Estudio de los mecanismos neuronales

implicados en las respuestas

motivacionales de las drogas de abuso.

Memoria presentada para optar al grado de Doctor de la

Universitat Pompeu Fabra por:

MIQUEL MARTÍN SÁNCHEZ

Director:
Pr. Rafael Maldonado López

Laboratori de Neurofarmacologia
Departament de Ciències Experimentals i de la Salut
Universistat Pompeu Fabra
Barcelona, España.

Programa de Doctorat en Ciències de la Salut i de la Vida

Esta Tesis esta dedicada a todas las personas que me han acompañado y me
han apoyado durante estos años. Me gustaría expresar mi más sincero
agradecimiento a todas ellas:

A mi director de Tesis Rafael Maldonado por haberme dado la

oportunidad de trabajar en su laboratorio y de realizar esta Tesis.

A todos mis compañeros de laboratorio, a los que nunca olvidare.

A los compañeros de los laboratorios de Fisiología Animal y Psicología

Medica de la Universitat Autónoma de Barcelona.

Al Carlos, Jordi, Sergi, David, Vicenç, Albert y a las Annas, por estar
siempre a mi lado.

A mi abuela, mis hermanos, mis tíos y mis primos por ser una parte
importante de mi vida.

A mis padres por todo su amor.

Y a Hagar, por su compañía, amistad y ayuda en todo momento.

A la memoria de mi abuela.
ABREVIACIONES

AA Aminoácidos
2-AG 2-Araquidonilglicerol
AC Adenilato Ciclasa
ACTH Hormona adrenocorticotrópica
AMPc Adenosina Monofosfato Cíclico
CB1 Receptor cannabinoide tipo I
CB2 Receptor cannabinoide tipo II
CHO Células de ovario de hamster chino
CMS Chronic Mild Stress
CRF Factor liberador de la hormona adrenocorticotrópica
ERK Extracellular receptor-activated Kinase
FAAH Fatty acid amido hydrolase
FSH Hormona folículo-estimulante
HPA Eje hipotalámico-hipofisario-adrenal
IP3 Inositol trifosfato
JNK C-jun N-terminal quinasa
LH Hormona luteinizante
LTP Potenciación a largo plazo
MAP Mitogen-activated quinasa
ORL1 Opioid-receptor like
PACAP Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide
PC Prohormona convertasa
PCR Polymerase chain reaction
PKA Proteína quinasa A
POMC Pro-opiomelanocortina
SNC Sistema nervioso central
THC Δ9-tetrahidrocannabinol
TRH Hormona liberadora de tirotropina
TSH Hormona estimulante de la tiroides
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN
1. El sistema cannabinoide 1
1.1. El sistema cannabinoide endógeno 2
1.1.1. Receptores cannabinoides 2
1.1.1.1. Otros receptores cannabinoides 6
1.1.1.2. Mecanismos de transducción inducidos por la
activación del receptor cannabinoide 7
1.1.1.3. Distribución anatómica de los receptores
cannabinoides 9
1.1.2. Endocannabinoides 11
1.1.2.1. Anandamida 12
1.1.2.1.1. Síntesis de la anandamida 12
1.1.2.1.2. Inactivación de la anandamida 13
1.1.2.1.3. Localización de la anandamida 14
1.1.2.2. El 2-araquidonilglicerol (2-AG) 15
1.1.2.2.1. Síntesis del 2-AG 15
1.1.2.2.2. Inactivación del 2-AG 15
1.1.2.2.3. Localización del 2-AG 16
1.1.2.3. El 2-araquidonilgliceril éter (noladín éter) 16
1.1.2.4. O-araquidonil etanolamina (virodamina) 16
1.1.2.5. Características específicas de la neurotransmisión
cannabinoide 17
1.1.2.5.1. Síntesis y liberación de los
endocannabinoides bajo demanda 17
1.1.2.5.2. Función de los endocannabinoides como
mensajeros retrógrados 17
1.1.3. Efectos farmacológicos de la activación de los receptores
cannabinoides 18
1.1.3.1. Efectos antinociceptivos 18
1.1.3.2. Efectos motores 21
1.1.3.3. Efectos sobre la memoria 25
1.1.3.4. Control sobre la temperatura corporal 27
1.1.3.5. Efectos endocrinos 27
1.1.3.6. Efectos emocionales 27
1.1.3.7. Efectos motivacionales de los cannabinoides 28
 1.1.3.8. Tolerancia y dependencia física de cannabinoides 30
1.1.3.8.1. Tolerancia a los efectos farmacológicos
de los cannabinoides 30
1.1.3.8.2. Dependencia física de cannabinoides 31
1.1.4. Interacción de los cannabinoides con otras drogas de abuso 33
1.1.4.1. Interacción cannabinoide-opioide 33
1.1.4.1.1. Estudios farmacológicos 34
1.1.4.1.1.1. Antinocicepción 34
1.1.4.1.1.2. Actividad locomotora 36
1.1.4.1.1.3. Propiedades reforzantes y
dependencia 37
1.1.4.1.1.4. Ansiedad 40
1.1.4.1.2. Mecanismos bioquímicos involucrados en
las interacciones cannabinoide-opioide 40
1.1.4.1.2.1. Modificaciones en los
receptores y ligandos
endógenos 40
1.1.4.1.2.2. Interacción a nivel de los
mecanismos de transducción
de señal 41
1.1.4.1.2.3. Interacción física entre los
receptores opioides y
cannabinoides 42
1.1.4.2. Interacción cannabinoide-cocaína 42
1.1.4.3. Interacción cannabinoide-anfetamina 43
1.1.4.4. Interacción cannabinoide-MDMA 44
1.1.4.5. Interacción cannabinoide-etanol 44
1.1.4.6. Interacción cannabinoide-nicotina 45
2. El sistema del péptido PACAP 47
2.1. Características del péptido PACAP 49
2.1.1. Características del gen que codifica el péptido PACAP 50
2.1.2. Distribución del péptido PACAP 51
2.1.2.1. Sistema Nervioso Central 51
2.1.2.2. Tejidos periféricos 52
2.1.2.2.1. Glándulas endocrinas 53
 2.1.2.2.2. Sistema digestivo 53
2.1.2.2.3. Sistema respiratorio 54
2.1.2.2.4. Sistema inmunitario 54
2.2. Receptores del péptido PACAP 54
2.2.1. Distribución de los receptores PACAP 57
2.2.1.1. Sistema Nervioso Central 57
2.2.1.1.1. Receptor PAC1 57
2.2.1.1.2. Receptores VPAC1 y VPAC2 58
2.2.1.2. Tejidos periféricos 59
2.3. Efectos de la activación de los receptores PACAP 60
2.3.1. Sistema Nervioso Central 60
2.3.1.1. Función neuroendocrina 60
2.3.1.2. Ritmo circadiano 61
2.3.1.3. Control de las funciones hipofisarias 62
2.3.1.4. Acciones antinociceptivas 64
2.3.1.5. Procesos de memoria 64
2.3.1.6. Efectos neurotróficos 65
2.3.1.7. Control de la ingesta 67
2.3.1.8. Regulación de las respuestas farmacológicas del
etanol y la morfina 67
2.3.1.9. Otras acciones centrales 68
2.3.2. Efectos a nivel de los órganos periféricos 69
2.3.2.1. Adrenal 69
2.3.2.2. Páncreas 69
2.3.2.3. Gónadas 70
2.3.2.4. Sistema gastrointestinal 70
3. El sistema opioide 72
3.1. Receptores opioides 72
3.2. Distribución de los receptores opioides 74
3.2.1. Receptor opioide μ 74
3.2.2. Receptor opioide δ 74
3.2.3. Receptor opioide κ 76
3.3. Vías de transducción implicadas en la activación de los receptores
 opioides 77
3.3.1. Proteínas G 77
3.3.2. Vía del adenilato ciclasa 77
3.3.3. Vía del fosfatidilinositol 77
3.3.4. Vía de las MAP quinasas 78
3.3.5. Canales iónicos 78
3.4. Péptidos opioides endógenos 79
3.4.1. Distribución 81
3.4.1.1. POMC y péptidos derivados 81
3.4.1.2. Pre-proencefalina y péptidos derivados 81
3.4.1.3. Prodinorfina y péptidos derivados 82
3.4.1.4. Endomorfinas 82
3.5. Respuestas farmacológicas 83
3.5.1. Analgesia 83
3.5.1.1. Efectos antinociceptivos a nivel supraespinal 83
3.5.1.2. Efectos antinociceptivos a nivel espinal 84
3.5.1.3. Efectos antinociceptivos a nivel periférico 85
3.5.2. Actividad locomotora 85
3.5.3. Memoria 86
3.5.4. Efectos endocrinos 87
3.6. Tolerancia y dependencia 87
3.6.1. Tolerancia 87
3.6.2. Dependencia física 90
3.7. Opioides y sistemas de recompensa 94
3.7.1. Efectos gratificantes de los opioides y sistema mesolímbico
dopaminérgico 94
3.7.2. Implicación de cada subtipo de receptor opioide 95
3.7.2.1. Receptor μ 95
3.7.2.2. Receptores δ 95
3.7.2.3. Receptores κ 96
3.7.3. Sensibilización a los efectos inducidos por los opioides 96
3.7.3.1. Adaptaciones a nivel del área ventral tegmental 97
3.7.3.2. Adaptaciones a nivel del núcleo accumbens 98
 3.7.3.3. Papel de la expresión de genes a largo plazo 98
3.7.4. Efectos disfóricos/aversivos de la abstinencia opioide 99

OBJETIVOS 101

RESULTADOS 103
ARTÍCULO 1. “Cocaine, but not morphine, induces conditioned place
preference and sensitization to locomotor responses in CB1 knockout
mice” 104
ARTÍCULO 2. “Involvement of CB1 cannabinoid receptors in emotional
behaviour” 114
ARTÍCULO 3. “Altered emotional behavior in PACAP-type-I-receptor-
deficient mice 124
ARTÍCULO 4. “Morphine withdrawal is modified in pituitary adenylate
cyclase-activating polypeptide type I-receptor-deficient mice” 132
ARTÍCULO 5. “Impairment of mossy fiber long-term potentiation and
associative learning in pituitary adenylate cyclase activating
polypeptide type I receptor-deficient mice” 142
ARTÍCULO 6. “Acute antinociceptive responses in single and
combinatorial opioid receptor knockout mice: distinct mu, delta and
kappa tones” 151

DISCUSIÓN 160

CONCLUSIONES 182

ANEXO - Otras publicaciones 185

BIBLIOGRAFÍA 192
INTRODUCCIÓN
1. El sistema cannabinoide.

La palabra cannabinoide engloba un conjunto de sustancias de origen natural o

sintético clasificadas en tres grupos: los cannabinoides naturales, los
cannabinoides sintéticos y los endocannabinoides. Dentro del grupo de los
cannabinoides naturales se incluyen los compuestos activos que contiene la
planta Cannabis sativa, como el Δ9-tetrahidrocannabinol (THC). Los
cannabinoides sintéticos incluyen dos grandes grupos de compuestos; los
derivados sintéticos del THC y los aminoalquilindoles. El HU-210 y el CP55940
son dos de los principales cannabinoides sintéticos derivados del THC. Entre
los aminoalquilindoles cabe destacar el WIN55212.

Los endocannabinoides engloban un conjunto de sustancias sintetizadas de

forma natural en diferentes especies animales, incluidos humanos y roedores, y
que provienen de la degradación de lípidos de membrana. Hasta el momento
se han descrito diferentes endocannabinoides, entre los que se incluyen la
anandamida, el 2-araquidonilglicerol (2-AG), el 2-araquidonilglicerileter (noladín
éter) y la virodamina.

Las sustancias cannabinoides han sido utilizadas por el hombre desde la

antigüedad, principalmente por sus efectos psicoactivos. El principal
componente activo de la planta Cannabis sativa es el THC, aislado en 1964 por
Gaoni y Mechoulan (Gaoni & Mechoulam, 1964). También se han descrito una
sesentena de otras sustancias cannabinoides que se hallan en menor cantidad
o tienen menor poder psicoactivo, como por ejemplo el Δ8-THC y el cannabinol
(ambos con efectos psicoactivos) o el cannabidiol (sin efectos psicoactivos). La
principal vía de consumo de los derivados de la planta Cannabis sativa es la
inhalación. Por esta vía, el THC es absorbido rápidamente a la corriente
sanguínea y pasa a ser distribuido por los diferentes tejidos. Una vez en el
organismo, es metabolizado sobre todo a nivel del hígado, donde se transforma
en 11-OH-Δ9-THC. Este metabolito es más potente que el propio THC y
atraviesa la barrera hematoencefálica con más facilidad, siendo el que ejerce
mayoritariamente los efectos psicoactivos. El siguiente paso en la ruta
metabólica, produce un compuesto más oxidado, el 11-nor-9-carboxi-Δ9-
tetrahidrocannabinol que no presenta propiedades cannabinomiméticas.

1
Los efectos del THC en humanos incluyen: disrupción de la memoria a corto
plazo, problemas cognitivos, sensación de que el tiempo discurre lentamente,
descoordinación, sequedad bucal, taquicardia y alteraciones en el estado de
ánimo (Hollister, 1986; Pertwee, 1988).

Las propiedades terapéuticas del cannabis también se conocen desde la

antigüedad, y fue en un principio empleado sobre todo para el tratamiento de
diferentes alergias, migrañas y para facilitar el parto (Mechoulam, 1986).
Actualmente, existen diferentes agonistas cannabinoides que están siendo
utilizados para el tratamiento de diversas dolencias o que están en fase de
ensayo para su posible aplicación en el futuro. Así, el cannabinoide sintético
NABILONE se está utilizando como antiemético en múltiples países, incluido
España, en pacientes que reciben quimioterapia. El DRONABINOL, nombre
genérico del THC, se utiliza con éxito para incrementar el apetito en pacientes
con SIDA y cáncer. Diversos compuestos cannabinoides están en fase de
desarrollo, entre los que podríamos citar los antagonistas cannabinoides que se
están testando como posibles adelgazantes y el DEXANABINOL. También se
está evaluando la aplicación de estos cannabinoides para aliviar el temblor y la
espasticidad en pacientes que sufren esclerosis múltiple, como agentes
antioxidantes, neuroprotectores, analgésicos, como fármacos para el
tratamiento del glaucoma y como antiproliferativos. El problema de estas
sustancias es que presentan un estrecho margen terapéutico y a dosis
mayores pueden provocar efectos indeseables, principalmente relacionados
con su actividad psicotrópica. El uso de cannabinoides no psicoactivos
permitirá disociar los efectos indeseables de los terapéuticos.

1.1. El sistema cannabinoide endógeno.

1.1.1. Receptores cannabinoides. Debido a la gran lipofilicidad del THC,

durante mucho tiempo se pensó que este compuesto producía sus efectos
farmacológicos mediante interacciones inespecíficas a nivel de la membrana
(Hillard et al., 1985). Sin embargo, el desarrollo de ligandos sintéticos de mayor
potencia permitió la caracterización definitiva de un receptor específico para los
cannabinoides. Uno de estos compuestos, el CP55940 fue tritiado y utilizado
para identificar y caracterizar un receptor cannabinoide en sinaptosomas de

2
cerebro de rata (Devane et al., 1988). Los resultados obtenidos demostraron
que la unión de [3H]-CP55940 a su receptor era saturable, de gran afinidad y
enantioselectividad, además de mostrar las características de un receptor
acoplado a proteínas G. La existencia de dicho receptor cannabinoide quedó
confirmada tras varias observaciones:

- La existencia de sitios de unión específicos que se saturan a

concentraciones bajas de diferentes agonistas cannabinoides y que
presentan una alta afinidad por estos mismos agentes (Devane et al.,
1988; Herkenham et al., 1990; Herkenham et al., 1991a; Herkenham
et al., 1991b).

- Un amplio rango de cannabinoides no marcados desplazan la unión

de [3H]-CP55940. Los cannabinoides presentan también una elevada
enantioselectividad en el desplazamiento de este compuesto, siendo
más efectivos los enantiómeros (-) (Devane et al., 1988; Howlett et
al., 1990; Herkenham et al., 1990; Herkenham et al., 1991a;
Herkenham et al., 1991b).

- Estos sitios de unión presentan una alta selectividad por los agentes
cannabinomiméticos y están presentes en grandes concentraciones
en el cerebro (Bidaut-Russell et al., 1990; Howlett et al., 1992).

- La distribución de estos sitios de reconocimiento está muy

relacionada con los efectos farmacológicos que producen los
cannabinoides (Herkenham et al., 1990; Mailleux & Vanderhaeghen,
1992; Herkenham et al., 1991a; Herkenham et al., 1991b; Bidaut-
Russell et al., 1990).

La clonación y secuenciación del receptor cannabinoide (CB1) localizado a

nivel del sistema nervioso central (SNC) se realizó en el año 1990 (Matsuda et
al., 1990) y fue el resultado de una estrategia que tenía como objetivo la
obtención de ADNc que codificara nuevos receptores acoplados a proteínas G.
A través de una librería de ADNc de corteza cerebral de rata, se obtuvo el
SKR6, cuya secuencia sugirió que su producto podía ser un receptor con 7
dominios transmembrana acoplado a proteínas G. Se expresó en células de

3
ovario de hámster chino (CHO), y se probó la capacidad de unión y activación
con diferentes ligandos. Finalmente se comprobó que las CHO transfectadas
con SKR6 eran sensibles a los efectos de diferentes cannabinoides. En
concreto se observó que el THC y el CP55940 eran capaces de inhibir la
actividad adenilato ciclasa (AC) (Matsuda et al., 1990). El receptor CB1 de la
rata, al igual que el del ratón, está constituido por 473 aminoácidos (AA).

Poco tiempo después se clonó el receptor CB1 humano a partir de muestras de

tronco cerebral (Gerard et al., 1990). El receptor CB1 humano contiene 472 AA
y presenta una homología del 93% en la secuencia nucleotídica y del 98% en la
aminoacídica con respecto al de rata (Gerard et al., 1991). El gen del receptor
CB1 humano se encuentra localizado en la región q14-q15 del cromosoma 6
(Caenazzo et al., 1991; Hoehe et al., 1991). Se ha descrito una variante
alternativa en humanos producida por “splicing diferencial” denominada CB1A
(Shire et al., 1995).

La clonación de un segundo tipo de receptor cannabinoide en células del bazo,

demostró la existencia de al menos dos tipos de receptores cannabinoides
(Munro et al., 1993). Este receptor se denominó CB2, y se aisló a partir de
células mieloides de bazo de rata, utilizándose una estrategia basada en la
técnica de la PCR (Munro et al., 1993). El ADNc del receptor CB2 humano se
aisló de una línea celular promielocítica (Slipetz et al., 1995).

Ambos receptores pertenecen a la superfamilia de receptores de membrana

con 7 dominios transmembranales acoplados a proteínas G. Los receptores
CB1 y CB2 presentan una homología del 44% en roedores, aunque la
homología alcanza el 68% a nivel de los dominios transmembranales (Figura.
1). El receptor CB1 es mayor que el CB2, presentando en la rata un total de 72
AA adicionales en el extremo N-terminal, 15 residuos adicionales en el tercer
“loop” extracelular y otros 13 AA extra en la región C-terminal. El mayor grado
de homología entre ambos receptores se encuentra en las regiones
transmembranales TM2, TM3, TM5 y TM6.

4
 5
Figura 1. Comparación de las estructuras péptidicas de los receptores cannabinoides CB1 y CB2.
1.1.1.1. Otros receptores cannabinoides. Diferentes estudios realizados en
los últimos años han sugerido la existencia de un tercer tipo de receptor
cannabinoide que aún no ha sido identificado. Así, estudios farmacológicos han
demostrado que la anandamida induce vasodilatación en tejido arterial
mesentérico (Wagner et al., 1999). Este efecto es parcialmente inhibido por el
antagonista CB1, SR141716A. Sin embargo, el THC o potentes agonistas
sintéticos de los receptores CB1 y CB2 (como por ejemplo el HU-210 o el
WIN55212) no muestran este efecto vasodilatador (Howlett et al., 1990; Felder
et al., 1995). Igualmente, estudios realizados en ratones deficientes en el
receptor CB1 o en los dobles mutantes CB1/CB2 han demostrado que el efecto
vasodilatador de la anandamida persiste en estos animales (Jarai et al., 1999).

Por otra parte, se ha demostrado que la anandamida es capaz de modificar la

actividad espontánea y el umbral nociceptivo en animales deficientes en el
receptor cannabinoide CB1. Sin embargo, el THC es inefectivo en estos
ratones (Di, V et al., 2000). Por otra parte, Haller y colaboradores (2002)
describieron que el antagonista cannabinoide SR141716A producía un efecto
ansiolítico tanto en ratones salvajes como en ratones mutantes deficientes en
el receptor cannabinoide CB1 (Haller et al., 2002).

Estudios bioquímicos también apoyan la hipótesis de la existencia de otros

receptores cannabinoides no identificados. Así, la anandamida es capaz de
estimular la unión de [35S]-GTPγS a nivel cerebral en ratones deficientes en el
receptor CB1, mientras que el THC fue capaz de ejercer este mismo efecto
únicamente en muestras extraídas de animales salvajes (Di, V et al., 2000).
Esta actividad de la anandamida no era inhibida ni por el antagonista CB1,
SR141716A, ni por el antagonista CB2, SR144528. En un estudio posterior se
observó que el WIN55212 también era capaz de estimular la unión de [35S]-
GTPγS en preparaciones de tejido cerebral de animales deficientes en el
receptor CB1 (Breivogel et al., 2001). Este efecto fue observado en
determinadas regiones cerebrales como en la corteza, hipocampo, tronco
cerebral, diencéfalo y médula espinal, pero no en los ganglios basales o en el
cerebelo.

6
1.1.1.2. Mecanismos de transducción inducidos por la activación del receptor
cannabinoide. Como ya se ha comentado anteriormente, los receptores
cannabinoides pertenecen a la superfamilia de receptores de membrana
acoplados a proteínas G. Sin embargo, la eficacia que presentan para activar a
las proteínas G es relativamente baja. Por ejemplo, a nivel del estriado cada
receptor cannabinoide activa únicamente una media de 3 proteínas G,
comparado con las 20 de media de los receptores μ- y δ-opioides (Sim et al.,
1996b; Breivogel et al., 1997). Posiblemente la escasa eficacia del receptor
cannabinoide explique la gran densidad del mismo en el cerebro.

Los receptores cannabinoides se unen principalmente a proteínas G del tipo

Gi/o produciendo un cambio en la actividad de diferentes sistemas efectores. En
primer lugar los cannabinoides inhiben la actividad AC, disminuyendo las
concentraciones de AMPc (Howlett, 1984; Pacheco et al., 1993; Felder et al.,
1995; Bidaut-Russell et al., 1990). Además del efecto inhibitorio, se ha
demostrado que los cannabinoides pueden estimular la síntesis de AMPc en
ciertas condiciones experimentales a nivel del globo pálido (Maneuf & Brotchie,
1997) y estriado (Glass & Felder, 1997), posiblemente mediante la activación
de proteínas Gs. Experimentos de cotransfección entre los dos tipos de
receptores cannabinoides y las diferentes isoformas de AC han demostrado
que los receptores CB1 y CB2 inhiben los subtipos I, V, VI y VIII, mientras que
los tipos II, IV y VII de la AC están estimuladas por la activación de estos
receptores (Rhee et al., 1998).

Como otros receptores acoplados a proteínas Gi/o, la activación de los

receptores CB1 disminuye la conductancia de canales de Ca2+ voltaje
dependientes (tipos N y P/Q), efecto mediado por las subunidades βγ de las
proteínas G (Caulfield & Brown, 1992; Mackie & Hille, 1992; Shen et al., 1996).
Este mecanismo puede mediar el efecto inhibitorio de los cannabinoides sobre
la liberación de neurotransmisores. Recientemente se ha demostrado que los
cannabinoides también pueden inhibir los canales de Ca2+ tipo L en la
musculatura lisa arterial, lo que podría explicar el papel vasodilatador de estas
sustancias.

Los cannabinoides también incrementan la conductancia del K+ (Mackie et al.,

1995) interaccionando a nivel de los canales de K+ rectificadores de potencial

7
acoplados a proteínas G (GIRK, "G protein-coupled inwardly-rectifying K+
channels”) (Henry & Chavkin, 1995). Además, se ha descrito que estas
sustancias pueden estimular la conductancia de los canales de K+
responsables de la generación de corrientes tipo "A" en cultivos primarios de
neuronas hipocampales (Deadwyler et al., 1993). El efecto sobre las corrientes
tipo A a diferencia del descrito para los canales tipo GIRK, depende de la
inhibición de la ruta AMPc/proteína quinasa A (PKA) (la disminución de la
fosforilación del canal da lugar a una activación del mismo). Las acciones de
los cannabinoides a nivel de los canales de K+ son responsables de la
hiperpolarización neuronal que provocan estas sustancias.

La mayor parte de los efectos de los cannabinoides sobre la conductividad

iónica se deben a un efecto directo sobre las proteínas G, y son independientes
de la vía del AMPc.

Estudios realizados en células CHO transfectadas sugieren que el receptor

CB2 no tiene efecto a nivel de las corrientes de Ca2+ ni de K+, aunque inhiben
la actividad AC (Felder et al., 1995).

Por otra parte los cannabinoides son activadores potentes de la fosforilación de

las MAP quinasas (Bouaboula et al., 1995). Este efecto es bloqueado tras la
administración de toxina pertussis, lo que demuestra la implicación de
proteínas Gi/o. La activación de la vía de las MAP quinasas podría ser el paso
intermedio hacia la expresión inducida por los receptores cannabinoides de los
genes tempranos Krox-24; Krox-20 y jun-B (Bouaboula et al., 1995; Bouaboula
et al., 1996), al parecer a través de la subunidad βγ de las proteínas G. Esta vía
es independiente de la actividad AC (Bouaboula et al., 1995). Recientemente,
Derkinderen y colaboradores (2001) han demostrado que diferentes sustancias
cannabinoides (THC, diferentes cannabinoides sintéticos y endocannabinoides)
pueden activar también la MAP quinasa p38 (Derkinderen et al., 2001). Se ha
estudiado in vivo la participación de la vía de las MAP quinasas en los efectos
farmacológicos de los cannabinoides. Así, recientemente se ha descrito que la
administración aguda de THC induce una activación transitoria de la MAP
quinasa ERK en el estriado dorsal y en el núcleo accumbens. Este efecto es
revertido mediante la administración del antagonista CB1, SR141716A. La

8
inhibición de la actividad de ERK bloquea las propiedades gratificantes del THC
en el paradigma de condicionamiento espacial (Valjent et al., 2001).

Finalmente se ha sugerido que el receptor cannabinoide podría regular la

actividad de la enzima fosfolipasa C a través de proteínas G. Así, los
cannabinoides inducen la liberación de ácido araquidónico (Burstein et al.,
1994; Shivachar et al., 1996).

1.1.1.3. Distribución anatómica de los receptores cannabinoides. La densidad

de receptores CB1 es muy elevada en el SNC. También se ha descrito su
presencia a nivel periférico, localizándose en el pulmón, células del endotelio
vascular, células del músculo liso, testículos, útero, bazo, glándula adrenal,
amígdalas, corazón, vas deferens y en la vejiga urinaria (Pertwee, 1997).
Mediante técnicas de autoradiografía, se ha demostrado que la mayor densidad
de sitios de unión a cannabinoides en el cerebro se encuentra en la sustancia
negra pars reticulata, el núcleo entopeduncular, el globo pálido, el caudado-
putamen lateral, el bulbo olfativo y en la capa molecular del cerebelo
(Herkenham et al., 1990; Mailleux & Vanderhaeghen, 1992; Jansen et al., 1992)
(Figura 2). Otras áreas que presentan niveles moderadamente altos de sitios
de unión a cannabinoides son el hipocampo, el núcleo accumbens y la corteza
cerebral. Hay escasez o ausencia de receptores cannabinoides CB1 a nivel del
tronco cerebral, el bulbo raquídeo y el hipotálamo. Igualmente, la presencia de
receptores cannabinoides a nivel del asta dorsal de la médula espinal es
moderada (Herkenham et al., 1991b; Mailleux & Vanderhaeghen, 1992).

Estudios realizados mediante técnicas inmunohistoquímicas han mostrado

resultados muy similares a los obtenidos mediante autoradiografía. Así, se ha
descrito una alta densidad de receptores CB1 en axones, dendritas y cuerpos
neuronales en el hipocampo, ganglios basales y capa molecular del cerebelo
(Pettit et al., 1998). Estos estudios han permitido demostrar que los receptores
CB1 a nivel espinal se encuentran mayoritariamente localizados en
interneuronas en el funículo dorsolateral, el asta dorsal superficial y la lámina X
(Farquhar-Smith et al., 2000).

9
 10
Caudado-putamen Hipocampo Cerebelo

Globo
Entope-duncular Sustancia
pálido
negra

Figura 2. Distribución del receptor cannabinoide CB1 en el cerebro.

También se ha estudiado la localización del receptor CB1 mediante hibridación
in situ. Los resultados son, en general, similares a los obtenidos mediante
autoradiografía (Mailleux & Vanderhaeghen, 1992; Rubino et al., 1994), aunque
se observaron diferencias en el globo pálido y la sustancia negra, donde los
niveles de ARNm del receptor CB1 son muy bajos. Estas diferencias se deben
a que los terminales nerviosos que contienen el receptor están distantes de los
cuerpos celulares que lo sintetizan. Este es también el caso del cerebelo,
donde las células granulares que contienen grandes cantidades de ARNm
proyectan en la capa molecular donde se localizan los receptores (Mailleux &
Vanderhaeghen, 1992).

Es importante mencionar que la localización de los receptores CB1 está

altamente conservada entre las diferentes especies estudiadas, sugiriendo un
papel específico del sistema endocannabinoide que se ha conservado a lo
largo de la evolución.

Los receptores CB2 se encuentran localizados en su mayor parte a nivel

periférico. Así, se ha descrito su presencia principalmente a nivel de células del
sistema inmune, especialmente linfocitos B (Munro et al., 1993; Galiegue et al.,
1995), y ha sido implicado en los efectos inmunomoduladores producidos por
los cannabinoides (Kaminski et al., 1992). A nivel cerebral, se ha descrito
recientemente la expresión del receptor CB2 en células de tumor glial (Sanchez
et al., 2001) o en células de la microglía (Walter et al., 2003). Parece ser que el
receptor CB2 no se localiza en las neuronas, aunque un estudio ha descrito la
presencia de ARNm que codifica para este receptor en cultivos de células
cerebelares granulares así como en cerebelo (Skaper et al., 1996).

1.1.2. Endocannabinoides. El descubrimiento del receptor cannabinoide CB1

llevó a la búsqueda de sustancias endógenas capaces de activar este receptor.
Así, en 1992 el grupo de Mechoulam (Devane et al., 1992) aisló e identificó la
primera sustancia cannabinoide endógena, la araquidoniletanolamina, que
denominaron anandamida. Trabajos posteriores han descrito diferentes
sustancias lipídicas con actividad cannabinoide, entre las que destacan el 2-
AG, el 2-araquidonilgliceril éter (noladín éter) y la virodamina.

11
1.1.2.1. Anandamida. Se ha demostrado que la anandamida se une tanto al
receptor CB1 como al CB2 en diversos estudios realizados a partir de
preparaciones de membrana obtenidas de cerebro y de células transfectadas
(Devane et al., 1992; Felder et al., 1993; Munro et al., 1993; Vogel et al., 1993;
Showalter et al., 1996). Aunque la afinidad de la anandamida por el receptor
CB1 es relativamente moderada (aprox. 100 nM), ésta es 4 veces superior a la
que presenta por el receptor CB2 (Felder et al., 1995; Slipetz et al., 1995). La
anandamida es muy inestable en el organismo, siendo metabolizada
rápidamente por amidasas (Deutsch & Chin, 1993). La inestabilidad de la
anandamida crea problemas a la hora de interpretar resultados experimentales
realizados con esta sustancia, y podría explicar estudios in vivo en los que no
se observó una actividad cannabinoide completa de este endocannabinoide
(Wiley et al., 1995). Aun así, este compuesto comparte con el THC y otros
cannabinoides la mayoría de las propiedades farmacológicas tanto a nivel
fisiológico (antinocicepción, catalepsia, hipotermia, hipolocomotricidad) (Fride &
Mechoulam, 1993; Crawley et al., 1993; Smith et al., 1994a; Romero et al.,
1995), como a nivel intracelular (inhibición de la actividad AC, de los canales de
Ca2+, activación de canales de K+) (Felder et al., 1993).

1.1.2.1.1. Síntesis de la anandamida. Inicialmente se supuso que la

anandamida se sintetizaba a través de un mecanismo no energético a partir de
la condensación de la etanolamina y el ácido araquidónico, reacción catalizada
por una anandamida sintasa (Deutsch & Chin, 1993). Sin embargo, diversos
autores cuestionaron esta idea (Di, V et al., 1994), ya que las concentraciones
libres de etanolamina y ácido araquidónico presentes en las diferentes áreas
cerebrales en las que se ha localizado el enzima no son lo suficientemente
elevadas como para conducir la síntesis de anandamida en una reacción que
no requiera aporte de energía. Más adelante se demostró que este paso era
una reacción inversa catalizada por el enzima anandamida amidohidrolasa, el
cual participa en la degradación de la anandamida (Devane & Axelrod, 1994;
Kruszka & Gross, 1994; Ueda et al., 1995).

12
Actualmente, se supone que la síntesis de anandamida se produce por la
hidrólisis del fosfolípido precursor N-araquidonil fosfatidiletanolamina, reacción
catalizada por la fosfolipasa D, produciendo ácido fosfatídico y anandamida (Di,
V et al., 1994; Cadas et al., 1997; Sasaki & Chang, 1997; Piomelli et al., 1998).
A su vez, la N-araquidonil fosfatidiletanolamina se sintetiza a partir de
fosfatidiletanolamina y de una molécula donadora del grupo araquidonato,
como la fosfatidilcolina. Esta reacción está catalizada por el enzima N-
aciltransferasa. El Ca2+ estimula tanto la actividad fosfolipasa D como la N-
aciltransferasa. La actividad N-aciltransferasa está regulada además por la
PKA.

1.1.2.1.2. Inactivación de la anandamida. La anandamida es inactivada en

el cerebro mediante dos mecanismos complementarios. El primero es la
recaptación mediante transportadores específicos (Beltramo et al., 1997). Tanto
las neuronas como los astrocitos recaptan la anandamida. El transportador de
anandamida es independiente de Na+, lo que supone que la anandamida es
recaptada por un proceso de difusión pasiva, a favor de gradiente. Esta
característica diferencia a este transportador de los demás recaptadores para
neurotransmisores, pero es similar al de la prostaglandina E2. Se han
sintetizado diferentes sustancias con capacidad para inhibir la recaptación de
endocannabinoides, entre las que cabe destacar el AM404. Esta sustancia
actúa como un inhibidor competitivo de razonable potencia y eficacia, y ha sido
utilizado ampliamente en investigación (Beltramo et al., 1997).

Tras su recaptación se produce un proceso de degradación enzimática. Se ha

identificado (Ueda et al., 1995; Desarnaud et al., 1995) y clonado (Cravatt et al.,
1996) un enzima unido a membrana que cataliza la hidrólisis de la anandamida
a ácido araquidónico y etanolamina, denominado anandamida amidohidrolasa
o amido hidrolasa de ácidos grasos (FAAH, del inglés Fatty Acid Amido
Hydrolase). Este enzima se halla localizado a nivel intracelular (Hillard et al.,
1995), y se ha demostrado que cataliza la hidrólisis de anandamida cuando
ésta se acumula en las células (Di, V et al., 1994). Sin embargo, la inactivación
del enzima a corto plazo, parece no afectar la recaptación de la anandamida
(Beltramo et al., 1997). Esto indica que la degradación de la anandamida no es

13
la razón que permite al transportador recaptar el lípido sin gasto de energía
(Piomelli et al., 1998). Se han sintetizado diferentes sustancias con capacidad
de inhibir la actividad FAAH como el α-KOP que actúa como inhibidor
competitivo (Boger et al., 2000) y los compuestos URB532 y URB597 que
actúan como inhibidores irreversibles (Kathuria et al., 2003).

1.1.2.1.3. Localización de la anandamida. La anandamida tiene efectos

tanto a nivel periférico como central. Debido a la naturaleza lipídica de la
anandamida, la carencia de un anticuerpo específico contra ésta y los bajos
niveles en tejido cerebral, actualmente se desconoce su distribución anatómica
precisa. Las técnicas que se utilizan para detectar y cuantificar la anandamida
son las de HPLC y cromatografía de gases. Así, se ha detectado anandamida
en circuitos neuronales involucrados en funciones tales como la cognición, la
memoria, el control del estado anímico y la nocicepción. Se han descrito
niveles altos de anandamida en el tronco cerebral, hipocampo, estriado y
médula espinal (Bisogno et al., 1999). A nivel periférico, la anandamida se
localiza sobretodo en el bazo, el corazón y en la piel (Felder et al., 1996). Los
niveles de anandamida en el cerebro son muy bajos, del orden de 10 pmoles
por gramo de tejido (Sugiura et al., 1996).

En cerebro humano también se han medido las concentraciones de

anandamida y se han descrito diferencias según la región cerebral estudiada
(Felder et al., 1996). Así, la mayor concentración se encontró a nivel del
hipocampo (110 pmoles/g tejido), mientras que las concentraciones más bajas
fueron detectadas en el cerebelo (30 pmoles/g tejido).

A la hora de determinar la cantidad de anandamida en un tejido es importante

tener en cuenta el tiempo transcurrido entre la muerte del individuo y la
extracción de los lípidos, ya que la concentración de anandamida aumenta
considerablemente tras la muerte (Felder et al., 1996; Kempe et al., 1996). Esto
sugiere que los niveles de anandamida pueden estar regulados por factores
tales como la isquemia o la hipoxia.

14
1.1.2.2. El 2-araquidonilglicerol (2-AG). Este lípido fue aislado inicialmente en
el intestino de perro (Mechoulam et al., 1995) y cerebro de rata (Sugiura et al.,
1995). Aunque presenta menor afinidad que la anandamida por los receptores
CB1 y CB2 (Sugiura et al., 1995), se halla presente en el cerebro a
concentraciones mucho mayores que esta última (Stella et al., 1997; Sugiura et
al., 1995). El 2-AG presenta una afinidad 3 veces superior por el receptor CB1
que por el CB2, y produce los mismos efectos farmacológicos que el THC,
incluyendo analgesia, hipolocomoción e hipotermia, además de inhibir la
contracción del conducto deferente de ratón (Mechoulam et al., 1995). A
diferencia de la anandamida, el 2-AG es un agonista total de los receptores
CB1. En un estudio realizado en cortes hipocampales, se estimuló
eléctricamente la síntesis y liberación de 2-AG, alcanzándose una
concentración de aproximadamente 1-2 μM. Este es un valor similar al de la Kd
que presenta el 2-AG por el receptor CB1 (Stella et al., 1997). Estos datos
sugieren que el 2-AG juega un papel más importante que la anandamida como
cannabinoide endógeno a nivel cerebral.

1.1.2.2.1. Síntesis del 2-AG. Aunque no se puede descartar que haya

diferentes rutas para la síntesis del 2-AG, la inhibición de la formación de 2-AG
en cultivos de neuronas corticales mediante la aplicación de inhibidores de la
fosfolipasa C y de la diacilglicerol lipasa, sugiere que la síntesis de 2-AG viene
mediada principalmente por la vía de la fosfolipasa C (Piomelli et al., 1998). A
pesar de ello, el sustrato fosfolipídico y la isoforma del enzima implicados en la
síntesis del 2-AG aún no han sido determinados. Al igual que la anandamida, la
síntesis de 2-AG se dispara tras el aumento en la concentración de Ca2+
intracelular (Stella et al., 1997).

1.1.2.2.2. Inactivación del 2-AG. El 2-AG es eliminado, como la

anandamida, a través de un proceso que consta de dos pasos: La recaptación
a través del mismo sistema de transporte que la anandamida (Piomelli et al.,
1999), y la posterior degradación enzimática en el interior celular. Se ha
descrito que el 2-AG es un sustrato de la FAAH (Goparaju et al., 1998; Lang et

15
al., 1999). Sin embargo, también se ha sugerido la existencia de otros enzimas
implicados en la degradación del 2-AG (Goparaju et al., 1999; Beltramo &
Piomelli, 2000; Lichtman et al., 2002). Así, se ha demostrado que la
monoglicérido lipasa puede hidrolizar el 2-AG, pero no la anandamida,
sugiriendo que pueda participar específicamente en la inactivación de este
endocannabinoide (Dinh et al., 2002).

1.1.2.2.3. Localización del 2-AG. La localización del 2-AG se ha estudiado

mediante el uso de las mismas técnicas aplicadas con la anandamida. El 2-AG
presenta una distribución anatómica similar a la de la anandamida,
presentando una alta concentración en la corteza, el tronco cerebral, el
hipocampo y el estriado entre otros (Bisogno et al., 1999). No obstante, la
concentración de 2-AG en las áreas estudiadas fue aproximadamente 150-200
veces más elevada que la de anandamida (Bisogno et al., 1999).

1.1.2.3. El 2-araquidonilgliceril éter (noladín éter). Este agonista cannabinoide

endógeno fue descubierto recientemente por Hanus y colaboradores (2001).
Presenta una mayor afinidad por el receptor CB1 que por el CB2. Los efectos
farmacológicos de esta sustancia incluyen sedación, hipotermia, inmovilidad
intestinal y antinocicepción. Se ha observado la presencia de noladín éter
mayoritariamente a nivel del hipocampo y tálamo (Fezza et al., 2002). Se
desconoce la vía de síntesis de este compuesto, pero se sabe que es diferente
a la del 2-AG (Fezza et al., 2002). El proceso de inactivación tampoco se ha
descrito, pero parece existir un proceso de recaptación mediante el mismo
sistema de transporte de la anandamida y el 2-AG (Fezza et al., 2002).

1.1.2.4. O-araquidonil etanolamina (virodamina). Este endocannabinoide fue

descrito recientemente por Porter y colaboradores (2002). Contrariamente a los
otros cannabinoides endógenos descritos, se ha sugerido que la virodamina
podría actuar como un antagonista del receptor CB1 en presencia de agonistas
endógenos como la anandamida. Sin embargo a nivel del receptor CB2 actúa
como un agonista total.

16
En el sistema nervioso central se ha descrito la presencia de virodamina en el
hipocampo, corteza, cerebelo, tronco cerebral y estriado. En tejidos periféricos
se ha detectado en la piel, bazo, riñones y corazón. La concentración de
virodamina a nivel cerebral es, en general, similar a la de anandamida. Sin
embargo, en tejidos periféricos, sobretodo en aquellos que expresan el receptor
CB2, la concentración de virodamina es más alta que la de anandamida.

Se desconocen los mecanismos de síntesis y degradación de este compuesto,

pero se ha observado que puede interaccionar con el transportador de
anandamida.

1.1.2.5. Características especificas de la neurotransmisión cannabinoide.

1.1.2.5.1. Síntesis y liberación de los endocannabinoides bajo demanda.

Tanto el 2-AG como la anandamida se sintetizan y liberan bajo demanda, tras
el desencadenamiento de un potencial de acción. Estas sustancias no se
almacenan en vesículas sinápticas, sino que son liberadas inmediatamente
después de su síntesis. Sin embargo, por el momento se desconoce el
mecanismo que utilizan los endocannabinoides (sustancias lipídicas) para
atravesar la hendidura sináptica (espacio acuoso) y llegar hasta los receptores.
Se baraja la hipótesis de la existencia de un transportador capaz de permitir el
paso a través de dicha hendidura sináptica (Piomelli et al., 1998).

1.1.2.5.2. Función de los endocannabinoides como mensajeros

retrógrados. En paralelo con el descubrimiento del sistema endocannabinoide,
diferentes estudios realizados en el cerebelo y el hipocampo revelaron la
existencia de un fenómeno al que denominaron supresión de la inhibición
inducida por despolarización (DSI) (Llano et al., 1991; Pitler & Alger, 1992). Los
primeros estudios sobre la DSI indicaron que se desencadenaba en respuesta
a un aumento en las concentraciones de Ca2+ a nivel postsináptico e
involucraba un mensajero retrogrado liberado en la neurona postsináptica. Así,
se ha descrito que la entrada de Ca2+ en las células de Purkinje produce la
liberación de un mensajero retrógrado que suprime de forma transitoria la
liberación presináptica de GABA. Sin embargo, no se había descrito la

17
identidad de esta sustancia hasta que diferentes estudios (Wilson & Nicoll,
2001; Ohno-Shosaku et al., 2001; Kreitzer & Regehr, 2001) demostraron que
los endocannabinoides actúan como mensajeros retrógrados suprimiendo tanto
sinapsis excitadoras como inhibitorias. Los antagonistas cannabinoides eran
capaces de bloquear este fenómeno. Recientemente se ha descrito que la DSI
en el hipocampo no se observa en animales deficientes en el receptor
cannabinoide CB1 (Wilson et al., 2001) (Figura 3).

1.1.3. Efectos farmacológicos de la activación de los receptores

cannabinoides.

1.1.3.1. Efectos antinociceptivos. El mecanismo de acción de los

cannabinoides como inhibidores de la transmisión del dolor incluye acciones a
nivel central y periférico (Lichtman & Martin, 1991; Pertwee, 2001). Igualmente,
se ha sugerido que los cannabinoides pueden ejercer sus efectos
antinociceptivos interaccionando no solo con receptores cannabinoides, sino
también con receptores vaniloides (Pertwee, 2001).

A nivel central, la actividad antinociceptiva de los cannabinoides se debe a la

presencia de receptores en la médula espinal y en estructuras supraespinales.
Los agonistas cannabinoides modulan tanto las vías ascendentes y
descendentes del dolor, así como la interpretación del mismo por estructuras
supraespinales. Aunque los canabinoides juegan un papel en el control
nociceptivo a nivel de las fibras primarias aferentes, el mecanismo de acción
más importante parece ser la modulación de las vías monoaminérgicas
inhibitorias descendentes que parten del tronco cerebral (Meng et al., 1998;
Lichtman et al., 1991). Este circuito incluye la sustancia gris periacueductal y la
médula ventromedial rostral. Ambas son zonas del cerebro que contienen
receptores CB1 (Tsou et al., 1998a).

La estimulación de la sustancia gris periacueductal y la médula ventromedial

produce analgesia (Fields et al., 1991), igual que la administración de agonistas
CB1 en estas áreas (Lichtman et al., 1991; Martin et al., 1998). Esto sugiere
que los cannabinoides desinhiben ambas regiones y en consecuencia activan
las vías inhibitorias descendentes.

18
 19
Figura 3. Papel del sistema cannabinoide endógeno como mensajero retrógrado.
El mecanismo celular de este fenómeno se supone que ocurre a través de la
reducción en la liberación de GABA en los botones presinápticos de
interneuronas localizadas en la médula ventromedial rostral (Vaughan et al.,
1999) y en la sustancia gris periacueductal (Vaughan et al., 2000). En estas
dos regiones, los receptores CB1 parecen estar localizados únicamente a nivel
presináptico. Al inhibir la liberación de GABA, los cannabinoides incrementan la
actividad de neuronas en esta zona, produciendo un efecto antinociceptivo.

A nivel supraespinal, los cannabinoides también pueden controlar la

interpretación subjetiva de los estímulos dolorosos modulando la actividad
neuronal en la amígdala (Manning et al., 2001).

A nivel espinal, la administración de agonistas cannabinoides inhibe la

transmisión nociceptiva de las fibras C en el asta dorsal de la médula espinal
(Hohmann et al., 1998; Drew et al., 2000). Se ha propuesto que el mecanismo
por el cual los cannabinoides ejercen sus efectos analgésicos a nivel espinal
consiste en la modulación de la transmisión en las neuronas nociceptivas
primarias, inhibiendo la liberación de neurotransmisores (Hohmann et al., 1998;
Richardson et al., 1998). Sin embargo, el ARNm del receptor CB1 está
colocalizado en poca cantidad en fibras aferentes primarias de pequeño
tamaño que contienen neuropéptidos responsables de la transmisión del dolor
tales como la sustancia P, el CGRP (Calcitonin Gener-Related Peptide) y la
somatostatina (Hohmann & Herkenham, 1999).

Diferentes estudios han demostrado que la anandamida también tiene efectos

analgésicos. Sin embargo, parte de estos efectos pueden ser debidos a la
interacción con el receptor vaniloide VR1. Se ha demostrado que la
anandamida se une al receptor VR1 con una afinidad algo menor que al
receptor CB1 (Di, V et al., 2001). Además, se ha observado que
concentraciones altas de anandamida pueden excitar los terminales aferentes
de los ganglios de la raíz dorsal incrementando la liberación de CGRP y
sustancia P vía la activación del receptor VR1 (Tognetto et al., 2001).

Los cannabinoides pueden asimismo ejercer efectos antinociceptivos a través

de la activación de los receptores CB1 y CB2 situados en la periferia. En este
sentido, diversos estudios han demostrado que los receptores CB2 modulan la
respuesta dolorosa de tipo inflamatorio. Así, la palmitoiletanolamida (agonista

20
CB2), puede disminuir la sensación dolorosa inducida por carragenina o
formalina (Mazzari et al., 1996; Calignano et al., 1998). Un posible mecanismo
por el cual la palmitoiletanolamida ejerce sus efectos antihiperalgésicos es
mediante la inhibición de la degranulación de mastocitos (Facci et al., 1995;
Mazzari et al., 1996), controlando así la liberación de histamina y serotonina.
Igualmente, hay presencia de receptores CB1 a nivel periférico que pueden
modular las respuestas en el caso de dolor inflamatorio (Calignano et al., 1998)
o en el caso de la estimulación térmica (Richardson et al., 1998). En contraste
con estos resultados, Beaulieu y colaboradores (2000) observaron que la
administración de antagonistas CB1 o CB2 no alteraba la respuesta dolorosa
en animales sometidos al test de la formalina. Igualmente, los niveles de
endocannabinoides así como la actividad FAAH no resultaron modificados en
estos animales, sugiriendo que el sistema cannabinoide endógeno no está
involucrado en el control de la hiperalgesia producida por un proceso
inflamatorio (Beaulieu et al., 2000).

1.1.3.2. Efectos motores. Los principales efectos farmacológicos de los

cannabinoides a nivel motor son hipoactividad y catalepsia (Dewey, 1986;
Hollister, 1986). No obstante, el efecto de los cannabinoides parece ser
bifásico. A dosis bajas los cannabinoides tienen un efecto estimulante y a dosis
altas un efecto inhibidor sobre la actividad locomotora (Davis et al., 1972). Por
otra parte, la administración de dosis muy elevadas puede producir
hiperreflexia, dando lugar al efecto conocido como “pop-corn behaviour” en
ratones y “barrel rotation behaviour” en ratas (Martin et al., 1991).

Se supone que los efectos hipolocomotores inducidos por los cannabinoides

vienen mediados por sus acciones inhibitorias a nivel del cerebelo, de la
sustancia negra y de los ganglios basales, donde hay una gran expresión de
receptores CB1 (Herkenham et al., 1990).

Los ganglios basales están constituidos por un conjunto de núcleos cerebrales

funcionalmente interconectados y que están involucrados en el control motor
(Albin et al., 1989). Estos incluyen: 1) el estriado, constituido por los núcleos
caudado y putamen, que es el área de los ganglios basales que recibe la
información proveniente de la corteza motora, sensorial y límbica así como del

21
núcleo talámico. Las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars
compacta modulan la actividad de esta estructura; 2) un conjunto de núcleos
intermedios, entre los que se incluyen el globo pálido externo y el núcleo
subtalámico, que procesan la información proveniente del estriado y 3) el globo
pálido interno (o núcleo entopeduncular en los roedores) y la sustancia negra
pars reticulata que envía proyecciones hacia áreas motoras del tálamo, la
habénula y el tronco cerebral.

En los ganglios basales, los efectos motores inducidos por los cannabinoides
son complejos. Estas sustancias activan el movimiento cuando son
microinyectadas en la llamada "vía directa" de los ganglios basales, en el
estriado o en la sustancia negra pars reticulata (Figura. 3) (Sañudo-Peña et al.,
1996; Sañudo-Peña et al., 1998). Los efectos opuestos se obtienen cuando los
cannabinoides son microinyectados en la denominada "vía indirecta" de los
ganglios basales (en el globo pálido o en el núcleo subtalámico) (Sanudo-Pena
& Walker, 1998; Miller et al., 1998). En esta estructura cerebral, la mayor
expresión de receptores CB1 ocurre a nivel presináptico, en neuronas del
estriado y núcleo subtalámico que inervan el globo pálido externo, la sustancia
negra pars reticulata y el núcleo entopeduncular (Breivogel & Childers, 1998;
Rodriguez et al., 1998). Así, los receptores CB1 pueden modular la actividad
tanto de las proyecciones GABAérgicas estriatales como de las proyecciones
glutamatérgicas subtalámicas.

Se ha sugerido que parte de los efectos hipolocomotores inducidos por los

cannabinoides se deben a la capacidad de estas sustancias de incrementar la
actividad de las neuronas de la sustancia negra pars reticulata. Este efecto
viene mediado por receptores CB1 localizados en los terminales presinápticos
de neuronas GABAérgicas. La activación de los receptores CB1 produciría una
disminución de la liberación de GABA a nivel de la sustancia negra pars
reticulata (Figura 4).

Por otra parte, los agonistas cannabinoides también pueden disminuir la

transmisión glutamatérgica que parte del núcleo subtalámico y que inerva a la
sustancia negra pars reticulata. La disminución en la actividad de las sinapsis
estimuladoras puede explicar el efecto hiperlocomotor observado tras la
administración de dosis bajas de cannabinoides.

22
 23
Figura 4. Papel del sistema cannabinoide endógeno en el control de la actividad locomotora. Los puntos
negros representan la localización de los receptores CB1.
Así, los cannabinoides modulan tanto las proyecciones inhibidoras como
estimuladoras que inervan a la sustancia negra pars reticulata (Breivogel &
Childers, 1998).

