Contenido

INTRODUCCIÓN.....................................................................................................................................2
PRINCIPIO DEL METODO. ......................................................................................................................3
DEFINICIONES .......................................................................................................................................3
SEGURIDAD ...........................................................................................................................................4
EQUIPOS, REACTIVOS Y MATERIAL. ......................................................................................................4
RECOLECCIÓN, PRESERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS.................................................5
PROCEDIMIENTO ..................................................................................................................................5
RESULTADOS Y DISCUSIONES................................................................................................................7
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES: ..............................................................................................8
MANEJO DE RESIDUOS..........................................................................................................................9
BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................................10
ANEXOS ...............................................................................................................................................11

1
 INTRODUCCIÓN.

El objetivo de esta práctica es la determinación del contenido de fosfatos solubles

en una muestra de agua mediante espectrofotometría ultravioleta-visible. Se
aplicará el método de adiciones estándar para eliminar interferencias con otros
compuestos. Este procedimiento permite la identificación de fosfatos en el agua.

El fosforo se encuentra en las aguas naturales y residuales casi exclusivamente

en forma de fosfatos, clasificados en ortofosfatos, fosfatos condensados piro,
meta y otros polifosfatos, y los ligados orgánicamente. Se presentan en solución,
partículas o detritus, o en los cuerpos de organismos acuáticos (NMX-AA-029-
SCFI-2001).

Un análisis de fosfato fiable es indispensable, no sólo para cumplir con el control

de los valores límite sino también para el control óptimo, y por tanto más rentable,
de la eliminación de fósforo (Petra Pütz).

El fosforo es esencial para el crecimiento de los organismos y puede ser el

nutriente limitador de la productividad primaria de un cuerpo en el agua. En los
casos en que constituye el nutriente limitador del crecimiento, la descarga de
aguas residuales brutas o tratadas, drenados agrícolas o ciertos residuos
industriales a esa agua puede estimular el crecimiento de micro y
macroorganismos acuáticos fotosintéticos en cantidades molestas (APHA,
AWWA, WPCF).

Los fosfatos pueden aparecer también en los sedimentos de fondos y en cienos

biológicos, tanto en formas orgánicas precipitadas como incorporadas a
compuestos orgánicos.

Es por ello que es un parámetro importante ya que un alto contenido de fosfatos

puede causar un desequilibrio ecológico y por estas razones es importante
controlar las concentraciones de fosfatos.

En análisis químico cuantitativo, muchas decisiones importantes se basan en los

resultados obtenidos por un laboratorio; por lo que es necesario, disponer de un

2
indicador sobre la calidad de tales resultados (María Guadalupe Cáñez
Carrasco).

PRINCIPIO DEL METODO.

En solución diluida de ortofosfato, el molibdato amónico reacciona en

condiciones ácidas para formar un heteropoliacido, ácido molibdofosfórico. En
presencia de vanadio, se forma ácido vanadomolibdofosfórico amarillo. La
intensidad del color amarillo es proporcional a la concentración de fosfato.

El método propuesto para determinar fosfatos se basa en la formación de un

heteropoliácido con el reactivo vanado-molíbdico (de color amarillo y soluble en
agua) cuya absorción de luz se mide a 420 nm. Para el ortofosfato, la formación
de este complejo tiene lugar según la reacción:

En esta identificación interfieren concentraciones apreciables de Fe(III), silicato

y arseniato, entre otras especies. Es decir, estas especies absorben luz a la
longitud de onda utilizada (420 nm, absorción del P(VMo11O40)3−). Para
eliminar dicha interferencia se preparará un blanco (sin fosfato) cuya
absorbancia se restará de la del resto de las muestras.

DEFINICIONES

Aguas naturales: Se define como agua natural el agua cruda, subterránea, de

lluvia, de tormenta, residual y superficial.

Análisis de blanco analítico: Es el someter una alícuota de agua reactivo a todo

el proceso de análisis por el cual pasa una muestra real. Los laboratorios deben
realizar los análisis de blancos para corregir la señal de fondo del sistema de
medición. El análisis de blancos se realiza en forma periódica o con cada lote de
muestras según lo requiera el método.

Blanco: Agua reactivo o matriz equivalente a la que no se le aplica ninguna parte

del procedimiento analítico y sirve para evaluar la señal de fondo.

Calibración: Conjunto de operaciones que establecen, bajo condiciones

específicas, la relación entre los valores de una magnitud indicados por un

3
instrumento o sistema de medición, o los valores representados por una medida
materializada y los valores correspondientes de la magnitud, realizados por los
patrones, efectuando una corrección del instrumento de medición para llevarlo a
las condiciones iniciales de funcionamiento.

