CICLO DE KREBS

Fosforilación oxidativa.
 UNIVERSIDAD DE
FACULTAD DE BIOLOGÍA
SALAMANCA

Licenciatura en Biología Plan 1997 4º Curso, 1er Cuatrimestre

METABOLISMO GLUCÍDICO Y SU REGULACIÓN

Prof. Enrique Villar. Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular
Prof. Mª Isabel Muñoz Barroso. Profesora Contratada Doctora.
Curso académico 2005/2006

GLUCÓLISIS
La glucosa (6C) y otros monosacáridos son degradados hasta piruvato
(3C). Parte de la energía libre liberada se conserva en forma de ATP.
Tiene lugar en el citoplasma.
No interviene para nada el oxígeno molecular.

Reacción sumaria:
Glucosa + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ ---> 2 Piruvato + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2
H2O

-D-glucopiranosa

ATP Hexoquinasa:
ADP Km muy baja (0.01 mM) para la
Hexoquinasa o glucosa.
Fosforilación Glucoquinasa Inhibida por glc-6-P. No especifica.
del sustrato Go' = - 4.0 Glucoquinasa:
kcal/mol Km alta (5-10 mM) para la glucosa.
No es inhibida por glc-6-P. Especifica
para glucosa
 -D-glucopiranosa-6-P

Fosfoglucoisomeras La reacción requiere la apertura del

Isomerezación
anillo piranósico, la isomerización y, por
(aldosa a a último, el cierre del anillo en forma
cetosa) G = + 0.4 kcal/mol
o'
furanósica

-D-fructofuranosa-
6-P

Fosfofructoquinsa ATP
Fosforilación -1 ADP
del sustrato Go' = - 3.3
kcal/mol

-D-
fructofuranosa-
1,6-bis-P

Aldolasa
Ruptura aldólica G = + 5.74
o'

kcal/mol

D-gliceraldehído-3-P
Dihidroxiacetona-P
Triosafosfato
Isomerezación isomerasa
(cetosa a
aldosa) Go'= + 1.8
kcal/mol
 D-gliceraldehído-3-P

Gliceraldehído-
NAD+ +
3-P El grupo aldehídico del C1 es oxidado a
Oxidación del
deshidrogenasa Pi acil-fosfato (o fosfoanhidro), en vez de
C1
Go'= + 1.5 NADH +
originar un carboxilo.

kcal/mol +
H

1,3-bis-
fosfoglicerato

Fosfoglicerato ADP
Fosforilación a quinasa ATP
nivel de sustrato Go'= - 4.5
kcal/mol

3-fosfoglicerato

Fosfoglicerato
mutasa
Isomarización
G = + 1.06
o'

kcal/mol

2-fosfoglicerato

Se origina un compuesto con un

Deshidratación del Enolasa enlace éster-fosfato, con un doble
2-fosfoglicerato Go'= + 0.4 enlace adyacente, que hace del PEP
(, -eliminación) kcal/mol un compuesto de alto contenido
energétco..
 Fosfoenolpiruvato

Piruvato quinasa ADP

Fosforilación a
Go'= - 7.5 ATP
nivel de sustrato
kcal/mol

Piruvato

FERMENTACIONES

FERMENTACIÓN LÁCTICA

NADH + H+ NAD+

Latato deshidrogenasa

Lactato
Piruvato
G0' = - 6.0 kcal/mol
La reación sumaria de la fermentación láctica sería:
Glucosa + 2ADP + 2Pi ------------------> 2Lactato + 2ATP + 2H2O
 La LDH es un tetrámero: H4, H3M, H2M2, HM3 y M4. La isoenzima H4
es la de menor Km para el piruvato, pero es inhibida por él. La M 4
tiene una Km más alta pero no es inhibida por piruvato (=mejor
adaptada a las células musculares)

FERMENTACIÓN ALCOHOLICA

NADH + H+
H2O CO2 NAD+

Piruvato Alcohol
descarboxilas deshidrogenas
a a

Piruvato Acetaldehído Etanol

La reación sumaria de la fermentación alcohólica sería:

Glucosa + 2ADP + 2Pi ------------------> 2Etanol + 2ATP + 2CO2

MECANISMO DE LA Piruvato descarboxilasa

La enzima es un tetrámero de subunidades idénticas.

La enzima posee TPP como cofactor, uno por subunidad.

La TPP de la enzima hace de sumidero electrónico, gracias a su anillo

tiazólico, en el que el H del C2 es relativamente ácido.

El mecanismo de la reación comienza por el ataque nucleofílico que el

carbanión del anillo tiazólico de la TPP hace sobre el carboxilo del
 piruvato.