A nivel del globo pálido externo, la administración sistémica de agonistas

cannabinoides disminuye la actividad neuronal (Miller & Walker, 1996). Sin
embargo se desconocen los mecanismos neuronales implicados en este
control.

Las proyecciones corticoestriales también están reguladas por los

cannabinoides (Figura 4). Estas neuronas parten de la corteza frontal y
prefrontal, inervan al estriado, y están involucradas en la planificación del
movimiento. Se ha descrito la presencia de receptores CB1 a nivel presináptico
en estas estructuras (Huang et al., 2001).

Por otra parte, el sistema cannabinoide regula la actividad locomotora actuando

a nivel mesolímbico. Se ha descrito la activación del sistema dopaminérgico
mesolímbico tras al administración de agonistas CB1 (Chen et al., 1990b). Así,
la liberación de dopamina a este nivel puede mediar en los efectos
hiperlocomotores transitorios observados tras la administración de una dosis
baja de agonistas cannabinoides (Rodriguez et al., 1998).

El cerebelo está implicado en la coordinación motora y posee una elevada

concentración de receptores CB1, a nivel de la capa molecular. En concreto,
los receptores cannabinoides se encuentran localizados en los terminales
axónicos de las células granulares glutamatérgicas que proyectan a la capa
molecular (Pacheco et al., 1993). Parece ser que los receptores CB1 modulan
la estimulación de las proyecciones de la corteza cerebelar. Estas proyecciones
proceden de las células de Purkinje, que no presentan receptor CB1, y son
enviadas hacia el tronco cerebral y el tálamo, para mediar la coordinación
motora.

Estudios sobre la actividad locomotora realizados en ratones deficientes en el

receptor CB1 han descrito efectos diferentes, dependiendo de la cepa de ratón
que se utilizó para generarlo. Así, Zimmer y colaboradores han descrito una
disminución en la actividad locomotora en ratones deficientes en el receptor
CB1 generados en la cepa consanguínea C57BL/6J (Zimmer et al., 1999). Sin

24
embargo, Ledent y colaboradores han descrito una hiperactividad moderada en
ratones sin receptor CB1 generados en la cepa no consanguínea CD-1 cuando
son expuestos a un entorno desconocido. Este efecto desaparece tras un
periodo de habituación (Ledent et al., 1999).

1.1.3.3. Efectos sobre la memoria. Los efectos de los cannabinoides sobre la

memoria son fundamentalmente mediados a nivel del hipocampo. Esta
estructura contiene una gran densidad de receptores CB1, sobretodo a nivel de
la capa molecular del giro dentado, así como en las capas superficiales de la
corteza perirrinal y entorrinal (Herkenham et al., 1990; Herkenham et al.,
1991b). Se ha observado que los receptores CB1 se expresan de una manera
abundante en los somas y axones de interneuronas GABAérgicas, en especial
en las que también coexpresan colecistoquinina (Tsou et al., 1998a; Tsou et al.,
1999; Katona et al., 1999; Katona et al., 2000).

Los cannabinoides provocan una disminución importante en la retención de la

memoria a corto plazo (Miller & Branconnier, 1983; Chait & Pierri, 1992).
Estudios realizados en diversas especies animales han descrito alteraciones de
memoria inducidos por THC u otros agonistas cannabinoides (Campbell et al.,
1986; Nava et al., 2001). Por ejemplo, en ratas que habían sido entrenadas
para responder a un estímulo acústico, el THC incrementó la latencia de
respuesta y disminuyó el porcentaje de respuestas correctas (Campbell et al.,
1986). Además, tanto la anandamida como el 2-AG inhiben el fenómeno de la
potenciación a largo plazo (LTP) en el hipocampo mediante un mecanismo
dependiente del receptor CB1. El mecanismo concreto por el cual los
cannabinoides modulan los procesos de aprendizaje y memoria no está claro.
Se ha sugerido que la inhibición de la LTP se debe a que los cannabinoides
actúan a nivel presináptico inhibiendo la liberación de glutamato. Sin embargo
los receptores CB1 están localizados predominantemente a nivel presináptico,
en neuronas que contienen GABA. Esta observación ha generado la hipótesis
de que la reducción en la liberación de GABA mediada por los cannabinoides
produciría un incremento en la excitabilidad general del sistema que impediría
su normal funcionamiento y la correcta formación de los procesos de memoria.

25
Otra hipótesis que se baraja para explicar el efecto de los cannabinoides sobre
la memoria implica la regulación del sistema colinérgico septohipocampal. Así,
se ha descrito que los cannabinoides inhiben la liberación de acetilcolina en el
hipocampo (Gifford & Ashby, Jr., 1996; Gessa et al., 1997). En concordancia
con estas observaciones, los ratones deficientes en el receptor CB1 muestran
un incremento en la liberación de acetilcolina en esta estructura en respuesta a
una estimulación eléctrica (Kathmann et al., 2001).

También se ha propuesto una posible implicación de la corteza prefrontal en

esta acción de los cannabinoides. Así, Jentsch y colaboradores (1997)
observaron que la administración de THC aumentaba la tasa de recambio de
dopamina y noradrenalina pero no de serotonina en la corteza prefrontal
(Jentsch et al., 1997). La administración de un antagonista NMDA bloqueaba
completamente el efecto sobre el metabolismo dopaminérgico y parcialmente
sobre el noradrenérgico. En concordancia, los autores observaron que el THC
deteriora la memoria de trabajo en el test de alternancia espacial demorada,
pero no la de referencia en el test de discriminación blanco/negro. Este efecto
se mejoró tras la administración de antagonistas NMDA. Estudios
electrofisiológicos también han observado que el THC aumenta la actividad de
las neuronas dopaminérgicas mesocorticales de manera dosis-dependiente y
que este efecto se revierte tras la aplicación del SR141716A (Diana et al.,
1998). Estos datos sugieren que los deterioros cognitivos inducidos por los
cannabinoides pueden estar relacionados en parte con una hiperactividad de la
transmisión dopaminérgica en la corteza prefrontal.

Estudios realizados con ratones deficientes en el receptor CB1 apoyan la

hipótesis de que, en condiciones fisiológicas, los cannabinoides modulan los
procesos de aprendizaje y memoria. Se ha descrito que estos ratones
presentan un incremento en la LTP a nivel del hipocampo (Bohme et al., 2000),
así como una mejor retención de memoria en un test de reconocimiento de
objetos (Reibaud et al., 1999). Otro estudio realizado con ratones deficientes en
el receptor CB1 ha sugerido que el sistema endocannabinoide juega un papel
facilitador de los procesos de extinción y/o facilitación del olvido de tareas
aprendidas en el test de memoria espacial de la piscina de Morris (Varvel &
Lichtman, 2002). Resultados similares han sido obtenidos en un test de miedo

26
condicionado al ruido, en el que está implicado especialmente otra estructura
cerebral, la amígdala (Marsicano et al., 2002).

Recientemente, se ha descrito un efecto facilitador de los endocannabinoides

en la generación de LTP. Sin embargo, este efecto se observó tan solo en
algunas neuronas sujetas a un fenómeno de DSI (Carlson et al., 2002).

1.1.3.4. Control sobre la temperatura corporal. Los cannabinoides producen

hipotermia de manera dosis-dependiente en la mayoría de las especies
(Pertwee, 1985), efecto que es revertido tras la administración de SR141716A.
Se supone que los efectos hipotérmicos vienen mediados por la regulación de
las vías serotonérgicas centrales. El área preóptica hipotalámica parece ser el
sitio donde los cannabinoides ejercen estos efectos. Así, se ha demostrado que
la administración sistémica de THC disminuye la actividad espontánea y
aumenta la sensibilidad de neuronas primarias termosensibles del área
preóptica (Schmeling & Hosko, 1980; Pertwee, 1983).

1.1.3.5. Efectos endocrinos. La administración aguda de sustancias

cannabinoides altera diferentes sistemas hormonales, incluyendo una inhibición
de la secreción de la hormona de crecimiento, prolactina y hormonas tiroideas
(Rodriguez et al., 1999b; Fernandez-Ruiz et al., 1997). La anandamida es
capaz de inducir la activación de c-fos en neuronas hipotalámicas. También se
ha observado que la administración central de este endocannabinoide provoca
la activación del eje hipotalámico-hipofisario-adrenal (HPA) (Weidenfeld et al.,
1994). Estos efectos parecen estar mediados por receptores cannabinoides
localizados en el hipotálamo o en sus proximidades (Brown & Dobs, 2002) así
como en los lóbulos anterior e intermedio de la hipófisis (Gonzalez et al., 1999).

1.1.3.6. Efectos emocionales. Los cannabinoides producen una respuesta

bifásica, dependiente de la dosis y de las condiciones experimentales, en
animales de laboratorio sometidos a diferentes modelos de ansiedad. Dosis
bajas suelen producir efectos ansiolíticos, mientras que dosis altas producen
efectos ansiogénicos (Onaivi et al., 1990; Rodriguez et al., 1996; Navarro et al.,

27
1993). Las bases neurobiológicas de las respuestas emocionales producidas
por los cannabinoides se desconocen, pero parecen estar mediadas por la
activación de los receptores CB1 presentes en el sistema límbico, así como en
áreas cerebrales involucradas en la respuesta al estrés (Herkenham et al.,
1991b). En este sentido, como ya se ha comentado, los cannabinoides
exógenos y los endocannabinoides pueden producir la liberación de la hormona
liberadora de corticotropina (CRF) y activar el eje HPA (Rodriguez et al., 1991;
Rubio et al., 1995; Weidenfeld et al., 1994). Por otra parte, el bloqueo
farmacológico de los receptores CB1 mediante la administración de
SR141716A produce efectos ansiogénicos en rata (Navarro et al., 1997),
sugiriendo un tono cannabinoide endógeno que regula las respuestas
emocionales. Recientemente, se ha demostrado que evitando la degradación
de anandamida mediante la inhibición de la actividad FAAH se observan
respuestas ansiolíticas en animales de laboratorio (Kathuria et al., 2003).

1.1.3.7. Efectos motivacionales de los cannabinoides. El estudio de las

propiedades motivacionales de los cannabinoides ha generado resultados
controvertidos. Así, diferentes trabajos han sugerido que los cannabinoides no
producen efectos gratificantes en ciertos modelos de autoestimulación eléctrica
(Stark & Dews, 1980) y de autoadministración intravenosa (Harris et al., 1974;
Mansbach et al., 1994) en diferentes especies animales. Asimismo, en el
paradigma de condicionamiento espacial, los cannabinoides han producido en
la mayoría de estudios una aversión de plaza (Parker & Gillies, 1995; Sañudo-
Peña et al., 1997). Sin embargo, los efectos subjetivos más descritos por
humanos que consumen marihuana corresponden a euforia y relajación
(Hollister et al., 1968; Wachtel & de Wit, 2000), aunque efectos opuestos
(ansiedad, disforia, pánico) también han sido descritos (Halikas et al., 1971;
Zuardi et al., 1982).

La dificultad para observar efectos reforzantes de los cannabinoides, y en

particular del THC en animales de experimentación parece ser debida a las
propiedades farmacocinéticas de estas sustancias así como a los efectos
disfóricos que producen la primera exposición a la droga.

28
Sin embargo, dosis bajas de THC facilitaron los efectos gratificantes de la
autoestimulación eléctrica cerebral (Gardner et al., 1988). Este efecto fue
revertido mediante la administración del antagonista CB1, SR141716A. Por otra
parte, se ha descrito recientemente que el THC es capaz de producir efectos
reforzantes en ratones en el test de condicionamiento espacial evitando los
efectos disfóricos de la primera administración de la droga (Valjent &
Maldonado, 2000). Igualmente ha sido demostrada una conducta de
autoadministración de THC en monos con dosis mucho menores que las
utilizadas en estudios anteriores y tras un aprendizaje de autoadministración de
cocaína (Tanda et al., 2000). También se han descrito conductas de
autoadministración intravenosa de otras sustancias cannabinoides como el
WIN55212 (Fattore et al., 2001; Martellotta et al., 1998), el CP55940 y el HU-
210 (Navarro et al., 2001), así como la autoadministración intracerebral y la
preferencia de plaza al CP55940 (Braida et al., 2001a).

A nivel bioquímico, se ha demostrado que los cannabinoides tienen la

capacidad de activar el sistema mesolímbico dopaminérgico (Chen et al.,
1990b; Tanda et al., 1997). La activación de este sistema está involucrada en la
aparición de los efectos reforzantes de todas las drogas de abuso. Así, se ha
descrito un incremento en la liberación de dopamina en el núcleo accumbens y
en el área prefrontal tras la administración de diferentes sustancias
cannabinoides (Chen et al., 1990a; Chen et al., 1991). También se ha
observado un incremento en la actividad espontánea de las neuronas
dopaminérgicas del área ventral tegmental tras la administración de THC
(French, 1997).

Hasta este momento se desconocen los mecanismos a través de los cuales los
cannabinoides ejercen sus efectos sobre el sistema dopaminérgico
mesolímbico. Se ha demostrado que los cannabinoides no afectan
directamente la actividad de los terminales axónicos de las neuronas
dopaminérgicas (Szabo et al., 1999), por lo que se ha sugerido que los
cannabinoides controlarían indirectamente la actividad dopaminérgica mediante
la regulación de la liberación de otros neurotransmisores como el GABA y el
glutamato. Así, se ha descrito que receptores CB1 localizados
presinápticamente regulan la liberación de glutamato y GABA en el área ventral

29
tegmental (Schlicker & Kathmann, 2001). Recientemente, se ha sugerido que
los agonistas cannabinoides actuarían a nivel presináptico inhibiendo la
liberación de GABA de los terminales axónicos que inervan el área ventral
tegmental produciendo un incremento en la liberación de dopamina (Szabo et
al., 2002a). Un mecanismo postsináptico adicional también se ha postulado, e
involucraría interacciones directas entre los receptores dopaminérgicos D2 y
cannabinoides CB1 (Giuffrida et al., 1999).

En concordancia con las acciones de los cannabinoides en los circuitos de

recompensa en el cerebro, se ha observado que la exposición repetida a
cannabinoides puede producir una sensibilización de sus efectos locomotores
(Cadoni et al., 2001), como en el caso de otras drogas de abuso.

1.1.3.8. Tolerancia y dependencia física de cannabinoides.

1.1.3.8.1. Tolerancia a los efectos farmacológicos de los cannabinoides. La

administración crónica de cannabinoides produce el desarrollo de un fenómeno
de tolerancia a la mayoría de sus respuestas farmacológicas. Se ha descrito
tolerancia a sus efectos antinociceptivos (Hutcheson et al., 1998),
anticonvulsivantes (Colasanti et al., 1982), hipolocomotores (Davis et al., 1972),
hipotérmicos (Lomax, 1971), hipotensivos (Birmingham, 1973), a los efectos
sobre el comportamiento operante (Lamb et al., 2000) y sobre la liberación de
corticosterona (Pertwee, 1974; Miczek & Dixit, 1980). El desarrollo de la
tolerancia cannabinoide parece ser de naturaleza predominantemente
farmacodinámica. En concreto modificaciones que afectan la expresión, las
características de fijación y la actividad funcional del receptor cannabinoide
parecen desempeñar un papel importante en este desarrollo. Diversos estudios
han descrito que el tratamiento crónico con agonistas cannabinoides disminuye
el número de receptores cannabinoides así como el ARNm que codifica para
este receptor (Rodriguez et al., 1994; Rubino et al., 2000; Rubino et al., 1994;
Romero et al., 1998a). La administración crónica de agonistas cannabinoides
también modifica la expresión y la capacidad de fijación de proteínas G al
receptor CB1. Rubino y colaboradores (1997a) observaron una disminución en
la expresión de diferentes subunidades α de las proteínas G en el cerebro tras

30
la administración crónica de CP55940. Sin embargo, las alteraciones en la
expresión de los genes de estas subunidades no fueron seguidas por ningún
cambio en la cantidad de proteínas. También se ha observado una disminución
de la fijación [35S]GTPγS tras la administración crónica de agonistas
cannabinoides en diferentes estructuras cerebrales (Sim et al., 1996a; Rubino
et al., 2000). Además, una sobreregulación de la vía del AMPc ha sido descrita
tras la administración crónica de THC, reflejada por un incremento en la
síntesis de AMPc y en la actividad PKA en el cerebelo, estriado y corteza
cerebral (Rubino et al., 2000). No obstante, en un estudio anterior, no se
describieron cambios en la actividad AC en preparaciones de membrana de
cerebelo tras un tratamiento crónico con CP55940, a pesar de observarse una
reducción del 50% en el número de sitios de fijación CB1 (Fan et al., 1996).

La duración temporal de los cambios bioquímicos inducidos por una

administración crónica con cannabinoides es corta, en concordancia con la
corta duración del fenómeno de tolerancia cannabinoide (Bass & Martin, 2000).
En este sentido, la mayoría de los cambios inducidos a nivel de la expresión del
ARNm que codifica para los receptores CB1 y las subunidades α de las
proteínas G se revierten tras un corto periodo de tiempo después del cese en el
tratamiento crónico (Rubino et al., 1998).

1.1.3.8.2. Dependencia física de cannabinoides. La presencia de

manifestaciones somáticas de un síndrome de abstinencia espontáneo a THC
no ha sido observada en diferentes especies animales, incluso tras la
administración de dosis muy elevadas de esta sustancia (McMillan et al., 1970;
Dewey et al., 1972; Aceto et al., 2001). En humanos se ha descrito un
síndrome de abstinencia cannabinoide espontáneo, pero esta abstinencia no se
manifiesta con signos somáticos sino únicamente con síntomas subjetivos tales
como ansiedad, irritabilidad y dolor hipogástrico, así como con una disminución
de la ingesta de comida (Jones et al., 1976; Haney et al., 1999b; Haney et al.,
1999a). A pesar de la ausencia de signos somáticos de abstinencia
espontánea, se ha observado que la interrupción de un tratamiento crónico con
THC produce una alteración en la ejecución de una conducta operante
previamente adquirida en monos (Beardsley et al., 1986). Esta alteración ha

31
sido interpretada como la manifestación de una abstinencia espontánea al
THC. Recientemente, Aceto y colaboradores (2001) han descrito un síndrome
de abstinencia espontáneo tras el tratamiento crónico con el potente agonista
cannabinoide WIN55212 (Aceto et al., 2001). La corta vida media del
WIN55212 en comparación con la del THC podría explicar la diferencia
observada entre estos dos cannabinoides.

El descubrimiento de antagonistas selectivos del receptor CB1 ha permitido

profundizar en el estudio de la dependencia física a los cannabinoides. Así,
diversos trabajos han descrito el desencadenamiento de un síndrome de
abstinencia cannabinoide tras la administración aguda de antagonistas como el
SR141716A en diferentes animales de experimentación tratados crónicamente
con THC (Cook et al., 1998; Aceto et al., 1995; Tsou et al., 1995; Lichtman et
al., 1998). El síndrome de abstinencia a cannabinoides en los roedores se
caracteriza por la presencia de signos somáticos y la ausencia de signos
vegetativos. Las manifestaciones somáticas más características son
movimientos de sacudida de perro mojado (“wet dog shakes”), temblor de
patas, temblor corporal, ataxia, ptosis, piloerección, disminución de la actividad
locomotora y masticación (Tsou et al., 1995; Aceto et al., 2001; Hutcheson et
al., 1998; Ledent et al., 1999). Existe una clara implicación de los receptores
CB1 en el desarrollo de las manifestaciones somáticas de la abstinencia
cannabinoide. En este sentido, la administración de SR141716A en ratones
deficientes en el receptor CB1 que habían recibido un tratamiento crónico con
THC no desencadenó ningún signo de abstinencia (Ledent et al., 1999).

El desarrollo de los signos somáticos del síndrome de abstinencia a los

cannabinoides se encuentra asociado a un incremento en la actividad del
enzima AC a nivel del cerebelo. La actividad de este enzima no se vio
modificada en otras áreas cerebrales tales como la corteza frontal, el
hipocampo, el estriado y la sustancia gris periacueductal (Hutcheson et al.,
1998). En concordancia con estas observaciones, la microinyección del
inhibidor de la actividad AC, Rp-8Br-cAMPS en el cerebelo atenúa las
manifestaciones somáticas de la abstinencia cannabinoide (Tzavara et al.,
2000).

32
Durante la abstinencia cannabinoide se ha descrito un incremento en la
liberación de CRF en el núcleo central de la amígdala, que puede estar
involucrado en la manifestación de los efectos ansiogénicos del síndrome de
abstinencia (Rodriguez et al., 1997). También se ha descrito una disminución
en la actividad electrofisiológica de las neuronas dopaminérgicas
mesolímbicas, efecto que podría estar implicado en la manifestación de un
estado disfórico asociado a la abstinencia cannabinoide (Diana et al., 1998).

1.1.4. Interacción de los cannabinoides con otras drogas de abuso.

1.1.4.1. Interacción cannabinoide-opioide. Los sistemas opioide y

cannabinoide comparten una distribución neuroanatómica común, unos
mecanismos de señalización intracelular similares y funciones neurobiológicas
comparables. En efecto, los péptidos opioides, sus receptores y los receptores
CB1 presentan una distribución neuroanatómica similar en diferentes
estructuras cerebrales involucradas en los circuitos de refuerzo y control motor,
como el caudado putamen dorsal, el estriado ventral, el núcleo septal y el
complejo amigdaloide (Herkenham et al., 1991a; Herkenham et al., 1991b;
Matsuda et al., 1993; Delfs et al., 1994; Navarro et al., 1998), así como en
estructuras implicadas en el control del dolor; incluyendo la médula espinal, la
sustancia gris periacueductal y estructuras talámicas (Tsou et al., 1998a;
Hohmann & Herkenham, 1999). Estudios anatómicos también han descrito la
colocalización de ARNm de los receptores opioides μ y CB1 en estructuras
límbicas asociadas con fenómenos de dependencia (Navarro et al., 1998). Los
receptores CB1 y μ también se hallan en poblaciones similares de neuronas
GABAérgicas estriatales (Tsou et al., 1998a; Wang et al., 1999; Hohmann &
Herkenham, 1999), así como en interneuronas de la lamina II del asta dorsal
(Salio et al., 2001). Recientemente, un estudio realizado con técnicas de
microscopía electrónica ha descrito la colocalización de receptores CB1 y μ en
dendritas y cuerpos celulares de las mismas neuronas estriatales (Rodriguez et
al., 2001).

Por otra parte, la activación de los receptores opioides y cannabinoides

producen efectos similares a nivel de diversos mecanismos de señalización

33
intracelular, incluyendo la ruta del AMPc/PKA y de las MAP quinasas, así como
en la permeabilidad iónica de los canales de Ca2+ y K+ (Howlett, 1995; Reisine
et al., 1996). Ambos tipos de drogas comparten propiedades farmacológicas,
tales como hipotermia, inhibición motora y de la movilidad intestinal, sedación,
hipotensión, antinocicepción, adicción y efectos reforzantes.

1.1.4.1.1. Estudios farmacológicos.

1.1.4.1.1.1. Antinocicepción. A nivel espinal, parte de los efectos

antinociceptivos de los cannabinoides parecen estar mediados por la activación
de los receptores opioides κ, mientras que a nivel supraespinal se ha sugerido
que el sistema encefalinérgico podría estar involucrado en dichos efectos
(Reche et al., 1996b; Reche et al., 1996a). Diferentes estudios han demostrado
que los antagonistas opioides, en especial el receptor κ, pueden bloquear los
efectos analgésicos inducidos por cannabinoides (Welch, 1994; Smith et al.,
1994b; Smith et al., 1998; Reche et al., 1996b; Reche et al., 1996a). Así, la
administración intratecal del antagonista específico del receptor opioide κ, nor-
binaltorfimina, disminuye los efectos antinociceptivos de la administración
intratecal de THC (Welch, 1993; Welch et al., 1995). Igualmente, el efecto
antinociceptivo del THC a nivel espinal es atenuado tras la administración de
anticuerpos anti-dinorfina A(1-13) y anti-dinorfina A(1-8) (Pugh, Jr. et al., 1997).
Sin embargo, estudios realizados con animales deficientes en el gen que
codifica para el péptido opioide prodinorfina han encontrado resultados
diferentes. Por ejemplo, Zimmer y colaboradores (2001) observaron una
reducción en los efectos antinociceptivos del THC en el test de inmersión de la
cola, mientras que Gardell y colaboradores (2002) no observaron diferencia en
los efectos antinociceptivos del THC entre genotipos en dicho test. El papel del
sistema encefalinérgico en el control de las respuestas antinociceptivas del
THC también se ha investigado mediante el uso de ratones deficientes en el
gen de la preproencefalina. Estos ratones mostraron una respuesta
antinociceptiva reducida en el test de inmersión de la cola en agua caliente tras
la administración de THC (Valverde et al., 2000). Por otra parte, estudios
realizados con ratones deficientes en los receptores μ, δ o κ han demostrado
que los efectos antinociceptivos de una administración aguda de THC no

34
resultan modificados tras la supresión de un único receptor opioide (Ghozland
et al., 2002).

Diversos estudios han demostrado que los cannabinoides pueden incrementar

los efectos analgésicos de los opioides. Así, los efectos antinociceptivos de la
morfina se ven incrementados tras la administración de THC (Cichewicz et al.,
1999). Por otra parte, se han descrito efectos aditivos y sinérgicos entre
opioides y cannabinoides tras la administración de dosis subefectivas de
ambos compuestos a nivel periférico (Cichewicz et al., 1999; Reche et al.,
1996b; Reche et al., 1996a), intratecal (Pugh, Jr. et al., 1996; Welch, 1993) o
intracerebroventricular (Reche et al., 1996b; Reche et al., 1996a; Welch et al.,
1995). Esto sugiere que el sinergismo entre cannabinoides y opioides se
produce tanto a nivel espinal como supraespinal. Los efectos sinérgicos fueron
antagonizados por SR141716A (Smith et al., 1998), nor-binaltorfimina y
naltrindol (Pugh, Jr. et al., 1996). Sin embargo, estudios recientes realizados en
animales deficientes en el receptor CB1 han demostrado que los efectos
analgésicos de la morfina y de agonistas específicos de los receptores μ, δ y κ,
no están modificados en estos animales, sugiriendo que los receptores CB1 no
participan en las respuestas antinociceptivas agudas de los opioides (Ledent et
al., 1999).

Una tolerancia cruzada entre opioides y cannabinoides a nivel antinociceptivo

también ha sido descrita. Así, la administración sistémica de THC puede
producir tolerancia a los efectos antinociceptivos de la morfina (Hine, 1985;
Thorat & Bhargava, 1994; Martin et al., 1994). Igualmente, un pretratamiento
con morfina produce tolerancia a los efectos antinociceptivos del THC (Thorat &
Bhargava, 1994; Bloom & Dewey, 1978). La tolerancia cruzada entre agonistas
cannabinoides y opioides κ también se ha descrito. Así, la administración
sistémica de THC produce tolerancia a los efectos antinociceptivos producidos
por dinorfinas o por el agonista κ, U-50,488H (Smith et al., 1994b). De manera
similar, la administración crónica de U-50,488H (Smith et al., 1994b) y el
bloqueo de la síntesis de receptores opioides κ mediante oligodeoxinucleótidos
antisentido facilita la tolerancia a los efectos analgésicos de una administración
intratecal de THC (Rowen et al., 1998). Sin embargo, estudios realizados con
anandamida no han descrito tolerancia cruzada con agonistas μ, δ o κ,

35
sugiriendo que el desarrollo de tolerancia a la anandamida podría implicar
mecanismos diferentes a los del THC (Welch, 1997).

Estudios realizados en ratones modificados genéticamente han descrito una

disminución en el desarrollo de la tolerancia a los efectos antinociceptivos del
THC en ratones deficientes en el gen de la preproencefalina (Valverde et al.,
2000). Por otra parte, animales deficientes en el receptores opioides μ, δ o κ no
presentan cambios en la tolerancia a los efectos hipotérmicos y
antinociceptivos del THC (Ghozland et al., 2002).

Finalmente, la tolerancia a los efectos analgésicos de la morfina tampoco

resultó modificada en animales deficientes en el receptor cannabinoide CB1
(Ledent et al., 1999).

1.1.4.1.1.2. Actividad locomotora. Los receptores cannabinoides están

colocalizados con diferentes péptidos y receptores opioides en áreas
cerebrales implicadas en el control motor. Estudios realizados mediante la
técnica de hibridación in situ han descrito la síntesis de receptor CB1 en
neuronas estriatonigrales que contienen dinorfina y sustancia P, y que
partiendo del caudado-putamen inervan la sustancia negra; así como en
neuronas estriatopalidales que contienen encefalinas y que partiendo del
caudado-putamen acaban en el pálido (Hohmann & Herkenham, 2000). Estas
observaciones sugieren un posible papel de los receptores CB1 en la liberación
de péptidos opioides endógenos en el sistema motor.

Diferentes estudios han descrito interacciones entre ambos sistemas a nivel

locomotor. Así, la administración de THC potencia los efectos hiperlocomotores
de la morfina de manera dosis dependiente (Ayhan et al., 1979). También se ha
observado que el bloqueo de los receptores CB1 con SR141716A disminuye la
hiperactividad producida por morfina (Poncelet et al., 1999). Por otra parte, la
naloxona puede invertir parcialmente la depresión motora inducida por una
administración aguda de THC (Tulunay et al., 1982).

En animales tolerantes a la morfina, el efecto potenciador del THC en la

hiperlocomoción desaparece, indicando un fenómeno de tolerancia cruzada
(Ulku et al., 1980). Igualmente, el pretratamiento crónico con THC o WIN55212

36
produce un incremento de los efectos locomotores de la heroína (Lamarque et
al., 2001; Pontieri et al., 2001a).

Estudios realizados con ratones deficientes en los receptores μ, δ o κ han

demostrado que la inactivación de un único receptor opioide no modifica el
efecto hipolocomotor producido por la administración aguda de THC. Tras un
tratamiento crónico con THC, únicamente los animales deficientes en el
receptor κ presentan una ligera disminución del desarrollo de la tolerancia a
dichos efectos hipolocomotores del THC (Ghozland et al., 2002).

1.1.4.1.1.3. Propiedades reforzantes y dependencia. Se ha

demostrado la existencia de interacciones bidireccionales en los fenómenos de
refuerzo y dependencia inducidos por cannabinoides y opioides.

Los efectos reforzantes de los cannabinoides están modulados por el sistema

opioide. En este sentido, la administración de naloxona bloquea la facilitación
de la conducta de autoestimulación eléctrica intracraneal inducida por el THC
(Gardner & Lowinson, 1991; Gardner & Vorel, 1998), así como la
autoadministración de WIN55212 o HU-210 (Fattore et al., 2001; Navarro et al.,
2001). La naloxona también es capaz de bloquear la autoadministración
intracerebroventricular (Braida et al., 2001b) y la preferencia de plaza
condicionada al CP55940 (Braida et al., 2001a). En concordancia con estos
resultados, Ghozland y colaboradores (2002) han demostrado que el receptor
opioide μ es necesario para la manifestación de las propiedades reforzantes del
THC en el paradigma del condicionamiento espacial. Los efectos aversivos
producidos por la administración aguda de THC en este paradigma están
mediados por una activación del receptor opioide κ (Ghozland et al., 2002). En
concordancia, ratones deficientes en el gen de la prodinorfina tampoco
presentan una aversión de plaza tras la administración aguda de THC (Zimmer
et al., 2001).

Diferentes estudios bioquímicos y farmacológicos avalan esta participación del

sistema opioide endógeno. Así, el THC es capaz de activar el sistema
dopaminérgico mesolímbico mediante un mecanismo dependiente de los
receptores opioides μ (Tanda et al., 1997). Sin embargo, otro estudio ha

37
demostrado que el THC incrementa de manera dosis dependiente la actividad
dopaminérgica mesolímbica, sin que dicho efecto sea modificado tras la
administración de naloxona (French, 1997). Esto sugiere la existencia de
diferentes mecanismos reguladores de la acción de los cannabinoides en los
cuerpos celulares y en los terminales axónicos en estas neuronas
dopaminérgicas.

El papel del sistema cannabinoide como mediador de los efectos reforzantes

de los opioides también ha sido estudiado. Se ha descrito que el bloqueo del
receptor CB1 puede reducir la autoadministación intracerebroventricular de
heroína (Braida et al., 2001b). Por otra parte, el antagonista cannabinoide
SR141716A reduce la conducta de autoadministración intravenosa de heroína
en animales sometidos a un régimen capaz de generar un proceso de
dependencia física al opiáceo, pero no en un modelo de autoadministración
limitada que no produce dependencia. La administración de SR141716A
también bloqueó los efectos reforzantes de la morfina en el test de preferencia
de plaza condicionada en dichas condiciones experimentales (Navarro et al.,
2001). Estudios realizados en ratones deficientes en el receptor CB1
corroboran esta hipótesis, al observarse que estos animales no se
autoadministran morfina (Ledent et al., 1999). Estos resultados sugieren que
los cannabinoides actuando a nivel de los receptores CB1, son necesarios para
la expresión de los efectos reforzantes de los opioides. Por otra parte se ha
descrito recientemente que la administración de agonistas cannabinoides
provoca un fenómeno de recaída en animales que han extinguido un
comportamiento de autoadministración de heroína (De Vries et al., 2003). Un
estudio realizado en humanos observó una asociación entre una variante
genética del receptor CB1 y la susceptibilidad en el abuso de diferentes tipos
de drogas de abuso (Comings et al., 1997).

También se han descrito interacciones bidireccionales entre opioides y

cannabinoides a nivel del desarrollo de fenómenos de dependencia física. Así,
un síndrome de abstinencia ha podido ser precipitado tras la administración de
naloxona en ratas dependientes a HU-210 (Navarro et al., 1998) o THC
(Kaymakcalan et al., 1977). Sin embargo, en otros estudios no se ha descrito el
desarrollo de un proceso de abstinencia en diferentes especies animales

38
dependientes al THC tras la administración de naloxona (Beardsley et al., 1986;
Lichtman et al., 2001). Diferentes trabajos realizados con ratones modificados
genéticamente han permitido avanzar en el conocimiento de estas
interacciones. Así, los ratones deficientes en el gen de la preproencefalina
muestran una disminución en la severidad del síndrome de abstinencia al THC
(Valverde et al., 2000). Por otra parte, el síndrome de abstinencia cannabinoide
no resultó modificado en ratones deficientes en los receptores opioides δ o κ
(Ghozland et al., 2002). Sin embargo, los estudios realizados con ratones
deficientes en el receptor opioide μ han descrito resultados diferentes
dependiendo de las dosis de THC utilizadas para inducir la dependencia. Así,
los animales que recibieron THC a la dosis de 20 mg/kg dos veces al día o 10
mg/kg una vez al día durante un periodo de 5 días no mostraron una
modificación en las manifestaciones de la abstinencia (Ghozland et al., 2002;
Lichtman et al., 2001). Sin embargo, los ratones deficientes en el receptor
opioide μ tratados crónicamente con dosis más elevadas de THC (30 ó 100
mg/kg una vez al día) mostraron un síndrome de abstinencia menos severo que
los ratones salvajes (Lichtman et al., 2001). Por otra parte, ratones doble
mutantes deficientes en los receptores opioides μ y δ mostraron una
disminución importante en la severidad del síndrome de abstinencia
cannabinoide, sugiriendo que una estimulación conjunta de ambos tipos de
receptores es requerida para la manifestación de la abstinencia cannabinoide
(Castañe et al., 2003).

Los cannabinoides también modulan los fenómenos de dependencia a

opiáceos. Así, se ha descrito que la administración aguda de SR141716A
desencadena una aversión de plaza condicionada y una disminución en el
número de respuestas operantes para obtener comida en animales
dependientes de morfina (Navarro et al., 2001). El bloqueo de los receptores
CB1 también produce diferentes manifestaciones bioquímicas y conductuales
de abstinencia en animales dependientes a la morfina (Navarro et al., 1998).
Por otra parte, se ha observado que la administración de THC alivia el
síndrome de abstinencia desencadenado por naloxona en animales
dependientes de morfina (Bhargava, 1976; Bhargava, 1978; Valverde et al.,
2001; Lichtman et al., 2001). Efectos similares se han descrito con el

39
cannabinoide endógeno anandamida (Vela et al., 1995). Una disminución en el
síndrome de abstinencia morfínico fue asimismo observada en ratones
knockout deficientes en el receptor cannabinoide CB1 (Ledent et al., 1999).

1.1.4.1.1.4. Ansiedad. Una interacción entre los sistemas opioides y

cannabinoides a nivel de las respuestas emocionales ha sido observada en
modelos animales de ansiedad. Así, los antagonistas de los receptores
opioides μ y δ, pero no los antagonistas κ suprimen los efectos ansiolíticos
producidos por la administración de una dosis baja de THC (Berrendero &
Maldonado, 2002). También se ha descrito que los antagonistas de los
receptores κ son capaces de suprimir los efectos ansiogénicos inducidos por el
CP55940 en la rata (Marin et al., 2003).

1.1.4.1.2. Mecanismos bioquímicos involucrados en las interacciones

cannabinoide-opioide. Diferentes hipótesis se han formulado para explicar los
mecanismos bioquímicos de estas interacciones. Sin embargo dichos
mecanismos posiblemente difieran dependiendo de la respuesta farmacológica
estudiada.

1.1.4.1.2.1. Modificaciones en los receptores y ligandos endógenos.

Una de las hipótesis que se baraja es el posible papel del sistema
cannabinoide como modulador de la síntesis y liberación de péptidos opioides
endógenos y de la expresión de receptores opioides. Así, el tratamiento agudo
con THC incrementa la liberación de met-encefalina en el núcleo accumbens,
medida mediante la técnica de microdiálisis in vivo (Valverde et al., 2001). Por
otra parte, la administración crónica de THC incrementa la expresión del gen de
la proopiomelanocortina en el núcleo arcuado del hipotálamo (Corchero et al.,
1997b), y de los genes de la prodinorfina y de la preproencefalina a nivel
espinal (Corchero et al., 1997a). El tratamiento crónico con cannabinoides
también incrementa los niveles de ARNm de la preproencefalina en los núcleos
ventromedial y paraventricular del hipotálamo, en la sustancia gris
periacueductal, el núcleo mamilar, el núcleo accumbens, el caudado-putamen y

40
el estriado (Manzanares et al., 1998; Corchero et al., 1999a; Corchero et al.,
1999b), así como los niveles de met-encefalina y β-endorfina en
homogenizados del área preóptica y del hipotálamo medio-basal (Kumar et al.,
1984; Kumar et al., 1986).

Por otra parte, técnicas de cateterización espinal han permitido observar que el
THC incrementa la liberación de dinorfina A y B en la médula espinal (Pugh, Jr.
et al., 1997; Houser et al., 2000).

Diversos trabajos han evaluado el posible papel regulador del sistema opioide
sobre la expresión del receptor CB1 en el cerebro. Los resultados de estos
trabajos han sido en gran parte contradictorios, ya que se han descrito
aumentos (Rubino et al., 1997b), ausencia de cambios (Romero et al., 1998b) o
efectos diferentes según el área en la cual se han medido la unión de ligandos
selectivos del receptor CB1 o su ARNm (Navarro et al., 2001; Gonzalez et al.,
2002b).

1.1.4.1.2.2. Interacción a nivel de los mecanismos de transducción de

señal. Diferentes estudios han demostrado que el tratamiento crónico con
morfina o cannabinoides disminuye la eficiencia de los receptores para activar
el sistema proteína Gi/AC (Nestler, 1992; Nestler & Aghajanian, 1997; Sim et
al., 1996a) y produce una sobreregulación en la actividad de las proteínas
quinasas dependientes de AMPc para contrarrestar la inhibición inducida por la
droga (Blendy & Maldonado, 1998; Hutcheson et al., 1998; Koob et al., 1998).
El tratamiento crónico con estas drogas puede afectar de manera heteróloga la
eficiencia de activación por otros receptores también acoplados a proteínas Gi
o Go. Así, se ha observado una disminución de los niveles de fijación de
[35S]GTPγS en la sustancia negra en condiciones basales en animales
dependientes a la morfina. Sin embargo, la fijación aumentó en esta estructura
tras la estimulación con WIN55212 (Romero et al., 1998b). Estos datos
sugieren que la morfina incrementa la eficiencia del acoplamiento de los
receptores cannabinoides a las proteínas G en la sustancia negra. Resultados
similares se observaron en la sustancia gris periacueductal de ratones
dependientes de morfina (Romero et al., 1998b).

41
Mediante el uso de una línea celular de neuroblastoma, se ha demostrado que
el tratamiento conjunto con un agonista opioide y cannabinoide produce una
estimulación de la unión de [35S]GTPγS similar a la suma de los efectos de
cada uno de ellos por separado (Shapira et al., 1998). Este efecto aditivo fue
observado incluso tras la ablación parcial del reservorio de proteínas G,
sugiriendo que los opioides y los cannabinoides activan diferentes “pools” de
proteínas G.

La interacción entre opioides y cannabinoides también se ha estudiado a nivel

de los efectos sobre la actividad AC en cultivos de células de neuroblastoma.
Así, los opioides y los cannabinoides inhiben la actividad AC en estas células.
El efecto inhibidor de los opioides se bloquea por la naloxona, pero ésta no
afectó la respuesta cannabimimética. La interacción entre cannabinoide y
opioide en este estudio no fue ni sinérgica ni aditiva en las máximas
concentraciones, sugiriendo que ambos tipos de drogas pueden operar a través
de un mismo sistema efector (Devane et al., 1986).

1.1.4.1.2.3. Interacción física entre los receptores opioides y

cannabinoides. Se ha demostrado recientemente que los receptores opioides μ,
δ o κ pueden interaccionar físicamente con los receptores cannabinoides CB1,
produciendo una modificación de su actividad. Así, la capacidad de unión del
[35S]GTPγS al receptor CB1 tras la administración de WIN55212 está
modificada de manera dosis dependiente por agonistas o antagonistas κ.
Igualmente, la unión de [35S]GTPγS mediada por WIN55212 disminuye tras la
administración del agonista opioide μ, DAMGO (Rios et al., 2002). La
observación de que los receptores opioides μ y CB1 colocalizan en la misma
neurona (Rodriguez et al., 2001) apoya esta hipótesis.

1.1.4.2. Interacción cannabinoide-cocaína. Se ha observado que el agonista

cannabinoide WIN55212 disminuye la conducta de autoadministración de
cocaína en ratas (Fattore et al., 1999). Este efecto es revertido tras la
administración de SR141716A. Sin embargo, los ratones deficientes en el
receptor CB1 se autoadministran cocaína en cantidades similares a los

42
animales salvajes (Cossu et al., 2001). Estudios bioquímicos han descrito que
el tratamiento crónico con cocaína disminuye la expresión del ARNm que
codifica para el receptor CB1, pero no el número de sitios de fijación selectivos
CB1 en el hipotálamo ventromedial y corteza cerebral (Gonzalez et al., 2002b).
Igualmente, un tratamiento crónico con cocaína no modificó los niveles de
anandamida en las diferentes estructuras cerebrales estudiadas, observándose
tan solo una pequeña disminución en la concentración de 2-AG en el sistema
(Gonzalez et al., 2002a).

El sistema cannabinoide parece estar involucrado en el fenómeno de recaída a

la cocaína (De Vries et al., 2001). Así, la administración de HU-210 provoca un
fenómeno de recaída en animales que han extinguido un comportamiento de
autoadministración de cocaína. Este efecto, así como la recaída inducida por la
administración de cocaína o por estímulos asociados con dicha administración,
es revertido tras la administración de SR141716A. Sin embargo, el SR141716A
no fue capaz de inhibir esta recaída cuando era inducida por una situación
estresante. Dos hipótesis han sido propuestas para explicar este fenómeno
basándose en la conexión entre la dopamina y los endocannabinoides. En un
primer modelo, el incremento en los niveles de dopamina producidos por la
cocaína o por estímulos asociados con sus efectos reforzantes producirían la
liberación de endocannabinoides, que causarían la recaída. En concordancia
con esta hipótesis, Giuffrida y colaboradores (1999) han descrito que la
dopamina produce la liberación de anandamida en el estriado dorsal por un
mecanismo dependiente de la activación de receptores D2 (Giuffrida et al.,
1999). Una explicación alternativa sugiere que la cocaína o los estímulos
asociados con su consumo elevaría los niveles de endocannabinoides, los
cuales producirían un fenómeno de recaída a través de una estimulación de la
liberación de dopamina. A favor de esta última hipótesis está el hecho de que
los receptores CB1 se expresan en un número elevado en neuronas
GABAérgicas. La inhibición de la liberación de GABA facilitaría indirectamente
la liberación de dopamina (Katona et al., 1999).

1.1.4.3. Interacción cannabinoide-anfetamina. La administración aguda de

agonistas cannabinoides produce una disminución en la actividad locomotora

43
inducida por d-anfetamina (Gorriti et al., 1999; Muschamp & Siviy, 2002). En
concordancia con estos resultados, el SR141716A facilita la hiperactividad
locomotora producida por este psicostimulante (Masserano et al., 1999). Por lo
contrario, el tratamiento crónico con agonistas cannabinoides da lugar a una
sensibilización de los efectos locomotores y conductas estereotipadas
inducidos por la d-anfetamina (Gorriti et al., 1999; Lamarque et al., 2001).

1.1.4.4. Interacción cannabinoide-MDMA. El sistema cannabinoide endógeno

parece estar involucrado en la expresión de las propiedades reforzantes del
MDMA (Braida & Sala, 2002). Así, el agonista cannabinoide CP55940 reduce la
autoadministración intracerebroventricular de MDMA, mientras que el
antagonista CB1, SR141716A facilita dicha conducta. Estos resultados
sugieren que la estimulación de los receptores CB1 tiene una acción sinérgica
con los efectos motivacionales inducidos por el MDMA.

1.1.4.5. Interacción cannabinoide-etanol. La administración del antagonista

cannabinoide SR141716A reduce el consumo voluntario de etanol en roedores,
mientras que los agonistas CP55940 o WIN55212 promueven dicho consumo a
través de un mecanismo dependiente del sistema opioide. Dichos resultados
sugieren que el sistema cannabinoide participa en los efectos reforzantes del
etanol (Wang et al., 2003; Rodriguez et al., 1999a; Freedland et al., 2001;
Colombo et al., 2002). Por otra parte, la funcionalidad del sistema cannabinoide
endógeno se encuentra reducida en ratones DBA/2, los cuales presentan una
baja preferencia por el consumo de etanol (Hungund & Basavarajappa, 2000).
En un estudio reciente, se ha descrito que los ratones deficientes en el receptor
cannabinoide CB1 presentan una clara disminución en el consumo voluntario
de etanol (Wang et al., 2003; Hungund et al., 2003) y una disminución en la
liberación de dopamina a nivel del núcleo accumbens inducida por esta
sustancia (Hungund et al., 2003). En acuerdo con estos resultados, ha sido
descrita una reducción en la liberación de dopamina inducida por etanol tras la
administración de SR141716A (Cohen et al., 2002). También se ha descrito
una ausencia completa del síndrome de abstinencia al etanol en ratones
deficientes en el receptor CB1, aunque no se modificaron en dichos animales

44
los efectos agudos ni la tolerancia y preferencia inducidos por esta sustancia
(Racz et al., 2003).

A nivel bioquímico se ha demostrado que el tratamiento crónico con etanol no

produce cambios en los niveles de ARNm del receptor CB1 ni en los sitios de
unión de 3H-CP55940 en el cerebro (Gonzalez et al., 2002a). Sin embargo, otro
estudio demostró una disminución en el ARNm y en la capacidad de unión de
[35S]GTPγS después de una exposición crónica a etanol (Basavarajappa &
Hungund, 1999). Una disminución en los niveles de anandamida y 2-AG en el
mesencéfalo, así como un incremento en la concentración de anandamida en
el sistema límbico, ha sido igualmente descrita tras la administración crónica de
etanol (Gonzalez et al., 2002a).

1.1.4.6. Interacción cannabinoide-nicotina: Diversas acciones farmacológicas

inducidas por los cannabinoides resultan facilitadas tras la administración de
nicotina (Valjent et al., 2002). La nicotina incrementa los efectos hipotérmicos,
hipolocomotores y antinociceptivos producidos por una administración aguda
de THC. Asimismo, la administración conjunta de dosis subefectivas de THC y
nicotina produce una respuesta ansiolítica así como una preferencia de plaza
condicionada. Por otra parte, el cotratamiento con nicotina y THC produjo una
disminución en la tolerancia al THC y un incremento en la expresión somática
del síndrome de abstinencia cannabinoide (Valjent et al., 2002).

Las acciones farmacológicas de la nicotina también resultan moduladas por el

sistema cannabinoide endógeno (Castane et al., 2002). Así, la nicotina produce
un efecto antinociceptivo mayor en los ratones deficientes en el receptor
cannabinoide CB1, pero sus efectos reforzantes disminuyen. La
hipolocomoción y la dependencia física de nicotina no están modificadas en
estos ratones (Castane et al., 2002). Por otra parte, el SR141716A reduce la
conducta de autoadministración de nicotina en ratas, así como la liberación de
dopamina inducida por nicotina en el núcleo accumbens (Cohen et al., 2002).

Estudios bioquímicos han demostrado que el tratamiento crónico con nicotina

incrementa los niveles de anandamida en el sistema límbico y los disminuye en
el hipocampo, estriado y corteza cerebral. Sin embargo, la administración

45
crónica de nicotina no modificó la expresión del receptor CB1 ni los sitios de
unión del 3H-CP55940 (Gonzalez et al., 2002a). La interacción funcional entre
estas drogas también ha sido demostrada en estudios de expresión de c-fos.
La administración conjunta de THC y nicotina incrementó la expresión de c-fos
en el núcleo accumbens, el núcleo central y basolateral de la amígdala, el
núcleo del lecho de la estría terminal y en el núcleo paraventricular del
hipotálamo (Valjent et al., 2002).

46
2. El sistema del péptido PACAP

La hipófisis o glándula pituitaria se encuentra localizada en la base del cerebro

y está unida al hipotálamo mediante un conjunto de fibras nerviosas. Desde un
punto de vista fisiológico, la hipófisis está dividida en tres secciones
denominadas lóbulo anterior o adenohipófisis, lóbulo posterior o neurohipófisis
y lóbulo intermedio o pars intermedia. Esté último lóbulo es prácticamente
inexistente en el hombre, pero no en algunas especies inferiores como la rata y
el ratón. Cada lóbulo de la glándula hipofisaria produce ciertas hormonas. Las
más importantes sintetizadas por la adenohipófisis incluyen la hormona de
crecimiento, la prolactina, la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), la hormona
estimulante de la tiroides (TSH), la hormona folículo-estimulante (FSH) y la
hormona luteinizante (LH). El lóbulo intermedio produce la hormona estimulante
de melanocitos. Finalmente, el lóbulo posterior produce la vasopresina u
hormona antidiurética y la oxitocina.

La actividad hipofisaria está controlada mayoritariamente por señales

hormonales y nerviosas procedentes del hipotálamo. Así, señales nerviosas
que parten del hipotálamo controlan la secreción de la neurohipófisis, mientras
que la actividad de la adenohipófisis está controlada por hormonas sintetizadas
en el hipotálamo, denominadas hormonas hipofisiotrópicas. Estas hormonas
son liberadas por el hipotálamo en la eminencia media y llegan a la
adenohipófisis a través de un conjunto de capilares sanguíneos denominado
sistema portal hipofisario. Diferentes neuropéptidos han sido aislados de
extractos hipotalámicos y han sido caracterizados por su capacidad para
estimular o inhibir la secreción de hormonas de la pituitaria anterior. Entre estos
se incluyen la hormona de liberadora de tirotropina (TRH) que produce la
liberación de la TSH (Boler et al., 1969), la hormona liberadora de la
gonadotropina (GnRH) que produce la liberación de LH y FSH (Amoss et al.,
1971; Matsuo et al., 1971), la somatostatina que inhibe la liberación de la
hormona de crecimiento (Brazeau et al., 1973), CRF que produce la liberación
de ACTH (Vale et al., 1981) y la hormona liberadora de la hormona de
crecimiento (GRF) (Guillemin et al., 1982). La vasopresina y la dopamina
también se incluyen como hormonas hipofisiotrópicas ya que la vasopresina
aumenta la secreción de ACTH inducida por el CRF, y la dopamina controla la

47
secreción de la prolactina (MacLeod et al., 1970). Estudios posteriores han
descrito la presencia de otros neuropéptidos con capacidad reguladora de la
actividad de las células de la pituitaria anterior, como por ejemplo el péptido
liberador de prolactina (Hinuma et al., 1998).

Sin embargo, diversos estudios sugerían la existencia de otras sustancias con

capacidad moduladora de la actividad adenohipofisaria. En este sentido, se ha
apuntado la existencia de otros tipos celulares en la pituitaria anterior no
identificados (Sbarbati et al., 1988), así como de otras sustancias con
capacidad para liberar prolactina y FSH diferentes de las conocidas (Nagy et
al., 1988; Lumpkin et al., 1987). Esto llevó al grupo de Arimura a aislar en 1989
un péptido de 38 AA con capacidad estimuladora de la AC en la hipófisis que
denominaron PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide)
(Miyata et al., 1989).

Existen unos criterios clásicos para definir a una sustancia como factor
hipofisiotrópico. Estos son: 1) presencia en las neuronas hipotalámicas que
proyectan a la eminencia media, 2) liberación en el sistema circulatorio portal
hipofisario, 3) presencia de receptores para la sustancia a nivel
adenohipofisario, 4) capacidad de la sustancia de regular la actividad de las
células de la adenohipófisis, 5) demostrar que el bloqueo de la acción de la
sustancia altera la función de la pituitaria anterior y 6) existencia de una
modulación en la liberación de este factor dentro del sistema portal en
diferentes condiciones fisiológicas. Hasta el momento se ha demostrado que el
PACAP satisface los 4 primeros criterios. Así, se ha descrito la presencia de
PACAP a nivel parvocelular, aunque en menor cantidad que en el sistema
magnocelular (Takahashi et al., 1994; Hannibal et al., 1995). También se ha
observado una red de fibras que contienen PACAP a nivel de la eminencia
media, en contacto con el sistema circulatorio portal hipofisario (Koves et al.,
1990; Vigh et al., 1991). Igualmente, la concentración de este péptido es mucho
mayor en el sistema portal hipofisario que en la circulación sanguínea periférica
(Dow et al., 1994).