Disolución estándar: Disolución de concentración conocida preparada a partir de

un patrón primario.

SEGURIDAD

No ha sido determinada la carcinogenicidad de todos los reactivos con precisión.

Por lo que cada sustancia química debe tratarse como peligro potencial a la
salud. La exposición a estas sustancias debe reducirse al menor nivel posible.

Este método puede no mencionar todas las precauciones de seguridad

asociadas con su uso. El laboratorio es responsable de mantener un ambiente
de trabajo seguro y un archivo de las normas de seguridad respecto a la
exposición y manejo seguro de las sustancias químicas especificadas en este
método. Debe tenerse un archivo de referencia de las hojas de información de
seguridad el cual debe estar disponible a todo el personal involucrado en estos
análisis.

EQUIPOS, REACTIVOS Y MATERIAL.

Materiales y reactivos:

Equipo y Material

8 matraces aforados de 25 ml. Probeta de 250 ml.

1 matraz aforado de 100 ml. Pipetas de 5 y 10 ml.

Matraces aforados de 100ml y 1000 ml por banco. Espectrofotómetro.

Reactivos

Heptamolibadto amónico. Ortofosfato ácido potásico

Metavanadato amónico.

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 RECOLECCIÓN, PRESERVACIÓN Y
ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS.

Tomar un mínimo de 500 mL de muestra en envases de plástico. Pueden

utilizarse muestras compuestas o simples.

Si la muestra solamente es analizada para determinar la forma de fósforo

disuelto, filtrar la muestra inmediatamente después de la colecta a través de un
papel filtro de poro fino.

Conservar en refrigeración a 4°C.

El tiempo máximo de almacenamiento previo al análisis es de 28 días.

PROCEDIMIENTO
Preparación de reactivos:

1. Reactivo vanado-molíbdico (única para todos): En unos 400 ml de agua

destilada,disolver 20g de heptamolibdato amónico,
Mo7O24(NH4)6⋅4H2O. Preparar una segunda disolución de 0.5 g de
metavanadato amónico, NH4VO3, en 300 ml de agua y añadir 100 ml de
ácido nítrico concentrado (con guantes y gafas de protección, en la
campana extractora). Mezclar ambas disoluciones en un matraz aforado
de un litro y enrasar con agua destilada.
2. Disolución patrón de ortofosfato (PO4)3− (1 g/l) (única para todos).
Preparar 100 ml de disolución patrón en matraz aforado disolviendo la
cantidad adecuada (calcúlela) de KH2PO4 en agua destilada.
3. Disolución de trabajo de ortofosfato (0.1 g/l): Cada pareja prepara una
disolución de trabajo pipeteando 10 ml de disolución patrón y enrasando
a 100 ml con agua destilada en matraz aforado.

Calibrado:

En matraces aforados de 25 ml se pipetean alícuotas de la disolución de trabajo

de forma que la concentración final de fosfato sea de 250, 500 y 1000 mg/l. Se
agregan 10 ml de la disolución vanado-molibdato amónico a cada una de ellas y

5
se enrasa con agua destilada. Agitar cada matraz para homogeneizar la
disolución y dejar en reposo 10 minutos para que tenga lugar el desarrollo del
color. Preparar además un blanco (disolución con 10 ml de vanado-molibdato,
sin fosfato).

Preparación de las muestras problema:

Pipetear 5 ml de la disolución problema y pasarlos a un matraz aforado de 25 ml.

Añadir 10 ml de la disolución vanado-molibdato y enrasar con agua destilada.
Repetir este procedimiento otras 2 veces más para tener 3 muestras problema.
Dejar reposar 10 minutos.

Medidas de absorbancia:

1. Ajustar el espectrofotómetro para medidas de absorbancia a 400 nm.

2. Introducir el blanco en el aparato y ponerlo a cero.
3. Medir finalmente la absorbancia a 400 nm de los patrones y de las 3
muestras.
4. Construir la recta de calibrado y determinar la concentración de cada
muestra problema.
5. La concentración de fosfatos en la muestra problema original será el
resultado de promediar los resultados de las tres medidas y aplicar el
factor de dilución. El error se obtiene a partir de la dispersión de los datos:
ε= ± t⋅(s/√N), donde s es la desviación cuadrática y N el número de
medidas realizadas.