RENDIMIENTO ENERGÉTICO DE LAS

FERMENTACIONES
FERMENTACIÓN LÁCTICA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
C6H1206 + 2ADP + 2Pi C6H1206 + 2ADP + 2Pi

2C3H603 + 2ATP + 2H2O 2C2H50H + 2ATP + 2CO2

G0' = - 47 kcal/mol G0' = - 56.3 kcal/mol

Rendimiento energético (cond. Rendimiento energético (cond.

estándar): estándar):
(14.6/47.0)x100 = 31% (14.6/56)x100 = 26%
 PRODUCCIÓN AEROBIA DEL ATP
(METABOLISMO AEROBIO RESPIRATORIO)
La molécula del lactato (2 lactatos) retiene casi toda la energía libre
de la glucosa y posee el mismo estado de oxidación y una complejidad
estructural similar.

El rendimiento energético en ATP es 20 veces superior, ya que se logra

conservar una gran cantidad de energía libre de la glucosa.

DESCARBOXILACIÓN OXIDATIVA DEL

PIRUVATO
El piruvato es convertido a acetil-CoA mediante una reación de
descarboxilación.

NAD+
NADH + H+
CoA- Acetil-
CO2
SH CoA
piruvato
deshidrogenasa
G = - 8.0 kcal/mol (-33.3
o'
Piruvato
kJ/mol)

La reación es esencialmente IRREVERSIBLE en la célula.

El complejo multienzimáticoPiruvato deshidrogenasa está formado

por múltiples copias de tres enzimas:
Piruvato
Dihidrolipoil Dihidrolipoil
deshidrogenasa
transacetilasa (E2) deshidrogenasa (E3)
(E1)

En la catálisis intervienen 5 coenzimas: TPP, ácido lipoico, CoA-SH,

NAD+ y FAD.

El mecanismo de catálisis de la piruvato deshidrogenasa comprende

 cinco pasos.

CICLO DEL ÁCIDO CÍTRICO O DE

KREBS
Se encarga de transformar los carbonos de la acetil-CoA en CO 2 y
H2O

Reación sumaria:
Acetyl-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi ------------> 3 NADH + FADH2 +
CoA-SH + GTP + 3 CO2

Consta de 8 reacciones agrupadas en tres fases:

1. Primera fase: ENTRADA DEL ACETATO (reacción 1)
2. Segunada fase: REACCIONES DE DESCARBOXILACIÓN
(reacciones 2 a 5)
3. Tercera fase: REGENERACIÓN DEL OXALACETATO
(reacciones 6 a 8)

Acetyl-CoA

Oxalacetato Citrato

Malato
Isocitrato
 Fumarato -cetoglutarato

Succinato
Succinil-CoA

**************

Reacción 1: Catalizada por la citrato sintasa

Tipo de reación: aldocondensación
Go' = - 7.7 kcal/mol (= - 32.2 kJ/mol)

La citrato sintasa es un dímero que existe en dos estados

conformacionales diferentes: ABIERTO (sin sustratos) y CERRADO
(con sus dos sistrato unidos), que explica el mecanismo cinético.

**************

Reacción 2: Catalizada por la aconitasa

Tipo de reación: isomerización

El C central (C3) del citrato es un centro proquiral, es decir, los dos

carboximetilos que le rodean NO SON EQUIVALENTES.

La aconitasa es capaz de distinguir el carboxilo superior del inferior

La aconitasa posee en su centro activo un centro de [4Fe-4S]

 encargado de coordinar el OH- del citrato, para facilitar su
eliminación.

**************

Reacción 3: Catalizada por la isocitrato deshidrogenasa

Tipo de reación: descarboxilación oxidativa.
Go' = - 5.0 kcal/mol (= - 20.85 kJ/mol)

Esta es una reacción muy común en el metabolismo:

Oxidar un ácido en , para dar un -cetoácido, el cual será luego
descarboxilado.
(el -carbonilo del -cetoglutarato hace sencilla la ruptura del enlace
C-C adyacente)

**************

Reacción 4: Catalizada por la  -cetoglutarato deshidrogenasa

Tipo de reación: descarboxilación oxidativa.
Go' = - 8.0 kcal/mol (= - 33.36 kJ/mol)

La  -cetoglutarato deshidrogenasa es un complejo multienzimático

casi idéntico al de la piruvato deshidrogenasa, y con un mecanismo de
reacción similar.

**************

Reacción 5: Catalizada por la succinil-CoA sintetasa (= succinato

tioquinasa)
Tipo de reación: transferencia del fosfato

En el mecanismo de acción interviene una His del centro activo, que

es fosforilada al comienzo de la reacción.

**************

Reacción 6: Catalizada por la succinato deshidrogenasa (localizada en

la membrana mitocondrial interna)
Tipo de reación: deshidrogenación (=oxidación).