Este péptido es único en comparación con otros neuropéptidos

hipofisiotrópicos, ya que todos los tipos celulares de la adenohipófisis con
función endocrina poseen receptores para el PACAP (Vigh et al., 1993;

48
Rawlings & Hezareh, 1996). Una de las características más importantes de
este péptido a nivel hipofisario, es su capacidad para estimular la formación de
AMPc (Miyata et al., 1989) así como la movilización de Ca2+ en todas las
células endocrinas (Canny et al., 1992; Rawlings & Hezareh, 1996).

Como otras hormonas hipofisiotrópicas también se ha observado la presencia

de PACAP en neuronas extra-hipotalámicas además de en numerosos tejidos
periféricos. En acuerdo con su amplia distribución, el PACAP ejerce un amplio
abanico de efectos.

2.1. Características del péptido PACAP. El PACAP es un péptido que

presenta dos formas α-amidadas biológicamente activas, denominadas
PACAP38 y PACAP27 (Miyata et al., 1989; Miyata et al., 1990). Ambas
provienen de un precursor común, y las dos comparten los últimos 27 AA de la
fracción N-terminal (Miyata et al., 1990; Kimura et al., 1990; Ogi et al., 1990). El
PACAP27 es un péptido que se halla muy conservado a través de la evolución,
de tal forma que especies tan alejadas como los tunicados presentan una
homología del 85% con el PACAP27 de mamíferos, el cual es igual en todos
los mamíferos. Estructuras similares al péptido PACAP se han descrito hasta
en insectos como la mosca Drosofila melanogaster (Feany & Quinn, 1995).

La secuencia del PACAP27 presenta una homología del 68% con el péptido
vasoactivo intestinal (VIP), identificando al PACAP como miembro de la familia
de péptidos relacionados con el VIP-glucagón-GRF-secretina (Campbell &
Scanes, 1992; Goldring et al., 1993).

La estructura bidimensional del PACAP27 consta de una zona de estructura

desordenada en la parte N-terminal, seguida de un giro β y tres regiones
helicoidales (Inooka et al., 1992). La estructura del PACAP38 es idéntica a la
del PACAP27 en la zona N-terminal, pero en la región C-terminal posee una
pequeña hélice extra (Wray et al., 1993). La estructura tridimensional del
PACAP es similar a la de otros miembros de la familia del VIP-glucagón (Wray
et al., 1993).

49
2.1.1. Características del gen que codifica el péptido PACAP. La organización
estructural del gen PACAP es similar a la del VIP y el GRF, sugiriendo un
posible origen de los tres genes a partir de un ancestro común mediante
duplicación génica (Ohkubo et al., 1992). El gen que codifica al péptido PACAP
ha sido clonado en diferentes especies como el humano (Hosoya et al., 1992) y
el ratón (Yamamoto et al., 1998). En humanos, el gen se halla localizado en el
cromosoma 18, en la banda 18p11 (Hosoya et al., 1992) y consta de 5 exones.
Parte del segundo exón codifica para el péptido de señalización de 24 AA. La
secuencia que codifica para el péptido PACAP está localizada en el quinto
exón. El promotor del gen contiene dos secuencias CRE (cAMP response
element) que median la activación transcripcional en respuesta a la activación
de la vía del AMPc/PKA, una secuencia TRE (12-O-tetradecanoylphorbol 13-
acetate response element) que depende de la activación de la vía de la
proteína quinasa C y dos secuencias GHF-1 (growth hormone factor 1),
involucradas en la expresión del gen de la hormona de crecimiento. Sin
embargo no posee las secuencias promotoras TATA o CAAT que permiten la
unión de factores de transcripción (Hosoya et al., 1992; Arimura & Shioda,
1995; Shioda, 2000). Diferentes estudios han demostrado que la trascripción
del gen PACAP es constitutiva y que puede estimularse mediante AMPc, 12-O-
tetradecanoilforbol 13-acetato y por el mismo PACAP (Suzuki et al., 1994;
Hashimoto et al., 2000).

El ADNc del precursor del péptido PACAP se ha caracterizado en diferentes

especies (Ogi et al., 1990; Ohkubo et al., 1992; Arimura & Shioda, 1995;
Okazaki et al., 1995). Este codifica un precursor de la proteína de 175 o 176 AA
dependiendo de la especie y que se ha denominado prepro-PACAP (Arimura,
1998). Los primeros 24 AA de la zona N-terminal del prepro-PACAP
constituyen un péptido de señalización (Hosoya et al., 1992). En el precursor
del PACAP de humanos (Ohkubo et al., 1992), oveja (Kimura et al., 1990), rata
(Ogi et al., 1990) y ratón (Okazaki et al., 1995) se ha descrito también la
presencia de un pequeño péptido de 29 AA que presenta una ligera homología
estructural con el PACAP27 y que se ha denominado PRP (PACAP-related
peptide). Por el momento se desconoce el papel fisiológico del PRP, aunque
parece jugar un papel en la regulación de la motilidad de la vesícula biliar,

50
similar al del PACAP (Wray et al., 1995). El péptido PACAP se halla localizado
en la parte C-terminal del precursor, entre los AA 132 y 169.

La generación del PRP, PACAP38 y PACAP27 se produce mediante diferentes

roturas proteolíticas en secuencias peptídicas específicas. Se ha descrito la
actividad de varias prohormonas convertasas (PC) implicadas en este
fenómeno (Seidah et al., 1994; Seidah et al., 1998). En concreto, las
prohormonas convertasas PC1 y PC2 parecen estar involucradas en el
procesamiento del precursor a nivel cerebral (Koves et al., 1994; Dong et al.,
1997; Li et al., 1999), mientras que en los testículos la isoforma implicada es la
PC4 (Li et al., 1998). Igualmente se requiere de la actividad amidasa de la
enzima peptidylglycine α-amidating monooxygenase para producir la forma
activa del péptido (Hansel et al., 2001).

2.1.2. Distribución del péptido PACAP.

2.1.2.1. Sistema Nervioso Central. El péptido PACAP se encuentra

ampliamente expresado a nivel del SNC, tanto en neuronas (Koves et al.,
1990;Koves et al., 1991) como en células gliales (Jaworski, 2000). A nivel
central, la forma predominante del neuropéptido es la de 38 AA, y únicamente
un 10% corresponde a la forma de 27 AA (Arimura et al., 1991; Ghatei et al.,
1993). La mayor concentración de PACAP se observa en el área hipotalámica
(Arimura et al., 1991; Hannibal, 2002). Se ha descrito la presencia de PACAP
en casi todos los núcleos hipotalámicos, pero sobre todo a nivel del núcleo
supraquiasmático (Masuo et al., 1993; Hannibal, 2002), paraventricular y
supraóptico (Koves et al., 1991; Kivipelto et al., 1992).

A nivel extrahipotalámico, se han descrito cantidades significativas de PACAP

en la sustancia negra, el globo pálido, el sistema límbico, la hipófisis posterior,
el hipocampo, el cerebelo, la corteza cerebral, el tronco cerebral, la hipófisis y
la médula espinal (Ghatei et al., 1993; Masuo et al., 1993; Arimura, 1998;
Hannibal, 2002).

A nivel hipofisario (Arimura & Shioda, 1995; Rawlings & Hezareh, 1996;
Arimura, 1998), el PACAP se expresa en fibras nerviosas (Mikkelsen et al.,
1995) así como en una subpoblación de células gonadotropas en el área

51
anterior (Koves et al., 1998; Szabo et al., 2002b) y en la parte ventral del lóbulo
neural (Mikkelsen et al., 1995). En el sistema límbico, el PACAP ha sido
detectado en el complejo amigdalar principalmente en el núcleo central de la
amígdala y en el núcleo del lecho de la estría terminal, así como en el tálamo y
núcleo accumbens (Koves et al., 1991; Masuo et al., 1993; Palkovits et al.,
1995; Hannibal, 2002). A nivel cerebelar, se ha detectado la presencia de
péptido a nivel del soma y las dendritas de las células de Purkinje (Nielsen et
al., 1998; Hannibal, 2002). En el hipocampo, técnicas de inmunohistoquímica
han demostrado la presencia de PACAP en células piramidales de las regiones
CA1, CA2 y CA3 (Hannibal, 2002). El PACAP también es abundante en el
tronco cerebral, tanto a nivel del tracto solitario como del núcleo ambiguo y el
núcleo caudal del rafe (Palkovits et al., 1995).

A nivel de la medula espinal se han detectado fibras nerviosas que contienen

PACAP sobretodo en las láminas I y II del asta dorsal (Dun et al., 1996; Moller
et al., 1993), un área importante en la transmisión de la información nociceptiva
(Cervero & Iggo, 1980). La expresión del ARNm del VIP y del PACAP se
localiza principalmente en neuronas de diámetro medio o pequeño en los
ganglios de la raíz dorsal asociadas con la transmisión del estímulo doloroso
(Dun et al., 1996).

Se ha observado que la distribución de los péptidos PACAP y VIP es diferente

en distintas áreas del SNC (Masuo et al., 1993), tales como el tálamo, tronco
cerebral, núcleo del lecho de la estría terminal e hipotálamo (Koves et al., 1991;
Kozicz et al., 1997).

2.1.2.2. Tejidos periféricos. Al igual que en el SNC, la forma predominante del

péptido PACAP en los órganos periféricos es la de 38 AA, aunque la proporción
entre ambas varía según el órgano (Arimura et al., 1991). Por ejemplo, a nivel
del colon, el PACAP27 representa un 30% del total, pero en los testículos es
prácticamente inexistente (Arimura et al., 1991). Se supone que las diferentes
proporciones de ambas formas depende de la actividad PC en los diferentes
tejidos. A diferencia del sistema nervioso central, en los órganos periféricos los
péptidos PACAP y VIP se coexpresan a menudo en las mismas células,

52
incluido en el tejido nervioso periférico (Uddman et al., 1991a; Ny et al., 1995;
Sundler et al., 1992; Luts & Sundler, 1994).

2.1.2.2.1. Glándulas endocrinas. La presencia del péptido PACAP así como

del ARNm que lo codifica se ha descrito en la mayoría de las glándulas
endocrinas de diferentes especies. Así, la inmunoreactividad al PACAP se ha
descrito en las gónadas (Shioda et al., 1994), adrenal (Arimura et al., 1991),
paratiroides (Luts & Sundler, 1994) y páncreas endocrino (Arimura & Shioda,
1995; Love & Szebeni, 1999).

En la rata, la mayor cantidad de PACAP se halla en los testículos, en una

concentración mayor incluso que en el cerebro (Arimura et al., 1991). Estudios
de hibridación in situ han demostrado la presencia del precursor en las células
germinales (McArdle, 1994; Shioda et al., 1994; Hannibal & Fahrenkrug, 1995).
En los ovarios, la concentración es mucho menor que en los testículos, y el
péptido parece estar localizado en terminaciones nerviosas (Steenstrup et al.,
1995) así como en células granulosas de los folículos preovulatorios (Ko et al.,
1999).

La glándula adrenal es uno de los órganos periféricos que presenta una mayor
cantidad de PACAP (Arimura et al., 1991), aunque hay gran variabilidad
dependiendo de las especies (Tabarin et al., 1994). Estudios
inmunohistoquímicos han descrito que el PACAP se halla presente a nivel
medular y que no se coexpresa con el VIP (Tabarin et al., 1994). Su presencia
se ha observado en las células cromafinas (Holgert et al., 1996) así como en
las fibras nerviosas que las rodean (Frodin et al., 1995; Moller & Sundler,
1996).

En la glándula paratiroide, el PACAP se expresa en fibras nerviosas que

inervan la glándula (Luts & Sundler, 1994).

2.1.2.2.2. Sistema digestivo. La presencia de PACAP se ha descrito a nivel

de los ganglios mientéricos del tracto digestivo (Shen et al., 1992; Hannibal et
al., 1998) y en pequeñas arterias y arteriolas que lo irrigan (Arimura et al.,
1991). Una gran cantidad de fibras nerviosas que contienen PACAP se ha

53
observado en el esófago, a nivel de las capas de musculatura lisa circular y
longitudinal (Uddman et al., 1991a; Koves et al., 1993; Olsson & Holmgren,
1994), así como en varias glándulas exocrinas a lo largo del sistema digestivo
(Fridolf et al., 1992; Luts & Sundler, 1994).

2.1.2.2.3. Sistema respiratorio. Se ha descrito la presencia de PACAP en el

sistema respiratorio en diferentes especies (Uddman et al., 1991b), tanto a
nivel del epitelio como alrededor de los vasos sanguíneos, de las glándulas
seromucosas y de los músculos (Moller et al., 1993; Uddman et al., 1991b). El
péptido se ha observado a diferentes niveles desde la laringe y la tráquea hasta
los bronquiolos (Moller et al., 1993; Uddman et al., 1991b).

2.1.2.2.4. Sistema inmunitario. Se ha observado la presencia de PACAP en

varios tejidos linfoides incluyendo el timo y el bazo (Gaytan et al., 1994).

2.2. Receptores del péptido PACAP. Dos tipos de receptores han sido
caracterizados en base a su afinidad por el PACAP y el VIP. El tipo I que se
caracterizó originalmente en la pituitaria anterior y en el hipotálamo utilizando
125
I-PACAP27 como radioligando, presenta una gran afinidad por el PACAP38
y PACAP27 (Kd ≅ 0.5 nM), y una escasa afinidad por el VIP (Kd > 500 nM)
(Cauvin et al., 1990; Gottschall et al., 1990; Gottschall et al., 1991; Suda et al.,
1992). Este receptor se denominó PAC1 y su secuencia nucleotídica fue
clonada en la rata en 1993 por diferentes grupos (Hashimoto et al., 1993;
Morrow et al., 1993; Pisegna & Wank, 1993; Spengler et al., 1993; Svoboda et
al., 1993). En 1993 también se clonó el gen del receptor en humanos (Ogi et
al., 1993). Estos estudios demostraron que el receptor PAC1 pertenece a la
familia de receptores acoplados a proteínas G, con un nivel bajo de N-
glicosilaciones y que presenta un grado de identidad alto con las secuencias de
los genes que codifican para los receptores del glucagón, secretina y
calcitonina. El gen codifica para una proteína de 495 AA, en su variante más
larga, con 7 dominios transmembranales y con capacidad de activar la vía de la
AC, fosfolipasa C y MAP quinasas (Zhou et al., 2002; Villalba et al., 1997). El

54
receptor PAC1 consta de, al menos, 6 variantes producidas por splicing
alternativo en la región del tercer loop intracelular (Figura 5). Las diferentes
variantes se caracterizan por la presencia o ausencia de una o dos secuencias
aminoacídicas de 28 AA (hip o hop1) y una de 27 AA (hop2) (Spengler et al.,
1993). Estas variantes presentan diferente capacidad de activación de la AC y
la fosfolipasa C (Spengler et al., 1993; Zhou et al., 2002) y han sido descritas
sobre todo en la rata, aunque en el humano y en la vaca también se han
observado (Ogi et al., 1993; Miyamoto et al., 1994). En todas las variantes del
receptor PAC1, el PACAP38 y el PACAP27 presentan una capacidad similar de
activación de la AC, pero el PACAP38 es más potente en cuanto a su
capacidad de activar la fosfolipasa C (Deutsch & Sun, 1992;Spengler et al.,
1993). Sin embargo, recientemente se ha descrito una nueva variante del
receptor producida por una delección de 21 AA en la región extracelular N-
terminal que presenta la misma capacidad de activación de la fosfolipasa C por
PACAP27 y PACAP38 (Pantaloni et al., 1996; Dautzenberg et al., 1999).
Finalmente se ha descrito otra variante del receptor producida por
substituciones en diferentes secuencias localizadas en el segundo y cuarto
dominio transmembranal, que se halla presente en los islotes pancreáticos y
que se ha denominado PAC1-TM4 (Chatterjee et al., 1996). La activación de
este tipo de receptor no afecta las actividades AC y fosfolipasa C, pero modifica
la permeabilidad de los canales de Ca2+ sensibles a voltaje tipo L y parece
estar involucrada en la regulación de la secreción de insulina en las células β
del páncreas (Chatterjee et al., 1996).

Los receptores PACAP de tipo II presentan una afinidad similar por el VIP y el
PACAP (Kd ≅ 1 nM) (Gottschall et al., 1990; Lam et al., 1990). Estos receptores
han sido subdivididos en dos grupos dependiendo de su capacidad para unirse
a la secretina (Hubel, 1972) y la helodermina (Christophe et al., 1986), y se han
denominado VPAC1 y VPAC2 respectivamente. El receptor VPAC1 fue clonado
en la rata en 1992 (Ishihara et al., 1992). Presenta un 84% de homología con el
humano (Sreedharan et al., 1993) y un 50% de homología con el receptor
PAC1 (Pisegna & Wank, 1993).

55
 56
Figura 5. Diferentes variantes del receptor PAC1.
El gen codifica para una proteína de 459 AA en la rata y 457 AA en el humano
(Deutsch & Sun, 1992; Sreedharan et al., 1993). El receptor VPAC2 se clonó
en la rata en 1993 (Lutz et al., 1993) y en 1995 en humanos (Adamou et al.,
1995). Presenta un 50% de homología con el receptor PAC1 y un 51% con el
VPAC1 (Arimura, 1998). Los receptores VPAC1 y VPAC2 tienen la capacidad
de activar la vía de la AC, y algunos estudios también sugieren que pueden
activar otras vías de señalización intracelular (Sreedharan et al., 1993; Inagaki
et al., 1994).

Preparaciones de membrana parecen indicar que la expresión de los

receptores PACAP de tipo II no es célula-específica, y que la mayoría de los
tejidos presentan proporciones diferentes de VPAC1 y VPAC2 (Tatsuno et al.,
1990; Nguyen et al., 1993). Por el momento no se ha descrito ninguna variante
de los receptores VPAC1 y VPAC2.

2.2.1. Distribución de los receptores PACAP.

2.2.1.1. Sistema Nervioso Central. El receptor más abundante a nivel del

SNC es el PAC1, siendo las uniones de tipo II menos abundantes y restringidas
a un menor número de áreas cerebrales (Ishihara et al., 1992). Por otra parte,
se han descrito sitios de unión para los receptores de tipo I y II en cultivos de
astrocitos (Tatsuno et al., 1990), así como la expresión del gen para el receptor
PAC1 en células gliales (Tatsuno et al., 1991a; Ashur-Fabian et al., 1997).
Mediante RT-PCR también se ha descrito la presencia de ARNm para los
receptores VPAC1 y VPAC2 en células gliales (Grimaldi & Cavallaro, 1999).

2.2.1.1.1. Receptor PAC1. En la rata se ha descrito que la variante del

receptor PAC1 más abundante es la que no presenta ninguna secuencia
adicional de 28 ó 27 AA (Spengler et al., 1993). La localización del ARNm del
receptor PAC1 correlaciona bien con la distribución de los sitios de unión tipo I
en el SNC (Basille et al., 1993; Shioda et al., 1997a). Se ha descrito una gran
concentración de dichos receptores a nivel del hipotálamo, núcleos del rafe,
corteza piriforme y cingular, hipocampo, locus coeruleus, amígdala, tálamo,
bulbo olfatorio y cerebelo (Cauvin et al., 1991; Masuo et al., 1991; Hou et al.,

57
1994; Shioda et al., 1997a; Otto et al., 1999). Niveles menores se han
observado en la sustancia gris periacueductal, sustancia negra y núcleo
habenular (Masuo et al., 1991). A nivel hipotalámico, la presencia de PAC1 es
abundante en neuronas que expresan vasopresina en el núcleo supraóptico,
pero raramente en neuronas que contengan oxitocina (Shioda et al., 1997a).
Mediante la técnica de hibridación in situ también se ha demostrado la
expresión de PAC1 en el asta dorsal espinal (Dickinson et al., 1999). Estudios
realizados con anticuerpos específicos para el receptor PAC1 han demostrado
que la mayoría se localiza en el soma celular y las dendritas, sobre todo a nivel
de las formaciones sinápticas (Shioda et al., 1997a), aunque su localización a
nivel presináptico también ha sido descrita (Otto et al., 1999).

También se ha descrito la presencia de receptor PAC1 en todos los tipos

celulares de la adenohipófisis (Vigh et al., 1993; Usdin et al., 1994; Rawlings &
Hezareh, 1996). En la pituitaria posterior, tanto en el lóbulo neural como en el
intermedio, hay una expresión moderada de ARNm del receptor PAC1
(Hashimoto et al., 1996; Rene et al., 1996).

2.2.1.1.2. Receptores VPAC1 y VPAC2. Los sitios de unión tipo II son

menos abundantes y su distribución mucho más restringida que los de tipo I a
nivel del SNC. Los sitios de unión de tipo II se localizan principalmente en el
bulbo olfativo, núcleos hipotalámicos, corteza cerebral, hipocampo, amígdala y
glándula pineal (Besson et al., 1984; Martin et al., 1987; Vertongen et al.,
1998).

Los receptores VPAC1 y VPAC2 se expresan en zonas del cerebro diferentes

con una distribución complementaria, de tal forma que zonas en las que
abunda uno de los subtipos, la presencia del segundo es por lo general escasa
(Ishihara et al., 1992; Usdin et al., 1994). Así, se ha descrito que el receptor
VPAC1 se expresa sobre todo a nivel de la corteza cerebral y del hipocampo
(Usdin et al., 1994; Sheward et al., 1995). En cambio, la expresión del receptor
VPAC2 es abundante a nivel del tálamo, núcleo supraquiasmático del
hipotálamo, núcleo central de la amígdala y núcleo pontino (Usdin et al., 1994;
Sheward et al., 1995). Tan sólo a nivel del hipocampo hay una expresión
abundante de ambos receptores (Usdin et al., 1994). Mediante la técnica de

58
hibridación in situ se ha demostrado la expresión de VPAC1 y VPAC2 en el
asta dorsal espinal, siendo el receptor VPAC1 el más abundantemente a este
nivel (Dickinson et al., 1999).

También se ha descrito la presencia de receptores VPAC2, pero no de VPAC1

en diferentes tipos celulares de la adenohipófisis (Vigh et al., 1993; Usdin et al.,
1994; Rawlings & Hezareh, 1996).

2.2.1.2. Tejidos periféricos. Mediante técnicas de fijación específica y

autoradiografía se ha observado la presencia de receptores para el PACAP en
la mayoría de las glándulas endocrinas. A nivel pancreático, las células
productoras de insulina presentan receptores tipo PAC1 y VPAC2 (Usdin et al.,
1994; Filipsson et al., 1998; Torii et al., 1998), mientras que los receptores
VPAC1 se hallan únicamente en las paredes de los capilares sanguíneos a
dicho nivel (Usdin et al., 1994).

En la glándula adrenal se ha observado, en especial a nivel de las células

cromafinas, la presencia de receptores PAC1 (Shivers et al., 1991; Moller &
Sundler, 1996), VPAC1 y VPAC2 (Usdin et al., 1994), aunque la de este último
receptor en mucha menor cantidad.

A nivel de órganos reproductores, se ha descrito la expresión de ARNm de

PAC1 y VPAC2 en ovarios de rata (Usdin et al., 1994; Kotani et al., 1997). En
los testículos, únicamente se ha observado la presencia de ARNm de VPAC2
en células germinales (Usdin et al., 1994; El Gehani et al., 1998). Sin embargo,
la presencia de lugares de fijación de tipo I también se ha descrito en diferentes
tipos celulares en los testículos (Shivers et al., 1991; Romanelli et al., 1997;
Heindel et al., 1992).

Los receptores PACAP se encuentran distribuidos a lo largo de todo el

conducto digestivo así como en muchas de sus glándulas accesorias, sobre
todo los receptores de tipo II (Tornwall et al., 1994; Felley et al., 1992; Murthy et
al., 1997; Teng et al., 1998; Salomon et al., 1993; Gagnon et al., 1994).

A nivel del tracto respiratorio, la expresión de receptores VPAC1 y VPAC2 se

ha descrito en el epitelio que recubre los bronquios y bronquiolos (Ishihara et
al., 1992; Usdin et al., 1994).

59
En el sistema cardiovascular, hay presencia de receptores PAC1, VPAC1 y
VPAC2 en el corazón (Gagnon et al., 1994; Adamou et al., 1995; Wong et al.,
1998) así como en la aorta (Miyata et al., 1998).

En el sistema inmunitario, el receptor PAC1 se expresa en los macrófagos

(Delgado et al., 1996; Pozo et al., 1997). Los receptores de tipo II se han
descrito en células mononucleares (Guerrero et al., 1981) y la expresión de
VPAC1 también se ha observado en linfocitos T (Waschek et al., 1995;
Delgado et al., 1996).

2.1. Efectos de la activación de los receptores PACAP. La amplia

distribución del PACAP y sus receptores sugiere que este sistema debe ejercer
un papel importante en el control de múltiples funciones fisiológicas. Por el
momento, se han descrito diversas funciones hormonales, neurotransmisoras y
tróficas en diferentes tejidos.

2.3.1. Sistema Nervioso Central.

2.3.1.1. Función neuroendocrina. El hipotálamo es la zona del cerebro que

contiene mayor concentración de PACAP así como de receptores (Arimura,
1992; Arimura & Shioda, 1995). La administración intracerebroventricular de
PACAP produce un incremento en la producción de Fos en los núcleos
paraventricular y supraóptico del hipotálamo (Nomura et al., 1999) e incrementa
la concentración plasmática de vasopresina de manera dosis dependiente
(Murase et al., 1993). Además, estudios electrofisiológicos han demostrado que
la administración de PACAP en estas áreas produce un aumento en la
actividad de las neuronas magnocelulares. Se ha sugerido que el PACAP
activa las neuronas que contienen vasopresina en los núcleos paraventricular y
supraóptico a través de los receptores PAC1 acoplados a la vía de señalización
intracelular AMPc-PKA/Ca2+, incrementando la concentración de Ca2+ en el
interior celular que estimula tanto la expresión como la liberación de
vasopresina (Zhou et al., 2002). El péptido PACAP también modula la actividad
de otras poblaciones neuronales hipotalámicas. Así, la administración central
de PACAP produce un incremento en la expresión de los genes de la GnRH,

60
somatostatina y CRF. Este efecto se revierte mediante la administración del
antagonista para los receptores PACAP, PACAP(6-38) (Li et al., 1996;
Grinevich et al., 1997).

La administración intracerebroventricular de PACAP también puede

incrementar la actividad dopaminérgica a nivel hipotalámico (Anderson &
Curlewis, 1998) y estimular la expresión del gen para la prolactina (Bredow et
al., 1994). También se ha demostrado que la microinyección de PACAP en el
núcleo paraventricular del hipotálamo produce un incremento en los niveles de
noradrenalina y de su metabolito 4-hidroxi-3-metoxifenilglicol. El VIP presentó
una eficacia menor, por lo que se supone que este efecto está mediado por
receptores PAC1 (Huang et al., 1996).

Estos datos indican que el PACAP actúa a nivel hipotalámico como un

neurotransmisor o neuromodulador que regula la función de diversas hormonas
hipofisiotrópicas y neurohipofisales.

2.3.1.2. Ritmo circadiano. Diversos estudios sugieren la participación de

PACAP en el control del ritmo circadiano. Así, el PACAP se sintetiza en una
subpoblación de neuronas glutamatérgicas del tracto retinohipotalámico
(Hannibal et al., 2000; Hannibal et al., 2001). Dicho tracto está involucrado en
sincronizar y ajustar la actividad del núcleo supraquiasmático con el ciclo día-
noche (Moore & Lenn, 1972; Levine et al., 1991; Moore et al., 1995). Por otra
parte, los niveles de PACAP, PAC1 y VPAC2 en este núcleo presentan una
oscilación a lo largo del ritmo circadiano (Fukuhara et al., 1997; Cagampang et
al., 1998; Shinohara et al., 1999). Se ha demostrado que la administración de
PACAP en el núcleo supraquiasmático reajusta el marcapasos endógeno que
controla el ritmo circadiano de una forma parecida a como lo realiza la luz
(Chen et al., 1999; Harrington et al., 1999; Nielsen et al., 2001).

Al igual que en el núcleo supraquiasmático, el PACAP presenta un patrón

circadiano en su contenido a nivel de la glándula pineal (Fukuhara et al., 1998).
Se supone que el PACAP actúa como un regulador de la producción de
melatonina. A favor de esta hipótesis la administración de PACAP estimula la
liberación de melatonina en cultivo de pinealocitos (Simonneaux et al., 1993).

61
También se ha observado que el PACAP estimula la fosforilación de CREB en
una subpoblación de pinealocitos de rata (Schomerus et al., 1996) y aumenta la
actividad de enzimas involucrados en la síntesis de melatonina de forma dosis-
dependiente (Yuwiler et al., 1995; Ribelayga et al., 1997).

Estudios en animales deficientes en el receptor PAC1, han demostrado que

este receptor participa, pero no es esencial, en el control de la actividad del
núcleo supraquiasmático (Hannibal et al., 2001). Sin embargo, el receptor
VPAC2 parece jugar un papel mucho más importante en este control, tal y
como se ha demostrado mediante el uso de ratones deficientes en este
receptor y ratones transgénicos que lo sobreexpresan (Shen et al., 2000;
Harmar et al., 2002).

2.3.1.3. Control de las funciones hipofisarias. Estudios in vivo en animales de

laboratorio han demostrado que la administración de PACAP estimula la
liberación de LH (Osuga et al., 1992), hormona de crecimiento (Jarry et al.,
1992), prolactina (Yamauchi et al., 1995; Jarry et al., 1992). Igualmente, se ha
descrito que la administración de PACAP en humanos incrementa de manera
dosis dependiente la concentración de ACTH y prolactina en sangre (Chiodera
et al., 1996).

Estudios realizados in vitro han producido resultados contradictorios. Así,

PACAP tiene un efecto débil sobre la liberación de hormonas en cultivos de
células pituitarias (Tatsuno et al., 1991b; Matsumoto et al., 1993). Sin embargo
se ha observado, mediante superfusión de células pituitarias, que este péptido
puede estimular la liberación de hormona de crecimiento, prolactina, ACTH y
LH de manera dosis dependiente (Miyata et al., 1989). Estos datos sugieren
que el PACAP puede actuar como una hormona hipofisiotrópica que no regula
la secreción hormonal directamente, sino mediante un mecanismo indirecto de
tipo paracrino o actuando a nivel hipotalámico. A favor de esta hipótesis hay
evidencias que indican que el PACAP modula la liberación de hormonas como
LH, prolactina y hormona de crecimiento mediante sus acciones ejercidas a
nivel de factores hipotalámicos. Así, el PACAP incrementa la liberación de LH y
FSH inducida por la GnRH en cultivos celulares (Schomerus et al., 1994; Culler
& Paschall, 1991) y también puede actuar sinérgicamente con la TRH en

62
células lactotropas y tirotropas, y con la vasopresina en células corticotropas
(Rawlings & Hezareh, 1996).

Por otra parte, el PACAP puede producir efectos indirectos en la actividad

celular a nivel de la pituitaria anterior mediante la estimulación de la liberación
de la interleucina-6 de las células FS (Rawlings & Hezareh, 1996). La
interleucina-6 actúa como un factor paracrino, estimulando la liberación de la
hormona de crecimiento, LH, FSH, ACTH y prolactina en células pituitarias
(Gorospe & Spangelo, 1993) e influye en el crecimiento celular en la hipófisis
(Arzt et al., 1993).

El PACAP también modifica la actividad de las células hipofisarias modulando

la expresión de diferentes genes. En este sentido, se ha observado que el
PACAP puede estimular la expresión de los genes de las hormonas LH y FSH
(Tsujii et al., 1995; Winters et al., 1997).

A nivel neurohipofisario, diversos estudios inmunohistoquímicos han descrito la

existencia de terminaciones nerviosas que expresan PACAP en neuronas que
contienen oxitocina (Koves et al., 1991) y en neuronas de los núcleos
paraventricular y supraóptico que contienen vasopresina (Takahashi et al.,
1994; Shioda et al., 1997b). También se ha observado la expresión de ARNm
de receptores PACAP en neuronas que contienen vasopresina, sugiriendo que
el péptido PACAP puede actuar como un neurotransmisor o neuromodulador
en estas neuronas. Así, el PACAP puede estimular la secreción de vasopresina
en cultivos neurohipofisarios mediante un mecanismo dependiente de la vía
AMPc/PKA, así como la liberación de oxitocina, aunque con menor potencia
(Lutz-Bucher et al., 1996).

Por otra parte, se ha descrito que el PACAP puede actuar sinérgicamente con
la noradrenalina en el control de la liberación de vasopresina. Así, se ha
descrito la presencia de neuronas medulares que contienen PACAP y
noradrenalina que proyectan hacia el hipotálamo (Shioda et al., 1998b). Ambos
neurotransmisores a dosis elevadas producen un incremento en la
concentración de Ca2+ intracelular en neuronas que contienen vasopresina
(Shioda et al., 1997b). Sin embargo, a dosis bajas, únicamente la
administración conjunta de PACAP y noradrenalina produce dicho incremento
en la concentración de Ca2+ intracelular (Shioda et al., 1998b).

63
2.3.1.4. Acciones antinociceptivas. La distribución anatómica del PACAP
sugiere que puede estar involucrado en la modulación de las respuestas
nociceptivas. Por otra parte, el daño producido por el corte en un nervio
periférico o por un proceso inflamatorio produce un incremento de los niveles
de VIP y PACAP en los ganglios de la raíz dorsal (Nahin et al., 1994; Zhang et
al., 1996b; Zhang et al., 1998b). Igualmente, en un modelo de dolor neuropático
se observó que la expresión del ARNm del VPAC1 estaba disminuida en las
láminas III-IV, mientras que la del VPAC2 resultó incrementada y la del PAC1
se mantuvo inalterada (Dickinson et al., 1999).

Sin embargo, existe una controversia con respecto al papel preciso que juega
el PACAP en el control de la transmisión nociceptiva. Algunos autores han
descrito un efecto antinociceptivo del PACAP a nivel espinal. En este sentido,
la administración intratecal de PACAP produjo una disminución en el reflejo
flexor evocado de las fibras C (Zhang et al., 1993) y en el número de
respuestas dolorosas en el test de la formalina (Yamamoto & Tatsuno, 1995;
Zhang et al., 1996a). Sin embargo, otros estudios han demostrado que el
PACAP actúa como un facilitador de la trasmisión del estímulo doloroso en el
test de retirada de la cola (Narita et al., 1996), de la formalina (Ohsawa et al.,
2002) y de estimulación plantar (Ohsawa et al., 2002). Estudios realizados en
modelos de dolor neuropático han sugerido que la activación de los receptores
VPAC1 y PAC1 es necesaria para la respuesta de alodinia al frío, mientras que
los tres receptores, PAC1, VPAC1 y VPAC2, son requeridos para la
hiperalgesia en este modelo de dolor (Dickinson et al., 1999).

Recientemente se ha demostrado que los animales deficientes en el receptor

PAC1 presentan una disminución de las respuestas nociceptivas ante
situaciones de dolor crónico, como la inflamación. Sin embargo, las respuestas
nociceptivas agudas de tipo mecánico o térmico no resultaron modificadas en
dichos animales (Jongsma et al., 2001).

2.3.1.5. Procesos de memoria. Se ha observado la presencia del péptido

PACAP en áreas cerebrales que están involucradas en el control de los

64
procesos de memoria como el hipocampo, la amígdala, la corteza entorrinal y
el núcleo accumbens (Arimura, 1998; Zhou et al., 1999). La memoria en
vertebrados e invertebrados involucra modificaciones en la eficiencia de la
transmisión sináptica, procesos que se han denominado LTP y depresión a
largo plazo (LTD). Estudios electrofisiológicos han demostrado que el PACAP
es capaz de producir una facilitación a largo plazo en la transmisión sináptica
basal en la zona CA1 del hipocampo. El efecto del PACAP puede ser
bloqueado mediante la administración del antagonista muscarínico atropina y
disminuido tras el bloqueo de los receptores NMDA, compartiendo de esta
manera un mecanismo común con la LTP (Roberto et al., 2001). El péptido
PACAP también incrementa la transmisión sináptica colinérgica en la región
CA1 del hipocampo en mamíferos (Roberto & Brunelli, 2000) así como la
liberación espontánea de acetilcolina en los terminales colinérgicos del
hipocampo dorsal. El sistema colinérgico juega un papel importante como
facilitador de procesos de memoria (Markram & Segal, 1990;Auerbach & Segal,
1994).

Estos datos sugieren que el PACAP puede modular los procesos de

aprendizaje y memoria. En concordancia, la administración
intracerebroventricular de PACAP incrementa el aprendizaje en ratas en un
paradigma de evitación pasiva (Telegdy & Kokavszky, 2000; Sacchetti et al.,
2001). Finalmente, estudios realizados en ratones deficientes en el receptor
PAC1 han demostrado que presentan un déficit en procesos de memoria y
aprendizaje en los test de condicionamiento al miedo y de sesión múltiple de
discriminación contextual (Sauvage et al., 2000).

2.3.1.6. Efectos neurotróficos. Diferentes estudios han demostrado que el

péptido PACAP es capaz de estimular la formación de neuritas así como la
supervivencia de neuroblastos (DiCicco-Bloom et al., 2000; Lu & DiCicco-
Bloom, 1997), células PC12 (Deutsch & Sun, 1992; Cavallaro et al., 1995) y
líneas celulares de neuroblastoma humano (Deutsch & Sun, 1992). Además, la
administración de PACAP previene la apoptosis en cultivos de células
granulares del cerebelo (Canonico et al., 1996) y de neuronas corticales (Morio
et al., 1996). Este efecto parece estar mediado por la activación de la vía de las

65
MAP quinasas tipo ERK (extracelular signal-regulated kinase) a través de un
mecanismo dependiente de AMPc (Villalba et al., 1997). El PACAP resultó más
efectivo que el VIP para inhibir el proceso de muerte celular en un cultivo de
células cerebelosas, sugiriendo que este efecto está mediado por receptores
PAC1 (Canonico et al., 1996). Sin embargo, alguno de los efectos
neuroprotectores del VIP no pueden ser inducidos por PACAP, sugiriendo la
existencia de un receptor VIP no caracterizado (Gressens et al., 1997; Zupan et
al., 1998; Hill et al., 1999).

El efecto citoprotector y neurotrófico del PACAP puede estar mediado tanto por
acciones directas sobre las neuronas como por acciones indirectas mediadas
por células gliales. Así, el PACAP puede estimular la producción de factores
neurotróficos en astrocitos responsables de la proliferación y/o diferenciación
neuronal (Ashur-Fabian et al., 1997). Igualmente, durante el proceso de
isquemia cerebral se incrementa la expresión del ARNm de PAC1 en neuronas
y en astrocitos (Uchida et al., 1996). Por otra parte, el PACAP es capaz de
estimular la liberación de interleucina-6 a nivel astrocitario (Shioda et al.,
1998a).

El sistema PACAP juega también un papel importante como regulador del

crecimiento y del desarrollo neuronal embrionario (Arimura & Shioda, 1995;
Masuo et al., 1994). Tanto el PACAP como sus receptores se expresan de una
manera abundante en el cerebro de la rata en los primeros estadíos del
desarrollo embrionario (Tatsuno et al., 1994; Roth & Beinfeld, 1985; Basille et
al., 2000). La concentración de PACAP38 aumenta a lo largo de la gestación y
alcanza el máximo un mes después del nacimiento (Tatsuno et al., 1994).
Durante el desarrollo cerebral, un conjunto de señales controla la transición
desde la proliferación a la diferenciación celular. PACAP promueve esta
transición, produciendo un incremento en el número de neuritas y en la
expresión del receptor para la neurotrofina 3 (NT-3) trk B (Lu & DiCicco-Bloom,
1997). En concordancia con estas observaciones, se ha sugerido que el
PACAP podría actuar como una señal autocrina que pararía el ciclo de división
celular e induciría la transición desde la proliferación a la diferenciación
neuronal (Lu & DiCicco-Bloom, 1997). En este sentido, se ha demostrado que
la administración intrauterina de PACAP en los ventrículos cerebrales de

66
embriones de rata inhibe la división mitótica durante el desarrollo de la corteza
cerebral, disminuyendo la proliferación neuronal sin incrementar la muerte
celular (Suh et al., 2001).

El sistema PACAP también participa en el desarrollo de las glándulas

adrenales en mamíferos (Yon et al., 1998; Breault et al., 2000). Así, el PACAP
puede actuar conjuntamente con los glucocorticoides para controlar el
crecimiento de las células de la médula adrenal en rata, inhibiendo su
crecimiento y manteniéndolas en un estado postmitótico (Frodin et al., 1995).
Sin embargo, animales deficientes en el péptido PACAP presentan un
desarrollo normal de esta glándula, aunque su presencia parece ser
imprescindible para un funcionamiento adecuado en situaciones de cambios
adaptativos como el estrés metabólico (Hamelink et al., 2002).

2.3.1.7. Control de la ingesta. La elevada concentración del PACAP en

regiones cerebrales involucradas en la regulación de la ingesta como los
núcleos paraventricular y ventromedial del hipotálamo (Leibowitz, 1988;
Schwartz et al., 1995), sugieren que pueda estar involucrado en esta conducta.
Así, la administración intracerebroventricular de PACAP disminuye la ingesta
de comida (Morley et al., 1992), al parecer mediante un mecanismo
independiente de la regulación ejercitada por el neuropéptido Y y el CRF
(Mizuno et al., 1998). Igualmente, el PACAP regula la ingesta de agua. La
administración del péptido en el hipotálamo perifornical lateral estimula la
ingesta de agua (Puig et al., 1995), y la deprivación hídrica incrementa los
niveles de PACAP a nivel subfornical (Nomura et al., 1997).

2.3.1.8. Regulación de las respuestas farmacológicas del etanol y la morfina.

Las primeras evidencias referentes a la modulación por PACAP de las
respuestas inducidas por drogas de abuso se obtuvieron con el estudio de los
efectos del etanol en el mutante amnesiac de la mosca Drosofila melanogaster
(Moore et al., 1998). En 1979 el grupo de Quinn y colaboradores aislaron un
mutante de la mosca Drosofila melanogaster que denominaron amnesiac y que
presentaba un deterioro en la retención de memoria en un modelo de

67
aprendizaje asociativo (Quinn et al., 1979). Posteriormente, se identificó el ADN
genómico que codificaba para el neuropéptido (Feany & Quinn, 1995). Aunque
el producto maduro del gen amnesiac no ha sido identificado, se supone que
codifica para un péptido que presenta gran homología con el PACAP. Los
mutantes son más sensibles a los efectos inducidos por vapores de etanol,
perdiendo con mayor rapidez su capacidad de controlar la postura (Moore et
al., 1998).

En el ratón también se ha estudiado el papel del PACAP en los efectos agudos

y crónicos del etanol. El PACAP no está implicado en la pérdida del reflejo
postural inducida por la administración aguda de etanol ni en el desarrollo de la
tolerancia a los efectos hipotérmicos de esta sustancia (Szabo et al., 1998). Sin
embargo, un tratamiento intracerebroventricular subcrónico de PACAP
disminuye la respuesta hipotérmica aguda del etanol (Szabo et al., 1998).
Asimismo, la exposición a etanol en un cultivo de células de glioma de rata
produce un incremento en la expresión del ARNm del receptor PAC1 (He et al.,
2002).

Los efectos del PACAP sobre la analgesia, tolerancia y dependencia física de

morfina también han sido estudiados. La administración a nivel
intracerebroventricular de una dosis elevada de PACAP disminuye el efecto
analgésico agudo de la morfina e incrementa la tolerancia a dichos efectos y la
severidad del síndrome de abstinencia (Macsai et al., 2002).

2.3.1.9. Otras acciones centrales. La administración intracerebroventricular

de PACAP produce un incremento en el número de acicalamientos (Morley et
al., 1992) y en la actividad locomotora horizontal y vertical en la rata (Masuo et
al., 1995). Sin embargo, los ratones deficientes en PACAP son hiperactivos y
presentan una conducta de saltos espontáneos en un campo abierto, así como
un incremento de la exploración y una respuesta de tipo ansiolítica en el test en
cruz elevado (Hashimoto et al., 2001). Un estudio reciente ha observado que
estos ratones knockout presentan problemas de termorregulación, de manera
que a 21º C tan sólo un 11% de los ratones deficientes en PACAP
sobrevivieron las dos primeras semanas después del nacimiento, mientras que

68
el porcentaje aumentó hasta el 76% a una temperatura de 24º C (Gray et al.,
2002).

2.3.2. Efectos a nivel de los órganos periféricos.

2.3.2.1. Adrenal. El PACAP estimula la actividad AC y eleva los niveles de

Ca2+ en el citosol de las células cromafines además de ser un potente
secretagogo de la adrenalina (Watanabe et al., 1992). También se ha
observado tras la administración de PACAP una liberación de corticosterona y
aldosterona in vitro de forma dosis dependiente (Yon et al., 1992), así como de
CRF y encefalinas (Edwards & Jones, 1994). Estudios inmunohistoquímicos
han revelado que el PACAP se halla en las terminaciones nerviosas
colinérgicas de la médula adrenal, sugiriendo que el PACAP puede actuar
como neurotransmisor, liberado conjuntamente con la acetilcolina del nervio
esplácnico que inerva la glándula adrenal, controlando la secreción de
catecolaminas. Además, el PACAP es capaz de estimular la actividad del
enzima limitante en la síntesis de catecolaminas, la tirosina-hidroxilasa, en
cultivos de células cromafines (Marley et al., 1996).

El efecto del PACAP en la secreción de catecolaminas resultó incrementado

tras la inducción de un estado de hipoglucemia producido por insulina,
sugiriendo que el PACAP contribuye a la regulación de los niveles glucídicos al
actuar sobre las células cromafines adrenales (Yamaguchi & Lamouche, 1999).
Igualmente, la secreción adrenomedular en ratones deficientes en PACAP es
normal en condiciones basales, pero en condiciones de estrés metabólico
prolongado el PACAP juega un papel importante para mantener la secreción de
adrenalina (Hamelink et al., 2002).

2.3.2.2. Páncreas. Estudios de inmunofluorescencia han demostrado la

presencia de fibras nerviosas que contienen PACAP en el páncreas (Fridolf et
al., 1992). A este nivel, el PACAP tiene efectos endocrinos y exocrinos. Así,
PACAP puede estimular la secreción de amilasa (Kashimura et al., 1991) y
glucagón, así como la liberación de insulina de forma glucosa dependiente
(Kawai et al., 1992). Los receptores del tipo I y tipo II están involucrados en la

69
estimulación de la liberación de insulina (Bertrand et al., 1996; Filipsson et al.,
1997; Yada et al., 1994; Jamen et al., 2002). Así, ratones deficientes en el
receptor PAC1 presentan una disminución en la secreción de insulina mediada
por PACAP, además de un deterioro en la secreción de insulina inducida por
glucosa y una reducción en la tolerancia a este azúcar (Jamen et al., 2000). Por
otra parte, un estudio reciente ha demostrado que los ratones deficientes en el
receptor VPAC2 presentan una mayor sensibilidad a la insulina y tasa
metabólica basal que los animales salvajes (Asnicar et al., 2002). Asimismo, los
ratones deficientes en PACAP presentan disfunciones en el metabolismo de
carbohidratos y lípidos (Gray et al., 2001).

2.3.2.3. Gónadas. En los testículos, la concentración de PACAP es alta en

los primeros estadíos del desarrollo de las células germinales, disminuyendo
con posterioridad hasta desaparecer (Shioda et al., 1994). Estudios in vitro han
demostrado que el PACAP estimula la secreción de testosterona en las células
de Leydig (Romanelli et al., 1997). La síntesis de PACAP en los testículos está
controlada por el eje hipotalámico-hipofisario-gonadal (Shuto et al., 1995) y
parece estar implicado en el proceso de espermatogénesis (Shioda et al., 1994;
Hannibal & Fahrenkrug, 1995). En efecto, los ratones macho deficientes en el
receptor VPAC2 presentan una degeneración de los túbulos seminíferos,
hipospermia y una tasa de fertilidad reducida (Asnicar et al., 2002).

A diferencia de los testículos, la concentración de PACAP en los ovarios es

mucho menor (Arimura et al., 1991) y es dependiente del ciclo estral (Gras et
al., 1996). Las hembras deficientes en PACAP presentan una fertilidad
reducida, debido en parte a una disminución en la frecuencia de apareamientos
y a una conducta maternal inadecuada (Shintani et al., 2002).

2.3.2.4. Sistema gastrointestinal. Se ha sugerido que el PACAP puede jugar

un papel en el control de la motilidad y el riego sanguíneo en este sistema
(Heinemann & Holzer, 1999). Además, la administración intracerebroventricular
de PACAP estimula la secreción de ácido gástrico (Ozawa et al., 1997) y

70
administrado por vía intravenosa incrementa la secreción de bicarbonato a nivel
duodenal (Takeuchi et al., 1997).

71
3. El sistema opioide

Los opioides exógenos como la morfina y los péptidos opioides endógenos

ejercen sus efectos farmacológicos mediante la activación de unos receptores
de membrana específicos denominados receptores opioides. A principios de los
años setenta se describió la existencia de receptores específicos para las
sustancias opioides, mediante el uso de radioligandos de alta especificidad
(Pert & Snyder, 1973; Simon et al., 1973; Terenius, 1973). El descubrimiento de
la existencia de receptores específicos para los opioides llevó a la búsqueda de
sustancias endógenas que actuasen como agonistas específicos de los
mismos. Así, las primeras evidencias sobre su existencia se obtuvieron en
estudios en los que se demostró que extractos cerebrales contenían actividad
opioide (Terenius & Wahlstrom, 1974; Kosterlitz & Waterfield, 1975).
Posteriores investigaciones llevaron al aislamiento y caracterización de las
encefalinas (Hughes et al., 1975). En la actualidad se han descrito 4 familias de
péptidos opioides que se han denominado encefalinas, endorfinas, dinorfinas y
endomorfinas.

3.1. Receptores opioides. A mediados de los años 70, y en base a estudios

farmacológicos se postuló la existencia de diferentes subtipos de receptores
opioides. Así, se denominó mu al tipo de receptor que presentaba una alta
afinidad por la morfina, kappa al receptor que se unía preferentemente a la
ketociclozacina y sigma al que presentaba una gran afinidad por el SKF10.047
(Martin et al., 1976). Posteriormente se describieron otros tipos de receptores.
Lord y colaboradores (1977) propusieron la existencia de un cuarto receptor
que se hallaba en el conducto deferente y que mostraba una alta afinidad por
las encefalinas, al que denominaron delta (Lord et al., 1977).

En la actualidad se conoce la existencia de 3 tipos de receptores opioides, que

han sido aislados y clonados a principios de los años 90. Estos se han
denominado μ, δ y κ (Evans et al., 1992; Kieffer et al., 1992; Reisine & Bell,
1993; Uhl et al., 1994; Knapp et al., 1995). Por el momento no se ha
demostrado la existencia de ningún otro receptor opioide más. En la actualidad
el receptor sigma está identificado pero considerado como un receptor de

72
naturaleza no opioide. Sin embargo, se han descrito diferentes variantes de los
receptores μ, δ y κ producidas por mecanismos postranscripcionales, así como
la formación de complejos heterodiméricos entre los receptores μ y δ
(Schoffelmeer et al., 1992; Schoffelmeer et al., 1993; Rothman et al., 1993).
Estas variantes o complejos presentan unas características farmacológicas
diferentes que podrían corresponder a las diferentes subdivisiones de
receptores opioides descritos farmacológicamente y que no corresponden con
ninguno de los receptores aislados y clonados.

El primer receptor opioide clonado fue el receptor δ (Evans et al., 1992; Kieffer
et al., 1992). Posteriormente, los receptores μ y κ se aislaron gracias a la
homología de secuencia que presentaban con el receptor δ (Chen et al., 1993;
Fukuda et al., 1993). Los receptores opioides pertenecen a la superfamilia de
receptores con 7 dominios transmembrana acoplados a proteínas G. Los tres
receptores opioides presentan una homología de aproximadamente un 60% en
su secuencia aminoacídica, pero este porcentaje es mayor en los dominios
transmembranales y en los “loops” intracelulares.

Estos receptores presentan sitios potenciales para ser fosforilados vía PKA y
proteína quinasa C en el segundo y tercer loop intracelular, así como en el
extremo C-terminal. Igualmente, presentan secuencias aminoacídicas
susceptibles de sufrir N-glucosilaciones en la región N-terminal y
palmitoilaciones en el dominio C-terminal (para revisión, ver Satoh & Minami,
1995).

Recientemente se ha clonado otro receptor que posee una alta homología de

secuencia con los receptores opioides pero que no exhibe una afinidad
importante por los ligandos opioides. Se le ha denominado ORL-1 (del ingles
“Opioid Receptor Like”) y el agonista endógeno del mismo parece ser la
sustancia denominada orfanina FQ o nociceptina (Meunier et al., 1995;
Reinscheid et al., 1995). El ARNm del ORL-1 y del precursor de la nociceptina
se hallan ampliamente distribuidos a nivel del sistema nervioso central
(Mollereau et al., 1994; Nothacker et al., 1996). Las funciones fisiológicas del
sistema ORL-1/nociceptina parecen ser opuestas a las del sistema opioide en
determinados casos (Meunier et al., 1995).

73
3.2. Distribución de los receptores opioides. La distribución de los
receptores opioides a nivel del sistema nervioso central ha sido revisada en
detalle (Mansour et al., 1995a) (Figura 6).

