo un ejemplo de los resultados benéficos que se pueden obtener
mediante el desarrollo y la optimización de este ciencia que estudia a los
microorganismos y sus aplicaciones. A diferencia de la medicina, la cual estudia a
los microorganismos de una manera en la que afectan al ser humano, la
microbiología busca obtener materiales benéficos a partir de ellos; por lo que
impulsar su desarrollo es de suma importancia ya que dichos microorganismos
representan​ ​la​ ​mayor​ ​parte​ ​de​ ​nuestra​ ​biomasa​ ​y​ ​aún​ ​quedan​ ​muchos​ ​por​ ​descubrir.

Sebastián Alejos: La microbiología es un campo que se ha investigado por cientos

de años, más que nada con el propósito de combatir enfermedades. Recientemente,
se está dando un nuevo uso a esta ciencia a través de la biotecnología. Esta nueva
rama de la ciencia nos ha abierto un nuevo mundo de posibilidades. Yo creo que la
microbiología son los cimientos para la biotecnología. Pienso que en los
microorganismos están muchas de las respuestas que hemos estado buscando a
muchos problemas, desde ambientales hasta de salud. El mundo está en un estado
de transición hacia la destrucción del mismo, pero con los nuevos avances en la
microbiología se puede revertir la situación. Personalmente me ha sorprendido todo
lo aprendido en este proyecto y en la clase en general ya que me he dado cuenta de
todo un mundo que existe y que no lo podemos apreciar. Este mundo está lleno de
posibilidades​ ​que​ ​tenemos​ ​que​ ​explorar​ ​para​ ​hacer​ ​de​ ​este​ ​mundo​ ​un​ ​lugar​ ​mejor.

Regina Sánchez: ​La microbiología es una manera de aplicar la ciencia para

resolver diferentes necesidades humanas. Como ciencia aplicada, la microbiología
es de interés en muchos sectores para poder dar soluciones a problemas
relacionados con la medicina, la farmacéutica y la cosmética, la industria
alimentaria, la agricultura, el medio ambiente y la industria. Además, los
microorganismos también están involucrados en muchos procesos biotecnológicos,
como en la producción de medicamentos, antibióticos, vitaminas o proteína humana.
Otra cosa que es importante entender es que, en ausencia de microorganismos, las
complejas formas de vida que existen hoy en día jamás habrían podido
desarrollarse y mantenido. El oxígeno que respiramos proviene de las actividades
de los microorganismos. Los seres humanos, los animales y las plantas estamos
estrechamente relacionados con las actividades microbianas en cuanto al reciclaje
 30

de nutrientes y la degradación de materia orgánica. Ninguna otra forma de vida

puede​ ​sostener​ ​la​ ​vida​ ​en​ ​el​ ​planeta​ ​Tierra​ ​como​ ​los​ ​microorganismos​.

Sharon: Durante los últimos años, hemos encontrado diversas utilidades a los
microorganismos, pero no todas las utilidades son buenas. Algunas como el
bioterrorismo atentan con la paz mundial y el bienestar en general de la población
mundial. Es increible que esos organismos que antes eran no-apreciados por el
hombre, hoy forman una parte fundamental del desarrollo global, para bien o para
mal. A pesar de eso, los microorganismos han salvado muchas vidas, gracias a su
gran beneficio y aporte en la industria farmacéutica. Los microorganismos han
ayudado crear un mundo mejor, no solamente al hombre, pero también a los
animales​ ​y​ ​al​ ​ambiente.

Fernando: ​Los microorganismos han sido nuestros compañeros y enemigos más

antiguos, son los que nos dan placeres como la cerveza, alimentos como el pan y
plagas como la peste, son tan importantes que sin ellos no podríamos sobrevivir
fuera de una burbuja esterilizada podría decirse que son paradoja, nos ayudan y nos
matan a la vez. Como seres pensantes, lentamente estamos aprendiendo a
domarlos, mediante este proceso, descubrimos más y más cosas interesantes que
tienen diferentes intereses económicos, políticos y sociales y vamos estructurando
normas​ ​y​ ​procesos​ ​para​ ​aprovecharlos.

Siento que el estudio de los microorganismos nunca parará, y por ende, la

búsqueda de sus posibles usos tampoco, aunque, también merecen un increíble
respeto​ ​por​ ​brindarnos​ ​tantas​ ​cosas​ ​de​ ​las​ ​cuales​ ​que​ ​no​ ​hay​ ​manera​ ​de​ ​pagarles.

La microbiología aplicada canaliza cada una de las áreas de oportunidad que nos
brindan los microorganismos y nos da, ya sea información útil o un producto útil
aplicable​ ​en​ ​nuestro​ ​entorno.