**************
Reacción 7: Catalizada por la fumarasa (= fumarato hidratasa)
Tipo de reación: hidratación.

La enzima es altamente estereoespecífica: únicamente reconoce el

doble enlace en configuración TRANS y nunca en CIS. Por ello, no
reconoce el maleato.

**************

Reacción 8: Catalizada por la malato deshidrogenasa

Tipo de reación: oxidación.
G = + 7.1 kcal/mol (29.7 kJ/mol)
o'

**************

RESUMEN del CICLO DEL ÁCIDO CÍTRICO:

1.- El acetato (2C, como Ac-CoA) se condensa con una molécula de
4C para dar citrato.
2.- Se dan dos descarboxilaciones por vuelta del ciclo, con lo que la
entrada de los 2C queda compensada.
3.- Los 2C que se pierden en una vuelta del ciclo no son los que
provienen del acetato que entra en esa vuelta.
4.- La oxidación tiene lugar en cuatro pasos (3 con NAD+ y uno con
FAD)
5.- Se genera una molécula de ATP por vuelta del ciclo.
6.- El ciclo termina con la regeneración del acetato.

Si el balance del ciclo la hacemos partiendo de la glucosa:

Glucosa + 6H20 + 10NAD+ + 2FAD + 4ADP + 4Pi

6CO2 + 10NADH + 10H+ + 2FADH2 + 4ATP

**************

SALIDA DE LOS CARBONOS EN EL CICLO

Usando Acetato14C (en el C metilenico o en el carbonilo) se ha
demostrado que los 2C que se pierden en una vuelta del ciclo no son
los que provienen del acetato que entra en esa vuelta .

Primera vuelta:
 Acetil-CoA + CO2
OAA CO2

Citrato Succinato Oxalacetato

Segunda vuelta:

Acetil-CoA + CO2
OAA CO2

Citrato Succinato Oxalacetato

Tercera vuelta:

Acetil-CoA + CO2
OAA CO2

Citrato Succinato Oxalacetato

Cuarta vuelta:

Acetil-CoA + CO2
OAA CO2

Citrato Succinato Oxalacetato

En definitiva, si consideramos que en un determinado momento entra

en el ciclo del ácido cítrico un acetato:

1.- El carbono del carboxilo saldrá en forma de CO2 a la vuelta

siguiente.
2.- El carbono metilénico saldrá tres vueltas después de su entrada.

La aconitasa es capaz de distinguir el carboximetilo superior del

inferior porque interacciona de forma asimétrica con la superficie de la
aconitasa, ya que existe en ésta tres puntos distintos de reconocimiento
del sustrato.

REGULACIÓN DE LA GLUCÓLISIS
 Las velocidades de las enzimas que catalizan reacciones en el equilibrio o
próximas a él (G0'~0), se regulan por las concentraciones relativas de los
sustratos y los productos.

En las reacciones que transcurren fuera del equilibrio (G0' -) los cambios en
la concentración de los sustratos no ejercen efecto alguno sobre la velocidad
de la reación

Flujo de metabolitos de una reación: J = vf - vr

- En el equilibrio: J= 0 (vf = vr )
- Fuera del equilibrio: vf >> vr por lo que J = vf

Podemos entonces sacar ciertas conclusiones importantes:

1) El flujo de una vía metabólica en estado estacionario es constante y

está determinado por la velocidad de la(s) reacción(es) que transcurren
fuera del equilibrio, también llamadas reacciones limitantes de la
velocidad de la ruta metabólica.

2) Será necesario incrementar (o disminuir) enormemente la velocidad

de cualquier enzima de una reacción fuera del equilibrio para poder
modificar el flujo de la reacción. Esto se logra mediante interaciones
alostéricas.

3) El flujo de una vía metabólica está determinado por la velocidad de

la(s) reacción(es) que transcurre(n) fuera del equilibrio (=reaciones
limitantes)

4) Para comprender cuáles son los puntos de regulación, debemos

repasar la energética de toda la vía glucolítica.

G0' G
Reación Enzima
(kcal/mol) (kcal/mol)
1 Hexoquinasa o - 4.0 - 8.0
 Glucoquinasa
2 Fosfoglucoisomerasa + 0.4 - 0.6
3 Fosfofructoquinasa-1 - 3.3 - 5.3
Fructosa-1,6-bis-fosfato
4 + 5.7 - 0.3
aldolasa
5 Triosa-fosfato isomerasa + 1.8 + 0.6
Gliceraldehído-3-fosfato
6 + 1.5 - 0.4
deshidrogenasa
7 Fosfoglicerato quinasa - 4.5 + 0.3
8 Fosfoglicerato mutasa + 1.06 + 0.2
9 Enolasa + 0.4 - 0.8
10 Piruvato quinasa - 7.5 - 4.03

Existen pues tres puntos de regulación: hexoquinasa,

fosfofructoquinasa-1 (el punto más importante) y piruvato quinasa.