3.2.1. Receptor opioide μ. Una elevada densidad de sitios de unión de tipo μ

ha sido observada en la rata a nivel de múltiples estructuras cerebrales incluido
el estriado, núcleo accumbens, tálamo, hipocampo, sustancia gris
periacueductal, sustancia negra y los núcleos amigdaloides lateral y cortical.

La presencia de ARNm se ha descrito en el cerebro de rata mediante técnicas

de hibridación in situ, principalmente a nivel del tálamo, estriado, locus
coeruleus, núcleo del tracto solitario y núcleos amigdaloides medial y cortical.

A nivel del estriado, los sitios de unión así como el ARNm del receptor μ están
distribuidos en forma de parches, tanto en el caudado y putamen como a nivel
del núcleo accumbens.

El uso de anticuerpos específicos ha permitido observar la presencia de

receptores μ en fibras y/o pericaria en neuronas de regiones tales como la
neocorteza, los parches estriatales, el núcleo accumbens, el globo pálido, la
amígdala, el hipocampo, los núcleos talámicos e hipotalámicos, la sustancia
gris central, la sustancia negra, el área tegmental ventral, los núcleos del rafe,
la médula espinal y los ganglios del asta dorsal de la médula espinal.

3.2.2. Receptor opioide δ. Los receptores δ presentan una distribución

neuroanatómica más restringida que los μ. Mediante técnicas de unión con
ligandos específicos marcados radiactivamente, se ha observado una
localización predominante en el estriado dorsal, el núcleo accumbens y el
tubérculo olfatorio, así como en las capas II, III, V y VI de la corteza y en los
núcleos amigdaloides medial y lateral cortical.

En la rata, el ARNm del receptor opioide δ se encuentra principalmente a nivel

de la corteza, estriado, tubérculo olfatorio y en los núcleos amigdaloides medial
y lateral.

74
Figura 6. Distribución de los receptores opioides μ, δ y κ en el cerebro.

75
En el estriado, a diferencia del receptor μ, el ARNm del receptor δ está
distribuido de manera muy densa y homogénea a través del caudado-putamen
y del núcleo accumbens.

A nivel neuronal, el uso de anticuerpos específicos ha permitido describir la

presencia de receptores δ en axones y terminales neuronales, con una
distribución que concuerda con la observada con técnicas de autoradiografía e
hibridación in situ.

3.2.3. Receptor opioide κ. Los receptores κ también presentan una distribución

más restringida que la de los receptores μ. Se ha observado la presencia de
sitios de unión específicos para el receptor κ sobretodo a nivel del núcleo
accumbens, tubérculo olfatorio, área preóptica, núcleo amigdaloide medial,
hipotálamo, núcleo amigdaloide lateral, núcleo paraventricular del hipotálamo y
núcleo del tracto solitario.

En la rata, el ARNm del receptor opioide κ se halla localizado principalmente a

nivel del núcleo accumbens, tubérculo olfatorio, hipotálamo, sustancia negra,
área tegmental ventral, núcleo del tracto solitario, núcleos amigdaloides medial
y cortical, corteza entorrinal y núcleos de la estría terminal.

Estudios realizados mediante la técnica de inmunohistoquímica han mostrado

la presencia de receptores κ en el soma y/o fibras en regiones tales como las
capas profundas de la corteza parietal, temporal y occipital, la amígdala central
e intermedia, los núcleos de la estría terminal, el núcleo accumbens, el
tubérculo olfatorio, los núcleos hipotalámicos, los núcleos talámicos, la
sustancia gris central, el rafe caudal y dorsal, la sustancia negra, el área
tegmental ventral, el núcleo de la zona solitaria, la médula espinal y los
ganglios del asta dorsal de la médula espinal. También se ha descrito la
presencia de receptores κ en la pituitaria, donde la pericaria y las fibras
inmunoreactivas se localizan en los lóbulos de los nervios intermedios.

76
3.3. Vías de transducción implicadas en la activación de los receptores
opioides.

3.3.1. Proteínas G. Los receptores opioides están acoplados preferentemente

a proteínas G que contienen subunidades del tipo Gi/Go como Gi1, Gi2, Gi3, Go1;
Go2 y que pueden ser bloqueadas por la toxina pertussis, así como a las
subunidades insensibles a la toxina pertussis Gz y G16. También se ha descrito
la interacción de estos receptores con proteínas Gs (Connor & Christie, 1999).

Debido a esta unión, los receptores opioides inhiben la actividad AC (Sharma et

al., 1977), modifican la conductividad de canales de K+ y Ca2+ (Surprenant et
al., 1990; Jin et al., 1992), regulan la vía de señalización intracelular de la
fosfolipasa C y de las MAP quinasas (Fukuda et al., 1996; Burt et al., 1996).
Algunos efectos excitatorios descritos para los opioides (para revisión, ver
Smart & Lambert, 1996b) están mediados a través del subtipo de proteínas G,
Gs (Crain & Shen, 1990) y son regulados por gangliósidos GM1 (para revisión,
ver Crain & Shen, 1998).

3.3.2. Vía del adenilato ciclasa. La capacidad de inhibir la actividad AC se ha

descrito para los tres tipos de receptores opioides en cultivos celulares
(Childers et al., 1992; Frey & Kebabian, 1984; Brown & Pasternak, 1998;
Rubenzik et al., 2001; Avidor-Reiss et al., 1995) y en muestras de tejido
cerebral. Así, la activación de los receptores opioides κ, inhibe la actividad AC
en membranas de médula espinal de rata y de cerebelo de cobayo entre otros
tejidos (Attali et al., 1989; Konkoy & Childers, 1989; Childers et al., 1992).
Igualmente, los receptores opioides μ y δ producen la inhibición de la actividad
AC en membranas de tálamo y de estriado de rata entre otras estructuras
cerebrales (Childers et al., 1992).

3.3.3. Vía del fosfatidilinositol. Los agonistas opioides estimulan la producción

de IP3 a través de la activación de la vía de la fosfolipasa C en una variedad de
preparaciones experimentales. Así, la administración de agonistas δ estimula la
producción de IP3 en cultivos de células NG108-15 (Smart & Lambert, 1996a) e

77
induce la liberación de Ca2+ de los almacenes intracelulares a través de un
mecanismo que implica la activación de la fosfolipasa C (Jin et al., 1994).

Los receptores opioides μ estimulan la actividad fosfolipasa Cβ y la formación

de IP3 en células de neuroblastoma humano (Smart et al., 1994).

Los opioides pueden activar la fosfolipasa C a través de dos mecanismos.

Mediante la movilización de las subunidades β/γ de las proteínas Gi/o (Tsu et al.,
1995; Smart et al., 1994; Smart et al., 1997), o a través de la entrada de Ca2+
por los canales de tipo L (Smart et al., 1995).

La implicación de la fosfolipasa Cβ en los procesos de señalización intracelular

mediados por los receptores opioides ha sido confirmada tras la observación de
alteraciones de las respuestas analgésicas y celulares a la morfina en ratones
deficientes en la proteína fosfolipasa Cβ3 (Xie et al., 1999).

3.3.4. Vía de las MAP quinasas. Se ha demostrado que los tres tipos de
receptores opioides son capaces de estimular las MAP quinasas ERK1 y ERK2
en células recombinantes CHO (Fukuda et al., 1996). Estudios in vivo también
han descrito que los agonistas opioides como la morfina pueden estimular la
fosforilación de ERK en el cerebro a nivel de la médula (Narita et al., 2002), así
como de ERK, JNK y p38 en neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (Ma et
al., 2001).

Recientemente se ha descrito que ratones deficientes en ERK-1 presentan un

incremento en los efectos reforzantes de la morfina en el test de la preferencia
de plaza condicionada, sugiriendo un papel opuesto de ERK-1 y ERK-2 en la
mediación de las respuestas farmacológicas de la morfina (Mazzucchelli et al.,
2002).

3.3.5. Canales iónicos. Los opioides son capaces de controlar la actividad de

canales de Ca2+ y K+. A nivel presináptico, la activación de los receptores
opioides suprime la liberación de neurotransmisores, principalmente mediante
el bloqueo de la entrada de Ca2+. Los receptores opioides pueden inhibir
diferentes tipos de canales de Ca2+ en varias regiones del cerebro. Así, se ha

78
descrito un efecto inhibitorio sobre los canales N y P/Q (Rhim & Miller, 1994;
Kim et al., 1997). También se ha observado que la activación de receptores
opioides μ y δ transfectados en células pituitarias GH3 puede inhibir canales de
calcio de tipo L (Piros et al., 1996), de manera reversible por naloxona, e
inhibida mediante la aplicación de toxina pertussis, sugiriendo que estas
acciones son mediadas a través de las subunidades Gβ/γ de las proteínas Go.

A nivel postsináptico, los receptores opioides, al igual que otros receptores

acoplados a proteínas G de tipo inhibitorio, producen una hiperpolarización, vía
la activación de canales de K+. Así, en el locus coeruleus de rata, los
receptores opioides μ y δ pueden activar canales de K+ de manera sensible a la
toxina pertussis (North et al., 1987). Por otra parte, estudios electrofisiológicos
realizados en neuronas de la sustancia gelatinosa, han demostrado que los tres
tipos de receptores opioides son capaces de activar corrientes de K+ (Grudt &
Williams, 1993; Schneider et al., 1998).

También se ha descrito que los receptores opioides pueden regular la función

de otros canales iónicos, como los receptores NMDA. Así, agonistas opioides μ
inhiben las corrientes postsinápticas inducidas por receptores NMDA en el giro
dentado (Xie et al., 1997).

3.4. Péptidos opioides endógenos. Los receptores opioides son activados

por un conjunto de péptidos endógenos denominados péptidos opioides (Figura
7). Estos péptidos provienen de unos grandes precursores peptídicos, y son
generados mediante roturas proteolíticas. Así, de la pro-opiomelanocortina
(POMC) se obtiene principalmente la β-endorfina. La proencefalina es el
precursor de la Met- y Leu-encefalina y de otras formas extendidas de estos
péptidos. La secuencia peptídica de la proencefalina incluye 4 fragmentos que
codifican para la Met-encefalina y 1 para la Leu-encefalina.

La prodinorfina contiene tres secuencias de Leu-encefalina pero ninguna de

Met-encefalina. Su rotura proteolítica genera derivados extendidos de la Leu-
encefalina como son las dinorfinas A y B, y las α- y β-neoendorfinas (Goldstein
et al., 1981).

79
 TIPO AGONISTAS ANTAGONISTAS

μ Endomorfina 1 Naloxona
Endomorfina 2 Naltrexona
β-endorfina CTOP
Leu-encefalina Cipromide
Met-encefalina Diprenorfina
Morfina
Fentanil
Dihidromorfina
DAGO
Sufentanil
Etorfina

δ Leu-encefalina ICI 154.129

Met-encefalina ICI 174.864
β-endorfina Naltrindol
Etorfina Diprenorfina
DPDPE
BUBU
DSLET
DTLET

κ Dinorfina Nor-binaltorfimina
α-neoendorfina Diprenorfina
U 50.488H MR 2266
U 69.593 WIN 44.441-3
Pentazocina
Etorfina

Figura 7. Agonistas y antagonistas de los diferentes receptores opioides.

80
También se ha descrito una dinorfina de 32 AA que está constituida por las
secuencias de la dinorfina A y de la dinorfina B unidas por un par Lys-Arg.

Una cuarta familia de péptidos opioides endógenos, las endomorfinas, fue

descrita en 1997, pero por el momento se desconoce el precursor de dichos
péptidos (Zadina et al., 1997).

3.4.1. Distribución. Cada precursor posee una distribución anatómica única

tanto a nivel central como en los órganos periféricos (Akil et al., 1984;
Khachaturian et al., 1985).

3.4.1.1. POMC y péptidos derivados. La distribución de los derivados de

POMC está restringida a determinadas estructuras cerebrales. Los lóbulos
anterior y neurointermedial de la glándula pituitaria son las áreas donde se da
una mayor síntesis de POMC. A nivel cerebral, la expresión del mRNA de
POMC se halla principalmente a nivel del núcleo arcuado del hipotálamo y el
núcleo del tracto solitario (Pelletier, 1993). Niveles menores se han descrito
también en la corteza frontal y en el hipocampo (Jiaxu & Weiyi, 2000).

Las técnicas de inmunohistoquímica también han permitido estudiar la

localización de la β-endorfina en el SNC (Finley et al., 1981). Se ha descrito su
presencia en el hipotálamo, tálamo, amígdala, núcleo rafe dorsal, sustancia gris
periacueductal, locus coeruleus, núcleos parabraquiales, núcleo trigeminal y
núcleo del tracto solitario.

3.4.1.2. Pre-proencefalina y péptidos derivados. La pre-proencefalina se halla

ampliamente distribuida en el SNC. Diferentes estudios han demostrado,
mediante hibridación in situ, una elevada expresión de dicho precursor en
neuronas del núcleo hipotalámico paraventricular, núcleos central e intercalado
de la amígdala, caudado putamen, núcleo accumbens y tubérculo olfatorio
entre otras estructuras (Cowen & Lawrence, 2001; Pittius et al., 1985).

La distribución neuroanatómica de las encefalinas también ha sido estudiada

usando anticuerpos específicos para Met- y Leu-encefalina. Su presencia ha

81
sido detectada en el núcleo central de la amígdala, área CA2 del hipocampo,
en la corteza, estriado, núcleo de la estría terminal, hipotálamo, tálamo,
sustancia gris periacueductal, locus coeruleus, núcleo del tracto solitario, la
formación reticular y en la sustancia gelatinosa de la médula espinal entre otras
(Sar et al., 1978).

3.4.1.3. Prodinorfina y péptidos derivados. La distribución del ARNm de la

prodinorfina se ha observado mayoritariamente en el estriado, el hipotálamo y
el hipocampo (Morris & Gibbins, 1987;Pittius et al., 1987).

Estudios de inmunohistoquímica han observado una amplia distribución de

dinorfinas en el SNC de la rata a nivel de diversas áreas que incluyen el
hipotálamo, sustancia gris periacueductal, corteza cerebral, bulbo olfativo,
núcleo accumbens, caudado-putamen, sustancia negra, amígdala, núcleo del
lecho de la estría terminal así como a nivel espinal (Khachaturian et al., 1982;
Fallon & Leslie, 1986).

3.4.1.4. Endomorfinas. Zadina y colaboradores (1997) aislaron dos péptidos

con gran afinidad y selectividad por el receptor μ que denominaron
endomorfina-1 y endomorfina-2 (Zadina et al., 1997). Ambas presentan una
distribución a nivel del SNC diferente, siendo la endomorfina-1 más abundante
a nivel del cerebro y la endomorfina-2 más abundante en la médula espinal
(Martin-Schild et al., 1999). Mediante técnicas inmunológicas se ha descrito la
presencia de endomorfina-1 y -2 en el núcleo accumbens, el septum lateral, el
locus coeruleus, la sustancia gris periacueductal y la estría terminal (Martin-
Schild et al., 1999; Schreff et al., 1998; Pierce & Wessendorf, 2000). La
endomorfina-1 también se detectó en diferentes zonas de la corteza,
hipotálamo y tálamo.

La endomorfina-2 está presente en el asta dorsal superficial de la médula

espinal (Barr & Zadina, 1999a; Barr & Zadina, 1999b; Martin-Schild et al., 1999;
Schreff et al., 1998). Existen estudios que sugieren la existencia de
endomorfina-2 en la periferia (Barr & Zadina, 1999a).

82
3.5. Respuestas farmacológicas.

3.5.1. Analgesia. Los opioides ejercen sus efectos analgésicos a nivel

supraespinal, espinal y periférico. La generación de ratones modificados
genéticamente ha permitido profundizar en el estudio de la implicación del
sistema opioide en el control de las respuestas nociceptivas. Se ha demostrado
que los receptores μ están involucrados en el control de las respuestas
antinociceptivas producidas por estímulos térmicos a nivel espinal y
supraespinal. También se ha observado la implicación de los receptores μ en la
modulación de las respuestas ante estímulos dolorosos de naturaleza química
en procesos inflamatorios (Sora et al., 1997; Qiu et al., 2000a). Sin embargo,
Matthes y colaboradores no han descrito un papel modulador del receptor
opioide μ a nivel espinal ante estímulos térmicos de diferente naturaleza
(Matthes et al., 1996). Los ratones deficientes en el receptor δ no presentan
modificaciones en su umbral nociceptivo ante estímulos agudos (Zhu et al.,
1999; Filliol et al., 2000). Igualmente, los animales deficientes en el receptor
opioide κ presentan un umbral nociceptivo menor en respuesta a un dolor
químico visceral, pero no ante estímulos térmicos, mecánicos o inflamatorios
(Simonin et al., 1998).

3.5.1.1. Efectos antinociceptivos a nivel supraespinal. Los opioides ejercen

efectos directos sobre el procesamiento del estímulo doloroso en centros
superiores como el tálamo, la corteza y la amígdala. Se ha sugerido también,
que los opioides pueden controlar las vías descendientes inhibidoras del dolor
a nivel supraespinal, en los centros que parten del tronco cerebral como la
sustancia gris periacueductal, locus coeruleus y núcleo del rafe magnus (Jones
& Gebhart, 1988). El uso de técnicas farmacológicas como la administración de
agonistas opioides tiene la limitación de que presentan diferentes afinidades
para cada uno de los receptores. Es por esto que hay estudios que han
sugerido que parte de los efectos antinociceptivos producidos por agonistas δ,
vienen mediados realmente por su interacción a nivel de receptores μ. Así,
Hutcheson y colaboradores (1999) observaron que el antagonista opioide μ
ciprodime bloqueaba los efectos analgésicos de una administración central del

83
péptido opioide BUBU (con alta afinidad por el receptor δ) en los test de la
placa caliente y de la inmersión de la cola, mientras que el antagonista δ-
especifico naltrindol solo disminuía los efectos antinociceptivos del BUBU en el
test de inmersión de la cola. En concordancia con estas observaciones,
estudios realizados en animales deficientes en el receptor opioide μ han
descrito que parte de los efectos antinociceptivos del agonista δ DPDPE están
disminuidos en estos ratones (Matthes et al., 1998; Hosohata et al., 2000).
Igualmente, Zhu y colaboradores (1999) han demostrado que diferentes
agonistas δ mantienen sus efectos analgésicos a nivel supraespinal en
animales deficientes en el receptor opioide δ, y que son parcialmente
antagonizados por el naltrindol (antagonista δ).

Estudios anatómicos han mostrado que los receptores opioides que se

expresan predominantemente en zonas implicadas en el control nociceptivo
(como por ejemplo el tálamo, la sustancia gris periacueductal y los núcleos del
rafe) son μ y κ, mientras que los receptores delta se encuentran localizados
predominantemente en el estriado, la corteza y la sustancia negra.

Estas observaciones sugieren que a nivel supraespinal el receptor μ juega un

papel predominante en los efectos antinociceptivos.

3.5.1.2. Efectos antinociceptivos a nivel espinal. A nivel espinal, numerosos

estudios farmacológicos y electrofisiológicos han descrito una implicación de
los receptores μ, δ y κ (Yaksh & Rudy, 1977; Przewlocki et al., 1983; Porreca et
al., 1984). Además, la presencia de ARNm de los tres receptores en zonas de
la médula espinal implicadas en control de los estímulos dolorosos como los
ganglios del asta dorsal, apoyan esta hipótesis (Mansour et al., 1995b). Así, la
administración intratecal de agonistas μ produce efectos antinociceptivos en el
test de la retirada de la cola y en el test de la placa caliente (Bernatzky & Jurna,
1986; Stevens & Yaksh, 1989). Estos efectos son revertidos tras la
administración de naloxona pero no se vieron modificados por los antagonistas
específicos δ (Paul et al., 1989; Drower et al., 1991).

84
Los agonistas δ también presentan actividad antinociceptiva a nivel espinal en
diferentes tests como el de la retirada de la cola y la placa caliente (Porreca et
al., 1984). Su efecto antinociceptivo es revertido por antagonistas δ, pero no μ
(Sofuoglu et al., 1991; Traynor et al., 1990).

Los receptores κ también participan en el control de las respuestas

nociceptivas ante estímulos de naturaleza mecánica y térmica a nivel espinal.
Sin embargo, los agonistas κ son ineficaces modulando otros tipos de
estímulos nociceptivos como el estímulo eléctrico (Millan et al., 1989; Millan,
1989).

Estudios realizados mediante técnicas electrofisiológicas han demostrado que

la activación de los receptores μ, δ y κ es capaz de disminuir la actividad
eléctrica de las fibras C, que son las responsables de la transmisión del
estímulo doloroso a nivel periférico (Dickenson et al., 1987; Sullivan &
Dickenson, 1991).

3.5.1.3. Efectos antinociceptivos a nivel periférico. Los opioides también

pueden ejercer efectos analgésicos cuando son administrados localmente a
nivel periférico, bajo ciertas condiciones patológicas como la inflamación. Así
mismo se ha observado un potente efecto antiinflamatorio de los agonistas μ y
κ (para revisión, ver Stein et al., 2001a). Una liberación de péptidos opioides ha
sido descrita en células del tejido inmunológico en procesos inflamatorios que
podrían activar receptores opioides localizados en terminales nerviosos
sensoriales (para revisión ver; Cabot, 2001).

3.5.2. Actividad locomotora. La activación de los receptores opioides μ y δ

producen efectos hiperlocomotores en el ratón (Murray & Cowan, 1990; Di
Chiara & North, 1992), mientras que la activación de los receptores κ produce
ataxia y efectos sedantes (Pfeiffer et al., 1986). Sin embargo, en las ratas, los
agonistas μ producen un efecto bifásico, hiperlocomotor a dosis bajas e
hipolocomotor a dosis elevadas (Mansour et al., 1995b). Los efectos inducidos
por los agonistas opioides sobre la actividad motora se han relacionado

85
principalmente con interacciones a nivel de la transmisión dopaminérgica
mesolímbica y nigroestriatal, aunque algunos autores también muestran la
importancia de proyecciones no dopaminérgica de la sustancia negra en dichos
efectos motores (Matsumoto et al., 1988). Los agonistas opioides μ y δ pueden
aumentar los niveles extracelulares de DA en el núcleo accumbens y estriado,
mientras que los agonistas opioides κ exhiben la acción opuesta (Di Chiara &
Imperato, 1988; Pan, 1998). Estudios sobre locomoción realizados en ratones
modificados genéticamente han descrito que los ratones deficientes en el
receptor μ presentan como fenotipo espontáneo un estado de hipolocomoción
(Matthes et al., 1996), los deficientes en el receptor δ son hiperlocomotores
(Filliol et al., 2000), mientras que los κ no presentan una modificación en sus
respuestas (Simonin et al., 1998).

3.5.3. Memoria. Los agonistas opioides producen efectos importantes sobre los
procesos de memoria. Los agonistas μ-selectivos DAMGO y TAPA, y los
agonistas δ-selectivos DADLE y deltorfina II deterioran los procesos de
memoria a corto y/o largo plazo (Ukai et al., 1993b; Ukai et al., 1997; Itoh et al.,
1994), mientras que el agonista κ dinorfina A-(1-13) mejora el aprendizaje y la
memoria en tareas aversivas y no-aversivas (Ukai et al., 1993a). La activación
selectiva del receptor opioide μ por la administración de DAMGO deteriora la
memoria de trabajo en el test de la alternancia espontánea en el ratón. Por otra
parte, la dinorfina administrada a dosis subefectivas mejora los efectos
inducidos por DAMGO en este test de memoria (Itoh et al., 1994). La dinorfina
también mejora la disfunción de memoria en un modelo animal de amnesia, la
prueba de retención de una respuesta de evitación inhibitoria (Ilyutchenok &
Dubrovina, 1995). Estos efectos de la dinorfina son revertidos totalmente por el
tratamiento previo con nor-binaltorfimina. Por otra parte, estudios in vitro
realizados en neuronas del hipocampo han mostrado que los agonistas μ y κ
tienen acciones opuestas sobre la LTP. Los agonistas μ facilitan la inducción de
la LTP, mientras que los agonistas κ, como U69593 o dinorfina inhiben la LTP,
efecto que es revertido por la nor-binaltorfimina (Simmons & Chavkin, 1996;
Weisskopf et al., 1993; Wagner et al., 1993).

86
3.5.4. Efectos endocrinos. Los opioides ejercen una gran variedad de efectos
sobre el sistema endocrino mediados esencialmente a nivel del hipotálamo,
aunque también se han descrito efectos a nivel de la hipófisis (para revisión,
ver Morley, 1981). Así, la administración aguda de morfina en la rata, estimula
la liberación de la hormona de crecimiento y de prolactina (Bruni et al., 1977)
de manera dosis dependiente (Martin et al., 1975), así como la liberación de
corticosterona (Jezova et al., 1982). Por el contrario, la administración aguda
de una dosis alta de morfina inhibe la liberación de TSH (Bruni et al., 1977), LH
y FSH (Cicero et al., 1976).

3.6. Tolerancia y dependencia. La adicción a los opioides es un desorden

caracterizado por el uso compulsivo de la droga, sin poder moderar el consumo
de la misma. Diferentes estudios realizados en animales de laboratorio han
sugerido que al igual que los psicostimulantes, los opioides inicialmente se
consumen por sus efectos reforzantes y hedónicos. Sin embargo el uso
repetido de estas sustancias produce alteraciones en sistemas de
neurotransmisores que conducen a un uso compulsivo de las mismas y a una
pérdida del control sobre el consumo, produciendo un estado de dependencia.
En esta situación, el cese en el consumo de la droga desencadena un
síndrome de abstinencia físico y motivacional.

3.6.1. Tolerancia. La tolerancia está definida como la respuesta disminuida a

una droga tras su administración repetida, o como la necesidad de dosis
crecientes de una droga para obtener el mismo efecto farmacológico. Se
desarrolla un grado importante de tolerancia a la mayoría de los efectos
farmacológicos de los opioides incluyendo la analgesia, euforia, disforia,
sedación, depresión respiratoria, antidiuresis, náusea/vómito y supresión de la
tos. Niveles intermedios de tolerancia se observan a otros efectos opioides
tales como la bradicardia. Niveles bajos o nulos se han observado a los efectos
de los opioides sobre la miosis, el estreñimiento y las convulsiones (Way et al.,
1998).

87
Los mecanismos implicados en la tolerancia opioide son extremadamente
complejos e incluyen fenómenos de aprendizaje, cambios compensatorios en
los circuitos neuronales y desensibilización en los mecanismos de transducción
intracelular. Estas formas de tolerancia se pueden distinguir en base a la
especificidad de los cambios (homólogos o heterólogos) así como en su
desarrollo temporal (de segundos o minutos a días o más).

Una forma rápida de tolerancia ocurre tras la desensibilización de los

receptores opioides. Se desarrolla en segundos o minutos después de la
administración aguda del agonista y es de naturaleza homóloga ya que afecta
al propio receptor opioide. Consiste en un desacoplamiento entre el receptor y
la proteína G y ocurre tras la administración de una dosis alta de agonista
(Johnson & Fleming, 1989). En el desarrollo de dicha desensibilización están
implicadas una familia de proteínas que se expresan en el cerebro
denominadas RGS (Regulator of G protein Signaling). Estas aceleran el cambio
de GTP a GDP en las subunidades α de las proteínas Gi, Go y Gq (Dohlman &
Thorner, 1997), forzando la reasociación de las subunidades β/γ con la
subunidad α de las proteínas G e inhibiendo su activación. Se cree que este
proceso participa en la desensibilización de los canales de K+ mediada por
agonistas opioides μ (Doupnik et al., 1997; Chuang et al., 1998).

La tolerancia a los efectos de los opioides también está controlada por

procesos de fosforilación e internalización de los receptores. La fosforilación del
receptor se produce mediante la activación de una familia de proteínas
denominadas GRK (G protein coupled receptor Kinase). Esta fosforilación
permite la posterior unión de la proteína β-arrestina al receptor que impide la
formación del complejo receptor-proteína G y facilitan su internalización. Así, se
ha observado que la morfina administrada crónicamente produce un
incremento en los niveles de β-arrestina en el locus coeruleus (Terwilliger et al.,
1994). Igualmente, estudios realizados en ratones deficientes en la β-arrestina
han demostrado que presentan una potenciación y prolongación de los efectos
analgésicos de la morfina y no desarrollan fenómenos de tolerancia a esta
droga. Los autores sugieren que ello es debido a la ausencia de
desensibilización del receptor μ. Es interesante comentar que la delección de la
β-arrestina no previene la sobreregulación de la actividad AC inducida por la

88
morfina, y la expresión de la dependencia física a la morfina no se vio
modificada en estos animales knockout (Bohn et al., 1999; Bohn et al., 2000).

Sin embargo, otros estudios han sugerido que la activación de la β-arrestina no

está implicada en el desarrollo de la tolerancia a la morfina. Así, se ha
demostrado que este opioide no es capaz de inducir la internalización del
receptor μ mediada por la β-arrestina en cultivos celulares y neuronales (Zhang
et al., 1998a; Whistler & von Zastrow, 1998; Whistler et al., 1999). Los autores
sugieren que la tolerancia morfínica ocurre debido a la activación mantenida
durante un tiempo anormalmente largo de los sistemas de señalización
intracelular (Whistler et al., 1999). También se propuso la disociación entre dos
tipos de mecanismos diferentes subyacentes a la tolerancia opioide: la
tolerancia debida a fenómenos de desensibilización y disminución del número
de receptores opioides, y la tolerancia debida a niveles basales elevados de
AMPc (Finn & Whistler, 2001).

Además de las adaptaciones que se producen a nivel del receptor, los

mecanismos de la tolerancia incluyen alteraciones importantes en los
mecanismos de señalización intracelular. El tratamiento crónico con opioides
produce cambios a nivel de las proteínas G (Ammer et al., 1991) y del sistema
del AC (Chakrabarti et al., 1998). Así, la administración repetida de diferentes
agonistas opioides produce un incremento en los niveles de proteína G. Este
fenómeno es revertido tras el cese del tratamiento crónico.

La sobreregulación de la vía del AMPc, fue descrita inicialmente en líneas

celulares híbridas de neuroblastoma/glioma (Sharma et al., 1975) y observado
posteriormente en neuronas (para revisión, ver Nestler & Aghajanian, 1997).
Esta regulación incluye aumentos de la actividad AC y de la PKA (Duman et al.,
1988; Nestler & Tallman, 1988; Matsuoka et al., 1994) en varias regiones del
cerebro, incluyendo el locus coeruleus, mediados al menos en parte por el
factor de transcripción CREB (Lane-Ladd et al., 1997). Otros elementos del
sistema de señalización intracelular también están alterados tras la exposición
crónica a opioides, incluyendo los canales Ca2+ y K+ y la vía de las MAP
quinasas (para revisión, ver Williams et al., 2001). Modificaciones inducidas a
nivel de los receptores glutamatérgicos, proteínas del esqueleto celular o de
factores neurotróficos también parecen estar implicados en los cambios

89
adaptativos que se producen durante la administración crónica de opioides
(para revisión, ver Nestler, 1996). Así, se ha descrito que la coadministración
de antagonistas competitivos o no competitivos de los receptores NMDA, en
determinadas condiciones experimentales, puede bloquear el desarrollo de la
tolerancia a los efectos analgésicos y de la dependencia física a los opiáceos.

3.6.2. Dependencia física. La dependencia física consiste en una alteración

fisiológica producida por la exposición crónica a una droga y que se manifiesta
tras el cese de dicha administración por la aparición de un cortejo de
alteraciones somáticas y conductuales que constituye el síndrome de
abstinencia. En humanos, el síndrome de abstinencia físico de los opioides
comporta una serie de síntomas que incluyen calambres, anorexia, ansiedad,
insomnio, deseo irrefrenable de consumo de la droga, cefalea, nauseas,
disforia, fatiga, irritabilidad, oleadas de calor y frío, mialgias, bostezos,
sudoración e inquietud. También se ha observado un conjunto de signos
somáticos que incluyen diarrea, elevación de la presión arterial, fiebre
moderada, taquicardia, midriasis, lagrimeo, piloerección, espasmos
musculares, vómitos y rinorrea (Himmelsbach, 1941). En roedores, el síndrome
de abstinencia opioide incluye signos somáticos y vegetativos tales como
saltos, sacudidas de perro mojado, temblor de patas, movimientos
estereotípicos (“sniffing”), castañeteo de dientes, temblor, piloerección, ptosis,
perdida de peso, diarrea e hipotermia (Wei, 1973).

Aunque el término dependencia fue originalmente utilizado para describir el

fenómeno de la dependencia física, más recientemente se ha establecido el
término de dependencia psicológica, que incluye síntomas emocionales o
motivacionales debidos a la abstinencia de la droga (Koob & Le Moal, 2001).
Este último componente de la dependencia es probablemente uno de los
determinantes más importantes para la consolidación del proceso adictivo.

Las adaptaciones a nivel molecular que subyacen al fenómeno de la

dependencia de opioides no pueden explicarse por variaciones en los niveles
de péptidos opioides endógenos o cambios en el número y/o afinidad de los
receptores opioides. Por el contrario, cambios en las vías de señalización

90
intracelular han sido identificados como factores importantes que contribuyen al
desarrollo de la dependencia física.

Diferentes estudios conductuales, farmacológicos, bioquímicos y

electrofisiológicos han demostrado que el locus coeruleus juega un papel
fundamental en los procesos de dependencia de opioides (para revisión ver,
Maldonado, 1997). El locus coeruleus es el mayor núcleo noradrenérgico del
cerebro y es importante en el control de estados atencionales y de la actividad
del sistema nervioso autónomo. La administración aguda de un opioide en el
locus coeruleus produce la inhibición de la vía del AMPc, así como la activación
de canales de K+ rectificadores de voltaje mediante la acción directa de las
subunidades βγ de la proteína G (Figura 8). Además, la inhibición de la
actividad PKA produce una disminución de las corrientes de Na+ en estas
neuronas. En consecuencia, estás modificaciones tienen como efecto final la
inhibición de la actividad neuronal en el locus coeruleus. Sin embargo, el
tratamiento crónico con opioides produce un conjunto de adaptaciones que
permiten un funcionamiento normal del locus coeruleus en presencia de la
droga. Así, la vía del AMPc se regula al alza, y como resultado hay un aumento
en la concentración de AC, actividad PKA y posiblemente en la permeabilidad
de los canales de Na+ que permite a las neuronas del locus coeruleus recobrar
su actividad normal. Los mecanismos moleculares que subyacen en la
sobreregulación de la vía del AMPc en el locus coeruleus, se deben
principalmente a la sobreexpresión de dos isoformas de la AC, los tipos I y VIII
(Matsuoka et al., 1994) así como a la regulación al alza de las subunidades
catalítica y reguladora tipo II de la PKA (Nestler & Tallman, 1988; Lane-Ladd et
al., 1997; Nestler & Aghajanian, 1997).

En esta situación, la administración de un antagonista opioide produce una

hiperactivación de las neuronas del locus coeruleus debido a la
sobreregulación de la vía del AMPc, y consecuentemente se desencadena un
síndrome de abstinencia.

Parte de la activación de las neuronas del locus coeruleus durante el síndrome

de abstinencia a los opioides se produce a través de un mecanismo extrínseco.

91
Figura 8. Esquema ilustrando las acciones de la morfina en el locus
coeruleus. Las flechas gruesas indican cambios compensatorios
inducidos por el tratamiento crónico con la droga.

92
En concreto, se debe a un aumento en la actividad glutamatérgica procedente
del núcleo paragigantocelular lateral (Rasmussen, 1991). Este efecto parece
estar mediado también por una sobreexpresión de la vía del AMPc en el núcleo
paragigantocelular y otras áreas del cerebro que lo inervan. La administración
de antagonistas glutamatérgicos a nivel del locus coeruleus así como las
lesiones a nivel del núcleo paragigantocelular atenúan el incremento en la
actividad de las neuronas del locus coeruleus (Rasmussen, 1995).

Mecanismos transcripcionales y postransduccionales parecen mediar estas

adaptaciones. Respecto a los primeros, los opioides regulan el factor de
transcripción CREB, que está en parte implicado en los efectos que la vía del
AMPc tiene en la regulación de la expresión de genes. El uso prolongado de
opioides aumenta la expresión de CREB en el locus coeruleus (Nestler, 1993).
Este aumento en la expresión parece estar mediado por un mecanismo
homeostático autoregulador. Así, los opioides producen una disminución en los
niveles de CREB fosforilado (el activado). Para compensar esta disminución, se
incrementa la transcripción del gen CREB. A su vez, el CREB incrementa la
expresión del AC tipo VIII, ya que el gen que codifica para la AC contiene
secuencias CRE en su región promotora.

Ratones knockout deficientes en las subunidades α y δ de CREB mostraron

una disminución importante del síndrome de abstinencia opioide (Maldonado et
al., 1996), apoyando un papel importante de este factor de transcripción en las
manifestaciones comportamentales de la dependencia opioide. Sin embargo, la
sobreexpresión de la PKA inducida por opioides no está regulada por la
proteína CREB, ya que el promotor del gen que codifica a esta quinasa no
posee secuencias CRE.

La dependencia física a los opioides está principalmente vinculada a los

receptores opioides μ, aunque los receptores δ y κ parecen estar involucrados
también (Maldonado et al., 1992a; Simonin et al., 1998; Matthes et al., 1996;
Maldonado et al., 1989). Así, estudios farmacológicos han demostrado que el
síndrome de abstinencia opioide más severo se observa tras el tratamiento
crónico con agonistas selectivos μ (Cowan et al., 1988). Resultados similares
se han descrito mediante el uso de antagonistas específicos para cada receptor
opioide. Así, ratas dependientes a la morfina mostraron un síndrome de

93
abstinencia desencadenado por antagonistas μ. La administración de
antagonistas δ y κ produjo una respuesta menor (Maldonado et al., 1992a).
Estas observaciones han sido confirmadas en estudios realizados en ratones
knockout, demostrándose que el receptor opioide μ es fundamental en la
mediación de estas respuestas (Matthes et al., 1996). Ratones knockout en el
receptor κ presentaron una disminución en el síndrome (Simonin et al., 1998).

3.7 Opioides y sistemas de recompensa.

3.7.1. Efectos gratificantes de los opioides y sistema mesolímbico

dopaminérgico. La administración sistémica de agonistas opioides produce
efectos gratificantes en múltiples modelos experimentales (Van Ree, 1979; De
Vry et al., 1989; Mucha & Iversen, 1984). La activación del sistema
dopaminérgico mesolímbico participa en dichos efectos. Esta hipótesis fue
inicialmente sugerida por estudios realizados mediante lesiones neurotóxicas
(Bozarth & Wise, 1981a; Wise & Bozarth, 1985). La capacidad de los opioides
de activar el sistema dopaminérgico mesolímbico ha sido demostrada en
estudios electrofisiológicos (Ostrowski et al., 1982), neuroquímicos (Di Chiara &
Imperato, 1988; Wood et al., 1980) y comportamentales (Holmes et al., 1983;
Holmes & Wise, 1985; Iversen & Joyce, 1978). En acuerdo con estos
resultados, los roedores aprenden a autoadministrarse morfina directamente en
el área tegmental ventral (Bozarth & Wise, 1981b; Devine & Wise, 1994).
Además, la morfina no produce efectos reforzantes en ratones deficientes en el
receptor dopaminérgico D2 (Maldonado et al., 1997).

Sin embargo, los opioides también pueden producir efectos gratificantes a

través de un mecanismo independiente de la liberación de dopamina (para
revisión, ver Van Ree & Ramsey, 1987). Así, la heroína y los péptidos opioides
son auto-administrados directamente en el núcleo accumbens (Olds, 1982;
Goeders et al., 1984). Por otra parte, las propiedades gratificantes de la
heroína también fueron atenuadas por lesiones en el núcleo accumbens que no
afectan la actividad dopaminérgica (Zito et al., 1985). Por lo tanto, se considera
que los efectos gratificantes de los opioides están mediados tanto por
mecanismos dependientes como independientes del sistema dopaminérgico
mesocorticolímbico.

94
3.7.2. Implicación de cada subtipo de receptor opioide. Los tres subtipos de
receptores opioides tienen efectos intracelulares similares produciendo la
inhibición de la actividad neuronal. Sin embargo, debido a la distribución
neuroanatómica específica de cada subtipo de receptor, éstos pueden producir
efectos motivacionales opuestos.

3.7.2.1. Receptor μ. Se ha sugerido un papel predominante del receptor

opioide μ en la mediación de los efectos gratificantes de los opioides (Spanagel
et al., 1990; Johnson & North, 1992; Devine et al., 1993). Este papel
fundamental fue confirmado gracias a la generación de ratones deficientes en
receptor opioide μ. En estos animales, la morfina no produjo efectos
reforzantes en el test de condicionamiento espacial (Matthes et al., 1996).
Tampoco mostraron la conducta de autoadminstración de morfina (Becker et
al., 2000). Los receptores opioides μ están localizados en interneuronas
GABAérgicas del área tegmental ventral que controlan la actividad mesolímbica
dopaminérgica. Los agonistas opioides activan indirectamente las neuronas
dopaminérgicas mediante la inhibición de la liberación de GABA (Johnson &
North, 1992). La presencia de receptores opioides μ también ha sido descrita
en el núcleo accumbens. Esta observación apoya la hipótesis de una posible
acción dopamina-independiente de los opioides sobre este sistema (Koob,
1992). Así, el bloqueo farmacológico de los receptores μ en el área ventral
tegmental o el núcleo accumbens atenúan la conducta de autoadministración
de heroína. Igualmente se ha observado una respuesta de autoadministración
de agonistas opioides μ en ambas estructuras (Shippenberg & Elmer, 1998).

3.7.2.2. Receptores δ. A nivel del sistema dopaminérgico mesolímbico, los

receptores opioides δ están localizados en las dos subdivisiones del núcleo
accumbens (core y shell), así como en el área tegmental ventral (Mansour et
al., 1993). La activación de los receptores opioides δ produce efectos
gratificantes en el test de condicionamiento espacial (Shippenberg et al., 1987;
Suzuki et al., 1997). Sin embargo, estudios recientes han mostrado que el

95
agonista δ, deltorfina II no produce efectos reforzantes en los ratones
deficientes en el receptor opioide μ (Hutcheson et al., 2001). Por consiguiente
no puede excluirse la posibilidad de que una activación parcial de los
receptores opioides μ por los agonistas teóricamente específicos δ pueda
participar en las respuestas motivacionales de estos compuestos. En
consecuencia, la contribución exacta de los receptores δ en los efectos
reforzantes permanece incierta.

3.7.2.3. Receptores κ. Los receptores opioides κ están localizados en el

núcleo accumbens, a nivel presináptico en las neuronas dopaminérgicas. Su
activación produce la inhibición de dichas neuronas, y disminuye la liberación
de dopamina. Así, los receptores opioides κ produce efectos aversivos (Mucha
& Herz, 1985). Se ha descrito la presencia de estos receptores en el área
tegmental ventral, y se ha demostrado que la administración de agonistas κ
directamente en esta región también produce efectos aversivos (Bals-Kubik et
al., 1993).

3.7.3. Sensibilización a los efectos inducidos por los opioides. El proceso

adictivo se mantiene a causa del efecto reforzante de la droga y de la
motivación para aliviar los efectos aversivos del síndrome. Sin embargo, tanto
los efectos reforzantes como los síntomas físicos de la abstienencia
desaparecen relativamente rápido después del cese en el consumo de la droga
y no pueden explicar la recaída tras un largo periodo de abstinencia. Cambios
relativamente permanentes que se producen en diferentes regiones cerebrales,
entre ellas el sistema dopaminérgico mesolímbico, podrían estar involucrados
en este fenómeno. Así, se ha observado que el deseo por la droga se puede
intensificar con el uso repetido, y puede persistir tras largos periodos de
abstinencia. Este proceso se ha denominado sensibilización y ha sido
ampliamente demostrado en animales de laboratorio. La sensibilización se
manifiesta por un aumento en la actividad locomotora, conductas
estereotipadas y efectos reforzantes tras la administración crónica de
psicostimulantes, opioides, nicotina o THC (Vanderschuren & Kalivas, 2000a;

96
Cadoni et al., 2001; Balfour et al., 1998). También se ha observado una
sensibilización cruzada entre diferentes drogas, indicando la existencia de un
mecanismo neurobiológico común para ellas.

3.7.3.1. Adaptaciones a nivel del área ventral tegmental. La manifestación del

fenómeno de la sensibilización requiere una activación persistente del sistema
dopaminérgico mesolímbico. Se ha demostrado que la administración directa
en el área ventral tegmental de diferentes drogas de abuso induce un
fenómeno de sensibilización (para revision ver, Vanderschuren & Kalivas,
2000a). Dicha sensibilización en el área ventral tegmental debe involucrar una
subsensibilidad de los autoreceptores D2. Los receptores D2 no parecen estar
regulados a la baja, pero se ha descrito una disminución transitoria en la
expresion de la subunidad α de las proteínas Gi/o en el área ventral tegmental
después de un tratamiento prolongado con diferentes tipos de drogas, que
produciría una disminución de la funcionalidad del receptor (Self & Nestler, ). A
favor de esta hipótesis, la inactivacion de estas proteínas G con toxina
pertussis puede producir sensibilización conductual a una administración
posterior de cocaína (Steketee & Kalivas, 1991). Esta sensibilización puede
persistir incluso después de que los niveles de proteína G vuelvan al nivel
basal, sugiriendo que cambios de poca duración en las proteínas G juegan un
papel en la inducción, pero no en la expresión, de esta sensibilización.

Un tratamiento prolongado con diferentes tipos de drogas también puede

producir adaptaciones en el sistema glutamatérgico en el área ventral
tegmental que deben ser importantes en los fenómenos de sensibilización. Se
ha observado que un tratamiento prolongado con psicostimulantes, opioides o
etanol incrementa la expresión de ciertas subunidades del receptor
glutamatérgico AMPA (Fitzgerald et al., 1996). Por otra parte el incremento en
la expresión de la subunidad GluR1 del receptor AMPA a nivel del área ventral
tegmental produce una sensibilización a los efectos estimulantes de la morfina
(Carlezon, Jr. et al., 1997).

97
3.7.3.2. Adaptaciones a nivel del núcleo accumbens. Un incremento en la
liberación de dopamina en el núcleo accumbens ha sido asociado al fenomeno
de la sensibilización. Este efecto puede persistir semanas tras el cese del
tratamiento crónico con opioides o psicoestimulantes (Vanderschuren &
Kalivas, 2000b). Se desconocen los mecanismos implicados, pero posibles
cambios en la regulación de la vía del AMPc en el núcleo accumbens parecen
estar involucrado en estos procesos (Pierce & Kalivas, 1997). En acuerdo con
esta hipótesis, el incremento en la actividad de la vía del AMPc en el núcleus
accumbens aumenta la respuesta locomotora y potencia el desarrollo de la
sensibilización a la cocaína (Miserendino & Nestler, 1995).

3.7.3.3. Papel de la expresión de genes a largo plazo. Cambios en la expresión

de genes producidos por el tratamiento con drogas pueden estar involucrados
en el desarrollo de la adicción. En este sentido, modificaciones en la expresión
y funcionalidad de CREB inducidos por las drogas de abuso se observan
durante un periodo de tiempo relativamente corto, y están implicados en
aspectos de la adicción que también perduran un periodo de tiempo
relativamente corto tras el cese en el consumo de la droga, como el síndrome
de abstinencia (Maldonado et al., 1996). Sin embargo, se ha descrito
recientemente que el factor de transcripción ΔFosB puede acumularse en las
neuronas durante largos periodos de tiempo tras la administración de
determinadas drogas de abuso (para revisión ver, Nestler, 2001). A diferencia
de otros miembros de la misma familia Fos, los cuales se inducen rápidamente
y de forma transitoria, ΔFosB se induce débilmente por un estímulo inicial. Sin
embargo, tras una estimulación repetida, ΔFosB comienza a acumularse en las
neuronas debido a su gran estabilidad. Este fenómeno se ha descrito tras la
administración de diferentes tipos de drogas de abuso, como la cocaína,
anfetamina, opioides, nicotina y etanol (Nestler et al., 2001). Todas ellas
inducen ΔFosB en el núcleo accumbens y regiones estriatales relacionadas.
Esta induccion parece ser específica de neuronas espinosas de tamaño medio
GABAérgicas que coexpresan dinorfina y sustancia P (Nye et al., 1995;
Moratalla et al., 1996). Estudios recientes han demostrado que la inducción de
ΔFosB en estas neuronas puede producir respuestas conductuales

98
sensibilizadas a las drogas de abuso (Kelz et al., 1999). La acumulación de
ΔFosB representa un mecanismo molecular por el cual las drogas de abuso
pueden inducir cambios en la expresión de genes que persisten durante un
periodo de tiempo largo tras el cese de la administración. Sin embargo, los
genes diana a través de los cuales ΔFosB y otros mecanismos de transcripción
ejercen sus efectos en la plasticidad neuronal y conductual se desconocen.
Entre los genes diana del ΔFosB en el núcleo accumbens, podrían estar
algunas subunidades del receptor glutamatérgico AMPA (Nestler et al., 2001).
Estos cambios podrían explicar las alteraciones de las respuestas de los
receptores AMPA en estas neuronas tras un tratamiento crónico con cocaína.

Aunque ΔFosB tiene una vida media muy larga, finalmente es degradado por
proteólisis. Por ello, resulta dificil suponer que el ΔFosB sea el único factor que
media los cambios a largo plazo en la conducta que acompañan a la adicción.
Sin embargo, estas modificaciones en la regulación de los factores de
transcripción pueden dar lugar a alteraciones en la morfología y la estructura
sináptica que desencadenen en último término los cambios a largo plazo que
acompañan a los fenómenos adictivos.

3.7.4. Efectos disfóricos/aversivos de la abstinencia opioide. Una reducción en

la actividad del sistema dopaminérgico mesolímbico ha sido observada durante
el síndrome de abstinencia opioide (Diana et al., 1995). Se ha sugerido que
esta disminución de la actividad dopaminérgica participa en los efectos
motivacionales del síndrome de abstinencia opioide (Koob et al., 1989). Así, los
antagonistas D2 inducen signos afectivos del síndrome de abstinencia en
animales dependientes de morfina (Funada & Shippenberg, 1996).

La sobreregulación de la vía del AMPc en el núcleo accumbens es una

adaptación observada tras la administración crónica de diferentes tipos de
drogas, entre ellas los opioides. En concreto consiste en un aumento en los
niveles de AC y PKA, y una disminución en los niveles de Gi/o. El núcleo
accumbens es un área rica en el subtipo V del AC (Glatt & Snyder, 1993; Mons
& Cooper, 1995). Esta isoforma está inhibida por la acción aguda de los

99
opioides y su expresión se incrementa tras un tratamiento crónico con este tipo
de drogas (Avidor-Reiss et al., 1996; Avidor-Reiss et al., 1997).

El tratamiento crónico con morfina y otras drogas de abuso también altera la

funcionalidad de CREB en el núcleo accumbens y otras regiones estriatales
relacionadas (Nestler, 2001). Esta modificación afecta a la expresión de genes
que contienen secuencias CRE en el promotor. En este sentido, la cocaína y la
anfetamina pueden inducir la expresión del gen de la prodinorfina, el cual
contiene secuencias CRE. Igualmente se ha observado un incremento en los
niveles de expresión de dinorfina en el estriado tras un tratamiento crónico con
morfina que podria estar implicado en los efectos disfóricos de la abstinencia
(Trujillo et al., 1995). En acuerdo con esta hipótesis, los agonistas κ producen
efectos disfóricos mediante la inhibición de la liberación de dopamina en el
núcleo accumbens activando receptores que se hallan en esta estructura
(Shippenberg & Elmer, 1998).

La administración crónica de opioides produce igualmente adaptaciones en

otras áreas y sistemas neuronales. Entre éstos, se ha descrito una alteración
en la actividad de neuronas que contienen CRF. El CRF es un neuropéptido
que se expresa en elevada concentración en neuronas del hipotálamo y núcleo
central de la amígdala. Juega un papel importante en la respuesta al estrés,
manifestación de estados de ansiedad y en la regulación de la liberación de
dopamina y opioides en el sistema límbico (Sarnyai et al., 2001). Diversos
estudios han implicado este neuropéptido en la mediación de las
manifestaciones ansiogénicas y aversivas del síndrome de abstiencia a las
drogas de abuso. En concreto se ha observado una activación en las neuronas
que contienen CRF del núcleo central de la amígdala durante el síndrome de
abstinencia a opioides y a otras drogas de abuso como el etanol o los
cannabinoides (Koob, 1996; Rodriguez et al., 1997; Merlo et al., 1995). Por otra
parte, antagonistas del CRF revierten los efectos aversivos del sindrome de
abstinencia a los opioides y etanol (Heinrichs et al., 1995b; Rassnick et al.,
1993).

100
1- Estudiar la implicación del sistema cannabinoide endógeno en las
respuestas emocionales de tipo ansioso, depresivo y agresivo mediante el uso
de ratones knockout deficientes en el receptor CB1.

2- Estudiar la implicación del sistema cannabinoide endógeno en los

procesos de memoria y aprendizaje mediante el uso de ratones knockout
deficientes en el receptor CB1.

3- Estudiar la implicación del sistema cannabinoide endógeno en la

modulación de los fenómenos de adicción y dependencia a drogas de abuso
mediante el uso de ratones knockout deficientes en el receptor CB1.

4- Estudiar la implicación del sistema PACAP en la regulación del ritmo

circadiano, de los procesos de memoria y aprendizaje y de las respuestas
emocionales de tipo ansioso mediante el empleo de diferentes líneas de
ratones knockout deficientes en el receptor PAC1.

5- Estudiar la implicación del sistema PACAP en la regulación de las

respuestas nociceptivas basales y los efectos antinociceptivos de la morfina
mediante el empleo de diferentes líneas de ratones knockout deficientes en el
receptor PAC1.

6- Estudiar la implicación del sistema PACAP en la modulación de los

fenómenos de dependencia de morfina y etanol.

7- Estudiar la participación de los diferentes receptores opioides en la

modulación de las respuestas nociceptivas basales mediante el empleo de
ratones knockout deficientes en los receptores opioides μ, δ o κ, así como en
dobles y triples knockouts.