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 RESULTADOS Y DISCUSIONES.
Los siguientes valores mostrados en la tabla se utilizaron para realizar la curva
de calibración, la longitud de onda ocupada fue de 400 nm.

Concentración fosfato (𝜇𝑔 𝑃/𝑚𝐿) Absorbancia

250 0.526

500 0.903

1000 1.882

A continuación, se muestra la curva obtenida de la regresión lineal.

Conc. P vs Absorbancia
2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8 y = 0.0018x + 0.0365
0.6 R² = 0.9963

0.4
0.2
0
0 200 400 600 800 1000 1200

Se realizaron ensayos para muestras de agua de diferentes tomas tales como

agua de la llave, mar, garrafón y San Mateo, de los cuales solo se tomaron 35
mL a continuación, se presentan los resultados obtenidos.

Muestra Absorbancia Conc. P (𝜇𝑔 𝑃/𝑚𝐿) 𝜇𝑔 𝑃

Llave 0.045 0.036581 1.28033

Mar 0.048 0.036586 1.28051

Garrafón 0.037 0.036566 1.27981

San Mateo 0.0294 0.036553 1.27935

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 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:

La determinación de fosfatos en el agua es de suma importancia debido a que el

fosforo se encuentra en las aguas naturales y residuales casi exclusivamente en
forma de fosfatos, clasificados en ortofosfatos, fosfatos condensados piro, meta
y otros polifosfatos, y los ligados orgánicamente. Se presentan en solución,
partículas o detritus, o en los cuerpos de organismos acuáticos. Tal sustancia a
grandes cantidades puede ocasionar un desequilibrio ecológico en el medio
acuático presente.

El fosforo es esencial para el crecimiento de los organismos y puede ser el

nutriente limitador de la productividad primaria de un cuerpo en el agua. En los
casos en que constituye el nutriente limitador del crecimiento, la descarga de
aguas residuales brutas o tratadas, drenados agrícolas o ciertos residuos
industriales a esa agua puede estimular el crecimiento de micro y
macroorganismos acuáticos fotosintéticos en cantidades molestas. Es por este
motivo que dicho parámetro es relevante.

Es recomendable repetir cada una de las muestras por lo menos tres veces para
analizarlas en el espectrofotómetro.

Los resultados obtenidos del análisis de las muestras fueron pequeños de orden
de magnitud 0.036 𝜇𝑔 𝑃/𝑚𝐿 por lo cual no puede presentar algun efecto sobre el
equilibrio ecológico.

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 MANEJO DE RESIDUOS

Es la responsabilidad del laboratorio cumplir con todos los reglamentos

federales, estatales y locales referente al manejo de residuos, particularmente
las reglas de identificación, almacenamiento y disposición de residuos
peligrosos.

Cada laboratorio debe contemplar dentro de su Programa de Control de Calidad

(CC) el destino final de los residuos generados durante la determinación.

Los desechos ácidos se deben neutralizar para su posterior desecho.

Las muestras líquidas con altos contenidos de fósforo, se deben envasar en

recipientes herméticos y almacenar temporalmente tomando todas las
precauciones necesarias y después enviarlas al confinamiento de residuos
peligrosos.

Todas las muestras que cumplan con la norma de descarga a alcantarillado

pueden ser descargadas en el mismo sistema.

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 BIBLIOGRAFÍA.

Daniel C. Harris, Análisis Químico Cuantitativo 2ª ed., Ed. Reverte.

APHA, AWWA, WPCF, Métodos normalizados, Ed. Díaz de Santos.

Boltz, D. F., ed. 1958. Colimetric Determination of Nonmetals. Interscience

Publishers, Nueva York.

American Water Works Association. 1958. Committee report. Determination of

orthophosphate, hidrolyzable phosphate, and total phosphate in surface waters.
J. Amer. Water Works Assoc.

Jackson, M. L 1958. Soil Chemical Analysis Prentice-Hall, Englewood Cliffs,

Nueva Jersey.

NMX-AA-029-SCFI-2001.

NOM-001-ECOL-1996.

NMX-AA-014-1980.

Criterios Ecológicos de Calidad del Agua, publicados en el Diario Oficial de la

Federación el 13 de diciembre de 1989.

Pütz, P., Eliminación y determinación de fosfatos.

Cañez, M. y Garcia A. (2015). Validación de un método analítico para la

determinación de fósforo por espectrofotometría ultravioleta-visible.