El mecanismo consiste en las interacciones alostéricas de ciertos

compuestos, que actúan como moduladores (externos o internos) sobre
las quinasas.

Regulación de la fosfofructoquinasa-1
Esquema

Es el punto más importante de la regulación del flujo glicolítico:

1.- No hay monosacárido (salvo la fructosa hepática) que entre en la
glucólisis y que no pase por la fosfofructoquinasa.
2.- Por la hexoquinasa no pasan las glucosas provenientes de la
glucogenolisis.
3.- La piruvato quinasa es la última reacción de la glucólisis y no
puede ser, por tanto, el pricipal punto regulador de la vía.

Fosfofructoquinasa-1:
- Tetrámero de 360 kDa Estados Efectores alostéricos:
- Cada subunidad conformacionales: Inh.: ATP,
tiene dos sitios de unión Fosfocreatina
para el ATP T R Act.: AMP, Pi, F6P,
 F2,6bP, F1,6bP.

1)Inhibición por ATP

El ATP se une a:
1) Centro activo (sustrato, que se une igual a las formas T y R) y
2) Sitio alostérico (ATP como inhibidor, que se une preferentemente a
la forma T), ejerciendo como efector negativo.

La base estructural del comportamiento alostérico con ATP es

conocida: interviene la Arg162 de cada subunidad y el segmento en el
que está (-hélice en la forma R) .

El ADP se une a su sitio alostérico de la enzima y con ello previene la

unión del ATP al suyo, evitando que se pase al estado T. con ello, la
presencia de ADP previene la inhibición ejercida por el ATP.

2) El AMP reduce la inhibición inducida por el ATP

El ATP y el AMP se pueden originar por la ación de dos enzimas:
Adenilato quinasa:
Creatina quinasa:
2ADP ------------------>
Fosfocreatina + ADP ------> ATP + Creatina
ATP + AMP

La adenilato quinasa amplifica la señal metabólica de pequeños

descensos en [ATP] en las células musculares:
Un descenso del 10%[ATP] (1 a 0.9
mM) prococará:
En el músculo:
- 100% incremento [ADP] (0.1 a
[ATP] = 50 [AMP]
0.2 mM)
[ATP] = 10 [ADP]
- 400% incremento [AMP] (0.02 a
0.1 mM)

3) Papel de la fructosa-2,6-bis-fosfato
fosfofructoquinasa-
2
fructosa-6-P + ATP ---------------------------------> ADP + fructosa-
2,6-bis-P

Es el activador alostérico más potente (0.1 M) de la PFK-1, siempre

que exista AMP. Es decir, para anular la inhibición del ATP, AMP y
 f2,6bP deben estar presentes.

La fructosa-2,6-bis-P impide queel flujo glicolítico se detenga cuando

haya ciertos niveles de ATP en la célula.

4) Papel regulador del "ciclo de fructosa-6-P"

Los mecanismos alostéricos sobre la PFK, por sí solos, no pueden
explicar cómo se logran los incrementos del 100% en el flujo
glucolítico que a veces se producen en la célula.

La reacción catalizada por la PFK transcurre fuera del equilibrio, por

lo que cambios en vf no afectarán el flujo a través de esa reación.

El recurso para incrememtar el flujo J es originar un "ciclo de

sustrato" con la F6P, utilizando la enzima fructosa-1-6-bis-fosfatasa.

fructosa-
1-6-bis-
fosfatasa
fructosa-1,6-bis-fosfato + H2O ---------------------------------------->
fructosa-6-P + Pi
 G = - 2.0 kcal/mol

Con esa enzima el sustrato está contínuamente regenerándose

(entrando en un cíclo fútil, también denominado "ciclo de sustrato"),
y ralentizando el flujo de la reacción.

La acción conjunta de los activadores alostéricos y del ciclo de la F6P

explican el elevado aumento del flujo glucolítico ante pequeñas
variaciones de aquéllos.

Regulación de la hexoquinasa
Esquema

Inhibida por Glc-6-P

Activada por Pi
 Regulación de la piruvatoquinasa
Esquema

Inhibida por Fosfocreatina y ATP

Activada por ADP y fructosa-2,6-bis-P

[Inicial] [Glucólisis] [Krebs] [Fermentaciones]

PREGUNTAS DE REPASO
- ¿Cuál es la razón por la que sólo tres reaciones de la glucólisis están
sujetas a regulación?

- ¿Qué ventajas tiene el que la PFK-I sea el punto más importante de la

regulación?

- ¿Para qué existen los ciclos de sustrato? ¿Son importantes para la

regulación de la glucólisis? ¿Por qué?