102
ARTÍCULO I
Martin M, Ledent C, Parmentier M, Maldonado R, Valverde O.
Cocaine, but not morphine, induces conditioned place
preference and sensitization to locomotor responses in CB1
knockout mice.
Eur J Neurosci. 2000 Nov;12(11):4038-46.
ARTÍCULO II

103
Martin M, Ledent C, Parmentier M, Maldonado R, Valverde O.
Involvement of CB1 cannabinoid receptors in emotional
behaviour.
Psychopharmacology (Berl). 2002 Feb;159(4):379-87. Epub
2001 Nov 20.
ARTÍCULO III

113
Otto C, Martin M, Wolfer DP, Lipp HP, Maldonado R, Schütz G.
Altered emotional behavior in PACAP-type-I-receptor-deficient
mice.
Brain Res Mol Brain Res. 2001 Aug 15;92(1-2):78-84.
ARTÍCULO IV

123
Martin M, Otto C, Santamarta MT, Torrecilla M, Pineda J,
Schütz G, Maldonado R.
Morphine withdrawal is modified in pituitary adenylate
cyclase-activating polypeptide type I-receptor-deficient
mice.
Brain Res Mol Brain Res. 2003 Jan 31;110(1):109-18.
ARTÍCULO V

131
Otto C, Kovalchuk Y, Wolfer DP, Gass P, Martin M,
Zuschratter W, Gröne HJ, Kellendonk C, Tronche F, Maldonado
R, Lipp HP, Konnerth A, Schütz G.
Impairment of mossy fiber long-term potentiation and
associative learning in pituitary adenylate cyclase
activating polypeptide type I receptor-deficient mice.
J Neurosci. 2001 Aug 1;21(15):5520-7.
ARTÍCULO VI

142
Martin M, Matifas A, Maldonado R, Kieffer BL.
Acute antinociceptive responses in single and combinatorial
opioid receptor knockout mice: distinct mu, delta and kappa
tones.
Eur J Neurosci. 2003 Feb;17(4):701-8.
DISCUSIÓN

151
Los sistemas cannabinoide, opioide y del péptido PACAP comparten el control
de una gran variedad de respuestas fisiológicas. Así, diferentes estudios han
descrito la implicación de estos sistemas en la modulación de respuestas de
tipo emocional, nociceptivas, en la formación de memoria y en el desarrollo de
procesos de adicción a drogas de abuso. En nuestro trabajo nos planteamos
investigar diversas respuestas emocionales y nociceptivas, así como
determinadas acciones farmacológicas de la morfina en ratones modificados
genéticamente que presentaban una deficiencia en alguno de los componentes
del sistema opioide, cannabinoide o del péptido PACAP. En una primera parte,
discutiremos los resultados obtenidos con los ratones deficientes en el receptor
cannabinoide CB1. Seguidamente se comentarán los trabajos realizados en
ratones deficientes en el receptor PAC1, para acabar con la discusión de los
resultados obtenidos en ratones deficientes en los diferentes receptores
opioides.

- Estudio de la participación del receptor cannabinoide CB1 en el control

de las respuestas emocionales, en los procesos de memoria y en los
fenómenos de adicción a diferentes drogas de abuso:

Los estudios realizados con ratones deficientes en el receptor cannabinoide

CB1 nos han permitido evaluar el papel de este receptor en la modulación de
diferentes respuestas emocionales, en procesos memoria y aprendizaje, así
como en el desarrollo de fenómenos de adicción y dependencia a drogas de
abuso.

En un primer grupo de estudios hemos evaluado las respuestas espontáneas

de estos animales knockout en diferentes modelos de ansiedad y depresión. La
disrupción funcional del receptor CB1 produjo un efecto ansiogénico en el
modelo de la caja blanca/negra, lo cual sugiere la existencia de un tono
cannabinoide endógeno implicado en el control de estas respuestas. En
acuerdo con esta hipótesis, la administración del antagonista CB1, SR141716A
produce efectos ansiogénicos en la rata (Navarro et al., 1997; Arevalo et al.,
2001). Por otra parte, la administración de dosis bajas de agonistas
cannabinoides produce efectos ansiolíticos en diferentes tests de ansiedad

161
(Rodriguez et al., 1996; Valjent et al., 2002). Una respuesta similar se ha
observado tras la administración de inhibidores de la degradación de
anandamida (Kathuria et al., 2003). Actualmente se desconoce el mecanismo a
través del cual los cannabinoides modulan estas respuestas, pero dada la
amplia distribución del receptor CB1 a nivel cerebral, diferentes núcleos pueden
estar implicados. Una presencia elevada de receptores cannabinoides ha sido
descrita a nivel del sistema límbico y en áreas cerebrales que regulan la
respuesta al estrés (Herkenham et al., 1991b).

La liberación de CRF, en especial a nivel del núcleo central de la amígdala,

juega un papel importante en la modulación de las respuestas al estrés,
produciendo efectos ansiogénicos (Krysiak et al., 2000). Diferentes estudios
sugieren que el sistema cannabinoide puede regular la liberación de CRF en el
cerebro. En este sentido, los efectos ansiogénicos producidos por la
administración aguda de agonistas cannabinoides pueden ser revertidos por el
antagonista del CRF, D-Phe CRF12-41 (Rodriguez et al., 1996). Un incremento
en los niveles de CRF ha sido igualmente observado en el hipotálamo medio
basal en hembras tratadas crónicamente con THC (Rubio et al., 1995).

En la amígdala, los receptores cannabinoides se encuentran distribuidos

mayoritariamente a nivel presináptico, en neuronas de los núcleos lateral y
basal que contienen GABA y colecistoquinina. Sin embargo, la presencia de
receptores CB1 en el núcleo central de la amígdala no se ha demostrado
mediante técnicas inmunológicas (Katona et al., 2001), aunque se ha
observado el mRNA que codifica para el receptor a este nivel (Navarro et al.,
1998). Se ha sugerido que los agonistas cannabinoides podrían producir
efectos ansiolíticos regulando la actividad del núcleo central de la amígdala,
mediante un mecanismo indirecto que se iniciaría en los núcleos lateral y basal
de la amígdala (Katona et al., 2001). A este nivel, la activación de los
receptores CB1 inhibiría la liberación de GABA y produciría en último termino
una disminución en la actividad del núcleo central de la amígdala (Katona et al.,
2001). Este efecto podría no ocurrir en los ratones deficientes en el receptor
CB1 y ello daría lugar a la respuesta de tipo ansiogénica observada en estos
animales.

162
En otras áreas cerebrales como el hipocampo, también se ha observado la
presencia presináptica de receptores CB1 en neuronas que coexpresan GABA
y colecistoquinina (Katona et al., 1999; Tsou et al., 1999; Marsicano & Lutz,
1999). Así, la activación de los receptores CB1 inhibe la liberación de
colecistoquinina en preparaciones de hipocampo (Beinfeld & Connolly, 2001).
Este neuropéptido produce efectos ansiogénicos actuando tanto a nivel de los
receptor CCKA como CCKB (Dauge & Lena, 1998). Por consiguiente, la
disrupción del receptor CB1 podría producir un incremento en la liberación de
colecistoquinina que participaría en la manifestación de las respuestas
ansiogénicas observadas en estos animales.

Una interacción funcional entre el sistema cannabinoide y el sistema opioide

también ha sido descrita en el control de la ansiedad. En concreto, la activación
de los receptores opioides μ y δ participa en los efectos ansiolíticos del THC
(Berrendero & Maldonado, 2002). En este sentido, los agonistas cannabinoides
pueden producir una liberación de encefalinas endógenas con alta afinidad por
los receptores δ y μ a nivel del núcleo accumbens (Valverde et al., 2001). Los
ratones deficientes en el receptor cannabinoide CB1 podrían también presentar
una alteración en la funcionalidad del sistema opioide endógeno que afectaría
su nivel de ansiedad espontánea.

En los últimos años se han acumulado evidencias sobre la existencia de otros

receptores cannabinoides en el cerebro diferentes del receptor CB1 que
también participarían en el control de la ansiedad (Haller et al., 2002). Por otra
parte, la anandamida es capaz de estimular la síntesis de la proteína FOS en el
núcleo paraventricular del hipotálamo, así como de incrementar los niveles de
ACTH y corticosterona en la sangre por un mecanismo independiente de los
receptores CB1 (Wenger et al., 1997). Posiblemente la actividad de otros
receptores cannabinoides diferentes del CB1 pueda estar involucrada en la
manifestación de las respuestas emocionales observadas en estos ratones.

El papel del receptor CB1 también ha sido evaluado en estos animales en la

inducción de un estado de tipo depresivo. Para ello hemos utilizado un modelo
en el que los animales son expuestos a un estrés suave, crónico e impredecible
(chronic unpredictable mild stress o CMS). El CMS es un modelo de depresión
que produce en el animal un estado similar al de la anhedonia, es decir una

163
pérdida de interés o respuesta a estímulos placenteros o reforzantes (Willner,
1997). La inducción de un estado anhedónico se evalúa midiendo la ingesta de
una solución apetecible de agua azucarada. A diferencia de otros modelos
animales de depresión, únicamente el tratamiento crónico con antidepresivos
tricíclicos e inhibidores de la recaptación de serotonina, pero no el agudo,
recupera los niveles de ingesta de agua azucarada en animales sometidos a un
procedimiento de CMS.

En nuestro estudio observamos que los ratones deficientes en el receptor CB1

desarrollaron un estado anhedónico antes que los ratones salvajes. Sin
embargo, un estudio reciente ha descrito que el SR141716A produce un efecto
antidepresivo en el test de la natación forzada, sugiriendo que el bloqueo del
receptor CB1 tiene efectos antidepresivos (Tzavara et al., 2003). La utilización
de diferentes modelos animales de depresión puede explicar las discrepancias
observadas entre ambos estudios.

Diferentes hipótesis han sido descritas para explicar el fenómeno de la

depresión. Una de las más predominantes implica un déficit en los niveles
monoaminérgicos, en especial de serotonina y noradrenalina, en determinadas
estructuras cerebrales aunque el sistema dopaminérgico podría igualmente
participar por un mecanismo indirecto o a través de la modulación de la
actividad de otras monoaminas. En el modelo del CMS se ha sugerido que la
capacidad de los antidepresivos para revertir el estado anhedónico en animales
sometidos a este procedimiento viene mediada por la hipersensibilización de
los receptores D2/D3 en el núcleo accumbens (Willner, 2003). Así, se ha
descrito una disminución en la liberación de dopamina y en el número de
receptores D2/D3 a nivel del núcleo accumbens de animales sometidos a un
procedimiento de CMS (Willner, 1997). En acuerdo con estos resultados el
efecto de los antidepresivos es revertido con antagonistas D2/D3 (Borsini et al.,
1988; Muscat et al., 1992; Papp et al., 1993), y la administración de agonistas
D2/D3 en el núcleo accumbens produce efectos antidepresivos en el test de la
natación forzada y en el CMS.

Diferentes estudios indican que el sistema cannabinoide puede estar

involucrado en la regulación de la actividad monoaminérgica. Una coexpresión
de receptores CB1 con diferentes tipos de receptores dopaminérgicos y

164
serotonérgicos ha sido observada en diversas poblaciones neuronales
(Hermann et al., 2002; Morales & Backman, 2002). Sin embargo, el estudio del
papel del sistema cannabinoide en el control de la actividad monoaminérgica
ha producido resultados contradictorios. Algunos estudios han observado un
incremento en la liberación de noradrenalina, serotonina, dopamina y
acetilcolina tras la administración del antagonista CB1, SR141716A (Tzavara et
al., 2001; Tzavara et al., 2003). Por otra parte, la anandamida reduce los
niveles de serotonina en el hipocampo y los incrementa en el hipotálamo (Hao
et al., 2000). Otros autores han descrito que el THC puede inhibir la
recaptación de diferentes monoaminas (Holtzman et al., 1969; Banerjee et al.,
1975; Hershkowitz & Szechtman, 1979) e incrementar los niveles de dopamina
en diversas estructuras (Malone & Taylor, 1999; Pistis et al., 2002), y en
particular a nivel del núcleo accumbens (Chen et al., 1990b; Tanda et al.,
1997). Esta observación sugiere que el incremento en las respuestas
anhedónicas observadas en los ratones deficientes en el receptor CB1 podrían
venir mediadas por una disminución en la actividad del sistema mesolímbico
dopaminérgico.

Por otra parte, se ha descrito que el sistema opioide participa en los efectos
antidepresivos de diferentes fármacos (Martin et al., 1986) y que la inhibición
de la degradación de las encefalinas causa efectos antidepresivos en
diferentes modelos animales a través de una activación de los receptores
opioide δ (Baamonde et al., 1992; Valverde et al., 2001). Estudios realizados en
ratones modificados genéticamente han descrito que la disrupción funcional del
receptor opioide δ produce efectos ansiogénicos y un incremento en las
respuestas de tipo depresivo (Filliol et al., 2000) similar en cierto modo al
observado en los ratones CB1 knockout. Igualmente, la reactividad del sistema
opioide endógeno está reducida en animales sujetos a un procedimiento de
CMS (Bertrand et al., 1997). Así pues, el sistema opioide endógeno podría
igualmente participar en el incremento en la respuesta anhedónica observada
en los ratones deficientes en el receptor CB1.

Otra de las respuestas conductuales investigadas en ratones knockout CB1 fue

la agresividad. Los ratones deficientes en el receptor CB1 presentan una
respuesta agresiva mayor en el modelo del “Resident-Intruder test”. Los

165
agonistas cannabinoides tienen un efecto bifásico sobre la conducta agresiva.
Así, a dosis bajas incrementan la agresividad, pero a dosis altas la disminuyen.
Este efecto también se ha observado con la anandamida (Sulcova et al., 1998).
Una vez más, las catecolaminas y la serotonina podrían estar involucradas en
esta función del sistema cannabinoide endógeno. Así, el THC incrementa la
respuesta agresiva en ratas pretratadas con agentes que disminuyen los
niveles de serotonina (Carlini et al., 1976) y tras la reducción en los niveles de
catecolaminas mediante el tratamiento con 6-hidroxi-dopamina (Fujiwara et al.,
1984). Sin embargo, se ha descrito recientemente que los cannabinoides,
incluidos el THC, inhiben la actividad de los receptores 5-HT2A (Darmani, 2001).
Los antagonistas de este receptor pueden disminuir las respuestas agresivas
en ratones (Sakaue et al., 2002).

Una posible relación funcional entre el sistema cannabinoide y opioide también

puede participar en el control de la agresividad. En este sentido, se ha descrito
que los ratones deficientes en el gen de la preproencefalina presentan un
incremento en la respuesta agresiva (Konig et al., 1996) similar al observado en
nuestros estudios en ratones deficientes en receptores CB1.

En la siguiente secuencia experimental, hemos investigado el papel del

receptor CB1 en los procesos de memoria y aprendizaje mediante el uso del
paradigma de la evitación activa. Hemos observado que la disrupción funcional
del receptor CB1 mejora el aprendizaje en este modelo. La actividad
locomotora, el umbral nociceptivo y la ansiedad pueden influir en la respuesta
del animal en este modelo. Sin embargo, ninguno de estos parámetros parecen
estar involucrados en la mejora del aprendizaje observada en estos ratones, ya
que la actividad locomotora y el umbral nociceptivo no están modificados y los
niveles de ansiedad están incrementados en estos ratones knockout. En
acuerdo con nuestros resultados, los ratones deficientes en el receptor CB1
presentan un incremento en el proceso de LTP en el hipocampo (Bohme et al.,
2000). Otro estudio han demostrado que estos ratones presentan una mayor
capacidad de retención de memoria, sin observar modificaciones en el proceso
de adquisición (Reibaud et al., 1999).

Los agonistas cannabinoides producen efectos inhibitorios sobre los procesos

de memoria en el hipocampo. Así, la administración de agonistas

166
cannabinoides en el giro dentado o CA1 produce los mismos efectos sobre la
memoria que una administración sistémica de estas sustancias (Lichtman et al.,
1995). A nivel hipocampal, la mayor densidad de receptores CB1 se halla en
las áreas CA1, CA3 y giro dentado, sobre todo en interneuronas GABAérgicas
que coexpresan colecistoquinina (Katona et al., 1999; Tsou et al., 1999). Se ha
sugerido que los cannabinoides pueden modular los procesos de memoria
regulando el sistema GABAérgico. En concreto, la activación de receptores
CB1 presinápticos reduciría la liberación de GABA (Katona et al., 1999),
produciendo un incremento no específico en las sinapsis excitatorias que
alteraría los procesos de memoria. En acuerdo con esta hipótesis, el bloqueo
de la recaptación de GABA incrementa el aprendizaje espacial en el test de la
piscina de Morris (Noguchi et al., 2002). Además, la activación de los
receptores CB1 también inhibe la liberación de colecistoquinina que se
coexpresa en las neuronas GABAérgicas (Tsou et al., 1999). El bloqueo de los
receptores de la colecistoquinina disminuye el aprendizaje en un laberinto
radial (Harro & Oreland, 1993).

Los receptores CB1 pueden modificar la actividad de otros sistemas de

neurotransmisores en el hipocampo, como la dopamina (Nava et al., 2001) y la
acetilcolina (Gessa et al., 1997), ambos involucrados en los procesos de
memoria. Parte de los efectos de los cannabinoides sobre los procesos de
memoria y aprendizaje podrían estar mediados por la inhibición de la vía
colinérgica septohipocampal. Esta hipótesis surgió tras la observación de que
los cannabinoides podían inhibir la liberación de acetilcolina en el hipocampo
(Nava et al., 2001; Gessa et al., 1997). Sin embargo, el tratamiento con un
inhibidor de la actividad colinesterasa (fisostigmina) no atenúa el deterioro en el
aprendizaje en el laberinto radial producido por el THC (Lichtman & Martin,
1996). Igualmente, la administración de SR141716A no revierte los efectos
sobre la memoria producidos por antagonistas colinérgicos (Lichtman & Martin,
1996). Además, un incremento en la liberación de acetilcolina en el hipocampo
ha sido descrito recientemente tras la administración de agonistas
cannabinoides (Acquas et al., 2000; Acquas et al., 2001).

Los agonistas cannabinoides también reducen la transmisión glutamatérgica en

cultivos de células hipocampales (Shen et al., 1996; Shen & Thayer, 1999). Los

167
cannabinoides pueden disminuir la liberación de glutamato a través de un
mecanismo presináptico mediado por proteínas G inhibitorias tipo Gi/o (Shen et
al., 1996; Sullivan, 1999; Misner & Sullivan, 1999). La inhibición en la liberación
de glutamato, impediría el desarrollo de la LTP.

Recientemente se ha sugerido que el sistema endocannabinoide puede regular

la extinción de los fenómenos de memoria aversiva en un modelo de miedo
condicionado (Marsicano et al., 2002). Se ha sugerido un papel importante de
la amígdala en la adquisición y el almacenamiento de este tipo de memorias
(LeDoux, 1993). Los autores describen un incremento en la LTP en el núcleo
basolateral de la amígdala en ratones deficientes en el receptor CB1
(Marsicano et al., 2002).

Finalmente, nos hemos planteado estudiar la función del sistema cannabinoide

en la modulación de las respuestas producidas tras un tratamiento crónico con
dos tipos de drogas de abuso que presentan mecanismos de acción diferentes,
la morfina y la cocaína. Los efectos hiperlocomotores producidos por la
administración aguda de morfina no resultaron modificados en los ratones
deficientes en el receptor CB1. En un estudio anterior realizado en estos
ratones knockout, tampoco se observaron modificaciones en los efectos
antinociceptivos agudos de la morfina (Ledent et al., 1999). Sin embargo, los
animales deficientes en el receptor CB1 presentaron una disminución en la
sensibilización locomotora y en los efectos reforzantes producidos por un
tratamiento crónico con morfina. Estos datos concuerdan con la observación de
que estos ratones knockout no se autoadministran morfina (Ledent et al., 1999;
Cossu et al., 2001).

El sistema mesolímbico, en especial el área ventral tegmental y el núcleo

accumbens, está involucrado en la manifestación de la sensibilización a los
efectos locomotores y reforzantes de los opioides (Cunningham et al., 1997;
Koob et al., 1998). Modificaciones en la actividad dopaminérgica y
glutamatérgica en estas estructuras participan en el desarrollo de la
sensibilización (Kalivas, 1985; Jeziorski et al., 1994; Carlezon, Jr. et al., 1997;
Hemby et al., 1995; Koob et al., 1998). Diferentes estudios han demostrado que
el receptor CB1 puede modular las respuestas opioides en el sistema
mesolímbico. Así, la morfina no produce un incremento en los niveles de

168
dopamina en el núcleo accumbens en ratones deficientes en el receptor CB1
(Mascia et al., 1999). Sin embargo los receptores CB1 no se expresan en las
neuronas dopaminérgicas mesolímbicas, indicando que el efecto regulador de
los cannabinoides es indirecto.

Se ha sugerido que los receptores cannabinoides y opioides pueden

interaccionar físicamente, produciendo una modificación en su actividad (Rios
et al., 2002). En consecuencia, la falta del receptor CB1 podría impedir por esta
razón el normal funcionamiento de los receptores opioides y disminuir la
sensibilización locomotora y los efectos reforzantes de la morfina observada en
los ratones deficientes en el receptor CB1. La demostración de la existencia de
neuronas que coexpresan receptores CB1 y opioide μ en el núcleo accumbens
y en otras áreas telencefálicas involucradas en los procesos de refuerzo,
apoyan esta hipótesis (Navarro et al., 1998). Sin embargo, los efectos
hiperlocomotores y antinociceptivos agudos de la morfina no resultaron
modificados en estos ratones knockout.

Los opioides producen sus efectos reforzantes inhibiendo la actividad de

interneuronas GABAérgicas del área ventral tegmental (Johnson & North,
1992). Los agonistas cannabinoides también pueden controlar de una forma
similar la liberación de GABA en esta área. Así, un efecto inhibidor de los
cannabinoides sobre la liberación de GABA ha sido observado en el área
ventral tegmental (Szabo et al., 2002a). Estos datos sugieren que la regulación
del sistema GABAérgico puede estar involucrada en el control de las
respuestas de la morfina por los cannabinoides.

A diferencia de la sensibilización locomotora y del condicionamiento espacial,

los efectos aversivos/disfóricos del síndrome de abstinencia a la morfina no
resultaron modificados en los ratones deficientes en el receptor CB1. Estudios
anteriores tampoco observaron una modificación en la tolerancia a los efectos
analgésicos de la morfina en estos ratones deficientes, aunque las
manifestaciones físicas del síndrome de abstinencia morfínico resultaron
disminuidas (Ledent et al., 1999). La necesidad de utilizar diferentes dosis de
naloxona para poner de manifiesto una aversión de plaza condicionada a la
abstinencia y una expresión adecuada de los signos somáticos del síndrome de
abstinencia físico pueden explicar las diferencias observadas. En efecto, los

169
efectos disfóricos aparecen tras la aplicación de dosis de naloxona mucho
menores de las requeridas para producir signos somáticos (Stinus et al., 1990).

Por otra parte, las respuestas somáticas y motivacionales de la abstinencia a

los opioides están reguladas por estructuras cerebrales diferentes (Stinus et al.,
1990; Koob et al., 1992; Maldonado et al., 1992b). El sistema dopaminérgico
mesolímbico (Stinus et al., 1990; Diana et al., 1999), el sistema noradrenérgico
que inerva el núcleo del lecho de la estría terminal (Delfs et al., 2000; Phelix &
Paull, 1990; Phelix et al., 1994), y el sistema CRF de la amígdala (Heinrichs et
al., 1995a) juegan un papel importante en los efectos disfóricos/aversivos del
síndrome de abstinencia a los opioides. Una disminución en la actividad
dopaminérgica mesolímbica ha sido observada durante el síndrome de
abstinencia opioide, producida por el incremento en la liberación de GABA en el
área ventral tegmental. Este aumento en la actividad GABAérgica se debe a
una sobreregulación de la vía del AMPc producida tras el tratamiento crónico
con los opioides (Bonci & Williams, 1997; Williams et al., 2001). Se ha descrito
la inducción de una aversión de plaza y una disminución en el número de
respuestas operantes tras la administración de SR141716A en animales
dependientes a la morfina (Navarro et al., 2001). En este mismo estudio, se
demuestra que la inhibición de la actividad CB1 disminuye los efectos
reforzantes de los opioides, sugiriendo una modulación de la dopamina tras la
administración de SR14171A. No obstante, se desconoce el efecto de un
tratamiento crónico con opioides sobre el sistema mesolímbico dopaminérgico
en ratones deficientes en el receptor CB1, aunque se ha descrito que la
administración aguda de morfina no afecta los niveles de dopamina en el
núcleo accumbens en estos animales (Mascia et al., 1999). Estos datos
sugieren que en animales salvajes, el sistema cannabinoide puede modular los
efectos aversivos del síndrome de abstinencia morfínico a través del control en
la liberación de dopamina, pero otros mecanismos diferentes podrían participar
en los efectos aversivos del síndrome de abstinencia opioide observado en
ratones deficientes en el receptor CB1.

Un incremento en la actividad del sistema CRF en el núcleo central de la

amígdala también ha sido implicado en la manifestación de los efectos
motivacionales del síndrome de abstinencia opioide. Como se ha comentado

170
anteriormente, el sistema cannabinoide puede modular la liberación de CRF en
esta estructura. Las neuronas del sistema noradrenérgico que inervan al núcleo
del lecho de la estría terminal están igualmente involucradas en el desarrollo de
respuestas aversivas del síndrome de abstinencia opioide (Delfs et al., 2000).
Aunque se ha sugerido un papel modulador de los cannabinoides sobre el
sistema noradrenérgico, los resultados obtenidos en diferentes estudios son
contradictorios (Tzavara et al., 2001; Holtzman et al., 1969). La ausencia de
modificación de los efectos disfóricos del síndrome de abstinencia a la morfina
en ratones deficientes en el receptor CB1 sugiere que en estos mecanismos no
están directamente regulados por el receptor CB1.

En contraste con la morfina, los efectos farmacológicos inducidos por la

administración aguda o crónica de cocaína no resultaron modificados en los
ratones deficientes en el receptor cannabinoide CB1. Estos datos concuerdan
con los obtenidos en un trabajo anterior en el que se observó que estos ratones
knockout se autoadministraban cocaína (Cossu et al., 2001). Tanto la
dopamina como el glutamato juegan un papel importante en el sistema
mesolímbico en la manifestación de los efectos reforzantes y la sensibilización
locomotora a la cocaína (Koob et al., 1994; Rockhold, 1998). A diferencia de los
opioides y los cannabinoides, la cocaína incrementa los niveles de
monoaminas inhibiendo directamente el sistema de recaptación en la propia
neurona (Ritz et al., 1987). Por otra parte, la cocaína es capaz de inducir la
liberación de glutamato en el área ventral tegmental, mediante un mecanismo
dependiente de la activación de receptores dopaminérgicos (Kalivas & Duffy,
1998). Por lo tanto, la capacidad de la cocaína de modificar directamente la
actividad dopaminérgica mesolímbica puede ser la razón que explique la
ausencia de modificaciones de sus efectos farmacológicos en los ratones
deficientes en el receptor cannabinoide CB1.

- Estudio de la participación del receptor PAC1 en diferentes respuestas

comportamentales y en los fenómenos de adicción a diferentes drogas de
abuso:

En este apartado hemos estudiado el papel del receptor PAC1 en el control de

diferentes respuestas nociceptivas y emocionales así como en la manifestación

171
de fenómenos de adicción, tolerancia y dependencia física a diferentes drogas
de abuso. También hemos investigado la implicación del sistema PACAP en los
procesos de memoria y en el ritmo circadiano. Los estudios se realizaron en
dos cepas diferentes de ratones: una línea de ratones knockout clásicos que
presentaba la deficiencia en el receptor en todo el organismo (denominada
PAC1), y una línea de ratones knockout tejido-dependiente que era deficiente
del receptor mayoritariamente a nivel del hipocampo y corteza frontal
(denominada PAC1CaMKCre2). Los ratones PAC1 mostraron una disminución en
las respuestas ansiosas y un incremento en la actividad locomotora. Sin
embargo, estas respuestas no resultaron modificadas en los ratones
PAC1CaMKCre2, sugiriendo que están moduladas por receptores PAC1 situados
en áreas diferentes del hipocampo y de la corteza frontal.

Se había descrito anteriormente que la administración exógena de PACAP a

nivel intracerebroventricular produce un incremento en la actividad locomotora
en ratas, efecto que no se observa tras la administración de la misma dosis de
VIP. Esto sugería que la activación del receptor PAC1 produce efectos
hiperlocomotores (Masuo et al., 1995). Sin embargo, se ha generado
recientemente una línea de ratones deficientes en el péptido PACAP que
presenta un incremento en la actividad locomotora espontánea y una
disminución en los niveles de ansiedad, en concordancia con nuestros
resultados (Hashimoto et al., 2001). El uso de distintas especies animales (rata
y ratón) puede explicar estas diferencias, aunque otros factores no pueden ser
descartados.

Estudios histológicos han demostrado la presencia del péptido y receptores

PACAP en diferentes áreas cerebrales, incluyendo núcleos monoaminérgicos
como el hipotálamo, la amígdala, el núcleo accumbens, la sustancia negra y el
núcleo del rafe dorsal (Ghatei et al., 1993; Masuo et al., 1993). El péptido
PACAP incrementa la síntesis del mRNA de la tirosina-hidroxilasa y de la
dopamina-β-hidroxilasa en cultivos de células cromafinas adrenales (Isobe et
al., 1996). Igualmente, este péptido tiene la capacidad de modular la actividad
noradrenérgica y dopaminérgica a nivel cerebral (Huang et al., 1996; Anderson
& Curlewis, 1998). Dichas monoaminas juegan un papel importante en la
regulación de las respuestas de tipo locomotor y emocional. Estudios

172
realizados en ratones deficientes en el péptido PACAP han observado un ligero
incremento en la sensibilidad a los efectos hipolocomotores del haloperidol,
pero sin mostrar variaciones en el metabolismo dopaminérgico ni en los niveles
del receptor D2. Sin embargo, estos ratones presentan una alteración en el
metabolismo serotonérgico en el estriado y la corteza. Los autores sugieren
que la hiperlocomoción observada en los ratones deficientes en el péptido
PACAP se debe a una variación en el balance entre los sistemas
dopaminérgico y serotonérgico (Hashimoto et al., 2001).

El sistema del péptido PACAP está también implicado en el control de la

conducta emocional. La observación de que el ratón PAC1, pero no el
PAC1CaMKCre2 presenta una respuesta de tipo ansiolítica, sugiere que los
receptores localizados en otras zonas del cerebro tales como el sistema
límbico, el locus coeruleus o la amígdala están involucrados en los cambios
observados en el ratón PAC1. Los efectos anteriormente descritos del sistema
del péptido PACAP sobre la modulación de la actividad dopaminérgica,
noradrenérgica y serotonérgica también podrían participar en las respuestas
ansiolíticas observadas en los ratones PAC1. En este sentido, se ha descrito
que neuronas dopaminérgicas de la amígdala extendida que se activan en
respuesta a un estrés agudo están inervadas por terminaciones nerviosas que
expresan el péptido PACAP (Kozicz & Arimura, 2002). Como se citó con
anterioridad, los ratones deficientes en el péptido PACAP presentan una
modificación en el metabolismo serotonérgico en el estriado y la corteza que
puede mediar parte de los efectos ansiolíticos (Hashimoto et al., 2001).

Una reducción en la liberación de noradrenalina también podría estar

involucrada en las respuestas ansiolíticas observadas en los ratones
deficientes en el receptor PAC1. Un resultado indirecto que podría apoyar esta
hipótesis es un estudio en el que se ha observado que los ratones deficientes
en el péptido PACAP presentan una disminución en los niveles de
noradrenalina en tejido adiposo (Gray et al., 2002).

Recientemente el grupo de Günther Schütz ha generado una línea de ratón

modificada genéticamente que no sintetiza el receptor PAC1 en neuronas
noradrenérgicas. En estos ratones también hemos realizado una secuencia
experimental similar y hemos observado una disminución en las respuestas

173
ansiosas en diferentes modelos animales (laberinto en cruz elevado y caja
blanca/negra). Estos resultados apoyan la hipótesis de que el sistema
noradrenérgico participa en las respuestas ansiolíticas observadas en los
ratones PAC1.

Se ha descrito la presencia de terminales nerviosos ricos en PACAP y VIP en

el núcleo del lecho de la estría terminal lateral el cual recibe abundantes
proyecciones noradrenérgicas (Koves et al., 1991; Kozicz et al., 1997). Este
área cerebral está involucrada en la modulación de las respuestas al estrés a
través de sus conexiones hipotalámicas y sobre otros centros implicados en el
control de las emociones (Sawchenko & Swanson, 1983). Los terminales
axónicos que expresan PACAP o VIP conectan con neuronas inmunoreactivas
al CRF, encefalina y dopamina (Kozicz et al., 1998). En acuerdo con esta
localización, la administración de PACAP intracerebroventricular produce un
incremento en la expresión de CRF en las neuronas parvocelulares del núcleo
paraventricular del hipotálamo (Grinevich et al., 1997).

La observación de que la conducta emotiva y locomotora de los ratones

deficientes en el péptido PACAP y receptor PAC1 está modificada de una
manera similar, sugiere que la interacción PACAP-PAC1 participa de una
manera importante en el control de estas respuestas. Sin embargo, no se
puede descartar una participación de los receptores VPAC1 y VPAC2, ambos
activados por PACAP y VIP.

La variación en la actividad locomotora a lo largo del ritmo circadiano también

fue evaluada en los ratones PAC1. Diferentes estudios han descrito un papel
del VIP y PACAP en la regulación del ritmo circadiano (Hannibal et al.,
1997;Piggins et al., 1995). Así, en el núcleo supraquiasmático se ha observado
la expresión de receptores PAC1 y VPAC2, los cuales pueden jugar un papel
en el control del ritmo circadiano (Hannibal et al., 2001; Shen et al., 2000). Sin
embargo, patrón de la actividad locomotora circadiana no resultó modificado en
los ratones PAC1. Estudios en ratones modificados genéticamente han
demostrado que el receptor VPAC2, pero no el PAC1, es esencial en el control
del ritmo circadiano. Así, ratones transgénicos que sobreexpresan el receptor
VPAC2 presentan una resincronización del ritmo más rápida que en los
animales control cuando se varía el ciclo luz-oscuridad (Shen et al., 2000).

174
Además, ratones deficientes en el receptor VPAC2 son incapaces de mantener
un ritmo circadiano normal. Este fenotipo conductual está asociado con una
descoordinación en la expresión de genes implicados en el funcionamiento del
sistema regulador circadiano en el núcleo supraquiasmático (Harmar et al.,
2002).

Por otra parte, hemos estudiado el papel del receptor PAC1 en el desarrollo de
la tolerancia al etanol. Se había descrito anteriormente que la mutación en un
péptido de naturaleza similar al PACAP en la mosca D. Melanogaster producía
una disminución en la tolerancia a los efectos producidos por la inhalación de
vapores de etanol (Moore et al., 1998). Sin embargo, en ratones PAC1, la
respuesta tras la administración de etanol fue similar a la observada en los
ratones salvajes. Posiblemente, la distancia filogenética que separa a la mosca
D. Melanogaster del ratón pueda explicar estas diferencias. No obstante,
interacciones entre el sistema del péptido PACAP y el etanol han sido descritas
en el ratón. Así, se ha observado que la administración aguda de etanol es
capaz de incrementar la expresión del mRNA del receptor PAC1 en cultivos
celulares (He et al., 2002). Igualmente la administración de PACAP
intracerebroventricular es capaz de disminuir la respuesta hipotérmica
producida por etanol (Szabo et al., 1998).

El papel del receptor PAC1 en el control de las respuestas nociceptivas basales

y los efectos antinociceptivos de la morfina también se investigó en estos
ratones knockout. No se observaron diferencias entre genotipos en las
respuestas nociceptivas basales en los test de inmersión de la cola, presión en
la cola y placa caliente. Sin embargo, el número de contorsiones producidas
por la administración intraperitoneal de ácido acético fue menor en los ratones
PAC1. Los ratones deficientes PAC1CaMKCre2 también fueron testados en este
último modelo, pero no observamos diferencias entre genotipos. Estos
resultados sugieren que la modulación de la respuesta nociceptiva en el test
del ácido acético está mediada por receptores PAC1 localizados en otras áreas
cerebrales diferentes del hipocampo o la corteza frontal, o en neuronas
sensoriales periféricas. Estos resultados están en concordancia con los
obtenidos mediante el uso de una cepa diferente de ratones deficientes en el
receptor PAC1 (Jongsma et al., 2001). En dicho estudio, se observaron

175
diferencias en el umbral nociceptivo en el modelo de dolor químico/inflamatorio
de la formalina, pero no en modelos de dolor mecánico o térmico.

Los efectos antinociceptivos producidos por la administración aguda de morfina

tampoco resultaron modificados en los ratones PAC1. Sin embargo, estudios
farmacológicos han descrito que la administración de VIP o PACAP disminuye
el efecto analgésico de una dosis aguda de morfina (Macsai et al., 1998;
Macsai et al., 2002), sugiriendo que posiblemente los receptores VPAC1 y
VPAC2 estén involucrados en dichos efectos de la morfina.

Tampoco observamos diferencias entre genotipos en la sensibilización a los

efectos locomotores ni en la preferencia de plaza condicionada a la morfina.
Diferentes interacciones han sido descritas entre el PACAP y ciertos sistemas
de neurotransmisores implicados en estos efectos de la morfina, como la
dopamina y el glutamato. El péptido PACAP es capaz de estimular la actividad
tirosina-hidroxilasa en homogenizados provenientes del núcleo accumbens de
rata (Moser et al., 1999), pero se desconoce los mecanismos implicados en
dicha respuesta. Asimismo, la administración de PACAP promueve la síntesis
de dopamina en cultivos de células cromafinas adrenales (Houchi et al., 1995).
Dicho efecto estimulador del PACAP no fue revertido mediante la inhibición de
la actividad proteína quinasa C, por lo que no se puede descartar una
participación de los receptores VPAC1 y VPAC2. El PACAP también activa el
sistema dopaminérgico tuberoinfundibular (Arbogast & Voogt, 1994; Anderson
& Curlewis, 1998). Por otra parte, el PACAP puede incrementar la velocidad
máxima de recaptación de glutamato por la astroglía promoviendo la síntesis
de transportadores de glutamato y del enzima glutamina sintasa. El VIP solo
produce este efecto a dosis elevadas sugiriendo una participación del receptor
PAC1 (Figiel & Engele, 2000). Así mismo, VIP y el PACAP potencian la
expresión de c-fos inducida por glutamato en cultivos de neuronas corticales
(Martin et al., 1995) y el glutamato disminuye la formación de AMPc inducida
por PACAP en el hipocampo y otras áreas cerebrales (Kondo et al., 1995). La
ausencia de modificación en la sensibilización locomotora y la preferencia de
plaza inducidas por morfina en estos animales knockout podría ser debida a la
moderada expresión de PAC1 en el sistema mesolímbico dopaminérgico.
Tampoco podemos descartar una participación predominante de los receptores

176
VPAC1 y VPAC2 en el control de estos sistemas. En este sentido, las neuronas
que sintetizan dopamina en el núcleo del lecho de la estría terminal y en el
núcleo central de la amígdala están inervadas por terminales axónicos que
contienen VIP (Kozicz, 2003).

La única respuesta a la morfina modificada en los ratones PAC1 fue el

síndrome de abstinencia desencadenado por naloxona, que resultó
incrementado. En acuerdo con este resultado, la administración
intracerebroventricular de PACAP disminuyó las manifestaciones
comportamentales de la abstinencia morfínica. En los ratones knockout
controles, tratados únicamente con suero fisiológico, la administración de
naloxona también precipitó la aparición de ciertas respuestas somáticas
similares a la abstinencia opioide. Sin embargo, se ha descrito recientemente
que la administración intracerebroventricular de PACAP produce un incremento
en la respuesta de salto tras la administración de naloxona en ratones
dependientes a la morfina, por un mecanismo que implica la activación de los
receptores PAC1, ya que el VIP no produce estos efectos (Macsai et al.,
1998;Macsai et al., 2002).

Nuestros resultados hacían suponer que la ausencia del receptor PAC1 podría
incrementar la sensibilidad de las neuronas del locus coeruleus a los opioides
endógenos. El péptido PACAP estimula la síntesis y/o secreción de met-
encefalina a través de la activación de los receptores PAC1. Una disminución
en la concentración de met-encefalina produciría en consecuencia un
incremento en la expresión o la afinidad de los receptores opioides localizados
en el locus coeruleus. En acuerdo con esta hipótesis, un incremento en la
sensibilidad a la met-encefalina fue observada en neuronas del locus coeruleus
de ratones deficientes en el receptor PAC1. Sin embargo, estas diferencias
desaparecían en los ratones knockout tratados con morfina. Esta observación
sugiere que el sistema PACAP regula las manifestaciones somáticas del
síndrome de abstinencia morfínico mediante un mecanismo que no implica la
actividad opioide endógena en el locus coeruleus. La actividad de este núcleo
está controlada por aferencias glutamatérgicas que parten del núcleo
paragigantocelular. Como se ha descrito anteriormente, el péptido PACAP
puede incrementar la recaptación de glutamato mediante un mecanismo

177
dependiente de PAC1. Sin embargo, una sobreregulación del sistema adenilato
ciclasa/AMPc en las neuronas del locus coeruleus y en otras áreas cerebrales
producida como posible mecanismo compensatorio de la falta del receptor
PAC1 no puede ser descartada. En este sentido, un incremento en la actividad
adenilato ciclasa ha sido descrita en el locus coeruleus durante el síndrome de
abstinencia morfínico (Nestler, 1992).

Finalmente, investigamos el papel del receptor PAC1 en la generación del

fenómeno de LTP así como en los procesos de memoria y aprendizaje,
mediante el uso de ratones knockout PAC1 y PAC1CaMKCre2. La LTP es una
forma de plasticidad neuronal que está involucrada en los procesos de
almacenamiento de memoria. En el hipocampo se han descrito dos
mecanismos diferentes para inducir este proceso, diferenciados en el tipo de
receptor glutamatérgico involucrado así como en el lugar de inducción del
fenómeno. Así, en las vías perforante y de Schaffer la LTP se inicia en la
neurona postsináptica. Su inducción requiere la activación de los receptores
glutamatérgicos tipo NMDA y la concomitante entrada de Ca2+ en el interior
celular. Sin embargo, en la vía de las fibras musgosas, la LTP es inducida a
nivel presináptico, se requiere la presencia de Ca2+ a nivel presináptico pero no
la activación de receptores NMDA (Nicoll & Malenka, 1995).

Diferentes estudios han descrito que el péptido PACAP tiene la capacidad de

modular los procesos de memoria actuando en diferentes zonas del
hipocampo. Sin embargo, la presencia de receptor PAC1 solo ha sido descrita
a nivel presináptico en el giro dentado (Otto et al., 1999), por lo que el resto de
acciones a nivel hipocampal estarían mediadas por los receptores VPAC1 y
VPAC2. Diferentes estudios sugieren que las fibras musgosas están implicadas
en los procesos de aprendizaje espacial (Lassalle et al., 2000; Czeh et al.,
2001). No obstante, ratones modificados genéticamente deficientes en las
isoformas Cβ1 y RIβ de la PKA son incapaces de generar una LTP en las fibras
musgosas, pero mantienen la capacidad de aprender tareas de aprendizaje
espacial (Huang et al., 1995). En nuestro trabajo se demuestra que el receptor
PAC1 es imprescindible para la generación del fenómeno de LTP a nivel de las
fibras musgosas. La observación de que la administración de PACAP
incrementa la actividad de las sinapsis en el giro dentado apoya esta hipótesis

178
(Kondo et al., 1997). La activación del receptor PAC1 sería pues necesaria
para activar la PKA e incrementar los niveles de Ca2+ a nivel presináptico, que
son requeridos para la generación de la LTP en las fibras musgosas. En
acuerdo con esta hipótesis el péptido PACAP puede modular las
2+
concentraciones de Ca en el citosol en cultivos de células hipocampales
(Tatsuno et al., 1992).

La inhibición en la generación de la LTP en las fibras musgosas produce

déficits en el aprendizaje en los ratones knockout PAC1 y PAC1CaMKCre2. Estos
ratones presentaron una disminución en el aprendizaje contextual en el modelo
de miedo condicionado, cuando fueron reexpuestos a la caja donde recibieron
las descargas eléctricas. Sin embargo, ambos genotipos aprendieron la
asociación entre el tono y la descarga eléctrica. No se observaron diferencias
entre genotipos en el modelo de la piscina de Morris. El aprendizaje en el
modelo de miedo condicionado puede estar influido por los niveles de
ansiedad, el umbral nociceptivo y la actividad locomotora. No obstante, estos
parámetros no parecen jugar un papel importante pues influirían tanto en el
aprendizaje contextual como en el asociativo. Además, se observan las mismas
respuestas en los ratones deficientes PAC1 y PAC1CaMKCre2.

En concordancia con nuestros resultados, un estudio realizado en otra cepa de

ratón deficiente en el receptor PAC1 observó también un déficit en el
aprendizaje contextual en el test de miedo condicionado, pero no en otros
modelos de aprendizaje (Sauvage et al., 2000). Sin embargo, estas diferencias
únicamente fueron observadas en el tercer minuto tras ser expuestos al mismo
contexto, sugiriendo que estos ratones deficientes en el receptor PAC1 son
capaces de formar una asociación entre el contexto y las descargas eléctricas,
pero extinguen la respuesta más rápido.

- Estudio de la participación del sistema opioide endógeno en la

modulación de las respuestas nociceptivas en diferentes modelos
animales:

En una última secuencia experimental, hemos evaluado las respuestas

nociceptivas basales en ratones knockout deficientes en los receptores

179
opioides μ, δ o κ, así como en dobles y triples knockouts, utilizando diferentes
modelos animales que implican una estimulación térmica, mecánica o química.
En la mayoría de los tests, se observó una diferencia en el umbral nociceptivo
dependiendo del sexo utilizado. Cambios hormonales, en la actividad de los
receptores opioides y en la capacidad de activación del eje HPA pueden estar
involucrados en estas diferencias (Kepler et al., 1989; Berkley, 1997).

Nuestros resultados indican que los receptores opioides μ están implicados en

el control nociceptivo en el test de la placa caliente, presión en la cola y en la
fase temprana del test de la formalina, sugiriendo un control sobre estímulos
dolorosos de naturaleza térmica, mecánica y química. Sin embargo, no se
observaron diferencias en el test de inmersión de la cola en los animales
deficientes en receptores opioides μ. Este resultado sugiere que estos
receptores opioides modulan la transmisión del dolor producido por un estímulo
térmico mediante un mecanismo predominantemente supraespinal. En acuerdo
con nuestros resultados los ratones deficientes en el precursor de las
encefalinas, que presentan una alta afinidad por los receptores δ y μ, también
muestran una disminución en el umbral nociceptivo en el modelo de la placa
caliente (Konig et al., 1996).

Los resultados obtenidos en ratones deficientes en el receptor opioide δ

muestran una implicación de este receptor en el control de las respuestas
mecánicas en el test de presión de la cola y en la respuesta infamatoria en la
fase tardía del test de la formalina. La actividad del sistema opioide endógeno
se estimula durante el desarrollo de un proceso inflamatorio, tanto a nivel del
sistema nervioso central como en células del sistema inmune (Stein et al.,
2001b). Estudios farmacológicos han descrito un papel importante del receptor
opioide δ en la modulación de estas respuestas (Qiu et al., 2000b). Así, ratones
deficientes en el receptor μ mostraron una recuperación más rápida a los
efectos hiperalgésicos producidos por la administración de adyuvante de
Freund. Sin embargo, está recuperación se bloqueó tras la administración del
antagonista selectivo δ opioide, naltrindol. Además, estos ratones μ knockout
presentaron una respuesta analgésica mayor tras la administración de
agonistas δ opioide (Qiu et al., 2000b).

180
El receptor κ parece estar implicado en el control espinal de las respuestas
ante estímulos térmicos, aunque este efecto fue tan solo observado en ratones
hembra. Estudios realizados en ratones deficientes en el péptido prodinorfina
apoyan esta hipótesis. Así, estos ratones mostraron una disminución en la
latencia de respuesta en el test de inmersión de la cola, sin mostrar diferencias
en el test de la placa caliente (Wang et al., 2001). Sin embargo, la respuesta en
el test del ácido acético tampoco resultó modificada en los ratones deficientes
en prodinorfina (Wang et al., 2001), mientras que los ratones deficientes en el
receptor κ (Simonin et al., 1998), los dobles mutantes μ-κ y los triples mutantes
μ-δ-κ presentan una hiperalgesia en este último modelo de dolor.

Nuestros resultados confirman la existencia de un tono opioide endógeno

implicado en el control de determinados estímulos nociceptivos. Los resultados
obtenidos en las diferentes líneas de ratones knockout muestran una
implicación diferente de cada receptor opioide en las diversas modalidades de
dolor.

Aunque los ratones deficientes en un receptor opioide son aparentemente

normales, podrían existir cambios adaptativos en otros componentes del
sistema opioide con la finalidad de contrarrestar la falta del receptor. Sin
embargo, hasta el momento estos cambios compensatorios no se han
observado en ninguna de las líneas de ratones deficientes en los receptores
opioides (para revisión ver, Kieffer & Gaveriaux-Ruff, 2002).

Aunque el sistema opioide endógeno juega un papel importante en la

modulación de los estímulos nociceptivos, los resultados obtenidos en los triple
mutantes deficientes en todos los receptores opioides muestran cambios de
una magnitud limitada. Estos resultados sugieren que otros sistemas
endógenos juegan también un papel importante en el control de las respuestas
nociceptivas inducidas en estos modelos experimentales.

181
CONCLUSIONES
El trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral ha permitido extraer las
siguientes conclusiones sobre el papel de los sistemas cannabinoide, opioide y
del péptido PACAP en el control de diferentes respuestas fisiológicas y en el
desarrollo de fenómenos de adicción a drogas de abuso:

1. La supresión del receptor cannabinoide CB1 produce un incremento

en la agresividad y en las respuestas de tipo ansioso y depresivo.

2. La disrupción funcional del receptor cannabinoide CB1 mejora el

aprendizaje y la memoria en diferentes modelos animales.

3. La supresión del receptor cannabinoide CB1 suprime los efectos

reforzantes de la morfina, pero no modifica los efectos
disfóricos/aversivos asociados al síndrome de abstinencia a esta
droga.

4. Los efectos gratificantes de la cocaína no están modificados en los

ratones deficientes en el receptor cannabinoide CB1.

5. La sensibilización a los efectos locomotores de la morfina resultaron

modificados, pero no así los de la cocaína, en los ratones deficientes
en el receptor cannabinoide CB1.

6. La supresión del receptor PAC1 produce un incremento en la

actividad locomotora y una disminución en las respuestas de tipo
ansioso. Estas respuestas están mediadas por receptores localizados
en áreas diferentes al hipocampo o la corteza frontal.

7. El ritmo circadiano y la tolerancia al etanol no están modificados en

ratones deficientes en el receptor PAC1.

8. La supresión del receptor PAC1 produce una disminución en las

respuestas nociceptivas de tipo químico visceral. Estas respuestas
están mediadas por receptores localizados en áreas diferentes al

183
 hipocampo y la corteza frontal. No obstante, las respuestas
nociceptivas basales en modelos de la inmersión de la cola, retirada
de la cola y placa caliente no resultaron modificadas.

9. Las respuestas antinociceptivas y la manifestación de los efectos

reforzantes de la morfina no están reguladas por el receptor PAC1.
Sin embargo, la disrupción funcional del receptor PAC1 produce un
incremento en las manifestaciones somáticas del síndrome de
abstinencia físico a la morfina.

10. La supresión de la actividad del receptor PAC1 en las fibras

musgosas del hipocampo impide el desarrollo del fenómeno de LTP.
Los ratones deficientes en el receptor PAC1 presentan un déficit en
el aprendizaje contextual.

11. Existe un tono opioide endógeno involucrado en el control

nociceptivo. La supresión de los receptores opioides μ, δ y/o κ
produce alteraciones específicas en las respuestas nociceptivas
producidas por determinados estímulos. Este resultado sugiere un
papel diferencial de cada receptor opioide en el control de los
estímulos nociceptivos de origen térmico, mecánico y químico.