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 ANEXOS

Espectrofotometría:

La espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para

la detección específica de moléculas de distinta naturaleza (contaminantes,
biomoléculas, etc) y estado de agregación (sólido, líquido, gas). El fundamento
físico-químico de la espectrofotometría está relacionado con la capacidad de las
moléculas de absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía
interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre
ellos el de la fotosíntesis en plantas y bacterias.

La Mecánica Cuántica nos dice que la luz está compuesta de fotones cada uno
de los cuáles tiene una energía:

donde h = 6.6 10-34 J⋅s es la constante de Planck, c es la velocidad de la luz, ν

es su frecuencia y λ su longitud de onda. Cuando decimos que una molécula
absorbe luz de longitud de onda λ, esto significa que la molécula absorbe un
fotón de esa longitud de onda. En esta práctica estudiaremos la absorción de luz
en el visible-ultravioleta cercano (λ ≈ 325-700 nm). Cuando una molécula
absorbe un fotón en este intervalo espectral, se excita pasando un electrón de

un orbital del estado fundamental a un orbital excitado de energía superior. De

esta manera la molécula almacena la energía del fotón:

Como la energía se conserva, la diferencia de energía entre el estado excitado

(A*) y el fundamental de la molécula (A) debe ser exactamente igual a la energía

11
del fotón. Cada molécula tiene una serie de estados excitados discretos (o
bandas) que dependen de su estructura electrónica y que la distinguen del resto
de moléculas. Como consecuencia, el espectro de absorción, es decir, la luz
absorbida en función de la longitud de onda, constituye una verdadera seña de
identidad de cada molécula. Dos moléculas distintas presentarán espectros de
absorción distintos, como se representa esquemáticamente en la figura 1.

Un espectrofotómetro (figura 2) consta de una fuente de luz “blanca”

caracterizada por un espectro de emisión continuo en un intervalo amplio de
longitudes de onda. Un monocromador actúa como filtro óptico transmitiendo un
haz de luz de longitud de onda fija λ e intensidad I0 que penetra en la cubeta de
análisis donde se encuentra la muestra. Un detector sensible a la luz mide la
intensidad del haz a la salida If.

La intensidad del haz de luz se va atenuando a medida que atraviesa la cubeta

con la muestra debido a la absorción de las moléculas. El ritmo de absorción
depende de la intensidad inicial de luz y de la concentración de moléculas. De
esta manera, cuando un haz de luz de intensidad I recorre una distancia dL en
una muestra con una concentración de moléculas [B], se produce una atenuación
de intensidad dI dada por:

El significado de la constante de proporcionalidad k se discute más abajo. La

expresión anterior se puede integrar de la siguiente forma:

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lo cual da lugar a la ley de Lambert-Beer para la absorción de luz en un medio,
que relaciona la intensidad a la salida de la muestra If, con la intensidad inicial
I0, la concentración de moléculas y la distancia recorrida por la luz en la muestra,
L:

El espectrofotómetro, en lugar de la intensidad, mide la absorbancia A que se

define por:

donde la constante ε es la denominada absortividad molar (o también coeficiente

de extinción), que en general depende de la longitud de onda de la luz incidente.

Como se puede observar, la absorbancia es directamente proporcional a la

concentración de moléculas en la muestra. Es decir la representación de
absorbancia frente a concentración sigue una recta de pendiente m = ε⋅L. Esta
ley de proporcionalidad se cumple para luz monocromática (de una longitud de
onda dada) y disoluciones diluidas de las moléculas absorbentes (< 0.01M). Se
encontrarán en general desviaciones cuando se realicen experimentos sobre
muestras concentradas de analitos.

Curva de calibrado:

Una curva de calibrado representa la respuesta de un método analítico (señal

detectada) sobre muestras patrón o estándar con concentraciones conocidas de
analito. Se prepara además una disolución blanco, que contienen únicamente la
matriz, es decir todos los reactivos y disolventes de la muestra salvo el analito
de interés. En el intervalo de respuesta lineal del método analítico (dentro del
cual la señal es proporcional a la concentración de analito), se obtiene una recta
de calibrado a partir del procedimiento siguiente (ver figura 3):

1. Se representa la señal detectada corregida de la señal del blanco frente

a la concentración de cada disolución patrón;
2. se realiza una regresión lineal de los puntos resultantes por el método de
mínimos cuadrados (ver el apéndice de este guión). . Se recomienda el
uso de Excel para obtener la recta de ajuste. La recta de calibrado y = ax

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+ b (x: concentración , y: señal) permite obtener la concentración de
cualquier muestra problema a partir de la señal obtenida
experimentalmente.

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