184
ANEXO

185
Filliol D, Ghozland S, Chluba J, Martin M, Matthes HW,
Simonin F, Befort K, Gavériaux-Ruff C, Dierich A, LeMeur M,
Valverde O, Maldonado R, Kieffer BL.
Mice deficient for delta- and mu-opioid receptors exhibit
opposing alterations of emotional responses.
Nat Genet. 2000 Jun;25(2):195-200.
BIBLIOGRAFÍA
Abel, T. & Lattal, K. M. (2001). Molecular mechanisms of memory acquisition,
consolidation and retrieval. Curr.Opin.Neurobiol.2001. 11, 180-187.
Aceto, M. D., Scates, S. M., Lowe, J. A., & Martin, B. R. (1995). Cannabinoid
precipitated withdrawal by the selective cannabinoid receptor antagonist, SR 141716A.
Eur J Pharmacol. 282, R1-R2.
Aceto, M. D., Scates, S. M., & Martin, B. B. (2001). Spontaneous and precipitated
withdrawal with a synthetic cannabinoid, WIN 55212-2. Eur J Pharmacol.2001. 416, 75-
81.
Acquas, E., Pisanu, A., Marrocu, P., & Di Chiara, G. (2000). Cannabinoid CB(1)
receptor agonists increase rat cortical and hippocampal acetylcholine release in vivo.
Eur J Pharmacol. 401, 179-185.
Acquas, E., Pisanu, A., Marrocu, P., Goldberg, S. R., & Di Chiara, G. (2001). Delta9-
tetrahydrocannabinol enhances cortical and hippocampal acetylcholine release in vivo:
a microdialysis study. Eur J Pharmacol. 419, 155-161.
Adamou, J. E., Aiyar, N., Van Horn, S., & Elshourbagy, N. A. (1995). Cloning and
functional characterization of the human vasoactive intestinal peptide (VIP)-2 receptor.
Biochem.Biophys.Res.Commun. 209, 385-392.
Akil, H., Watson, S. J., Young, E., Lewis, M. E., Khachaturian, H., & Walker, J. M.
(1984). Endogenous opioids: biology and function. Annu.Rev.Neurosci. 7, 223-255.
Albin, R. L., Young, A. B., & Penney, J. B. (1989). The functional anatomy of basal
ganglia disorders. Trends Neurosci. 12, 366-375.
Ammer, H., Nice, L., Lang, J., & Schulz, R. (1991). Regulation of G proteins by chronic
opiate and clonidine treatment in the guinea pig myenteric plexus. J
Pharmacol.Exp.Ther. 258, 790-796.
Amoss, M., Burgus, R., Blackwell, R., Vale, W., Fellows, R., & Guillemin, R. (1971).
Purification, amino acid composition and N-terminus of the hypothalamic luteinizing
hormone releasing factor (LRF) of ovine origin. Biochem.Biophys.Res.Commun. 44,
205-210.
Anderson, S. T. & Curlewis, J. D. (1998). PACAP stimulates dopamine neuronal
activity in the medial basal hypothalamus and inhibits prolactin. Brain Res. 790, 343-
346.
Arbogast, L. A. & Voogt, J. L. (1994). Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide
(PACAP) increases prolactin release and tuberoinfundibular dopaminergic neuronal
activity. Brain Res. 655, 17-24.
Arevalo, C., de Miguel, R., & Hernandez-Tristan, R. (2001). Cannabinoid effects on
anxiety-related behaviours and hypothalamic neurotransmitters. Pharmacol.
Biochem.Behav. 70, 123-131.
Arimura, A. (1992). Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP):
discovery and current status of research. Regul.Pept. 37, 287-303.
Arimura, A. (1998). Perspectives on pituitary adenylate cyclase activating polypeptide
(PACAP) in the neuroendocrine, endocrine, and nervous systems. Jpn J Physiol. 48,
301-331.
Arimura, A. & Shioda, S. (1995). Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide
(PACAP) and its receptors: neuroendocrine and endocrine interaction. Front.
Neuroendocrinol. 16, 53-88.

193
Arimura, A., Somogyvari-Vigh, A., Miyata, A., Mizuno, K., Coy, D. H., & Kitada, C.
(1991). Tissue distribution of PACAP as determined by RIA: highly abundant in the rat
brain and testes. Endocrinology 129, 2787-2789.
Arzt, E., Buric, R., Stelzer, G., Stalla, J., Sauer, J., Renner, U., & Stalla, G. K. (1993).
Interleukin involvement in anterior pituitary cell growth regulation: effects of IL-2 and IL-
6. Endocrinology 132, 459-467.
Ashur-Fabian, O., Giladi, E., Brenneman, D. E., & Gozes, I. (1997). Identification of
VIP/PACAP receptors on rat astrocytes using antisense oligodeoxynucleotides. J
Mol.Neurosci. 9, 211-222.
Asnicar, M. A., Koster, A., Heiman, M. L., Tinsley, F., Smith, D. P., Galbreath, E., Fox,
N., Ma, Y. L., Blum, W. F., & Hsiung, H. M. (2002). Vasoactive intestinal
polypeptide/pituitary adenylate cyclase-activating peptide receptor 2 deficiency in mice
results in growth retardation and increased basal metabolic rate. Endocrinology 143,
3994-4006.
Attali, B., Saya, D., & Vogel, Z. (1989). Kappa-opiate agonists inhibit adenylate cyclase
and produce heterologous desensitization in rat spinal cord. J Neurochem. 52, 360-
369.
Auerbach, J. M. & Segal, M. (1994). A novel cholinergic induction of long-term
potentiation in rat hippocampus. J Neurophysiol. 72, 2034-2040.
Avidor-Reiss, T., Bayewitch, M., Levy, R., Matus-Leibovitch, N., Nevo, I., & Vogel, Z.
(1995). Adenylylcyclase supersensitization in mu-opioid receptor-transfected Chinese
hamster ovary cells following chronic opioid treatment. J Biol.Chem. 270, 29732-29738.
Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Levy, R., Pfeuffer, T., & Vogel, Z. (1996). Chronic opioid
treatment induces adenylyl cyclase V superactivation. Involvement of Gbetagamma. J
Biol.Chem. 271, 21309-21315.
Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., & Vogel, Z. (1997). Opiate-induced
adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J Biol.Chem. 272, 5040-5047.
Ayhan, I. H., Kaymakcalan, S., & Tulunay, F. C. (1979). Interaction between delta 9-
tetrahydrocannabinol and morphine on the motor activity of mice. Psychopharmacology
(Berl) 63, 169-172.
Baamonde, A., Dauge, V., Ruiz-Gayo, M., Fulga, I. G., Turcaud, S., Fournie-Zaluski, M.
C., & Roques, B. P. (1992). Antidepressant-type effects of endogenous enkephalins
protected by systemic RB 101 are mediated by opioid delta and dopamine D1 receptor
stimulation. Eur J Pharmacol 216, 157-166.
Balfour, D. J., Benwell, M. E., Birrell, C. E., Kelly, R. J., & Al Aloul, M. (1998).
Sensitization of the mesoaccumbens dopamine response to nicotine.
Pharmacol.Biochem.Behav. 59, 1021-1030.
Bals-Kubik, R., Ableitner, A., Herz, A., & Shippenberg, T. S. (1993). Neuroanatomical
sites mediating the motivational effects of opioids as mapped by the conditioned place
preference paradigm in rats. J Pharmacol.Exp.Ther. 264, 489-495.
Banerjee, S. P., Snyder, S. H., & Mechoulam, R. (1975). Cannabinoids: influence on
neurotransmitter uptake in rat brain synaptosomes. J Pharmacol Exp.Ther. 194, 74-81.
Barr, G. A. & Zadina, J. E. (1999a). Maturation of endomorphin-2 in the dorsal horn of
the medulla and spinal cord of the rat. Neuroreport 10, 3857-3860.
Barr, G. A. & Zadina, J. E. (1999b). The ontogeny of endomorphin-1- and
endomorphin-2-like immunoreactivity in rat brain and spinal cord. Ann.N.Y.Acad.Sci.
897, 145-153.

194
Basavarajappa, B. S. & Hungund, B. L. (1999). Down-regulation of cannabinoid
receptor agonist-stimulated [35S]GTP gamma S binding in synaptic plasma membrane
from chronic ethanol exposed mouse. Brain Res. 815, 89-97.
Basille, M., Gonzalez, B. J., Leroux, P., Jeandel, L., Fournier, A., & Vaudry, H. (1993).
Localization and characterization of PACAP receptors in the rat cerebellum during
development: evidence for a stimulatory effect of PACAP on immature cerebellar
granule cells. Neuroscience 57, 329-338.
Basille, M., Vaudry, D., Coulouarn, Y., Jegou, S., Lihrmann, I., Fournier, A., Vaudry, H.,
& Gonzalez, B. J. (2000). Distribution of PACAP receptor mRNAs and PACAP binding
sites in the rat brain during development. Ann.N.Y.Acad.Sci. 921, 304-307.
Bass, C. E. & Martin, B. R. (2000). Time course for the induction and maintenance of
tolerance to Delta(9)-tetrahydrocannabinol in mice. Drug Alcohol Depend. 60, 113-119.
Beardsley, P. M., Balster, R. L., & Harris, L. S. (1986). Dependence on
tetrahydrocannabinol in rhesus monkeys. J Pharmacol.Exp.Ther. 239, 311-319.
Beaulieu, P., Bisogno, T., Punwar, S., Farquhar-Smith, W. P., Ambrosino, G., Di, M., V,
& Rice, A. S. (2000). Role of the endogenous cannabinoid system in the formalin test
of persistent pain in the rat. Eur J Pharmacol. 396, 85-92.
Becker, A., Grecksch, G., Brodemann, R., Kraus, J., Peters, B., Schroeder, H.,
Thiemann, W., Loh, H. H., & Hollt, V. (2000). Morphine self-administration in mu-opioid
receptor-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 361, 584-589.
Beinfeld, M. C. & Connolly, K. (2001). Activation of CB1 cannabinoid receptors in rat
hippocampal slices inhibits potassium-evoked cholecystokinin release, a possible
mechanism contributing to the spatial memory defects produced by cannabinoids.
Neurosci.Lett. 301, 69-71.
Beltramo, M., di Tomaso, E., & Piomelli, D. (1997). Inhibition of anandamide hydrolysis
in rat brain tissue by (E)-6-(bromomethylene) tetrahydro-3-(1-naphthalenyl)-2H-pyran-
2-one. FEBS Lett. 403, 263-267.
Beltramo, M. & Piomelli, D. (2000). Carrier-mediated transport and enzymatic
hydrolysis of the endogenous cannabinoid 2-arachidonylglycerol. Neuroreport 2000.
11, 1231-1235.
Berkley, K. J. (1997). Sex differences in pain. Behav.Brain Sci. 20, 371-380.
Bernatzky, G. & Jurna, I. (1986). Intrathecal injection of codeine, buprenorphine,
tilidine, tramadol and nefopam depresses the tail-flick response in rats. Eur J
Pharmacol. 120, 75-80.
Berrendero, F. & Maldonado, R. (2002). Involvement of the opioid system in the
anxiolytic-like effects induced by Delta(9)-tetrahydrocannabinol. Psychopharmacology
(Berl). 163, 111-117.
Bertrand, E., Smadja, C., Mauborgne, A., Roques, B. P., & Dauge, V. (1997). Social
interaction increases the extracellular levels of [Met]enkephalin in the nucleus
accumbens of control but not of chronic mild stressed rats. Neuroscience 80, 17-20.
Bertrand, G., Puech, R., Maisonnasse, Y., Bockaert, J., & Loubatieres-Mariani, M. M.
(1996). Comparative effects of PACAP and VIP on pancreatic endocrine secretions
and vascular resistance in rat. Br J Pharmacol. 117, 764-770.
Besson, J., Dussaillant, M., Marie, J. C., Rostene, W., & Rosselin, G. (1984). In vitro
autoradiographic localization of vasoactive intestinal peptide (VIP) binding sites in the
rat central nervous system. Peptides 5, 339-340.

195
Bhargava, H. N. (1976). Effect of some cannabinoids on naloxone-precipitated
abstinence in morphine-dependent mice. Psychopharmacology (Berl) 49, 267-270.
Bhargava, H. N. (1978). Time course of the effects of naturally occurring cannabinoids
on morphine abstinence syndrome. Pharmacol.Biochem.Behav. 8, 7-11.
Bidaut-Russell, M., Devane, W. A., & Howlett, A. C. (1990). Cannabinoid receptors and
modulation of cyclic AMP accumulation in the rat brain. J Neurochem. 55, 21-26.
Birmingham, M. K. (1973). Reduction by 9-tetrahydrocannabinol in the blood pressure
of hypertensive rats bearing regenerated adrenal glands. Br. J Pharmacol. 48, 169-
171.
Bisogno, T., Berrendero, F., Ambrosino, G., Cebeira, M., Ramos, J. A., Fernandez-
Ruiz, J. J., & Di, M., V (1999). Brain regional distribution of endocannabinoids:
implications for their biosynthesis and biological function.
Biochem.Biophys.Res.Commun. 256, 377-380.
Blendy, J. A. & Maldonado, R. (1998). Genetic analysis of drug addiction: the role of
cAMP response element binding protein. J Mol.Med. 76, 104-110.
Bloom, A. S. & Dewey, W. L. (1978). A comparison of some pharmacological actions of
morphine and delta9-tetrahydrocannabinol in the mouse. Psychopharmacology (Berl)
57, 243-248.
Boger, D. L., Sato, H., Lerner, A. E., Hedrick, M. P., Fecik, R. A., Miyauchi, H., Wilkie,
G. D., Austin, B. J., Patricelli, M. P., & Cravatt, B. F. (2000). Exceptionally potent
inhibitors of fatty acid amide hydrolase: the enzyme responsible for degradation of
endogenous oleamide and anandamide. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97, 5044-5049.
Bohme, G. A., Laville, M., Ledent, C., Parmentier, M., & Imperato, A. (2000). Enhanced
long-term potentiation in mice lacking cannabinoid CB1 receptors. Neuroscience. 95, 5-
7.
Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, F. T., Lefkowitz, R. J., & Caron, M. G. (2000). Mu-
opioid receptor desensitization by beta-arrestin-2 determines morphine tolerance but
not dependence. Nature 408, 720-723.
Bohn, L. M., Lefkowitz, R. J., Gainetdinov, R. R., Peppel, K., Caron, M. G., & Lin, F. T.
(1999). Enhanced morphine analgesia in mice lacking beta-arrestin 2. Science 286,
2495-2498.
Boler, J., Enzmann, F., Folkers, K., Bowers, C. Y., & Schally, A. V. (1969). The identity
of chemical and hormonal properties of the thyrotropin releasing hormone and
pyroglutamyl-histidyl-proline amide. Biochem.Biophys.Res.Commun. 37, 705-710.
Bonci, A. & Williams, J. T. (1997). Increased probability of GABA release during
withdrawal from morphine. J Neurosci. 17, 796-803.
Borsini, F., Lecci, A., Mancinelli, A., D'Aranno, V., & Meli, A. (1988). Stimulation of
dopamine D-2 but not D-1 receptors reduces immobility time of rats in the forced
swimming test: implication for antidepressant activity. Eur J Pharmacol. 148, 301-307.
Bouaboula, M., Poinot-Chazel, C., Bourrie, B., Canat, X., Calandra, B., Rinaldi-
Carmona, M., Le Fur, G., & Casellas, P. (1995). Activation of mitogen-activated protein
kinases by stimulation of the central cannabinoid receptor CB1. Biochem.J 312 (Pt 2),
637-641.
Bouaboula, M., Poinot-Chazel, C., Marchand, J., Canat, X., Bourrie, B., Rinaldi-
Carmona, M., Calandra, B., Le Fur, G., & Casellas, P. (1996). Signaling pathway
associated with stimulation of CB2 peripheral cannabinoid receptor. Involvement of
both mitogen-activated protein kinase and induction of Krox-24 expression. Eur J
Biochem. 237, 704-711.

196
Bozarth, M. A. & Wise, R. A. (1981a). Heroin reward is dependent on a dopaminergic
substrate. Life Sci. 29, 1881-1886.
Bozarth, M. A. & Wise, R. A. (1981b). Intracranial self-administration of morphine into
the ventral tegmental area in rats. Life Sci. 28, 551-555.
Braida, D., Pozzi, M., Cavallini, R., & Sala, M. (2001a). Conditioned place preference
induced by the cannabinoid agonist CP 55,940: interaction with the opioid system.
Neuroscience 104, 923-926.
Braida, D., Pozzi, M., Parolaro, D., & Sala, M. (2001b). Intracerebral self-administration
of the cannabinoid receptor agonist CP 55,940 in the rat: interaction with the opioid
system. Eur J Pharmacol. 413, 227-234.
Braida, D. & Sala, M. (2002). Role of the endocannabinoid system in MDMA
intracerebral self-administration in rats. Br J Pharmacol. 136, 1089-1092.
Brazeau, P., Vale, W., Burgus, R., Ling, N., Butcher, M., Rivier, J., & Guillemin, R.
(1973). Hypothalamic polypeptide that inhibits the secretion of immunoreactive pituitary
growth hormone. Science 179, 77-79.
Breault, L., Yon, L., Montero, M., Chouinard, L., Contesse, V., Delarue, C., Fournier,
A., Lehoux, J. G., Vaudry, H., & Gallo-Payet, N. (2000). Occurrence and effect of
PACAP in the human fetal adrenal gland. Ann.N.Y.Acad.Sci. 921, 429-433.
Bredow, S., Kacsoh, B., Obal, F., Jr., Fang, J., & Krueger, J. M. (1994). Increase of
prolactin mRNA in the rat hypothalamus after intracerebroventricular injection of VIP or
PACAP. Brain Res. 660, 301-308.
Breivogel, C. S. & Childers, S. R. (1998). The functional neuroanatomy of brain
cannabinoid receptors. Neurobiol.Dis. 5, 417-431.
Breivogel, C. S., Griffin, G., Di, M., V, & Martin, B. R. (2001). Evidence for a new G
protein-coupled cannabinoid receptor in mouse brain. Mol.Pharmacol. 60, 155-163.
Breivogel, C. S., Selley, D. E., & Childers, S. R. (1997). Acute and chronic effects of
opioids on delta and mu receptor activation of G proteins in NG108-15 and SK-N-SH
cell membranes. J Neurochem. 68, 1462-1472.
Brown, G. P. & Pasternak, G. W. (1998). 3H-naloxone benzoylhydrazone binding in
MOR-1-transfected Chinese hamster ovary cells: evidence for G-protein-dependent
antagonist binding. J Pharmacol.Exp.Ther. 286, 376-381.
Brown, T. T. & Dobs, A. S. (2002). Endocrine effects of marijuana. J Clin.Pharmacol.
42, 90S-96S.
Bruni, J. F., Van Vugt, D., Marshall, S., & Meites, J. (1977). Effects of naloxone,
morphine and methionine enkephalin on serum prolactin, luteinizing hormone, follicle
stimulating hormone, thyroid stimulating hormone and growth hormone. Life Sci. 21,
461-466.
Burstein, S., Budrow, J., Debatis, M., Hunter, S. A., & Subramanian, A. (1994).
Phospholipase participation in cannabinoid-induced release of free arachidonic acid.
Biochem.Pharmacol. 48, 1253-1264.
Burt, A. R., Carr, I. C., Mullaney, I., Anderson, N. G., & Milligan, G. (1996). Agonist
activation of p42 and p44 mitogen-activated protein kinases following expression of the
mouse delta opioid receptor in Rat-1 fibroblasts: effects of receptor expression levels
and comparisons with G-protein activation. Biochem.J 320 (Pt 1), 227-235.
Cabot, P. J. (2001). Immune-derived opioids and peripheral antinociception.
Clin.Exp.Pharmacol.Physiol. 28, 230-232.

197
Cadas, H., di Tomaso, E., & Piomelli, D. (1997). Occurrence and biosynthesis of
endogenous cannabinoid precursor, N-arachidonoyl phosphatidylethanolamine, in rat
brain. J Neurosci. 17 , 1226-1242.
Cadoni, C., Pisanu, A., Solinas, M., Acquas, E., & Di Chiara, G. (2001). Behavioural
sensitization after repeated exposure to Delta 9-tetrahydrocannabinol and cross-
sensitization with morphine. Psychopharmacology (Berl) 158, 259-266.
Caenazzo, L., Hoehe, M. R., Hsieh, W. T., Berrettini, W. H., Bonner, T. I., & Gershon,
E. S. (1991). HindIII identifies a two allele DNA polymorphism of the human
cannabinoid receptor gene (CNR). Nucleic Acids Res. 19, 4798.
Cagampang, F. R., Piggins, H. D., Sheward, W. J., Harmar, A. J., & Coen, C. W.
(1998). Circadian changes in PACAP type 1 (PAC1) receptor mRNA in the rat
suprachiasmatic and supraoptic nuclei. Brain Res. 813, 218-222.
Calignano, A., La Rana, G., Giuffrida, A., & Piomelli, D. (1998). Control of pain initiation
by endogenous cannabinoids. Nature 394, 277-281.
Campbell, K. A., Foster, T. C., Hampson, R. E., & Deadwyler, S. A. (1986). Effects of
delta 9-tetrahydrocannabinol on sensory-evoked discharges of granule cells in the
dentate gyrus of behaving rats. J Pharmacol.Exp.Ther. 239, 941-945.
Campbell, R. M. & Scanes, C. G. (1992). Evolution of the growth hormone-releasing
factor (GRF) family of peptides. Growth Regul. 2, 175-191.
Canny, B. J., Rawlings, S. R., & Leong, D. A. (1992). Pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide specifically increases cytosolic calcium ion concentration in rat
gonadotropes and somatotropes. Endocrinology 130, 211-215.
Canonico, P. L., Copani, A., D'Agata, V., Musco, S., Petralia, S., Travali, S., Stivala, F.,
& Cavallaro, S. (1996). Activation of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide
receptors prevents apoptotic cell death in cultured cerebellar granule cells.
Ann.N.Y.Acad.Sci. 805, 470-472.
Carlezon, W. A., Jr., Boundy, V. A., Haile, C. N., Lane, S. B., Kalb, R. G., Neve, R. L.,
& Nestler, E. J. (1997). Sensitization to morphine induced by viral-mediated gene
transfer. Science 277, 812-814.
Carlini, E. A., Lindsey, C. J., & Tufik, S. (1976). Environmental and drug interference
with effects of marihuana. Ann.N.Y.Acad.Sci. 281, 229-243.
Carlson, G., Wang, Y., & Alger, B. E. (2002). Endocannabinoids facilitate the induction
of LTP in the hippocampus. Nat.Neurosci. 5, 723-724.
Castane, A., Robledo, P., Matifas, A., Kieffer, B. L., & Maldonado, R. (2003).
Cannabinoid withdrawal syndrome is reduced in double mu and delta opioid receptor
knockout mice. Eur J Neurosci. 17, 155-159.
Castane, A., Valjent, E., Ledent, C., Parmentier, M., Maldonado, R., & Valverde, O.
(2002). Lack of CB1 cannabinoid receptors modifies nicotine behavioural responses,
but not nicotine abstinence. Neuropharmacology. 43, 857-867.
Caulfield, M. P. & Brown, D. A. (1992). Cannabinoid receptor agonists inhibit Ca
current in NG108-15 neuroblastoma cells via a pertussis toxin-sensitive mechanism. Br
J Pharmacol. 106, 231-232.
Cauvin, A., Buscail, L., Gourlet, P., De Neef, P., Gossen, D., Arimura, A., Miyata, A.,
Coy, D. H., Robberecht, P., & Christophe, J. (1990). The novel VIP-like hypothalamic
polypeptide PACAP interacts with high affinity receptors in the human neuroblastoma
cell line NB-OK. Peptides 11, 773-777.

198
Cauvin, A., Robberecht, P., De Neef, P., Gourlet, P., Vandermeers, A., Vandermeers-
Piret, M. C., & Christophe, J. (1991). Properties and distribution of receptors for
pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP) in rat brain and spinal cord.
Regul.Pept. 35, 161-173.
Cavallaro, S., D'Agata, V., Guardabasso, V., Travali, S., Stivala, F., & Canonico, P. L.
(1995). Differentiation induces pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide
receptor expression in PC-12 cells. Mol.Pharmacol. 48, 56-62.
Cervero, F. & Iggo, A. (1980). The substantia gelatinosa of the spinal cord: a critical
review. Brain 103, 717-772.
Chait, L. D. & Pierri, J. (1992). Effects of smoking marijuana on human performance. In
Marijuana/Cannabinoids: Neurobiology and Neurophysiology, eds. Murphy, L. &
Bartke, A., pp. 387-423. CRC Press, Boca Raton, FL.
Chakrabarti, S., Wang, L., Tang, W. J., & Gintzler, A. R. (1998). Chronic morphine
augments adenylyl cyclase phosphorylation: relevance to altered signaling during
tolerance/dependence. Mol.Pharmacol. 54, 949-953.
Chatterjee, T. K., Sharma, R. V., & Fisher, R. A. (1996). Molecular cloning of a novel
variant of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) receptor that
stimulates calcium influx by activation of L-type calcium channels. J Biol.Chem. 271,
32226-32232.
Chen, D., Buchanan, G. F., Ding, J. M., Hannibal, J., & Gillette, M. U. (1999). Pituitary
adenylyl cyclase-activating peptide: a pivotal modulator of glutamatergic regulation of
the suprachiasmatic circadian clock. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 96, 13468-13473.
Chen, J., Paredes, W., Lowinson, J. H., & Gardner, E. L. (1990a). Delta 9-
tetrahydrocannabinol enhances presynaptic dopamine efflux in medial prefrontal
cortex. Eur J Pharmacol. 190, 259-262.
Chen, J. P., Paredes, W., Li, J., Smith, D., Lowinson, J., & Gardner, E. L. (1990b).
Delta 9-tetrahydrocannabinol produces naloxone-blockable enhancement of
presynaptic basal dopamine efflux in nucleus accumbens of conscious, freely-moving
rats as measured by intracerebral microdialysis. Psychopharmacology (Berl) 102, 156-
162.
Chen, J. P., Paredes, W., Lowinson, J. H., & Gardner, E. L. (1991). Strain-specific
facilitation of dopamine efflux by delta 9-tetrahydrocannabinol in the nucleus
accumbens of rat: an in vivo microdialysis study. Neurosci.Lett. 129, 136-180.
Chen, Y., Mestek, A., Liu, J., & Yu, L. (1993). Molecular cloning of a rat kappa opioid
receptor reveals sequence similarities to the mu and delta opioid receptors. Biochem.J
295 (Pt 3), 625-628.
Childers, S. R., Fleming, L., Konkoy, C., Marckel, D., Pacheco, M., Sexton, T., & Ward,
S. (1992). Opioid and cannabinoid receptor inhibition of adenylyl cyclase in brain.
Ann.N.Y.Acad.Sci. 654, 33-51.
Chiodera, P., Volpi, R., Capretti, L., Caffarri, G., Magotti, M. G., & Coiro, V. (1996).
Effects of intravenously infused pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide on
adenohypophyseal Hormone secretion in normal men. Neuroendocrinology 64, 242-
246.
Christophe, J., Svoboda, M., Lambert, M., Waelbroeck, M., Winand, J., Dehaye, J. P.,
Vandermeers-Piret, M. C., Vandermeers, A., & Robberecht, P. (1986). Effector
mechanisms of peptides of the VIP family. Peptides 7 Suppl 1, 101-107.

199
Chuang, H. H., Yu, M., Jan, Y. N., & Jan, L. Y. (1998). Evidence that the nucleotide
exchange and hydrolysis cycle of G proteins causes acute desensitization of G-protein
gated inward rectifier K+ channels. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 95, 11727-11732.
Cicero, T. J., Meyer, E. R., Bell, R. D., & Koch, G. A. (1976). Effects of morphine and
methadone on serum testosterone and luteinizing hormone levels and on the
secondary sex organs of the male rat. Endocrinology 98, 367-372.
Cichewicz, D. L., Martin, Z. L., Smith, F. L., & Welch, S. P. (1999). Enhancement mu
opioid antinociception by oral delta9-tetrahydrocannabinol: dose-response analysis and
receptor identification. J Pharmacol.Exp.Ther. 289, 859-867.
Cohen, C., Perrault, G., Voltz, C., Steinberg, R., & Soubrie, P. (2002). SR141716, a
central cannabinoid (CB(1)) receptor antagonist, blocks the motivational and
dopamine-releasing effects of nicotine in rats. Behav.Pharmacol. 13, 451-463.
Colasanti, B. K., Lindamood, C., III, & Craig, C. R. (1982). Effects of marihuana
cannabinoids on seizure activity in cobalt-epileptic rats. Pharmacol.Biochem.Behav. 16,
573-578.
Colombo, G., Serra, S., Brunetti, G., Gomez, R., Melis, S., Vacca, G., Carai, M. M., &
Gessa, L. (2002). Stimulation of voluntary ethanol intake by cannabinoid receptor
agonists in ethanol-preferring sP rats. Psychopharmacology (Berl) 159, 181-187.
Comings, D. E., Muhleman, D., Gade, R., Johnson, P., Verde, R., Saucier, G., &
MacMurray, J. (1997). Cannabinoid receptor gene (CNR1): association with i.v. drug
use. Mol.Psychiatry 2, 161-168.
Connor, M. & Christie, M. D. (1999). Opioid receptor signalling mechanisms.
Clin.Exp.Pharmacol.Physiol. 26, 493-499.
Cook, S. A., Lowe, J. A., & Martin, B. R. (1998). CB1 receptor antagonist precipitates
withdrawal in mice exposed to Delta9-tetrahydrocannabinol. J Pharmacol.Exp.Ther.
285, 1150-1156.
Corchero, J., Avila, M. A., Fuentes, J. A., & Manzanares, J. (1997a). delta-9-
Tetrahydrocannabinol increases prodynorphin and proenkephalin gene expression in
the spinal cord of the rat. Life Sci. 61, L-43.
Corchero, J., Fuentes, J. A., & Manzanares, J. (1997b). delta 9-Tetrahydrocannabinol
increases proopiomelanocortin gene expression in the arcuate nucleus of the rat
hypothalamus. Eur J Pharmacol. 323, 193-195.
Corchero, J., Manzanares, J., & Fuentes, J. A. (1999a). Repeated administration of
delta9-tetrahydrocannabinol produces a differential time related responsiveness on
proenkephalin, proopiomelanocortin and corticotropin releasing factor gene expression
in the hypothalamus and pituitary gland of the rat. Neuropharmacology 38, 433-439.
Corchero, J., Romero, J., Berrendero, F., Fernandez-Ruiz, J., Ramos, J. A., Fuentes,
J. A., & Manzanares, J. (1999b). Time-dependent differences of repeated
administration with Delta9-tetrahydrocannabinol in proenkephalin and cannabinoid
receptor gene expression and G-protein activation by mu-opioid and CB1-cannabinoid
receptors in the caudate-putamen. Brain Res.Mol.Brain Res. 67, 148-157.
Cossu, G., Ledent, C., Fattore, L., Imperato, A., Bohme, G. A., Parmentier, M., &
Fratta, W. (2001). Cannabinoid CB1 receptor knockout mice fail to self-administer
morphine but not other drugs of abuse. Behav.Brain Res. 118, 61-65.
Cowan, A., Zhu, X. Z., Mosberg, H. I., Omnaas, J. R., & Porreca, F. (1988). Direct
dependence studies in rats with agents selective for different types of opioid receptor. J
Pharmacol.Exp.Ther. 246, 950-955.

200
Cowen, M. S. & Lawrence, A. J. (2001). Alterations in central preproenkephalin mRNA
expression after chronic free-choice ethanol consumption by fawn-hooded rats. Alcohol
Clin.Exp.Res. 25, 1126-1133.
Crain, S. M. & Shen, K. F. (1990). Opioids can evoke direct receptor-mediated
excitatory effects on sensory neurons. Trends Pharmacol.Sci. 11, 77-81.
Crain, S. M. & Shen, K. F. (1998). GM1 ganglioside-induced modulation of opioid
receptor-mediated functions. Ann.N.Y.Acad.Sci. 845, 106-125.
Cravatt, B. F., Giang, D. K., Mayfield, S. P., Boger, D. L., Lerner, R. A., & Gilula, N. B.
(1996). Molecular characterization of an enzyme that degrades neuromodulatory fatty-
acid amides. Nature 384, 83-87.
Crawley, J. N., Corwin, R. L., Robinson, J. K., Felder, C. C., Devane, W. A., & Axelrod,
J. (1993). Anandamide, an endogenous ligand of the cannabinoid receptor, induces
hypomotility and hypothermia in vivo in rodents. Pharmacol.Biochem.Behav. 46, 967-
972.
Culler, M. D. & Paschall, C. S. (1991). Pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide (PACAP) potentiates the gonadotropin-releasing activity of luteinizing
hormone-releasing hormone. Endocrinology 129, 2260-2262.
Cunningham, S. T., Finn, M., & Kelley, A. E. (1997). Sensitization of the locomotor
response to psychostimulants after repeated opiate exposure: role of the nucleus
accumbens. Neuropsychopharmacology 16, 147-155.
Czeh, B., Stuchlik, A., Wesierska, M., Cimadevilla, J. M., Pokorny, J., Seress, L., &
Bures, J. (2001). Effect of neonatal dentate gyrus lesion on allothetic and idiothetic
navigation in rats. Neurobiol.Learn.Mem. 75, 190-213.
Darmani, N. A. (2001). Cannabinoids of diverse structure inhibit two DOI-induced 5-
HT(2A) receptor-mediated behaviors in mice. Pharmacol. Biochem.Behav. 68, 311-
317.
Dauge, V. & Lena, I. (1998). CCK in anxiety and cognitive processes.
Neurosci.Biobehav.Rev 22, 815-825.
Dautzenberg, F. M., Mevenkamp, G., Wille, S., & Hauger, R. L. (1999). N-terminal
splice variants of the type I PACAP receptor: isolation, characterization and ligand
binding/selectivity determinants. J Neuroendocrinol. 11, 941-949.
Davis, W. M., Moreton, J. E., King, W. T., & Pace, H. B. (1972). Marihuana on
locomotor activity: biphasic effect and tolerance development. Res.Commun.
Chem.Pathol.Pharmacol. 3, 29-35.
De Vries, T. J., Homberg, J. R., Binnekade, R., Raaso, H., & Schoffelmeer, A. N.
(2003). Cannabinoid modulation of the reinforcing and motivational properties of heroin
and heroin-associated cues in rats. Psychopharmacology (Berl) In Press.
De Vries, T. J., Shaham, Y., Homberg, J. R., Crombag, H., Schuurman, K., Dieben, J.,
Vanderschuren, L. J., & Schoffelmeer, A. N. (2001). A cannabinoid mechanism in
relapse to cocaine seeking. Nat.Med. 7, 1151-1154.
De Vry, J., Donselaar, I., & Van Ree, J. M. (1989). Intraventricular self-administration of
heroin in the rat: reward seems dissociated from analgesia and physical dependence.
Eur J Pharmacol. 161, 19-25.
Deadwyler, S. A., Hampson, R. E., Bennett, B. A., Edwards, T. A., Mu, J., Pacheco, M.
A., Ward, S. J., & Childers, S. R. (1993). Cannabinoids modulate potassium current in
cultured hippocampal neurons. Receptors.Channels 1, 121-134.

201
Delfs, J. M., Kong, H., Mestek, A., Chen, Y., Yu, L., Reisine, T., & Chesselet, M. F.
(1994). Expression of mu opioid receptor mRNA in rat brain: an in situ hybridization
study at the single cell level. J Comp Neurol. 345, 46-68.
Delfs, J. M., Zhu, Y., Druhan, J. P., & Aston-Jones, G. (2000). Noradrenaline in the
ventral forebrain is critical for opiate withdrawal-induced aversion. Nature 403, 430-
434.
Delgado, M., Garrido, E., de la, F. M., & Gomariz, R. P. (1996). Pituitary adenylate
cyclase-activating polypeptide (PACAP-38) stimulates rat peritoneal macrophage
functions. Peptides 17, 1097-1105.
Derkinderen, P., Ledent, C., Parmentier, M., & Girault, J. A. (2001). Cannabinoids
activate p38 mitogen-activated protein kinases through CB1 receptors in hippocampus.
J Neurochem. 77, 957-960.
Desarnaud, F., Cadas, H., & Piomelli, D. (1995). Anandamide amidohydrolase activity
in rat brain microsomes. Identification and partial characterization. J Biol.Chem. 270,
6030-6035.
Deutsch, D. G. & Chin, S. A. (1993). Enzymatic synthesis and degradation of
anandamide, a cannabinoid receptor agonist. Biochem.Pharmacol. 46, 791-796.
Deutsch, P. J. & Sun, Y. (1992). The 38-amino acid form of pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide stimulates dual signaling cascades in PC12 cells and promotes
neurite outgrowth. J Biol.Chem. 267, 5108-5113.
Devane, W. A. & Axelrod, J. (1994). Enzymatic synthesis of anandamide, an
endogenous ligand for the cannabinoid receptor, by brain membranes.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91, 6698-6701.
Devane, W. A., Dysarz, F. A., III, Johnson, M. R., Melvin, L. S., & Howlett, A. C. (1988).
Determination and characterization of a cannabinoid receptor in rat brain.
Mol.Pharmacol. 34 , 605-613.
Devane, W. A., Hanus, L., Breuer, A., Pertwee, R. G., Stevenson, L. A., Griffin, G.,
Gibson, D., Mandelbaum, A., Etinger, A., & Mechoulam, R. (1992). Isolation and
structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science 258,
1946-1949.
Devane, W. A., Spain, J. W., Coscia, C. J., & Howlett, A. C. (1986). An assessment of
the role of opioid receptors in the response to cannabimimetic drugs. J Neurochem. 46,
1929-1935.
Devine, D. P., Leone, P., Pocock, D., & Wise, R. A. (1993). Differential involvement of
ventral tegmental mu, delta and kappa opioid receptors in modulation of basal
mesolimbic dopamine release: in vivo microdialysis studies. J Pharmacol.Exp.Ther.
266, 1236-1246.
Devine, D. P. & Wise, R. A. (1994). Self-administration of morphine, DAMGO, and
DPDPE into the ventral tegmental area of rats. J Neurosci. 14, 1978-1984.
Dewey, W. L. (1986). Cannabinoid pharmacology. Pharmacol.Rev. 38, 151-178.
Dewey, W. L., Jenkins, J., O'Rourke, T., & Harris, L. S. (1972). The effects of chronic
administration of trans- 9 -tetrahydrocannabinol on behavior and the cardiovascular
system of dogs. Arch.Int.Pharmacodyn.Ther. 198, 118-131.
Di Chiara, G. & Imperato, A. (1988). Drugs abused by humans preferentially increase
synaptic dopamine concentrations in the mesolimbic system of freely moving rats.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85, 5274-5278.

202
Di Chiara, G. & North, R. A. (1992). Neurobiology of opiate abuse. Trends
Pharmacol.Sci. 13, 185-193.
Di, M., V, Bisogno, T., & De Petrocellis, L. (2001). Anandamide: some like it hot.
Trends Pharmacol.Sci. 22, 346-349.
Di, M., V, Breivogel, C. S., Tao, Q., Bridgen, D. T., Razdan, R. K., Zimmer, A. M.,
Zimmer, A., & Martin, B. R. (2000). Levels, metabolism, and pharmacological activity of
anandamide in CB(1) cannabinoid receptor knockout mice: evidence for non-CB(1),
non-CB(2) receptor-mediated actions of anandamide in mouse brain. J Neurochem. 75,
2434-2444.
Di, M., V, Fontana, A., Cadas, H., Schinelli, S., Cimino, G., Schwartz, J. C., & Piomelli,
D. (1994). Formation and inactivation of endogenous cannabinoid anandamide in
central neurons. Nature 372, 686-691.
Diana, M., Melis, M., & Gessa, G. L. (1998). Increase in meso-prefrontal dopaminergic
activity after stimulation of CB1 receptors by cannabinoids. Eur J Neurosci. 10, 2825-
2830.
Diana, M., Muntoni, A. L., Pistis, M., Melis, M., & Gessa, G. L. (1999). Lasting reduction
in mesolimbic dopamine neuronal activity after morphine withdrawal. Eur J Neurosci.
11, 1037-1041.
Diana, M., Pistis, M., Muntoni, A., & Gessa, G. (1995). Profound decrease of
mesolimbic dopaminergic neuronal activity in morphine withdrawn rats. J
Pharmacol.Exp.Ther. 272, 781-785.
DiCicco-Bloom, E., Deutsch, P. J., Maltzman, J., Zhang, J., Pintar, J. E., Zheng, J.,
Friedman, W. F., Zhou, X., & Zaremba, T. (2000). Autocrine expression and
ontogenetic functions of the PACAP ligand/receptor system during sympathetic
development. Dev.Biol. 219, 197-213.
Dickenson, A. H., Sullivan, A. F., Knox, R., Zajac, J. M., & Roques, B. P. (1987). Opioid
receptor subtypes in the rat spinal cord: electrophysiological studies with mu- and
delta-opioid receptor agonists in the control of nociception. Brain Res. 413, 36-44.
Dickinson, T., Mitchell, R., Robberecht, P., & Fleetwood-Walker, S. M. (1999). The role
of VIP/PACAP receptor subtypes in spinal somatosensory processing in rats with an
experimental peripheral mononeuropathy. Neuropharmacology 38, 167-180.
Dinh, T. P., Freund, T. F., & Piomelli, D. (2002). A role for monoglyceride lipase in 2-
arachidonoylglycerol inactivation. Chem.Phys.Lipids 121, 149-158.
Dohlman, H. G. & Thorner, J. (1997). RGS proteins and signaling by heterotrimeric G
proteins. J Biol.Chem. 272, 3871-3874.
Dong, W., Seidel, B., Marcinkiewicz, M., Chretien, M., Seidah, N. G., & Day, R. (1997).
Cellular localization of the prohormone convertases in the hypothalamic paraventricular
and supraoptic nuclei: selective regulation of PC1 in corticotrophin-releasing hormone
parvocellular neurons mediated by glucocorticoids. J Neurosci. 17, 563-575.
Doupnik, C. A., Davidson, N., Lester, H. A., & Kofuji, P. (1997). RGS proteins
reconstitute the rapid gating kinetics of gbetagamma-activated inwardly rectifying K+
channels. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 94, 10461-10466.
Dow, R. C., Bennie, J., & Fink, G. (1994). Pituitary adenylate cyclase-activating
peptide-38 (PACAP)-38 is released into hypophysial portal blood in the normal male
and female rat. J Endocrinol. 142, R1-R4.
Drew, L. J., Harris, J., Millns, P. J., Kendall, D. A., & Chapman, V. (2000). Activation of
spinal cannabinoid 1 receptors inhibits C-fibre driven hyperexcitable neuronal

203
responses and increases [35S]GTPgammaS binding in the dorsal horn of the spinal
cord of noninflamed and inflamed rats. Eur J Neurosci. 12, 2079-2086.
Drower, E. J., Stapelfeld, A., Rafferty, M. F., de Costa, B. R., Rice, K. C., & Hammond,
D. L. (1991). Selective antagonism by naltrindole of the antinociceptive effects of the
delta opioid agonist cyclic[D-penicillamine2-D-penicillamine5]enkephalin in the rat. J
Pharmacol.Exp.Ther. 259, 725-731.
Duman, R. S., Tallman, J. F., & Nestler, E. J. (1988). Acute and chronic opiate-
regulation of adenylate cyclase in brain: specific effects in locus coeruleus. J
Pharmacol.Exp.Ther. 246, 1033-1039.
Dun, N. J., Miyazaki, T., Tang, H., & Dun, E. C. (1996). Pituitary adenylate cyclase
activating polypeptide immunoreactivity in the rat spinal cord and medulla: implication
of sensory and autonomic functions. Neuroscience 73, 677-686.
Edwards, A. V. & Jones, C. T. (1994). Adrenal responses to the peptide PACAP in
conscious functionally hypophysectomized calves. Am.J Physiol. 266, E870-E876.
El Gehani, F., Tena-Sempere, M., & Huhtaniemi, I. (1998). Vasoactive intestinal
peptide is an important endocrine regulatory factor of fetal rat testicular
steroidogenesis. Endocrinology 139, 1474-1480.
Evans, C. J., Keith, D. E., Jr., Morrison, H., Magendzo, K., & Edwards, R. H. (1992).
Cloning of a delta opioid receptor by functional expression. Science 258, 1952-1955.
Facci, L., Dal Toso, R., Romanello, S., Buriani, A., Skaper, S. D., & Leon, A. (1995).
Mast cells express a peripheral cannabinoid receptor with differential sensitivity to
anandamide and palmitoylethanolamide. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 92, 3376-3380.
Fallon, J. H. & Leslie, F. M. (1986). Distribution of dynorphin and enkephalin peptides
in the rat brain. J Comp.Neurol. 249, 293-336.
Fan, F., Tao, Q., Abood, M., & Martin, B. R. (1996). Cannabinoid receptor down-
regulation without alteration of the inhibitory effect of CP 55,940 on adenylyl cyclase in
the cerebellum of CP 55,940-tolerant mice. Brain Res. 706, 13-20.
Farquhar-Smith, W. P., Egertova, M., Bradbury, E. J., McMahon, S. B., Rice, A. S., &
Elphick, M. R. (2000). Cannabinoid CB(1) receptor expression in rat spinal cord.
Mol.Cell Neurosci. 15, 510-521.
Fattore, L., Cossu, G., Martellotta, C. M., & Fratta, W. (2001). Intravenous self-
administration of the cannabinoid CB1 receptor agonist WIN 55,212-2 in rats.
Psychopharmacology (Berl) 156, 410-416.
Fattore, L., Martellotta, M. C., Cossu, G., Mascia, M. S., & Fratta, W. (1999). CB1
cannabinoid receptor agonist WIN 55,212-2 decreases intravenous cocaine self-
administration in rats. Behav.Brain Res. 104, 141-146.
Feany, M. B. & Quinn, W. G. (1995). A neuropeptide gene defined by the Drosophila
memory mutant amnesiac. Science 268, 869-873.
Felder, C. C., Briley, E. M., Axelrod, J., Simpson, J. T., Mackie, K., & Devane, W. A.
(1993). Anandamide, an endogenous cannabimimetic eicosanoid, binds to the cloned
human cannabinoid receptor and stimulates receptor-mediated signal transduction.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90, 7656-7660.
Felder, C. C., Joyce, K. E., Briley, E. M., Mansouri, J., Mackie, K., Blond, O., Lai, Y.,
Ma, A. L., & Mitchell, R. L. (1995). Comparison of the pharmacology and signal
transduction of the human cannabinoid CB1 and CB2 receptors. Mol.Pharmacol. 48,
443-450.

204
Felder, C. C., Nielsen, A., Briley, E. M., Palkovits, M., Priller, J., Axelrod, J., Nguyen, D.
N., Richardson, J. M., Riggin, R. M., Koppel, G. A., Paul, S. M., & Becker, G. W.
(1996). Isolation and measurement of the endogenous cannabinoid receptor agonist,
anandamide, in brain and peripheral tissues of human and rat. FEBS Lett. 393, 231-
235.
Felley, C. P., Qian, J. M., Mantey, S., Pradhan, T., & Jensen, R. T. (1992). Chief cells
possess a receptor with high affinity for PACAP and VIP that stimulates pepsinogen
release. Am J Physiol. 263, G901-G907.
Fernandez-Ruiz, J. J., Munoz, R. M., Romero, J., Villanua, M. A., Makriyannis, A., &
Ramos, J. A. (1997). Time course of the effects of different cannabimimetics on
prolactin and gonadotrophin secretion: evidence for the presence of CB1 receptors in
hypothalamic structures and their involvement in the effects of cannabimimetics.
Biochem.Pharmacol. 53, 1919-1927.
Fezza, F., Bisogno, T., Minassi, A., Appendino, G., Mechoulam, R., & Di, M., V (2002).
Noladin ether, a putative novel endocannabinoid: inactivation mechanisms and a
sensitive method for its quantification in rat tissues. FEBS Lett. 513, 294-298.
Fields, H. L., Heinricher, M. M., & Mason, P. (1991). Neurotransmitters in nociceptive
modulatory circuits. Annu.Rev Neurosci. 14, 219-245.
Figiel, M. & Engele, J. (2000). Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide
(PACAP), a neuron-derived peptide regulating glial glutamate transport and
metabolism. J Neurosci. 20, 3596-3605.
Filipsson, K., Sundler, F., Hannibal, J., & Ahren, B. (1998). PACAP and PACAP
receptors in insulin producing tissues: localization and effects. Regul.Pept. 74, 167-
175.
Filipsson, K., Tornoe, K., Holst, J., & Ahren, B. (1997). Pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide stimulates insulin and glucagon secretion in humans. J
Clin.Endocrinol.Metab. 82, 3093-3098.
Filliol, D., Ghozland, S., Chluba, J., Martin, M., Matthes, H. W., Simonin, F., Befort, K.,
Gaveriaux-Ruff, C., Dierich, A., LeMeur, M., Valverde, O., Maldonado, R., & Kieffer, B.
L. (2000). Mice deficient for delta- and mu-opioid receptors exhibit opposing alterations
of emotional responses. Nat.Genet. 25, 195-200.
Finley, J. C., Lindstrom, P., & Petrusz, P. (1981). Immunocytochemical localization of
beta-endorphin-containing neurons in the rat brain. Neuroendocrinology 33, 28-42.
Finn, A. K. & Whistler, J. L. (2001). Endocytosis of the mu opioid receptor reduces
tolerance and a cellular hallmark of opiate withdrawal. Neuron 32, 829-839.
Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., & Nestler, E. J. (1996). Drugs of abuse
and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor
subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-
sensitizing agents. J Neurosci. 16, 274-282.
Freedland, C. S., Sharpe, A. L., Samson, H. H., & Porrino, L. J. (2001). Effects of
SR141716A on ethanol and sucrose self-administration. Alcohol Clin.Exp.Res.2001.
25, 277-282.
French, E. D. (1997). delta9-Tetrahydrocannabinol excites rat VTA dopamine neurons
through activation of cannabinoid CB1 but not opioid receptors. Neurosci.Lett. 226,
159-162.
Frey, E. A. & Kebabian, J. W. (1984). A mu-opiate receptor in 7315c tumor tissue
mediates inhibition of immunoreactive prolactin release and adenylate cyclase activity.
Endocrinology 115, 1797-1804.

205
Fride, E. & Mechoulam, R. (1993). Pharmacological activity of the cannabinoid receptor
agonist, anandamide, a brain constituent. Eur J Pharmacol. 231, 313-314.
Fridolf, T., Sundler, F., & Ahren, B. (1992). Pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide (PACAP): occurrence in rodent pancreas and effects on insulin and
glucagon secretion in the mouse. Cell Tissue Res. 269, 275-279.
Frodin, M., Hannibal, J., Wulff, B. S., Gammeltoft, S., & Fahrenkrug, J. (1995).
Neuronal localization of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide 38 in the
adrenal medulla and growth-inhibitory effect on chromaffin cells. Neuroscience 65, 599-
608.
Fujiwara, M., Kataoka, Y., Hori, Y., & Ueki, S. (1984). Irritable aggression induced by
delta 9-tetrahydrocannabinol in rats pretreated with 6-hydroxydopamine. Pharmacol
Biochem.Behav. 20, 457-462.
Fukuda, K., Kato, S., Mori, K., Nishi, M., & Takeshima, H. (1993). Primary structures
and expression from cDNAs of rat opioid receptor delta- and mu-subtypes. FEBS Lett.
327, 311-314.
Fukuda, K., Kato, S., Morikawa, H., Shoda, T., & Mori, K. (1996). Functional coupling of
the delta-, mu-, and kappa-opioid receptors to mitogen-activated protein kinase and
arachidonate release in Chinese hamster ovary cells. J Neurochem. 67, 1309-1316.
Fukuhara, C., Inouye, S. I., Matsumoto, Y., Tsujimoto, G., Aoki, K., & Masuo, Y. (1998).
Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide rhythm in the rat pineal gland.
Neurosci.Lett. 241, 115-118.
Fukuhara, C., Suzuki, N., Matsumoto, Y., Nakayama, Y., Aoki, K., Tsujimoto, G.,
Inouye, S. I., & Masuo, Y. (1997). Day-night variation of pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide (PACAP) level in the rat suprachiasmatic nucleus. Neurosci.Lett.
229, 49-52.
Funada, M. & Shippenberg, T. S. (1996). Differential involvement of D1 and D2
dopamine receptors in the expression of morphine withdrawal signs in rats.
Behav.Pharmacol. 7, 448-453.
Gagnon, A. W., Aiyar, N., & Elshourbagy, N. A. (1994). Molecular cloning and
functional characterization of a human liver vasoactive intestinal peptide receptor. Cell
Signal. 6, 321-333.
Galiegue, S., Mary, S., Marchand, J., Dussossoy, D., Carriere, D., Carayon, P.,
Bouaboula, M., Shire, D., Le Fur, G., & Casellas, P. (1995). Expression of central and
peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte
subpopulations. Eur J Biochem. 232, 54-61.
Gaoni, Y. & Mechoulam, R. (1964). Isolation, structure and partial synthesis of an
active constituent of hashish. J Am Chem. Scoc. 86, 1646-1647.
Gardell, L. R., Ossipov, M. H., Vanderah, T. W., Lai, J., & Porreca, F. (2002).
Dynorphin-independent spinal cannabinoid antinociception. Pain 100, 243-248.
Gardner, E. L. & Lowinson, J. H. (1991). Marijuana's interaction with brain reward
systems: update 1991. Pharmacol.Biochem.Behav. 40, 571-580.
Gardner, E. L., Paredes, W., Smith, D., Donner, A., Milling, C., Cohen, D., & Morrison,
D. (1988). Facilitation of brain stimulation reward by delta 9-tetrahydrocannabinol.
Psychopharmacology (Berl) 96, 142-144.
Gardner, E. L. & Vorel, S. R. (1998). Cannabinoid transmission and reward-related
events. Neurobiol.Dis. 5, 502-533.

206
Gaytan, F., Martinez-Fuentes, A. J., Garcia-Navarro, F., Vaudry, H., & Aguilar, E.
(1994). Pituitary adenylate cyclase-activating peptide (PACAP) immunolocalization in
lymphoid tissues of the rat. Cell Tissue Res. 276, 223-227.
Gerard, C., Mollereau, C., Vassart, G., & Parmentier, M. (1990). Nucleotide sequence
of a human cannabinoid receptor cDNA. Nucleic Acids Res. 18, 7142.
Gerard, C. M., Mollereau, C., Vassart, G., & Parmentier, M. (1991). Molecular cloning
of a human cannabinoid receptor which is also expressed in testis. Biochem.J 279 (Pt
1), 129-134.
Gessa, G. L., Mascia, M. S., Casu, M. A., & Carta, G. (1997). Inhibition of hippocampal
acetylcholine release by cannabinoids: reversal by SR 141716A. Eur J Pharmacol.
327, R1-R2.
Ghatei, M. A., Takahashi, K., Suzuki, Y., Gardiner, J., Jones, P. M., & Bloom, S. R.
(1993). Distribution, molecular characterization of pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide and its precursor encoding messenger RNA in human and rat tissues. J
Endocrinol. 136, 159-166.
Ghozland, S., Matthes, H. W., Simonin, F., Filliol, D., Kieffer, B. L., & Maldonado, R.
(2002). Motivational effects of cannabinoids are mediated by mu-opioid and kappa-
opioid receptors. J Neurosci. 22, 1146-1154.
Gifford, A. N. & Ashby, C. R., Jr. (1996). Electrically evoked acetylcholine release from
hippocampal slices is inhibited by the cannabinoid receptor agonist, WIN 55212-2, and
is potentiated by the cannabinoid antagonist, SR 141716A. J Pharmacol.Exp.Ther.
277, 1431-1436.
Giuffrida, A., Parsons, L. H., Kerr, T. M., Rodriguez, d. F., Navarro, M., & Piomelli, D.
(1999). Dopamine activation of endogenous cannabinoid signaling in dorsal striatum.
Nat.Neurosci. 2, 358-363.
Glass, M. & Felder, C. C. (1997). Concurrent stimulation of cannabinoid CB1 and
dopamine D2 receptors augments cAMP accumulation in striatal neurons: evidence for
a Gs linkage to the CB1 receptor. J Neurosci. 17, 5327-5333.
Glatt, C. E. & Snyder, S. H. (1993). Cloning and expression of an adenylyl cyclase
localized to the corpus striatum. Nature 361, 536-538.
Goeders, N. E., Lane, J. D., & Smith, J. E. (1984). Self-administration of methionine
enkephalin into the nucleus accumbens. Pharmacol.Biochem.Behav. 20, 451-455.
Goldring, S. R., Gorn, A. H., Yamin, M., Krane, S. M., & Wang, J. T. (1993).
Characterization of the structural and functional properties of cloned calcitonin receptor
cDNAs. Horm.Metab.Res. 25, 477-480.
Goldstein, A., Fischli, W., Lowney, L. I., Hunkapiller, M., & Hood, L. (1981). Porcine
pituitary dynorphin: complete amino acid sequence of the biologically active
heptadecapeptide. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78, 7219-7223.
Gonzalez, S., Cascio, M. G., Fernandez-Ruiz, J., Fezza, F., Di, M., V, & Ramos, J. A.
(2002a). Changes in endocannabinoid contents in the brain of rats chronically exposed
to nicotine, ethanol or cocaine. Brain Res. 954, 73-81.
Gonzalez, S., Fernandez-Ruiz, J., Sparpaglione, V., Parolaro, D., & Ramos, J. A.
(2002b). Chronic exposure to morphine, cocaine or ethanol in rats produced different
effects in brain cannabinoid CB(1) receptor binding and mRNA levels. Drug Alcohol
Depend. 66, 77-84.
Gonzalez, S., Manzanares, J., Berrendero, F., Wenger, T., Corchero, J., Bisogno, T.,
Romero, J., Fuentes, J. A., Di, M., V, Ramos, J. A., & Fernandez-Ruiz, J. (1999).

207
Identification of endocannabinoids and cannabinoid CB(1) receptor mRNA in the
pituitary gland. Neuroendocrinology 70, 137-145.
Goparaju, S. K., Ueda, N., Taniguchi, K., & Yamamoto, S. (1999). Enzymes of porcine
brain hydrolyzing 2-arachidonoylglycerol, an endogenous ligand of cannabinoid
receptors. Biochem.Pharmacol. 57, 417-423.
Goparaju, S. K., Ueda, N., Yamaguchi, H., & Yamamoto, S. (1998). Anandamide
amidohydrolase reacting with 2-arachidonoylglycerol, another cannabinoid receptor
ligand. FEBS Lett. 422, 69-73.
Gorospe, W. C. & Spangelo, B. L. (1993). Interleukin-6 production by rat granulosa
cells in vitro: effects of cytokines, follicle-stimulating hormone, and cyclic 3',5'-
adenosine monophosphate. Biol.Reprod. 48, 538-543.
Gorriti, M. A., Rodriguez, d. F., Navarro, M., & Palomo, T. (1999). Chronic (-)-delta9-
tetrahydrocannabinol treatment induces sensitization to the psychomotor effects of
amphetamine in rats. Eur J Pharmacol. 365, 133-142.
Gottschall, P. E., Tatsuno, I., & Arimura, A. (1991). Hypothalamic binding sites for
pituitary adenylate cyclase activating polypeptide: characterization and molecular
identification. FASEB J 5, 194-199.
Gottschall, P. E., Tatsuno, I., Miyata, A., & Arimura, A. (1990). Characterization and
distribution of binding sites for the hypothalamic peptide, pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide. Endocrinology 127, 272-277.
Gras, S., Hannibal, J., Georg, B., & Fahrenkrug, J. (1996). Transient periovulatory
expression of pituitary adenylate cyclase activating peptide in rat ovarian cells.
Endocrinology 137, 4779-4785.
Gray, S. L., Cummings, K. J., Jirik, F. R., & Sherwood, N. M. (2001). Targeted
disruption of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide gene results in early
postnatal death associated with dysfunction of lipid and carbohydrate metabolism.
Mol.Endocrinol. 15, 1739-1747.
Gray, S. L., Yamaguchi, N., Vencova, P., & Sherwood, N. M. (2002). Temperature-
sensitive phenotype in mice lacking pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.
Endocrinology 143, 3946-3954.
Gressens, P., Marret, S., Hill, J. M., Brenneman, D. E., Gozes, I., Fridkin, M., & Evrard,
P. (1997). Vasoactive intestinal peptide prevents excitotoxic cell death in the murine
developing brain. J Clin.Invest. 100, 390-397.
Grimaldi, M. & Cavallaro, S. (1999). Functional and molecular diversity of PACAP/VIP
receptors in cortical neurons and type I astrocytes. Eur J Neurosci. 11, 2767-2772.
Grinevich, V., Fournier, A., & Pelletier, G. (1997). Effects of pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide (PACAP) on corticotropin-releasing hormone (CRH) gene
expression in the rat hypothalamic paraventricular nucleus. Brain Res. 773, 190-196.
Grudt, T. J. & Williams, J. T. (1993). kappa-Opioid receptors also increase potassium
conductance. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90, 11429-11432.
Guerrero, J. M., Prieto, J. C., Elorza, F. L., Ramirez, R., & Goberna, R. (1981).
Interaction of vasoactive intestinal peptide with human blood mononuclear cells.
Mol.Cell Endocrinol. 21, 151-160.
Guillemin, R., Brazeau, P., Bohlen, P., Esch, F., Ling, N., & Wehrenberg, W. B. (1982).
Growth hormone-releasing factor from a human pancreatic tumor that caused
acromegaly. Science 218, 585-587.

208
Halikas, J. A., Goodwin, D. W., & Guze, S. B. (1971). Marihuana effects. A survey of
regular users. JAMA 217, 692-694.
Haller, J., Bakos, N., Szirmay, M., Ledent, C., & Freund, T. F. (2002). The effects of
genetic and pharmacological blockade of the CB1 cannabinoid receptor on anxiety. Eur
J Neurosci. 16, 1395-1398.
Hamelink, C., Tjurmina, O., Damadzic, R., Young, W. S., Weihe, E., Lee, H. W., &
Eiden, L. E. (2002). Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is a
sympathoadrenal neurotransmitter involved in catecholamine regulation and
glucohomeostasis. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 99, 461-466.
Haney, M., Ward, A. S., Comer, S. D., Foltin, R. W., & Fischman, M. W. (1999a).
Abstinence symptoms following oral THC administration to humans.
Psychopharmacology (Berl) 141, 385-394.
Haney, M., Ward, A. S., Comer, S. D., Foltin, R. W., & Fischman, M. W. (1999b).
Abstinence symptoms following smoked marijuana in humans. Psychopharmacology
(Berl) 141, 395-404.
Hannibal, J. (2002). Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central
nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Comp
Neurol. 453, 389-417.
Hannibal, J., Ding, J. M., Chen, D., Fahrenkrug, J., Larsen, P. J., Gillette, M. U., &
Mikkelsen, J. D. (1997). Pituitary adenylate cyclase-activating peptide (PACAP) in the
retinohypothalamic tract: a potential daytime regulator of the biological clock. J
Neurosci. 17, 2637-2644.
Hannibal, J., Ekblad, E., Mulder, H., Sundler, F., & Fahrenkrug, J. (1998). Pituitary
adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the gastrointestinal tract of the rat:
distribution and effects of capsaicin or denervation. Cell Tissue Res. 291, 65-79.
Hannibal, J. & Fahrenkrug, J. (1995). Expression of pituitary adenylate cyclase
activating polypeptide (PACAP) gene by rat spermatogenic cells. Regul.Pept. 55, 111-
115.
Hannibal, J., Jamen, F., Nielsen, H. S., Journot, L., Brabet, P., & Fahrenkrug, J. (2001).
Dissociation between light-induced phase shift of the circadian rhythm and clock gene
expression in mice lacking the pituitary adenylate cyclase activating polypeptide type 1
receptor. J Neurosci. 21, 4883-4890.
Hannibal, J., Mikkelsen, J. D., Clausen, H., Holst, J. J., Wulff, B. S., & Fahrenkrug, J.
(1995). Gene expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP)
in the rat hypothalamus. Regul.Pept. 55, 133-148.
Hannibal, J., Moller, M., Ottersen, O. P., & Fahrenkrug, J. (2000). PACAP and
glutamate are co-stored in the retinohypothalamic tract. J Comp Neurol. 418, 147-155.
Hansel, D. E., May, V., Eipper, B. A., & Ronnett, G. V. (2001). Pituitary adenylyl
cyclase-activating peptides and alpha-amidation in olfactory neurogenesis and
neuronal survival in vitro. J Neurosci. 21, 4625-4636.
Hanus, L., Abu-Lafi, S., Fride, E., Breuer, A., Vogel, Z., Shalev, D. E., Kustanovich, I.,
& Mechoulam, R. (2001). 2-arachidonyl glyceryl ether, an endogenous agonist of the
cannabinoid CB1 receptor. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 98, 3662-3665.
Hao, S., Avraham, Y., Mechoulam, R., & Berry, E. M. (2000). Low dose anandamide
affects food intake, cognitive function, neurotransmitter and corticosterone levels in
diet-restricted mice. Eur J Pharmacol. 392, 147-156.
Harmar, A. J., Marston, H. M., Shen, S., Spratt, C., West, K. M., Sheward, W. J.,
Morrison, C. F., Dorin, J. R., Piggins, H. D., Reubi, J. C., Kelly, J. S., Maywood, E. S.,

209
& Hastings, M. H. (2002). The VPAC(2) receptor is essential for circadian function in
the mouse suprachiasmatic nuclei. Cell 109, 497-508.
Harrington, M. E., Hoque, S., Hall, A., Golombek, D., & Biello, S. (1999). Pituitary
adenylate cyclase activating peptide phase shifts circadian rhythms in a manner similar
to light. J Neurosci. 19, 6637-6642.
Harris, R. T., Waters, W., & McLendon, D. (1974). Evaluation of reinforcing capability of
delta-9-tetrahydrocannabinol in rhesus monkeys. Psychopharmacologia. 37, 23-29.
Harro, J. & Oreland, L. (1993). Cholecystokinin receptors and memory: a radial maze
study. Pharmacol Biochem.Behav. 44, 509-517.
Hashimoto, H., Hagihara, N., Koga, K., Yamamoto, K., Shintani, N., Tomimoto, S.,
Mori, W., Koyama, Y., Matsuda, T., & Baba, A. (2000). Synergistic induction of pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) gene expression by nerve growth
factor and PACAP in PC12 cells. J Neurochem. 74, 501-507.
Hashimoto, H., Ishihara, T., Shigemoto, R., Mori, K., & Nagata, S. (1993). Molecular
cloning and tissue distribution of a receptor for pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide. Neuron 11, 333-342.
Hashimoto, H., Nogi, H., Mori, K., Ohishi, H., Shigemoto, R., Yamamoto, K., Matsuda,
T., Mizuno, N., Nagata, S., & Baba, A. (1996). Distribution of the mRNA for a pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide receptor in the rat brain: an in situ
hybridization study. J Comp Neurol. 371, 567-577.
Hashimoto, H., Shintani, N., Tanaka, K., Mori, W., Hirose, M., Matsuda, T., Sakaue, M.,
Miyazaki, J., Niwa, H., Tashiro, F., Yamamoto, K., Koga, K., Tomimoto, S., Kunugi, A.,
Suetake, S., & Baba, A. (2001). Altered psychomotor behaviors in mice lacking pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP). Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 98,
13355-13360.
He, D. Y., Vagts, A. J., Yaka, R., & Ron, D. (2002). Ethanol induces gene expression
via nuclear compartmentalization of receptor for activated C kinase 1. Mol.Pharmacol.
62, 272-280.
Heindel, J. J., Powell, C. J., Paschall, C. S., Arimura, A., & Culler, M. D. (1992). A
novel hypothalamic peptide, pituitary adenylate cyclase activating peptide, modulates
Sertoli cell function in vitro. Biol.Reprod. 47, 800-806.
Heinemann, A. & Holzer, P. (1999). Stimulant action of pituitary adenylate cyclase-
activating peptide on normal and drug-compromised peristalsis in the guinea-pig
intestine. Br J Pharmacol. 127, 763-771.
Heinrichs, S. C., Menzaghi, F., Schulteis, G., Koob, G. F., & Stinus, L. (1995b).
Suppression of corticotropin-releasing factor in the amygdala attenuates aversive
consequences of morphine withdrawal. Behav.Pharmacol. 6, 74-80.
Heinrichs, S. C., Menzaghi, F., Schulteis, G., Koob, G. F., & Stinus, L. (1995a).
Suppression of corticotropin-releasing factor in the amygdala attenuates aversive
consequences of morphine withdrawal. Behav.Pharmacol. 6, 74-80.
Hemby, S. E., Martin, T. J., Co, C., Dworkin, S. I., & Smith, J. E. (1995). The effects of
intravenous heroin administration on extracellular nucleus accumbens dopamine
concentrations as determined by in vivo microdialysis. J Pharmacol. Exp.Ther. 273,
591-598.
Henry, D. J. & Chavkin, C. (1995). Activation of inwardly rectifying potassium channels
(GIRK1) by co-expressed rat brain cannabinoid receptors in Xenopus oocytes.
Neurosci.Lett. 186, 91-94.

210
Herkenham, M., Lynn, A. B., de Costa, B. R., & Richfield, E. K. (1991a). Neuronal
localization of cannabinoid receptors in the basal ganglia of the rat. Brain Res. 547,
267-274.
Herkenham, M., Lynn, A. B., Johnson, M. R., Melvin, L. S., de Costa, B. R., & Rice, K.
C. (1991b). Characterization and localization of cannabinoid receptors in rat brain: a
quantitative in vitro autoradiographic study. J Neurosci. 11, 563-583.
Herkenham, M., Lynn, A. B., Little, M. D., Johnson, M. R., Melvin, L. S., de Costa, B.
R., & Rice, K. C. (1990). Cannabinoid receptor localization in brain.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 1932-1936.
Hermann, H., Marsicano, G., & Lutz, B. (2002). Coexpression of the cannabinoid
receptor type 1 with dopamine and serotonin receptors in distinct neuronal
subpopulations of the adult mouse forebrain. Neuroscience 109, 451-460.
Hershkowitz, M. & Szechtman, H. (1979). Pretreatment with delta 1-
tetrahydrocannabinol and psychoactive drugs: effects on uptake of biogenic amines
and on behavior. Eur J Pharmacol. 59 , 267-276.
Hill, J. M., Lee, S. J., Dibbern, D. A., Jr., Fridkin, M., Gozes, I., & Brenneman, D. E.
(1999). Pharmacologically distinct vasoactive intestinal peptide binding sites: CNS
localization and role in embryonic growth. Neuroscience 93, 783-791.
Hillard, C. J., Harris, R. A., & Bloom, A. S. (1985). Effects of the cannabinoids on
physical properties of brain membranes and phospholipid vesicles: fluorescence
studies. J Pharmacol.Exp.Ther. 232, 579-588.
Hillard, C. J., Wilkison, D. M., Edgemond, W. S., & Campbell, W. B. (1995).
Characterization of the kinetics and distribution of N-arachidonylethanolamine
(anandamide) hydrolysis by rat brain. Biochim.Biophys.Acta 1257, 249-256.
Himmelsbach, C. K. (1941). The morphine abstinence syndrome, its nature and
treatment. Ann.Intern.Med 15, 829-839.
Hine, B. (1985). Morphine and delta 9-tetrahydrocannabinol: two-way cross tolerance
for antinociceptive and heart-rate responses in the rat. Psychopharmacology (Berl) 87,
34-38.
Hinuma, S., Habata, Y., Fujii, R., Kawamata, Y., Hosoya, M., Fukusumi, S., Kitada, C.,
Masuo, Y., Asano, T., Matsumoto, H., Sekiguchi, M., Kurokawa, T., Nishimura, O.,
Onda, H., & Fujino, M. (1998). A prolactin-releasing peptide in the brain. Nature 393,
272-276.
Hoehe, M. R., Caenazzo, L., Martinez, M. M., Hsieh, W. T., Modi, W. S., Gershon, E.
S., & Bonner, T. I. (1991). Genetic and physical mapping of the human cannabinoid
receptor gene to chromosome 6q14-q15. New Biol. 3, 880-885.
Hohmann, A. G. & Herkenham, M. (1999). Localization of central cannabinoid CB1
receptor messenger RNA in neuronal subpopulations of rat dorsal root ganglia: a
double-label in situ hybridization study. Neuroscience 90, 923-931.
Hohmann, A. G. & Herkenham, M. (2000). Localization of cannabinoid CB(1) receptor
mRNA in neuronal subpopulations of rat striatum: a double-label in situ hybridization
study. Synapse 37, 71-80.
Hohmann, A. G., Tsou, K., & Walker, J. M. (1998). Cannabinoid modulation of wide
dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered
WIN55,212-2. Neurosci.Lett. 257, 119-122.
Holgert, H., Holmberg, K., Hannibal, J., Fahrenkrug, J., Brimijoin, S., Hartman, B. K., &
Hokfelt, T. (1996). PACAP in the adrenal gland--relationship with choline

211
acetyltransferase, enkephalin and chromaffin cells and effects of immunological
sympathectomy. Neuroreport 8, 297-301.
Hollister, L. E. (1986). Health aspects of cannabis. Pharmacol.Rev 38, 1-20.
Hollister, L. E., Richards, R. K., & Gillespie, H. K. (1968). Comparison of
tetrahydrocannabinol and synhexyl in man. Clin.Pharmacol.Ther. 9, 783-791.
Holmes, L. J., Bozarth, M. A., & Wise, R. A. (1983). Circling from intracranial morphine
applied to the ventral tegmental area in rats. Brain Res.Bull. 11, 295-298.
Holmes, L. J. & Wise, R. A. (1985). Contralateral circling induced by tegmental
morphine: anatomical localization, pharmacological specificity, and phenomenology.
Brain Res. 326, 19-26.
Holtzman, D., Lovell, R. A., Jaffe, J. H., & Freedman, D. X. (1969). 1-delta9-
tetrahydrocannabinol: neurochemical and behavioral effects in the mouse. Science
163, 1464-1467.
Hosohata, Y., Vanderah, T. W., Burkey, T. H., Ossipov, M. H., Kovelowski, C. J., Sora,
I., Uhl, G. R., Zhang, X., Rice, K. C., Roeske, W. R., Hruby, V. J., Yamamura, H. I., Lai,
J., & Porreca, F. (2000). delta-Opioid receptor agonists produce antinociception and
[35S]GTPgammaS binding in mu receptor knockout mice. Eur J Pharmacol. 388, 241-
248.
Hosoya, M., Kimura, C., Ogi, K., Ohkubo, S., Miyamoto, Y., Kugoh, H., Shimizu, M.,
Onda, H., Oshimura, M., & Arimura, A. (1992). Structure of the human pituitary
adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) gene. Biochim.Biophys.Acta 1129,
199-206.
Hou, X., Vandermeers, A., Gourlet, P., Vandermeers-Piret, M. C., & Robberecht, P.
(1994). Structural requirements for the occupancy of rat brain PACAP receptors and
adenylate cyclase activation. Neuropharmacology 33, 1189-1195.
Houchi, H., Azuma, M., Kitamura, K., Okuno, M., & Oka, M. (1995). Pituitary adenylate
cyclase-activating polypeptide stimulates the synthesis of dopamine in cultured bovine
adrenal chromaffin cells. Hypertens.Res. 18 (Suppl 1), S169-S171.
Houser, S. J., Eads, M., Embrey, J. P., & Welch, S. P. (2000). Dynorphin B and spinal
analgesia: induction of antinociception by the cannabinoids CP55,940, Delta(9)-THC
and anandamide. Brain Res. 857, 337-342.
Howlett, A. C. (1984). Inhibition of neuroblastoma adenylate cyclase by cannabinoid
and nantradol compounds. Life Sci. 35, 1803-1810.
Howlett, A. C. (1995). Pharmacology of cannabinoid receptors. Annu.Rev
Pharmacol.Toxicol. 35, 607-634.
Howlett, A. C., Bidaut-Russell, M., Devane, W. A., Melvin, L. S., Johnson, M. R., &
Herkenham, M. (1990). The cannabinoid receptor: biochemical, anatomical and
behavioral characterization. Trends Neurosci. 13, 420-423.
Howlett, A. C., Evans, DM., & Houston, D. B. (1992). The cannabinoid receptor. In
Marijuana/Cannabinoids. Neurobiology and Neurophysiology, eds. Murphy, L. &
Bartke, A., pp. 35-72. CRC Press Inc., Boca Raton, FL.
Huang, C. C., Lo, S. W., & Hsu, K. S. (2001). Presynaptic mechanisms underlying
cannabinoid inhibition of excitatory synaptic transmission in rat striatal neurons. J
Physiol. 532, 731-748.
Huang, Q., Legradi, G., & Arimura, A. (1996). Perfusion of the paraventricular nucleus
with pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and vasoactive intestinal

212
polypeptide stimulates local release of norepinephrine and its metabolite: microdialysis
study in freely moving rats. Ann.N.Y.Acad.Sci. 805, 737-742.
Huang, Y. Y., Kandel, E. R., Varshavsky, L., Brandon, E. P., Qi, M., Idzerda, R. L.,
McKnight, G. S., & Bourtchouladze, R. (1995). A genetic test of the effects of mutations
in PKA on mossy fiber LTP and its relation to spatial and contextual learning. Cell 83,
1211-1222.
Hubel, K. A. (1972). Secretin: a long progress note. Gastroenterology 62, 318-341.
Hughes, J., Smith, T. W., Kosterlitz, H. W., Fothergill, L. A., Morgan, B. A., & Morris, H.
R. (1975). Identification of two related pentapeptides from the brain with potent opiate
agonist activity. Nature 258, 577-580.
Hungund, B. L. & Basavarajappa, B. S. (2000). Distinct differences in the cannabinoid
receptor binding in the brain of C57BL/6 and DBA/2 mice, selected for their differences
in voluntary ethanol consumption. J Neurosci.Res. 60, 122-128.
Hungund, B. L., Szakall, I., Adam, A., Basavarajappa, B. S., & Vadasz, C. (2003).
Cannabinoid CB1 receptor knockout mice exhibit markedly reduced voluntary alcohol
consumption and lack alcohol-induced dopamine release in the nucleus accumbens. J
Neurochem. 84, 698-704.
Hutcheson, D. M., Matthes, H. W., Valjent, E., Sanchez-Blazquez, P., Rodriguez-Diaz,
M., Garzon, J., Kieffer, B. L., & Maldonado, R. (2001). Lack of dependence and
rewarding effects of deltorphin II in mu-opioid receptor-deficient mice. Eur J Neurosci.
13, 153-161.
Hutcheson, D. M., Sanchez-Blazquez, P., Rodriguez-Diaz, M., Garzon, J.,
Schmidhammer, H., Borsodi, A., Roques, B. P., & Maldonado, R. (1999). Use of
selective antagonists and antisense oligonucleotides to evaluate the mechanisms of
BUBU antinociception. Eur J Pharmacol. 383, 29-37.
Hutcheson, D. M., Tzavara, E. T., Smadja, C., Valjent, E., Roques, B. P., Hanoune, J.,
& Maldonado, R. (1998). Behavioural and biochemical evidence for signs of abstinence
in mice chronically treated with delta-9-tetrahydrocannabinol. Br J Pharmacol. 125,
1567-1577.
Ilyutchenok, R. Y. & Dubrovina, N. I. (1995). Memory retrieval enhancement by kappa
opioid agonist and mu, delta antagonists. Pharmacol.Biochem.Behav. 52, 683-687.
Inagaki, N., Yoshida, H., Mizuta, M., Mizuno, N., Fujii, Y., Gonoi, T., Miyazaki, J., &
Seino, S. (1994). Cloning and functional characterization of a third pituitary adenylate
cyclase-activating polypeptide receptor subtype expressed in insulin-secreting cells.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91, 2679-2683.
Inooka, H., Endo, S., Kitada, C., Mizuta, E., & Fujino, M. (1992). Pituitary adenylate
cyclase activating polypeptide (PACAP) with 27 residues. Conformation determined by
1H NMR and CD spectroscopies and distance geometry in 25% methanol solution.
Int.J Pept.Protein Res. 40, 456-464.
Ishihara, T., Shigemoto, R., Mori, K., Takahashi, K., & Nagata, S. (1992). Functional
expression and tissue distribution of a novel receptor for vasoactive intestinal
polypeptide. Neuron 8, 811-819.
Isobe, K., Yukimasa, N., Nakai, T., & Takuwa, Y. (1996). Pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide induces gene expression of the catecholamine synthesizing
enzymes, tyrosine hydroxylase, and dopamine beta-hydroxylase in cultured porcine
adrenal medullary chromaffin cells. Ann.N.Y.Acad.Sci. 805, 464-469.

213
Itoh, J., Ukai, M., & Kameyama, T. (1994). Dynorphin A-(1-13) potently improves the
impairment of spontaneous alternation performance induced by the mu-selective opioid
receptor agonist DAMGO in mice. J Pharmacol.Exp.Ther. 269, 15-21.
Iversen, S. D. & Joyce, E. M. (1978). Effect in the rat of chronic morphine treatment on
the behavioural response to apomorphine [proceedings]. Br J Pharmacol. 62, 390P-
391P.
Jamen, F., Persson, K., Bertrand, G., Rodriguez-Henche, N., Puech, R., Bockaert, J.,
Ahren, B., & Brabet, P. (2000). PAC1 receptor-deficient mice display impaired
insulinotropic response to glucose and reduced glucose tolerance. J Clin.Invest. 105,
1307-1315.
Jamen, F., Puech, R., Bockaert, J., Brabet, P., & Bertrand, G. (2002). Pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide receptors mediating insulin secretion in rodent
pancreatic islets are coupled to adenylate cyclase but not to PLC. Endocrinology 143,
1253-1259.
Jansen, E. M., Haycock, D. A., Ward, S. J., & Seybold, V. S. (1992). Distribution of
cannabinoid receptors in rat brain determined with aminoalkylindoles. Brain Res. 575,
93-102.
Jarai, Z., Wagner, J. A., Varga, K., Lake, K. D., Compton, D. R., Martin, B. R., Zimmer,
A. M., Bonner, T. I., Buckley, N. E., Mezey, E., Razdan, R. K., Zimmer, A., & Kunos, G.
(1999). Cannabinoid-induced mesenteric vasodilation through an endothelial site
distinct from CB1 or CB2 receptors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 96, 14136-14141.
Jarry, H., Leonhardt, S., Schmidt, W. E., Creutzfeldt, W., & Wuttke, W. (1992).
Contrasting effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) on in
vivo and in vitro prolactin and growth hormone release in male rats. Life Sci. 51, 823-
830.
Jaworski, D. M. (2000). Expression of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide
(PACAP) and the PACAP-selective receptor in cultured rat astrocytes, human brain
tumors, and in response to acute intracranial injury. Cell Tissue Res. 300, 219-230.
Jentsch, J. D., Andrusiak, E., Tran, A., Bowers, M. B., Jr., & Roth, R. H. (1997). Delta
9-tetrahydrocannabinol increases prefrontal cortical catecholaminergic utilization and
impairs spatial working memory in the rat: blockade of dopaminergic effects with
HA966. Neuropsychopharmacology 16, 426-432.
Jeziorski, M., White, F. J., & Wolf, M. E. (1994). MK-801 prevents the development of
behavioral sensitization during repeated morphine administration. Synapse 16, 137-
147.
Jezova, D., Vigas, M., & Jurcovicova, J. (1982). ACTH and corticosterone response to
naloxone and morphine in normal, hypophysectomized and dexamethasone-treated
rats. Life Sci. 31, 307-314.
Jiaxu, C. & Weiyi, Y. (2000). Influence of acute and chronic treadmill exercise on rat
brain POMC gene expression. Med.Sci.Sports Exerc. 32, 954-957.
Jin, W., Lee, N. M., Loh, H. H., & Thayer, S. A. (1992). Dual excitatory and inhibitory
effects of opioids on intracellular calcium in neuroblastoma x glioma hybrid NG108-15
cells. Mol.Pharmacol. 42, 1083-1089.
Jin, W., Lee, N. M., Loh, H. H., & Thayer, S. A. (1994). Opioids mobilize calcium from
inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores in NG108-15 cells. J Neurosci. 14, 1920-
1929.

214
Johnson, S. M. & Fleming, W. W. (1989). Mechanisms of cellular adaptive sensitivity
changes: applications to opioid tolerance and dependence. Pharmacol.Rev 41, 435-
488.
Johnson, S. W. & North, R. A. (1992). Opioids excite dopamine neurons by
hyperpolarization of local interneurons. J Neurosci. 12, 483-488.
Jones, R. T., Benowitz, N., & Bachman, J. (1976). Clinical studies of cannabis
tolerance and dependence. Ann.N.Y.Acad.Sci. 282, 221-239.
Jones, S. L. & Gebhart, G. F. (1988). Inhibition of spinal nociceptive transmission from
the midbrain, pons and medulla in the rat: activation of descending inhibition by
morphine, glutamate and electrical stimulation. Brain Res. 460, 281-296.
Jongsma, H., Pettersson, L. M., Zhang, Y., Reimer, M. K., Kanje, M., Waldenstrom, A.,
Sundler, F., & Danielsen, N. (2001). Markedly reduced chronic nociceptive response in
mice lacking the PAC1 receptor. Neuroreport 12, 2215-2219.
Kalivas, P. W. (1985). Sensitization to repeated enkephalin administration into the
ventral tegmental area of the rat. II. Involvement of the mesolimbic dopamine system. J
Pharmacol Exp.Ther. 235, 544-550.
Kalivas, P. W. & Duffy, P. (1998). Repeated cocaine administration alters extracellular
glutamate in the ventral tegmental area. J Neurochem. 70, 1497-1502.
Kaminski, N. E., Abood, M. E., Kessler, F. K., Martin, B. R., & Schatz, A. R. (1992).
Identification of a functionally relevant cannabinoid receptor on mouse spleen cells that
is involved in cannabinoid-mediated immune modulation. Mol.Pharmacol. 42, 736-742.
Kashimura, J., Shimosegawa, T., Kikuchi, Y., Koizumi, M., & Toyota, T. (1991). The
stimulatory effect of PACAP 38 on amylase release in dispersed rat pancreatic acini.
Tohoku J Exp.Med. 164, 309-318.
Kathmann, M., Weber, B., Zimmer, A., & Schlicker, E. (2001). Enhanced acetylcholine
release in the hippocampus of cannabinoid CB(1) receptor-deficient mice. Br J
Pharmacol. 132, 1169-1173.
Kathuria, S., Gaetani, S., Fegley, D., Valino, F., Duranti, A., Tontini, A., Mor, M., Tarzia,
G., La Rana, G., Calignano, A., Giustino, A., Tattoli, M., Palmery, M., Cuomo, V., &
Piomelli, D. (2003). Modulation of anxiety through blockade of anandamide hydrolysis.
Nat.Med. 9, 76-81.
Katona, I., Rancz, E. A., Acsady, L., Ledent, C., Mackie, K., Hajos, N., & Freund, T. F.
(2001). Distribution of CB1 cannabinoid receptors in the amygdala and their role in the
control of GABAergic transmission. J Neurosci. 21, 9506-9518.
Katona, I., Sperlagh, B., Magloczky, Z., Santha, E., Kofalvi, A., Czirjak, S., Mackie, K.,
Vizi, E. S., & Freund, T. F. (2000). GABAergic interneurons are the targets of
cannabinoid actions in the human hippocampus. Neuroscience 100, 797-804.
Katona, I., Sperlagh, B., Sik, A., Kafalvi, A., Vizi, E. S., Mackie, K., & Freund, T. F.
(1999). Presynaptically located CB1 cannabinoid receptors regulate GABA release
from axon terminals of specific hippocampal interneurons. J Neurosci. 19, 4544-4558.
Kawai, K., Ohse, C., Watanabe, Y., Suzuki, S., Yamashita, K., & Ohashi, S. (1992).
Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide stimulates insulin release from the
isolated perfused rat pancreas. Life Sci. 50, 257-261.
Kaymakcalan, S., Ayhan, I. H., & Tulunay, F. C. (1977). Naloxone-induced or
postwithdrawal abstinence signs in delta9-tetrahydrocannabinol-tolerant rats.
Psychopharmacology (Berl) 55, 243-249.

215
Kelz, M. B., Chen, J., Carlezon, W. A., Jr., Whisler, K., Gilden, L., Beckmann, A. M.,
Steffen, C., Zhang, Y. J., Marotti, L., Self, D. W., Tkatch, T., Baranauskas, G.,
Surmeier, D. J., Neve, R. L., Duman, R. S., Picciotto, M. R., & Nestler, E. J. (1999).
Expression of the transcription factor deltaFosB in the brain controls sensitivity to
cocaine. Nature 401, 272-276.
Kempe, K., Hsu, F. F., Bohrer, A., & Turk, J. (1996). Isotope dilution mass
spectrometric measurements indicate that arachidonylethanolamide, the proposed
endogenous ligand of the cannabinoid receptor, accumulates in rat brain tissue post
mortem but is contained at low levels in or is absent from fresh tissue. J Biol.Chem.
271, 17287-17295.
Kepler, K. L., Kest, B., Kiefel, J. M., Cooper, M. L., & Bodnar, R. J. (1989). Roles of
gender, gonadectomy and estrous phase in the analgesic effects of
intracerebroventricular morphine in rats. Pharmacol.Biochem.Behav. 34, 119-127.
Khachaturian, H., Lewis, M. E., Schafer, M. K., & Watson, S. J. (1985). Anatomy of the
CNS opioid systems. Trends Neurosci. 3, 111-119.
Khachaturian, H., Watson, S. J., Lewis, M. E., Coy, D., Goldstein, A., & Akil, H. (1982).
Dynorphin immunocytochemistry in the rat central nervous system. Peptides 3, 941-
954.
Kieffer, B. L., Befort, K., Gaveriaux-Ruff, C., & Hirth, C. G. (1992). The delta-opioid
receptor: isolation of a cDNA by expression cloning and pharmacological
characterization. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89, 12048-12052.
Kieffer, B. L. & Gaveriaux-Ruff, C. (2002). Exploring the opioid system by gene
knockout. Prog.Neurobiol. 66, 285-306.
Kim, C. J., Rhee, J. S., & Akaike, N. (1997). Modulation of high-voltage activated Ca2+
channels in the rat periaqueductal gray neurons by mu-type opioid agonist. J
Neurophysiol. 77, 1418-1424.
Kimura, C., Ohkubo, S., Ogi, K., Hosoya, M., Itoh, Y., Onda, H., Miyata, A., Jiang, L.,
Dahl, R. R., & Stibbs, H. H. (1990). A novel peptide which stimulates adenylate
cyclase: molecular cloning and characterization of the ovine and human cDNAs.
Biochem.Biophys.Res.Commun. 166, 81-89.
Kivipelto, L., Absood, A., Arimura, A., Sundler, F., Hakanson, R., & Panula, P. (1992).
The distribution of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-like
immunoreactivity is distinct from helodermin- and helospectin-like immunoreactivities in
the rat brain. J Chem.Neuroanat. 5, 85-94.
Knapp, R. J., Malatynska, E., Collins, N., Fang, L., Wang, J. Y., Hruby, V. J., Roeske,
W. R., & Yamamura, H. I. (1995). Molecular biology and pharmacology of cloned opioid
receptors. FASEB J 9, 516-525.
Ko, C., In, Y. H., & Park-Sarge, O. K. (1999). Role of progesterone receptor activation
in pituitary adenylate cyclase activating polypeptide gene expression in rat ovary.
Endocrinology 140, 5185-5194.
Kondo, K., Hashimoto, H., Sakata, K., Saga, H., Kitanaka, J., & Baba, A. (1995).
Stimulation of cyclic AMP formation by pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide is attenuated by glutamate in rat brain slices. Jpn.J Pharmacol 67, 399-
401.
Kondo, T., Tominaga, T., Ichikawa, M., & Iijima, T. (1997). Differential alteration of
hippocampal synaptic strength induced by pituitary adenylate cyclase activating
polypeptide-38 (PACAP-38). Neurosci.Lett. 221, 189-192.

216
Konig, M., Zimmer, A. M., Steiner, H., Holmes, P. V., Crawley, J. N., Brownstein, M. J.,
& Zimmer, A. (1996). Pain responses, anxiety and aggression in mice deficient in pre-
proenkephalin. Nature 383, 535-538.
Konkoy, C. S. & Childers, S. R. (1989). Dynorphin-selective inhibition of adenylyl
cyclase in guinea pig cerebellum membranes. Mol.Pharmacol. 36, 627-633.
Koob, G. F. (1992). Drugs of abuse: anatomy, pharmacology and function of reward
pathways. Trends Pharmacol.Sci. 13, 177-184.
Koob, G. F. (1996). Drug addiction: the yin and yang of hedonic homeostasis. Neuron
16, 893-896.
Koob, G. F., Caine, B., Markou, A., Pulvirenti, L., & Weiss, F. (1994). Role for the
mesocortical dopamine system in the motivating effects of cocaine. NIDA Res.Monogr.
145, 1-18.
Koob, G. F. & Le Moal, M. (2001). Drug addiction, dysregulation of reward, and
allostasis. Neuropsychopharmacology 24, 97-129.
Koob, G. F., Maldonado, R., & Stinus, L. (1992). Neural substrates of opiate
withdrawal. Trends Neurosci. 15, 186-191.
Koob, G. F., Sanna, P. P., & Bloom, F. E. (1998). Neuroscience of addiction. Neuron
21, 467-476.
Koob, G. F., Wall, T. L., & Bloom, F. E. (1989). Nucleus accumbens as a substrate for
the aversive stimulus effects of opiate withdrawal. Psychopharmacology (Berl) 98,
530-534.
Kosterlitz, H. W. & Waterfield, A. A. (1975). In vitro models in the study of structure-
activity relationships of narcotic analgesics. Annu.Rev Pharmacol. 15, 29-47.
Kotani, E., Usuki, S., & Kubo, T. (1997). Rat corpus luteum expresses both PACAP
and PACAP type IA receptor mRNAs. Peptides 18, 1453-1455.
Koves, K., Arimura, A., Gorcs, T. G., & Somogyvari-Vigh, A. (1991). Comparative
distribution of immunoreactive pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and
vasoactive intestinal polypeptide in rat forebrain. Neuroendocrinology 54, 159-169.
Koves, K., Arimura, A., Somogyvari-Vigh, A., Vigh, S., & Miller, J. (1990).
Immunohistochemical demonstration of a novel hypothalamic peptide, pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide, in the ovine hypothalamus. Endocrinology
127, 264-271.
Koves, K., Arimura, A., Vigh, S., Somogyvari-Vigh, A., & Miller, J. (1993).
Immunohistochemical localization of PACAP in the ovine digestive system. Peptides
14, 449-455.
Koves, K., Gorcs, T. J., Kausz, M., & Arimura, A. (1994). Present status of knowledge
about the distribution and colocalization of PACAP in the forebrain. Acta Biol.Hung. 45,
297-321.
Koves, K., Molnar, J., Kantor, O., Lakatos, A., Fogel, K., Kausz, M., Vandermeers-
Piret, M. C., Somogyvari-Vigh, A., & Arimura, A. (1998). Role of PACAP in the
regulation of gonadotroph hormone secretion during ontogenesis: a single neonatal
injection of PACAP delays puberty and its intracerebroventricular administration before
the critical period of proestrous stage blocks ovulation in adulthood. Ann.N.Y.Acad.Sci.
865, 590-594.
Kozicz, T. (2003). Dopamine and cyclic AMP-regulated phosphoprotein
immunoreactive neurons are innervated by axon terminals immunopositive for

217
vasoactive intestinal polypeptide in the bed nuclei of the stria terminalis and central
nucleus of the amygdala. Brain Res. 962, 237-243.
Kozicz, T. & Arimura, A. (2002). Dopamine- and cyclic AMP-regulated phosphoprotein-
immunoreactive neurons activated by acute stress are innervated by fiber terminals
immunopositive for pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in the extended
amygdala in the rat. Regul.Pept. 109, 63-70.
Kozicz, T., Vigh, S., & Arimura, A. (1997). Axon terminals containing PACAP- and VIP-
immunoreactivity form synapses with CRF-immunoreactive neurons in the dorsolateral
division of the bed nucleus of the stria terminalis in the rat. Brain Res. 767, 109-119.
Kozicz, T., Vigh, S., & Arimura, A. (1998). Immunohistochemical evidence for PACAP
and VIP interaction with met-enkephalin and CRF containing neurons in the bed
nucleus of the stria terminalis. Ann.N.Y.Acad.Sci. 865, 523-528.
Kreitzer, A. C. & Regehr, W. G. (2001). Retrograde inhibition of presynaptic calcium
influx by endogenous cannabinoids at excitatory synapses onto Purkinje cells. Neuron
29, 717-727.
Kruszka, K. K. & Gross, R. W. (1994). The ATP- and CoA-independent synthesis of
arachidonoylethanolamide. A novel mechanism underlying the synthesis of the
endogenous ligand of the cannabinoid receptor. J Biol.Chem. 269, 14345-14348.
Krysiak, R., Obuchowicz, E., & Herman, Z. S. (2000). Role of corticotropin-releasing
factor (CRF) in anxiety. Pol J Pharmacol. 52, 15-25.
Kumar, A. M., Solomon, J., Patel, V., Kream, R. M., Drieze, J. M., & Millard, W. J.
(1986). Early exposure to delta 9-tetrahydrocannabinol influences neuroendocrine and
reproductive functions in female rats. Neuroendocrinology 44, 260-264.
Kumar, M. S., Patel, V., & Millard, W. J. (1984). Effect of chronic administration of delta
9-tetrahydrocannabinol on the endogenous opioid peptide and catecholamine levels in
the diencephalon and plasma of the rat. Subst.Alcohol Actions Misuse 5, 201-210.
Lam, H. C., Takahashi, K., Ghatei, M. A., Kanse, S. M., Polak, J. M., & Bloom, S. R.
(1990). Binding sites of a novel neuropeptide pituitary-adenylate-cyclase-activating
polypeptide in the rat brain and lung. Eur J Biochem. 193, 725-729.
Lamarque, S., Taghzouti, K., & Simon, H. (2001). Chronic treatment with Delta(9)-
tetrahydrocannabinol enhances the locomotor response to amphetamine and heroin.
Implications for vulnerability to drug addiction. Neuropharmacology 41, 118-129.
Lamb, R. J., Jarbe, T. U., Makriyannis, A., Lin, S., & Goutopoulos, A. (2000). Effects of
Delta 9-tetrahydrocannabinol, (R)-methanandamide, SR 141716,and d-amphetamine
before and during daily Delta 9-tetrahydrocannabinol dosing. Eur J Pharmacol. 398,
251-258.
Lane-Ladd, S. B., Pineda, J., Boundy, V. A., Pfeuffer, T., Krupinski, J., Aghajanian, G.
K., & Nestler, E. J. (1997). CREB (cAMP response element-binding protein) in the
locus coeruleus: biochemical, physiological, and behavioral evidence for a role in
opiate dependence. J Neurosci. 17, 7890-7901.
Lang, W., Qin, C., Lin, S., Khanolkar, A. D., Goutopoulos, A., Fan, P., Abouzid, K.,
Meng, Z., Biegel, D., & Makriyannis, A. (1999). Substrate specificity and
stereoselectivity of rat brain microsomal anandamide amidohydrolase. J Med.Chem.
42, 896-902.
Lassalle, J. M., Bataille, T., & Halley, H. (2000). Reversible inactivation of the
hippocampal mossy fiber synapses in mice impairs spatial learning, but neither
consolidation nor memory retrieval, in the Morris navigation task.
Neurobiol.Learn.Mem. 73, 243-257.

218
Ledent, C., Valverde, O., Cossu, G., Petitet, F., Aubert, J. F., Beslot, F., Bohme, G. A.,
Imperato, A., Pedrazzini, T., Roques, B. P., Vassart, G., Fratta, W., & Parmentier, M.
(1999). Unresponsiveness to cannabinoids and reduced addictive effects of opiates in
CB1 receptor knockout mice. Science 283, 401-404.
LeDoux, J. E. (1993). Emotional memory systems in the brain. Behav.Brain Res. 58,
69-79.
Leibowitz, S. F. (1988). Hypothalamic paraventricular nucleus: interaction between
alpha 2-noradrenergic system and circulating hormones and nutrients in relation to
energy balance. Neurosci.Biobehav.Rev 12, 101-109.
Levine, J. D., Weiss, M. L., Rosenwasser, A. M., & Miselis, R. R. (1991).
Retinohypothalamic tract in the female albino rat: a study using horseradish peroxidase
conjugated to cholera toxin. J Comp Neurol. 306, 344-360.
Li, M., Nakayama, K., Shuto, Y., Somogyvari-Vigh, A., & Arimura, A. (1998). Testis-
specific prohormone convertase PC4 processes the precursor of pituitary adenylate
cyclase-activating polypeptide (PACAP). Peptides 19, 259-268.
Li, M., Shuto, Y., Somogyvari-Vigh, A., & Arimura, A. (1999). Prohormone convertases
1 and 2 process ProPACAP and generate matured, bioactive PACAP38 and PACAP27
in transfected rat pituitary GH4C1 cells. Neuroendocrinology 69, 217-226.
Li, S., Grinevich, V., Fournier, A., & Pelletier, G. (1996). Effects of pituitary adenylate
cyclase-activating polypeptide (PACAP) on gonadotropin-releasing hormone and
somatostatin gene expression in the rat brain. Brain Res.Mol.Brain Res. 41, 157-162.
Lichtman, A. H., Cook, S. A., & Martin, B. R. (1996). Investigation of brain sites
mediating cannabinoid-induced antinociception in rats: evidence supporting
periaqueductal gray involvement. J Pharmacol.Exp.Ther. 276, 585-593.
Lichtman, A. H., Dimen, K. R., & Martin, B. R. (1995). Systemic or intrahippocampal
cannabinoid administration impairs spatial memory in rats. Psychopharmacology (Berl)
119, 282-290.
Lichtman, A. H., Hawkins, E. G., Griffin, G., & Cravatt, B. F. (2002). Pharmacological
activity of fatty acid amides is regulated, but not mediated, by fatty acid amide
hydrolase in vivo. J Pharmacol.Exp.Ther. 302, 73-79.
Lichtman, A. H. & Martin, B. R. (1991). Spinal and supraspinal components of
cannabinoid-induced antinociception. J Pharmacol.Exp.Ther. 258, 517-523.
Lichtman, A. H. & Martin, B. R. (1996). Delta 9-tetrahydrocannabinol impairs spatial
memory through a cannabinoid receptor mechanism. Psychopharmacology (Berl) 126,
125-131.
Lichtman, A. H., Sheikh, S. M., Loh, H. H., & Martin, B. R. (2001). Opioid and
cannabinoid modulation of precipitated withdrawal in delta(9)-tetrahydrocannabinol and
morphine-dependent mice. J Pharmacol.Exp.Ther. 298, 1007-1014.
Lichtman, A. H., Wiley, J. L., LaVecchia, K. L., Neviaser, S. T., Arthur, D. B., Wilson, D.
M., & Martin, B. R. (1998). Effects of SR 141716A after acute or chronic cannabinoid
administration in dogs. Eur J Pharmacol. 357, 139-148.
Llano, I., Leresche, N., & Marty, A. (1991). Calcium entry increases the sensitivity of
cerebellar Purkinje cells to applied GABA and decreases inhibitory synaptic currents.
Neuron 6, 565-574.
Lomax, P. (1971). Acute tolerance to the hypothermic effect of marihuana in the rat.
Res.Commun Chem.Pathol.Pharmacol. 2, 159-167.

219
Lord, J. A., Waterfield, A. A., Hughes, J., & Kosterlitz, H. W. (1977). Endogenous opioid
peptides: multiple agonists and receptors. Nature 267, 495-499.
Love, J. A. & Szebeni, K. (1999). Morphology and histochemistry of the rabbit
pancreatic innervation. Pancreas 18, 53-64.
Lu, N. & DiCicco-Bloom, E. (1997). Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is
an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 94, 3357-3362.
Lumpkin, M. D., Moltz, J. H., Yu, W. H., Samson, W. K., & McCann, S. M. (1987).
Purification of FSH-releasing factor: its dissimilarity from LHRH of mammalian, avian,
and piscian origin. Brain Res.Bull. 18, 175-178.
Luts, L. & Sundler, F. (1994). Peptide-containing nerve fibers in the parathyroid glands
of different species. Regul.Pept. 50, 147-158.
Lutz-Bucher, B., Monnier, D., & Koch, B. (1996). Evidence for the presence of
receptors for pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in the neurohypophysis
that are positively coupled to cyclic AMP formation and neurohypophyseal hormone
secretion. Neuroendocrinology 64, 153-161.
Lutz, E. M., Sheward, W. J., West, K. M., Morrow, J. A., Fink, G., & Harmar, A. J.
(1993). The VIP2 receptor: molecular characterisation of a cDNA encoding a novel
receptor for vasoactive intestinal peptide. FEBS Lett. 334, 3-8.
Ma, W., Zheng, W. H., Powell, K., Jhamandas, K., & Quirion, R. (2001). Chronic
morphine exposure increases the phosphorylation of MAP kinases and the
transcription factor CREB in dorsal root ganglion neurons: an in vitro and in vivo study.
Eur J Neurosci. 14, 1091-1104.
Mackie, K. & Hille, B. (1992). Cannabinoids inhibit N-type calcium channels in
neuroblastoma-glioma cells. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89, 3825-3829.
Mackie, K., Lai, Y., Westenbroek, R., & Mitchell, R. (1995). Cannabinoids activate an
inwardly rectifying potassium conductance and inhibit Q-type calcium currents in AtT20
cells transfected with rat brain cannabinoid receptor. J Neurosci. 15, 6552-6561.
MacLeod, R. M., Fontham, E. H., & Lehmeyer, J. E. (1970). Prolactin and growth
hormone production as influenced by catecholamines and agents that affect brain
catecholamines. Neuroendocrinology 6, 283-294.
Macsai, M., Pataki, I., Toth, G., & Szabo, G. (2002). The effects of pituitary adenylate
cyclase-activating polypeptide on acute and chronic morphine actions in mice.
Regul.Pept. 109, 57-62.
Macsai, M., Szabo, G., & Telegdy, G. (1998). Vasoactive intestinal polypeptide induces
analgesia and impairs the antinociceptive effect of morphine in mice. Neuropeptides
32, 557-562.
Mailleux, P. & Vanderhaeghen, J. J. (1992). Distribution of neuronal cannabinoid
receptor in the adult rat brain: a comparative receptor binding radioautography and in
situ hybridization histochemistry. Neuroscience 48, 655-668.
Maldonado, R. (1997). Participation of noradrenergic pathways in the expression of
opiate withdrawal: biochemical and pharmacological evidence. Neurosci.Biobehav.Rev
21, 91-104.
Maldonado, R., Blendy, J. A., Tzavara, E., Gass, P., Roques, B. P., Hanoune, J., &
Schutz, G. (1996). Reduction of morphine abstinence in mice with a mutation in the
gene encoding CREB. Science 273, 657-659.

220
Maldonado, R., Dauge, V., Callebert, J., Villette, J. M., Fournie-Zaluski, M. C., Feger,
J., & Roques, B. P. (1989). Comparison of selective and complete inhibitors of
enkephalin-degrading enzymes on morphine withdrawal syndrome. Eur J Pharmacol.
165, 199-207.
Maldonado, R., Negus, S., & Koob, G. F. (1992a). Precipitation of morphine withdrawal
syndrome in rats by administration of mu-, delta- and kappa-selective opioid
antagonists. Neuropharmacology 31, 1231-1241.
Maldonado, R., Saiardi, A., Valverde, O., Samad, T. A., Roques, B. P., & Borrelli, E.
(1997). Absence of opiate rewarding effects in mice lacking dopamine D2 receptors.
Nature 388, 586-589.
Maldonado, R., Stinus, L., Gold, L. H., & Koob, G. F. (1992b). Role of different brain
structures in the expression of the physical morphine withdrawal syndrome. J
Pharmacol Exp.Ther. 261, 669-677.
Malone, D. T. & Taylor, D. A. (1999). Modulation by fluoxetine of striatal dopamine
release following Delta9-tetrahydrocannabinol: a microdialysis study in conscious rats.
Br J Pharmacol. 128, 21-26.
Maneuf, Y. P. & Brotchie, J. M. (1997). Paradoxical action of the cannabinoid WIN
55,212-2 in stimulated and basal cyclic AMP accumulation in rat globus pallidus slices.
Br J Pharmacol. 120, 1397-1398.
Manning, B. H., Merin, N. M., Meng, I. D., & Amaral, D. G. (2001). Reduction in opioid-
and cannabinoid-induced antinociception in rhesus monkeys after bilateral lesions of
the amygdaloid complex. J Neurosci. 21, 8238-8246.
Mansbach, R. S., Nicholson, K. L., Martin, B. R., & Balster, R. L. (1994). Failure of
Delta(9)-tetrahydrocannabinol and CP 55,940 to maintain intravenous self-
administration under a fixed-interval schedule in rhesus monkeys. Behav.Pharmacol. 5,
219-225.
Mansour, A., Fox, C. A., Akil, H., & Watson, S. J. (1995a). Opioid-receptor mRNA
expression in the rat CNS: anatomical and functional implications. Trends Neurosci. 18,
22-29.
Mansour, A., Thompson, R. C., Akil, H., & Watson, S. J. (1993). Delta opioid receptor
mRNA distribution in the brain: comparison to delta receptor binding and proenkephalin
mRNA. J Chem.Neuroanat. 6, 351-362.
Mansour, A., Watson, S. J., & Akil, H. (1995b). Opioid receptors: past, present and
future. Trends Neurosci. 18, 69-70.
Manzanares, J., Corchero, J., Romero, J., Fernandez-Ruiz, J. J., Ramos, J. A., &
Fuentes, J. A. (1998). Chronic administration of cannabinoids regulates proenkephalin
mRNA levels in selected regions of the rat brain. Brain Res.Mol.Brain Res. 55, 126-
132.
Marin, S., Marco, E., Biscaia, M., Fernandez, B., Rubio, M., Guaza, C.,
Schmidhammer, H., & Viveros, M. P. (2003). Involvement of the kappa-opioid receptor
in the anxiogenic-like effect of CP 55,940 in male rats. Pharmacol.Biochem.Behav. 74,
649-656.
Markram, H. & Segal, M. (1990). Long-lasting facilitation of excitatory postsynaptic
potentials in the rat hippocampus by acetylcholine. J Physiol 427, 381-393.
Marley, P. D., Cheung, C. Y., Thomson, K. A., & Murphy, R. (1996). Activation of
tyrosine hydroxylase by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP-27)
in bovine adrenal chromaffin cells. J Auton.Nerv.Syst. 60, 141-146.

221
Marsicano, G. & Lutz, B. (1999). Expression of the cannabinoid receptor CB1 in distinct
neuronal subpopulations in the adult mouse forebrain. Eur J Neurosci. 11, 4213-4225.
Marsicano, G., Wotjak, C. T., Azad, S. C., Bisogno, T., Rammes, G., Cascio, M. G.,
Hermann, H., Tang, J., Hofmann, C., Zieglgansberger, W., Di, M., V, & Lutz, B. (2002).
The endogenous cannabinoid system controls extinction of aversive memories. Nature
418, 530-534.
Martellotta, M. C., Cossu, G., Fattore, L., Gessa, G. L., & Fratta, W. (1998). Self-
administration of the cannabinoid receptor agonist WIN 55,212-2 in drug-naive mice.
Neuroscience 85 , 327-330.
Martin-Schild, S., Gerall, A. A., Kastin, A. J., & Zadina, J. E. (1999). Differential
distribution of endomorphin 1- and endomorphin 2-like immunoreactivities in the CNS
of the rodent. J Comp Neurol. 405, 450-471.
Martin, B. R., Compton, D. R., Thomas, B. F., Prescott, W. R., Little, P. J., Razdan, R.
K., Johnson, M. R., Melvin, L. S., Mechoulam, R., & Ward, S. J. (1991). Behavioral,
biochemical, and molecular modeling evaluations of cannabinoid analogs.
Pharmacol.Biochem.Behav. 40, 471-478.
Martin, B. R., Welch, S. P., & Abood, M. (1994). Progress toward understanding the
cannabinoid receptor and its second messenger systems. Adv.Pharmacol. 25, 341-
397.
Martin, J. B., Audet, J., & Saunders, A. (1975). Effects of somatostatin and
hypothalamic ventromedial lesions on GH release induced by morphine. Endocrinology
96, 839-847.
Martin, J. L., Dietl, M. M., Hof, P. R., Palacios, J. M., & Magistretti, P. J. (1987).
Autoradiographic mapping of [mono[125I]iodo-Tyr10, MetO17]vasoactive intestinal
peptide binding sites in the rat brain. Neuroscience 23, 539-565.
Martin, J. L., Gasser, D., & Magistretti, P. J. (1995). Vasoactive intestinal peptide and
pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide potentiate c-fos expression induced
by glutamate in cultured cortical neurons. J Neurochem. 65, 1-9.
Martin, P., Soubrie, P., & Simon, P. (1986). Noradrenergic and opioid mediation of
tricyclic-induced reversal of escape deficits caused by inescapable shock pretreatment
in rats. Psychopharmacology (Berl) 90, 90-94.
Martin, W. J., Tsou, K., & Walker, J. M. (1998). Cannabinoid receptor-mediated
inhibition of the rat tail-flick reflex after microinjection into the rostral ventromedial
medulla. Neurosci.Lett. 242, 33-36.
Martin, W. R., Eades, C. G., Thompson, J. A., Huppler, R. E., & Gilbert, P. E. (1976).
The effects of morphine- and nalorphine- like drugs in the nondependent and
morphine-dependent chronic spinal dog. J Pharmacol.Exp.Ther. 197, 517-532.
Mascia, M. S., Obinu, M. C., Ledent, C., Parmentier, M., Bohme, G. A., Imperato, A., &
Fratta, W. (1999). Lack of morphine-induced dopamine release in the nucleus
accumbens of cannabinoid CB1 receptor knockout mice. Eur J Pharmacol. 383, R1-R2.
Masserano, J. M., Karoum, F., & Wyatt, R. J. (1999). SR 141716A, a CB1 cannabinoid
receptor antagonist, potentiates the locomotor stimulant effects of amphetamine and
apomorphine. Behav.Pharmacol. 10, 429-432.
Masuo, Y., Noguchi, J., Morita, S., & Matsumoto, Y. (1995). Effects of
intracerebroventricular administration of pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide (PACAP) on the motor activity and reserpine-induced hypothermia in
murines. Brain Res. 700, 219-226.

222
Masuo, Y., Ohtaki, T., Masuda, Y., Nagai, Y., Suno, M., Tsuda, M., & Fujino, M. (1991).
Autoradiographic distribution of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide
(PACAP) binding sites in the rat brain. Neurosci.Lett. 126, 103-106.
Masuo, Y., Suzuki, N., Matsumoto, H., Tokito, F., Matsumoto, Y., Tsuda, M., & Fujino,
M. (1993). Regional distribution of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide
(PACAP) in the rat central nervous system as determined by sandwich-enzyme
immunoassay. Brain Res. 602, 57-63.
Masuo, Y., Tokito, F., Matsumoto, Y., Shimamoto, N., & Fujino, M. (1994). Ontogeny of
pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its binding sites in the
rat brain. Neurosci.Lett. 170, 43-46.
Matsuda, L. A., Bonner, T. I., & Lolait, S. J. (1993). Localization of cannabinoid
receptor mRNA in rat brain. J Comp Neurol. 327, 535-550.
Matsuda, L. A., Lolait, S. J., Brownstein, M. J., Young, A. C., & Bonner, T. I. (1990).
Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNA.
Nature 346, 561-564.
Matsumoto, H., Koyama, C., Sawada, T., Koike, K., Hirota, K., Miyake, A., Arimura, A.,
& Inoue, K. (1993). Pituitary folliculo-stellate-like cell line (TtT/GF) responds to novel
hypophysiotropic peptide (pituitary adenylate cyclase-activating peptide), showing
increased adenosine 3',5'-monophosphate and interleukin-6 secretion and cell
proliferation. Endocrinology 133, 2150-2155.
Matsumoto, R. R., Brinsfield, K. H., Patrick, R. L., & Walker, J. M. (1988). Rotational
behavior mediated by dopaminergic and nondopaminergic mechanisms after intranigral
microinjection of specific mu, delta and kappa opioid agonists. J Pharmacol.Exp.Ther.
246, 196-203.
Matsuo, H., Baba, Y., Nair, R. M., Arimura, A., & Schally, A. V. (1971). Structure of the
porcine LH- and FSH-releasing hormone. I. The proposed amino acid sequence.
Biochem.Biophys.Res.Commun. 43, 1334-1339.
Matsuoka, I., Maldonado, R., Defer, N., Noel, F., Hanoune, J., & Roques, B. P. (1994).
Chronic morphine administration causes region-specific increase of brain type VIII
adenylyl cyclase mRNA. Eur J Pharmacol. 268, 215-221.
Matthes, H. W., Maldonado, R., Simonin, F., Valverde, O., Slowe, S., Kitchen, I.,
Befort, K., Dierich, A., Le Meur, M., Dolle, P., Tzavara, E., Hanoune, J., Roques, B. P.,
& Kieffer, B. L. (1996). Loss of morphine-induced analgesia, reward effect and
withdrawal symptoms in mice lacking the mu-opioid-receptor gene. Nature 383, 819-
823.
Matthes, H. W., Smadja, C., Valverde, O., Vonesch, J. L., Foutz, A. S., Boudinot, E.,
Denavit-Saubie, M., Severini, C., Negri, L., Roques, B. P., Maldonado, R., & Kieffer, B.
L. (1998). Activity of the delta-opioid receptor is partially reduced, whereas activity of
the kappa-receptor is maintained in mice lacking the mu-receptor. J Neurosci. 18,
7285-7295.
Mazzari, S., Canella, R., Petrelli, L., Marcolongo, G., & Leon, A. (1996). N-(2-
hydroxyethyl)hexadecanamide is orally active in reducing edema formation and
inflammatory hyperalgesia by down-modulating mast cell activation. Eur J Pharmacol.
300, 227-236.
Mazzucchelli, C., Vantaggiato, C., Ciamei, A., Fasano, S., Pakhotin, P., Krezel, W.,
Welzl, H., Wolfer, D. P., Pages, G., Valverde, O., Marowsky, A., Porrazzo, A., Orban,
P. C., Maldonado, R., Ehrengruber, M. U., Cestari, V., Lipp, H. P., Chapman, P. F.,
Pouyssegur, J., & Brambilla, R. (2002). Knockout of ERK1 MAP kinase enhances

223
synaptic plasticity in the striatum and facilitates striatal-mediated learning and memory.
Neuron 34, 807-820.
McArdle, C. A. (1994). Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide: a key player
in reproduction? Endocrinology 135, 815-817.
McGaugh, J. L. & Roozendaal, B. (2002). Role of adrenal stress hormones in forming
lasting memories in the brain. Curr.Opin.Neurobiol. 12, 205-210.
McMillan, D. E., Harris, L. S., Frankenheim, J. M., & Kennedy, J. S. (1970). l-delta-9-
trans-tetrahydrocannabinol in pigeons: tolerance to the behavioral effects. Science 169,
501-503.
Mechoulam, R. (1986). In Cannabinoids as Therapeutic Agents, ed. Mechoulam, R.,
pp. 167-176. Boca Raton, FL, CRC Press.
Mechoulam, R., Ben Shabat, S., Hanus, L., Ligumsky, M., Kaminski, N. E., Schatz, A.
R., Gopher, A., Almog, S., Martin, B. R., & Compton, D. R. (1995). Identification of an
endogenous 2-monoglyceride, present in canine gut, that binds to cannabinoid
receptors. Biochem.Pharmacol. 50, 83-90.
Meng, I. D., Manning, B. H., Martin, W. J., & Fields, H. L. (1998). An analgesia circuit
activated by cannabinoids. Nature 395, 381-383.
Merlo, P. E., Lorang, M., Yeganeh, M., Rodriguez, d. F., Raber, J., Koob, G. F., &
Weiss, F. (1995). Increase of extracellular corticotropin-releasing factor-like
immunoreactivity levels in the amygdala of awake rats during restraint stress and
ethanol withdrawal as measured by microdialysis. J Neurosci. 15, 5439-5447.
Meunier, J. C., Mollereau, C., Toll, L., Suaudeau, C., Moisand, C., Alvinerie, P., Butour,
J. L., Guillemot, J. C., Ferrara, P., & Monsarrat, B. (1995). Isolation and structure of the
endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature 377, 532-535.
Miczek, K. A. & Dixit, B. N. (1980). Behavioral and biochemical effects of chronic delta
9-tetrahydrocannabinol in rats. Psychopharmacology (Berl) 67, 195-202.
Mikkelsen, J. D., Hannibal, J., Fahrenkrug, J., Larsen, P. J., Olcese, J., & McArdle, C.
(1995). Pituitary adenylate cyclase activating peptide-38 (PACAP-38), PACAP-27, and
PACAP related peptide (PRP) in the rat median eminence and pituitary. J
Neuroendocrinol. 7, 47-55.
Millan, M. J. (1989). Kappa-opioid receptor-mediated antinociception in the rat. I.
Comparative actions of mu- and kappa-opioids against noxious thermal, pressure and
electrical stimuli. J Pharmacol.Exp.Ther. 251, 334-341.
Millan, M. J., Czlonkowski, A., Lipkowski, A., & Herz, A. (1989). Kappa-opioid receptor-
mediated antinociception in the rat. II. Supraspinal in addition to spinal sites of action. J
Pharmacol.Exp.Ther. 251, 342-350.
Miller, A. S., Sanudo-Pena, M. C., & Walker, J. M. (1998). Ipsilateral turning behavior
induced by unilateral microinjections of a cannabinoid into the rat subthalamic nucleus.
Brain Res. 793, 7-11.
Miller, A. S. & Walker, J. M. (1996). Electrophysiological effects of a cannabinoid on
neural activity in the globus pallidus. Eur J Pharmacol. 304, 29-35.
Miller, L. L. & Branconnier, R. J. (1983). Cannabis: effects on memory and the
cholinergic limbic system. Psychol.Bull. 93, 441-456.
Miserendino, M. J. & Nestler, E. J. (1995). Behavioral sensitization to cocaine:
modulation by the cyclic AMP system in the nucleus accumbens. Brain Res. 674, 299-
306.

224
Misner, D. L. & Sullivan, J. M. (1999). Mechanism of cannabinoid effects on long-term
potentiation and depression in hippocampal CA1 neurons. J Neurosci. 19, 6795-6805.
Miyamoto, Y., Habata, Y., Ohtaki, T., Masuda, Y., Ogi, K., Onda, H., & Fujino, M.
(1994). Cloning and expression of a complementary DNA encoding the bovine receptor
for pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP). Biochim.Biophys.Acta
1218, 297-307.
Miyata, A., Arimura, A., Dahl, R. R., Minamino, N., Uehara, A., Jiang, L., Culler, M. D.,
& Coy, D. H. (1989). Isolation of a novel 38 residue-hypothalamic polypeptide which
stimulates adenylate cyclase in pituitary cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 164,
567-574.
Miyata, A., Jiang, L., Dahl, R. D., Kitada, C., Kubo, K., Fujino, M., Minamino, N., &
Arimura, A. (1990). Isolation of a neuropeptide corresponding to the N-terminal 27
residues of the pituitary adenylate cyclase activating polypeptide with 38 residues
(PACAP38). Biochem.Biophys.Res.Commun. 170, 643-648.
Miyata, A., Sato, K., Hino, J., Tamakawa, H., Matsuo, H., & Kangawa, K. (1998). Rat
aortic smooth-muscle cell proliferation is bidirectionally regulated in a cell cycle-
dependent manner via PACAP/VIP type 2 receptor. Ann.N.Y.Acad.Sci. 865, 73-81.
Mizuno, Y., Kondo, K., Terashima, Y., Arima, H., Murase, T., & Oiso, Y. (1998).
Anorectic effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in rats:
lack of evidence for involvement of hypothalamic neuropeptide gene expression. J
Neuroendocrinol. 10, 611-616.
Moller, K. & Sundler, F. (1996). Expression of pituitary adenylate cyclase activating
peptide (PACAP) and PACAP type I receptors in the rat adrenal medulla. Regul.Pept.
63, 129-139.
Moller, K., Zhang, Y. Z., Hakanson, R., Luts, A., Sjolund, B., Uddman, R., & Sundler, F.
(1993). Pituitary adenylate cyclase activating peptide is a sensory neuropeptide:
immunocytochemical and immunochemical evidence. Neuroscience 57, 725-732.
Mollereau, C., Parmentier, M., Mailleux, P., Butour, J. L., Moisand, C., Chalon, P.,
Caput, D., Vassart, G., & Meunier, J. C. (1994). ORL1, a novel member of the opioid
receptor family. Cloning, functional expression and localization. FEBS Lett. 341, 33-38.
Mons, N. & Cooper, D. M. (1995). Adenylate cyclases: critical foci in neuronal
signaling. Trends Neurosci. 18, 536-542.
Moore, M. S., DeZazzo, J., Luk, A. Y., Tully, T., Singh, C. M., & Heberlein, U. (1998).
Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for
regulation by the cAMP signaling pathway. Cell 93, 997-1007.
Moore, R. Y. & Lenn, N. J. (1972). A retinohypothalamic projection in the rat. J
Comp.Neurol. 146, 1-14.
Moore, R. Y., Speh, J. C., & Card, J. P. (1995). The retinohypothalamic tract originates
from a distinct subset of retinal ganglion cells. J Comp.Neurol. 352, 351-366.
Morales, M. & Backman, C. (2002). Coexistence of serotonin 3 (5-HT3) and CB1
cannabinoid receptors in interneurons of hippocampus and dentate gyrus.
Hippocampus 12, 756-764.
Moratalla, R., Xu, M., Tonegawa, S., & Graybiel, A. M. (1996). Cellular responses to
psychomotor stimulant and neuroleptic drugs are abnormal in mice lacking the D1
dopamine receptor. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93, 14928-14933.
Morio, H., Tatsuno, I., Hirai, A., Tamura, Y., & Saito, Y. (1996). Pituitary adenylate
cyclase-activating polypeptide protects rat-cultured cortical neurons from glutamate-
induced cytotoxicity. Brain Res. 741, 82-88.

225
Morley, J. E. (1981). The endocrinology of the opiates and opioid peptides. Metabolism
30, 195-209.
Morley, J. E., Horowitz, M., Morley, P. M., & Flood, J. F. (1992). Pituitary adenylate
cyclase activating polypeptide (PACAP) reduces food intake in mice. Peptides 13,
1133-1135.
Morris, J. L. & Gibbins, I. L. (1987). Neuronal colocalization of peptides,
catecholamines, and catecholamine-synthesizing enzymes in guinea pig paracervical
ganglia. J Neurosci. 7, 3117-3130.
Morrow, J. A., Lutz, E. M., West, K. M., Fink, G., & Harmar, A. J. (1993). Molecular
cloning and expression of a cDNA encoding a receptor for pituitary adenylate cyclase
activating polypeptide (PACAP). FEBS Lett. 329, 99-105.
Moser, A., Scholz, J., & Gansle, A. (1999). Pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide (PACAP-27) enhances tyrosine hydroxylase activity in the nucleus
accumbens of the rat. Neuropeptides 33, 492-497.
Mucha, R. F. & Herz, A. (1985). Motivational properties of kappa and mu opioid
receptor agonists studied with place and taste preference conditioning.
Psychopharmacology (Berl) 86, 274-280.
Mucha, R. F. & Iversen, S. D. (1984). Reinforcing properties of morphine and naloxone
revealed by conditioned place preferences: a procedural examination.
Psychopharmacology (Berl) 82 , 241-247.
Munro, S., Thomas, K. L., & Abu-Shaar, M. (1993). Molecular characterization of a
peripheral receptor for cannabinoids. Nature 365, 61-65.
Murase, T., Kondo, K., Otake, K., & Oiso, Y. (1993). Pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide stimulates arginine vasopressin release in conscious rats.
Neuroendocrinology 57, 1092-1096.
Murray, C. W. & Cowan, A. (1990). [D-Pen2, D-Pen5]enkephalin, the standard delta
opioid agonist, induces morphine-like behaviors in mice. Psychopharmacology (Berl)
102, 425-426.
Murthy, K. S., Jin, J. G., Grider, J. R., & Makhlouf, G. M. (1997). Characterization of
PACAP receptors and signaling pathways in rabbit gastric muscle cells. Am J Physiol
272, G1391-G1399.
Muscat, R., Papp, M., & Willner, P. (1992). Antidepressant-like effects of dopamine
agonists in an animal model of depression. Biol.Psychiatry 31, 937-946.
Muschamp, J. W. & Siviy, S. M. (2002). Behavioral sensitization to amphetamine
follows chronic administration of the CB1 agonist WIN 55,212-2 in Lewis rats.
Pharmacol.Biochem.Behav. 73, 835-842.
Nagy, G., Mulchahey, J. J., & Neill, J. D. (1988). Autocrine control of prolactin secretion
by vasoactive intestinal peptide. Endocrinology 122, 364-366.
Nahin, R. L., Ren, K., De Leon, M., & Ruda, M. (1994). Primary sensory neurons
exhibit altered gene expression in a rat model of neuropathic pain. Pain 58, 95-108.
Narita, M., Dun, S. L., Dun, N. J., & Tseng, L. F. (1996). Hyperalgesia induced by
pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in the mouse spinal cord. Eur J
Pharmacol. 311, 121-126.
Narita, M., Ioka, M., Suzuki, M., Narita, M., & Suzuki, T. (2002). Effect of repeated
administration of morphine on the activity of extracellular signal regulated kinase in the
mouse brain. Neurosci.Lett. 324, 97-100.

226
Nava, F., Carta, G., Colombo, G., & Gessa, G. L. (2001). Effects of chronic Delta(9)-
tetrahydrocannabinol treatment on hippocampal extracellular acetylcholine
concentration and alternation performance in the T-maze. Neuropharmacology 41,
392-399.
Navarro, M., Carrera, M. R., Fratta, W., Valverde, O., Cossu, G., Fattore, L., Chowen,
J. A., Gomez, R., Del, A., I, Villanua, M. A., Maldonado, R., Koob, G. F., & de Fonseca,
F. R. (2001). Functional interaction between opioid and cannabinoid receptors in drug
self-administration. J Neurosci. 21, 5344-5350.
Navarro, M., Chowen, J., Rocio, A. C., Del, A., I, Villanua, M. A., Martin, Y., Roberts, A.
J., Koob, G. F., & de Fonseca, F. R. (1998). CB1 cannabinoid receptor antagonist-
induced opiate withdrawal in morphine-dependent rats. Neuroreport 9, 3397-3402.
Navarro, M., Fernandez-Ruiz, J. J., de Miguel, R., Hernandez, M. L., Cebeira, M., &
Ramos, J. A. (1993). An acute dose of delta 9-tetrahydrocannabinol affects behavioral
and neurochemical indices of mesolimbic dopaminergic activity. Behav.Brain Res. 57,
37-46.
Navarro, M., Hernandez, E., Munoz, R. M., Del, A., I, Villanua, M. A., Carrera, M. R., &
Rodriguez, d. F. (1997). Acute administration of the CB1 cannabinoid receptor
antagonist SR 141716A induces anxiety-like responses in the rat. Neuroreport 8, 491-
496.
Nestler, E. J. (1992). Molecular mechanisms of drug addiction. J Neurosci. 12, 2439-
2450.
Nestler, E. J. (1993). Cellular responses to chronic treatment with drugs of abuse. Crit
Rev Neurobiol. 7, 23-39.
Nestler, E. J. (1996). Under siege: The brain on opiates. Neuron 16, 897-900.
Nestler, E. J. (2001). Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction.
Nat.Rev Neurosci. 2, 119-128.
Nestler, E. J. & Aghajanian, G. K. (1997). Molecular and cellular basis of addiction.
Science 278, 58-63.
Nestler, E. J., Barrot, M., & Self, D. W. (2001). DeltaFosB: a sustained molecular
switch for addiction. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 98, 11042-11046.
Nestler, E. J. & Tallman, J. F. (1988). Chronic morphine treatment increases cyclic
AMP-dependent protein kinase activity in the rat locus coeruleus. Mol.Pharmacol. 33,
127-132.
Nguyen, T. D., Heintz, G. G., & Wolfe, M. S. (1993). Structural characterization of
PACAP receptors on rat liver plasma membranes. Am J Physiol 265, G811-G818.
Nicoll, R. A. & Malenka, R. C. (1995). Contrasting properties of two forms of long-term
potentiation in the hippocampus. Nature 377, 115-118.
Nielsen, H. S., Hannibal, J., & Fahrenkrug, J. (1998). Expression of pituitary adenylate
cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex.
Neuroreport 9, 2639-2642.
Nielsen, H. S., Hannibal, J., Knudsen, S. M., & Fahrenkrug, J. (2001). Pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide induces period1 and period2 gene expression
in the rat suprachiasmatic nucleus during late night. Neuroscience 103, 433-441.
Noguchi, H., Kitazumi, K., Mori, M., & Shiba, T. (2002). Effect of zaleplon on learning
and memory in rats. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 366, 183-188.
Nomura, M., Ueta, Y., Larsen, P. J., Hannibal, J., Serino, R., Kabashima, N., Shibuya,
I., & Yamashita, H. (1997). Water deprivation increases the expression of pituitary

227
adenylate cyclase-activating polypeptide gene in the rat subfornical organ.
Endocrinology 138, 4096-4100.
Nomura, M., Ueta, Y., Serino, R., Yamamoto, Y., Shibuya, I., & Yamashita, H. (1999).
Effects of centrally administered pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide on c-
fos gene expression and heteronuclear RNA for vasopressin in rat paraventricular and
supraoptic nuclei. Neuroendocrinology 69, 167-180.
North, R. A., Williams, J. T., Surprenant, A., & Christie, M. J. (1987). Mu and delta
receptors belong to a family of receptors that are coupled to potassium channels.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 84, 5487-5491.
Nothacker, H. P., Reinscheid, R. K., Mansour, A., Henningsen, R. A., Ardati, A.,
Monsma, F. J., Jr., Watson, S. J., & Civelli, O. (1996). Primary structure and tissue
distribution of the orphanin FQ precursor. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93, 8677-8682.
Ny, L., Larsson, B., Alm, P., Ekstrom, P., Fahrenkrug, J., Hannibal, J., & Andersson, K.
E. (1995). Distribution and effects of pituitary adenylate cyclase activating peptide in
cat and human lower oesophageal sphincter. Br J Pharmacol. 116, 2873-2880.
Nye, H. E., Hope, B. T., Kelz, M. B., Iadarola, M., & Nestler, E. J. (1995).
Pharmacological studies of the regulation of chronic FOS-related antigen induction by
cocaine in the striatum and nucleus accumbens. J Pharmacol.Exp.Ther. 275, 1671-
1680.
Ogi, K., Kimura, C., Onda, H., Arimura, A., & Fujino, M. (1990). Molecular cloning and
characterization of cDNA for the precursor of rat pituitary adenylate cyclase activating
polypeptide (PACAP). Biochem.Biophys.Res.Commun. 173, 1271-1279.
Ogi, K., Miyamoto, Y., Masuda, Y., Habata, Y., Hosoya, M., Ohtaki, T., Masuo, Y.,
Onda, H., & Fujino, M. (1993). Molecular cloning and functional expression of a cDNA
encoding a human pituitary adenylate cyclase activating polypeptide receptor.
Biochem.Biophys.Res.Commun. 196, 1511-1521.
Ohkubo, S., Kimura, C., Ogi, K., Okazaki, K., Hosoya, M., Onda, H., Miyata, A.,
Arimura, A., & Fujino, M. (1992). Primary structure and characterization of the
precursor to human pituitary adenylate cyclase activating polypeptide. DNA Cell Biol.
11, 21-30.
Ohno-Shosaku, T., Maejima, T., & Kano, M. (2001). Endogenous cannabinoids
mediate retrograde signals from depolarized postsynaptic neurons to presynaptic
terminals. Neuron 29, 729-738.
Ohsawa, M., Brailoiu, G. C., Shiraki, M., Dun, N. J., Paul, K., & Tseng, L. F. (2002).
Modulation of nociceptive transmission by pituitary adenylate cyclase activating
polypeptide in the spinal cord of the mouse. Pain 100, 27-34.
Okazaki, K., Itoh, Y., Ogi, K., Ohkubo, S., & Onda, H. (1995). Characterization of
murine PACAP mRNA. Peptides 16, 1295-1299.
Olds, M. E. (1982). Reinforcing effects of morphine in the nucleus accumbens. Brain
Res. 237, 429-440.
Olsson, C. & Holmgren, S. (1994). Distribution of PACAP (pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide)-like and helospectin-like peptides in the teleost gut. Cell Tissue
Res. 277, 539-547.
Onaivi, E. S., Green, M. R., & Martin, B. R. (1990). Pharmacological characterization of
cannabinoids in the elevated plus maze. J Pharmacol.Exp.Ther. 253, 1002-1009.
Ostrowski, N. L., Hatfield, C. B., & Caggiula, A. R. (1982). The effects of low doses of
morphine on the activity of dopamine-containing cells and on behavior. Life Sci. 31,
2347-2350.

228
Osuga, Y., Mitsuhashi, N., & Mizuno, M. (1992). In vivo effect of pituitary adenylate
cyclase activating polypeptide 38 (PACAP 38) on the secretion of luteinizing hormone
(LH) in male rats. Endocrinol.Jpn. 39, 153-156.
Otto, C., Zuschratter, W., Gass, P., & Schutz, G. (1999). Presynaptic localization of the
PACAP-typeI-receptor in hippocampal and cerebellar mossy fibres. Brain
Res.Mol.Brain Res. 66, 163-174.
Ozawa, M., Aono, M., Mizuta, K., Moriga, M., & Okuma, M. (1997). Central
administration of PACAP stimulates gastric secretion mediated through the vagal
pathway in anesthetized rats. Dig.Dis Sci. 42, 2552-2559.
Pacheco, M. A., Ward, S. J., & Childers, S. R. (1993). Identification of cannabinoid
receptors in cultures of rat cerebellar granule cells. Brain Res. 603, 102-110.
Packard, M. G. & Cahill, L. (2001). Affective modulation of multiple memory systems.
Curr.Opin.Neurobiol. 11, 752-756.
Palkovits, M., Somogyvari-Vigh, A., & Arimura, A. (1995). Concentrations of pituitary
adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in human brain nuclei. Brain Res.
699, 116-120.
Pan, Z. Z. (1998). mu-Opposing actions of the kappa-opioid receptor. Trends
Pharmacol.Sci. 19, 94-98.
Pantaloni, C., Brabet, P., Bilanges, B., Dumuis, A., Houssami, S., Spengler, D.,
Bockaert, J., & Journot, L. (1996). Alternative splicing in the N-terminal extracellular
domain of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) receptor
modulates receptor selectivity and relative potencies of PACAP-27 and PACAP-38 in
phospholipase C activation. J Biol.Chem. 271, 22146-22151.
Papp, M., Willner, P., & Muscat, R. (1993). Behavioural sensitization to a dopamine
agonist is associated with reversal of stress-induced anhedonia. Psychopharmacology
(Berl) 110, 159-164.
Parker, LA & Gillies T. (1995). THC-induced place and taste aversions in Lewis and
Sprague-Dawley rats. Behav Neurosci. 109, 71-78.
Paul, D., Bodnar, R. J., Gistrak, M. A., & Pasternak, G. W. (1989). Different mu
receptor subtypes mediate spinal and supraspinal analgesia in mice. Eur J Pharmacol.
168, 307-314.
Pelletier, G. (1993). Regulation of proopiomelanocortin gene expression in rat brain
and pituitary as studied by in situ hybridization. Ann.N.Y.Acad.Sci. 680, 246-259.
Pert, C. B. & Snyder, S. H. (1973). Opiate receptor: demonstration in nervous tissue.
Science 179, 1011-1014.
Pertwee, R. G. (1974). Tolerance to the effect of delta1-tetrahydrocannabinol on
corticosterone levels in mouse plasma produced by repeated administration of
cannabis extract or delta1-tetrahydrocannabinol. Br J Pharmacol. 51, 391-397.
Pertwee, R. G. (1983) The effect of intrahypothalamic injection on delta 9-
tetrahydrocannabinol, dopamine and prostaglandin E2 on behavioral thermoregulation
in mice. Lomax, P. and Schonbaum, E. [Environemental Drugs Thermoregulation, 5th
International Symposium on Pharmacological Thermoregulation, Saint-Paul-de-Vence],
82-85 Basel, Karger.
Pertwee, R. G. (1985). Effects of cannabinoides on thermoregulation. In Marihuana '84,
ed. Harvey, D. J., pp. 265-277. IRL Press, Oxford.
Pertwee, R. G. (1988). The central neuropharmacology of psychotropic cannabinoids.
Pharmacol.Ther. 36, 189-261.

229
Pertwee, R. G. (1997). Pharmacology of cannabinoid CB1 and CB2 receptors.
Pharmacol.Ther. 74, 129-180.
Pertwee, R. G. (2001). Cannabinoid receptors and pain. Prog.Neurobiol. 63, 569-611.
Pettit, D. A., Harrison, M. P., Olson, J. M., Spencer, R. F., & Cabral, G. A. (1998).
Immunohistochemical localization of the neural cannabinoid receptor in rat brain. J
Neurosci.Res. 51, 391-402.
Pfeiffer, A., Brantl, V., Herz, A., & Emrich, H. M. (1986). Psychotomimesis mediated by
kappa opiate receptors. Science 233, 774-776.
Phelix, C. F., Liposits, Z., & Paull, W. K. (1994). Catecholamine-CRF synaptic
interaction in a septal bed nucleus: afferents of neurons in the bed nucleus of the stria
terminalis. Brain Res.Bull. 33, 109-119.
Phelix, C. F. & Paull, W. K. (1990). Demonstration of distinct corticotropin releasing
factor--containing neuron populations in the bed nucleus of the stria terminalis. A light
and electron microscopic immunocytochemical study in the rat. Histochemistry 94, 345-
364.
Pierce, R. C. & Kalivas, P. W. (1997). A circuitry model of the expression of behavioral
sensitization to amphetamine-like psychostimulants. Brain Res.Brain Res.Rev 25, 192-
216.
Pierce, T. L. & Wessendorf, M. W. (2000). Immunocytochemical mapping of
endomorphin-2-immunoreactivity in rat brain. J Chem.Neuroanat. 18, 181-207.
Piggins, H. D., Antle, M. C., & Rusak, B. (1995). Neuropeptides phase shift the
mammalian circadian pacemaker. J Neurosci. 15, 5612-5622.
Piomelli, D., Beltramo, M., Giuffrida, A., & Stella, N. (1998). Endogenous cannabinoid
signaling. Neurobiol.Dis. 5, 462-473.
Piomelli, D., Beltramo, M., Glasnapp, S., Lin, S. Y., Goutopoulos, A., Xie, X. Q., &
Makriyannis, A. (1999). Structural determinants for recognition and translocation by the
anandamide transporter. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 96, 5802-5807.
Piros, E. T., Prather, P. L., Law, P. Y., Evans, C. J., & Hales, T. G. (1996). Voltage-
dependent inhibition of Ca2+ channels in GH3 cells by cloned mu- and delta-opioid
receptors. Mol.Pharmacol. 50, 947-956.
Pisegna, J. R. & Wank, S. A. (1993). Molecular cloning and functional expression of the
pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90 , 6345-6349.
Pistis, M., Muntoni, A. L., Pillolla, G., & Gessa, G. L. (2002). Cannabinoids inhibit
excitatory inputs to neurons in the shell of the nucleus accumbens: an in vivo
electrophysiological study. Eur J Neurosci. 15, 1795-1802.
Pitler, T. A. & Alger, B. E. (1992). Postsynaptic spike firing reduces synaptic GABAA
responses in hippocampal pyramidal cells. J Neurosci. 12, 4122-4132.
Pittius, C. W., Kley, N., Loeffler, J. P., & Hollt, V. (1985). Quantitation of proenkephalin
A messenger RNA in bovine brain, pituitary and adrenal medulla: correlation between
mRNA and peptide levels. EMBO J 4, 1257-1260.
Pittius, C. W., Kley, N., Loeffler, J. P., & Hollt, V. (1987). Proenkephalin B messenger
RNA in porcine tissues: characterization, quantification, and correlation with opioid
peptides. J Neurochem. 48, 586-592.
Poncelet, M., Barnouin, M. C., Breliere, J. C., Le Fur, G., & Soubrie, P. (1999).
Blockade of cannabinoid (CB1) receptors by 141716 selectively antagonizes drug-

230
induced reinstatement of exploratory behaviour in gerbils. Psychopharmacology (Berl)
144, 144-150.
Pontieri, F. E., Monnazzi, P., Scontrini, A., Buttarelli, F. R., & Patacchioli, F. R. (2001a).
Behavioral sensitization to heroin by cannabinoid pretreatment in the rat. Eur J
Pharmacol. 421, R1-R3.
Pontieri, F. E., Monnazzi, P., Scontrini, A., Buttarelli, F. R., & Patacchioli, F. R. (2001b).
Behavioral sensitization to WIN55212.2 in rats pretreated with heroin. Brain Res. 898,
178-180.
Porreca, F., Mosberg, H. I., Hurst, R., Hruby, V. J., & Burks, T. F. (1984). Roles of mu,
delta and kappa opioid receptors in spinal and supraspinal mediation of gastrointestinal
transit effects and hot-plate analgesia in the mouse. J Pharmacol.Exp.Ther. 230, 341-
348.
Porter, A. C., Sauer, J. M., Knierman, M. D., Becker, G. W., Berna, M. J., Bao, J.,
Nomikos, G. G., Carter, P., Bymaster, F. P., Leese, A. B., & Felder, C. C. (2002).
Characterization of a novel endocannabinoid, virodhamine, with antagonist activity at
the CB1 receptor. J Pharmacol.Exp.Ther. 301, 1020-1024.
Pozo, D., Delgado, M., Martinez, C., Gomariz, R. P., Guerrero, J. M., & Calvo, J. R.
(1997). Functional characterization and mRNA expression of pituitary adenylate
cyclase activating polypeptide (PACAP) type I receptors in rat peritoneal macrophages.
Biochim.Biophys.Acta 1359, 250-262.
Przewlocki, R., Stala, L., Greczek, M., Shearman, G. T., Przewlocka, B., & Herz, A.
(1983). Analgesic effects of mu-, delta- and kappa-opiate agonists and, in particular,
dynorphin at the spinal level. Life Sci. 33 (Suppl 1), 649-652.
Pugh, G., Jr., Mason, D. J., Jr., Combs, V., & Welch, S. P. (1997). Involvement of
dynorphin B in the antinociceptive effects of the cannabinoid CP55,940 in the spinal
cord. J Pharmacol.Exp.Ther. 281, 730-737.
Pugh, G., Jr., Smith, P. B., Dombrowski, D. S., & Welch, S. P. (1996). The role of
endogenous opioids in enhancing the antinociception produced by the combination of
delta 9-tetrahydrocannabinol and morphine in the spinal cord. J Pharmacol.Exp.Ther.
279, 608-616.
Puig, d. P., Parada, M. A., & Hernandez, L. (1995). Dipsogenic effect of pituitary
adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP38) injected into the lateral
hypothalamus. Brain Res. 696, 254-257.
Qiu, C., Sora, I., Ren, K., Uhl, G., & Dubner, R. (2000a). Enhanced delta-opioid
receptor-mediated antinociception in mu-opioid receptor-deficient mice. Eur J
Pharmacol. 387, 163-169.
Qiu, C., Sora, I., Ren, K., Uhl, G., & Dubner, R. (2000b). Enhanced delta-opioid
receptor-mediated antinociception in mu-opioid receptor-deficient mice. Eur J
Pharmacol. 387, 163-169.
Quinn, W. G., Sziber, P. P., & Booker, R. (1979). The Drosophila memory mutant
amnesiac. Nature 277, 212-214.
Racz, I., Bilkei-Gorzo, A., Toth, Z. E., Michel, K., Palkovits, M., & Zimmer, A. (2003). A
critical role for the cannabinoid CB1 receptors in alcohol dependence and stress-
stimulated ethanol drinking. J Neurosci. 23, 2453-2458.
Rasmussen, K. (1991). Afferent effects on locus coeruleus in opiate withdrawal.
Prog.Brain Res. 88, 207-216.

231
Rasmussen, K. (1995). The role of the locus coeruleus and N-methyl-D-aspartic acid
(NMDA) and AMPA receptors in opiate withdrawal. Neuropsychopharmacology 13,
295-300.
Rassnick, S., Heinrichs, S. C., Britton, K. T., & Koob, G. F. (1993). Microinjection of a
corticotropin-releasing factor antagonist into the central nucleus of the amygdala
reverses anxiogenic-like effects of ethanol withdrawal. Brain Res. 605, 25-32.
Rawlings, S. R. & Hezareh, M. (1996). Pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide (PACAP) and PACAP/vasoactive intestinal polypeptide receptors: actions
on the anterior pituitary gland. Endocr.Rev 17, 4-29.
Reche, I., Fuentes, J. A., & Ruiz-Gayo, M. (1996a). A role for central cannabinoid and
opioid systems in peripheral delta 9-tetrahydrocannabinol-induced analgesia in mice.
Eur J Pharmacol. 301, 75-81.
Reche, I., Fuentes, J. A., & Ruiz-Gayo, M. (1996b). Potentiation of delta 9-
tetrahydrocannabinol-induced analgesia by morphine in mice: involvement of mu- and
kappa-opioid receptors. Eur J Pharmacol. 318, 11-16.
Reibaud, M., Obinu, M. C., Ledent, C., Parmentier, M., Bohme, G. A., & Imperato, A.
(1999). Enhancement of memory in cannabinoid CB1 receptor knock-out mice. Eur J
Pharmacol. 379, R1-R2.
Reinscheid, R. K., Nothacker, H. P., Bourson, A., Ardati, A., Henningsen, R. A.,
Bunzow, J. R., Grandy, D. K., Langen, H., Monsma, F. J., Jr., & Civelli, O. (1995).
Orphanin FQ: a neuropeptide that activates an opioidlike G protein-coupled receptor.
Science 270, 792-794.
Reisine, T. & Bell, G. I. (1993). Molecular biology of opioid receptors. Trends Neurosci.
16, 506-510.
Reisine, T., Law, S. F., Blake, A., & Tallent, M. (1996). Molecular mechanisms of opiate
receptor coupling to G proteins and effector systems. Ann.N.Y.Acad.Sci. 780, 168-175.
Rene, F., Monnier, D., Gaiddon, C., Felix, J. M., & Loeffler, J. P. (1996). Pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide transduces through cAMP/PKA and PKC
pathways and stimulates proopiomelanocortin gene transcription in mouse
melanotropes. Neuroendocrinology 64, 2-13.
Rhee, M. H., Bayewitch, M., Avidor-Reiss, T., Levy, R., & Vogel, Z. (1998).
Cannabinoid receptor activation differentially regulates the various adenylyl cyclase
isozymes. J Neurochem. 71, 1525-1534.
Rhim, H. & Miller, R. J. (1994). Opioid receptors modulate diverse types of calcium
channels in the nucleus tractus solitarius of the rat. J Neurosci. 14, 7608-7615.
Ribelayga, C., Pevet, P., & Simonneaux, V. (1997). Adrenergic and peptidergic
regulations of hydroxyindole-O-methyltransferase activity in rat pineal gland. Brain Res.
777, 247-250.
Richardson, J. D., Kilo, S., & Hargreaves, K. M. (1998). Cannabinoids reduce
hyperalgesia and inflammation via interaction with peripheral CB1 receptors. Pain 75,
111-119.
Rios, C., Haberny, S., Gomes, I., Trapaidze, N., & Devi, L. A. Opioid-cannabinoid cross
talk: A role for receptor-receptor interactions. 33rd International Narcotics Research
Conference. Asilomar, Pacific Grove, CA. July 9-14, 2002.
Ritz, M. C., Lamb, R. J., Goldberg, S. R., & Kuhar, M. J. (1987). Cocaine receptors on
dopamine transporters are related to self-administration of cocaine. Science 237, 1219-
1223.

232
Roberto, M. & Brunelli, M. (2000). PACAP-38 enhances excitatory synaptic
transmission in the rat hippocampal CA1 region. Learn.Mem. 7, 303-311.
Roberto, M., Scuri, R., & Brunelli, M. (2001). Differential effects of PACAP-38 on
synaptic responses in rat hippocampal CA1 region. Learn.Mem. 8, 265-271.
Rockhold, R. W. (1998). Glutamatergic involvement in psychomotor stimulant action.
Prog.Drug Res. 50, 155-192.
Rodriguez, d. F., Carrera, M. R., Navarro, M., Koob, G. F., & Weiss, F. (1997).
Activation of corticotropin-releasing factor in the limbic system during cannabinoid
withdrawal. Science 276, 2050-2054.
Rodriguez, d. F., Del, A., I, Martin-Calderon, J. L., Gorriti, M. A., & Navarro, M. (1998).
Role of the endogenous cannabinoid system in the regulation of motor activity.
Neurobiol.Dis 5, 483-501.
Rodriguez, d. F., Fernandez-Ruiz, J. J., Murphy, L., Eldridge, J. C., Steger, R. W., &
Bartke, A. (1991). Effects of delta-9-tetrahydrocannabinol exposure on adrenal
medullary function: evidence of an acute effect and development of tolerance in chronic
treatments. Pharmacol.Biochem.Behav. 40, 593-598.
Rodriguez, d. F., Gorriti, M. A., Fernandez-Ruiz, J. J., Palomo, T., & Ramos, J. A.
(1994). Downregulation of rat brain cannabinoid binding sites after chronic delta 9-
tetrahydrocannabinol treatment. Pharmacol.Biochem.Behav. 47, 33-40.
Rodriguez, d. F., Roberts, A. J., Bilbao, A., Koob, G. F., & Navarro, M. (1999a).
Cannabinoid receptor antagonist SR141716A decreases operant ethanol self
administration in rats exposed to ethanol-vapor chambers. Zhongguo Yao Li Xue.Bao.
20, 1109-1114.
Rodriguez, d. F., Rubio, P., Menzaghi, F., Merlo-Pich, E., Rivier, J., Koob, G. F., &
Navarro, M. (1996). Corticotropin-releasing factor (CRF) antagonist [D-
Phe12,Nle21,38,C alpha MeLeu37]CRF attenuates the acute actions of the highly
potent cannabinoid receptor agonist HU-210 on defensive-withdrawal behavior in rats.
J Pharmacol.Exp.Ther. 276, 56-64.
Rodriguez, d. F., Wenger, T., Navarro, M., & Murphy, L. L. (1999b). Effects of delta9-
THC on VIP-induced prolactin secretion in anterior pituitary cultures: evidence for the
presence of functional cannabinoid CB1 receptors in pituitary cells. Brain Res. 841,
114-122.
Rodriguez, J. J., Mackie, K., & Pickel, V. M. (2001). Ultrastructural localization of the
CB1 cannabinoid receptor in mu-opioid receptor patches of the rat Caudate putamen
nucleus. J Neurosci. 21, 823-833.
Rogers, R. D. & Robbins, T. W. (2001). Investigating the neurocognitive deficits
associated with chronic drug misuse. Curr.Opin.Neurobiol. 11, 250-257.
Romanelli, F., Fillo, S., Isidori, A., & Conte, D. (1997). Pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide regulates rat Leydig cell function in vitro. Neuropeptides 31, 311-
317.
Romero, J., Berrendero, F., Manzanares, J., Perez, A., Corchero, J., Fuentes, J. A.,
Fernandez-Ruiz, J. J., & Ramos, J. A. (1998a). Time-course of the cannabinoid
receptor down-regulation in the adult rat brain caused by repeated exposure to delta9-
tetrahydrocannabinol. Synapse 30, 298-308.
Romero, J., Fernandez-Ruiz, J. J., Vela, G., Ruiz-Gayo, M., Fuentes, J. A., & Ramos,
J. A. (1998b). Autoradiographic analysis of cannabinoid receptor binding and
cannabinoid agonist-stimulated [35S]GTP gamma S binding in morphine-dependent
mice. Drug Alcohol Depend. 50, 241-249.

233
Romero, J., Garcia, L., Cebeira, M., Zadrozny, D., Fernandez-Ruiz, J. J., & Ramos, J.
A. (1995). The endogenous cannabinoid receptor ligand, anandamide, inhibits the
motor behavior: role of nigrostriatal dopaminergic neurons. Life Sci. 56, 2033-2040.
Roth, B. L. & Beinfeld, M. C. (1985). The postnatal development of VIP binding sites in
rat forebrain and hindbrain. Peptides 6, 27-30.
Rothman, R. B., Holaday, J. W., & Porreca, F. (1993). Allosteric coupling among opioid
receptors: evidence for an opioid receptor complex. In Opioids I. Handbook of
Experimental Pharmacology, eds. Herz, A., Akil, H., & Simon, E. J., pp. 217-237.
Springer-Verlag, Berlin..
Rowen, D. W., Embrey, J. P., Moore, C. H., & Welch, S. P. (1998). Antisense
oligodeoxynucleotides to the kappa1 receptor enhance delta9-THC-induced
antinociceptive tolerance. Pharmacol.Biochem.Behav. 59, 399-404.
Rubenzik, M., Varga, E., Stropova, D., Roeske, W. R., & Yamamura, H. I. (2001).
Expression of alpha-transducin in Chinese hamster ovary cells stably transfected with
the human delta-opioid receptor attenuates chronic opioid agonist-induced adenylyl
cyclase superactivation. Mol.Pharmacol. 60, 1076-1082.
Rubino, T., Massi, P., Patrini, G., Venier, I., Giagnoni, G., & Parolaro, D. (1994).
Chronic CP-55,940 alters cannabinoid receptor mRNA in the rat brain: an in situ
hybridization study. Neuroreport 5, 2493-2496.
Rubino, T., Patrini, G., Massi, P., Fuzio, D., Vigano, D., Giagnoni, G., & Parolaro, D.
(1998). Cannabinoid-precipitated withdrawal: a time-course study of the behavioral
aspect and its correlation with cannabinoid receptors and G protein expression. J
Pharmacol.Exp.Ther. 285, 813-819.
Rubino, T., Patrini, G., Parenti, M., Massi, P., & Parolaro, D. (1997a). Chronic
treatment with a synthetic cannabinoid CP-55,940 alters G-protein expression in the rat
central nervous system. Brain Res.Mol.Brain Res. 44, 191-197.
Rubino, T., Tizzoni, L., Vigano, D., Massi, P., & Parolaro, D. (1997b). Modulation of rat
brain cannabinoid receptors after chronic morphine treatment. Neuroreport 8, 3219-
3223.
Rubino, T., Vigano, D., Massi, P., & Parolaro, D. (2000). Changes in the cannabinoid
receptor binding, G protein coupling, and cyclic AMP cascade in the CNS of rats
tolerant to and dependent on the synthetic cannabinoid compound CP55,940. J
Neurochem. 75, 2080-2086.
Rubio, P., Rodriguez, d. F., Munoz, R. M., Ariznavarreta, C., Martin-Calderon, J. L., &
Navarro, M. (1995). Long-term behavioral effects of perinatal exposure to delta 9-
tetrahydrocannabinol in rats: possible role of pituitary-adrenal axis. Life Sci. 56, 2169-
2176.
Sacchetti, B., Lorenzini, C. A., Baldi, E., Bucherelli, C., Roberto, M., Tassoni, G., &
Brunelli, M. (2001). Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide hormone
(PACAP) at very low dosages improves memory in the rat. Neurobiol.Learn.Mem. 76,
1-6.
Sakaue, M., Ago, Y., Sowa, C., Sakamoto, Y., Nishihara, B., Koyama, Y., Baba, A., &
Matsuda, T. (2002). Modulation by 5-hT2A receptors of aggressive behavior in isolated
mice. Jpn.J Pharmacol 89, 89-92.
Salio, C., Fischer, J., Franzoni, M. F., Mackie, K., Kaneko, T., & Conrath, M. (2001).
CB1-cannabinoid and mu-opioid receptor co-localization on postsynaptic target in the
rat dorsal horn. Neuroreport. 12, 3689-3692.

234
Salomon, R., Couvineau, A., Rouyer-Fessard, C., Voisin, T., Lavallee, D., Blais, A.,
Darmoul, D., & Laburthe, M. (1993). Characterization of a common VIP-PACAP
receptor in human small intestinal epithelium. Am J Physiol 264, E294-E300.
Sanchez, C., de Ceballos, M. L., del Pulgar, T. G., Rueda, D., Corbacho, C., Velasco,
G., Galve-Roperh, I., Huffman, J. W., Cajal, S., & Guzman, M. (2001). Inhibition of
glioma growth in vivo by selective activation of the CB(2) cannabinoid receptor. Cancer
Res. 61, 5784-5789.
Sanudo-Pena, M. C., Patrick, S. L., Khen, S., Patrick, R. L., Tsou, K., & Walker, J. M.
(1998). Cannabinoid effects in basal ganglia in a rat model of Parkinson's disease.
Neurosci.Lett. 248, 171-174.
Sanudo-Pena, M. C., Patrick, S. L., Patrick, R. L., & Walker, J. M. (1996). Effects of
intranigral cannabinoids on rotational behavior in rats: interactions with the
dopaminergic system. Neurosci.Lett. 206, 21-24.
Sanudo-Pena, M.C., Tsou, K., Delay, E.R., Hohman, A.G., Force, M., Walker, J.M.
(1997). Endogenous cannabinoids as an aversive or counter-rewarding system in the
rat. Neurosci. Lett. 223, 125-128.
Sanudo-Pena, M. C. & Walker, J. M. (1998). Effects of intrapallidal cannabinoids on
rotational behavior in rats: interactions with the dopaminergic system. Synapse 28, 27-
32.
Sar, M., Stumpf, W. E., Miller, R. J., Chang, K. J., & Cuatrecasas, P. (1978).
Immunohistochemical localization of enkephalin in rat brain and spinal cord. J Comp
Neurol. 182, 17-37.
Sarnyai, Z., Shaham, Y., & Heinrichs, S. C. (2001). The role of corticotropin-releasing
factor in drug addiction. Pharmacol.Rev 53, 209-243.
Sasaki, T. & Chang, M. C. (1997). N-arachidonylethanolamine (anandamide) formation
from N-arachidonylphosphatidylethanolamine in rat brain membranes. Life Sci. 61,
1803-1810.
Satoh, M. & Minami, M. (1995). Molecular pharmacology of the opioid receptors.
Pharmacol.Ther. 68, 343-364.
Sauvage, M., Brabet, P., Holsboer, F., Bockaert, J., & Steckler, T. (2000). Mild deficits
in mice lacking pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor type 1
(PAC1) performing on memory tasks. Brain Res.Mol.Brain Res. 84, 79-89.
Sawchenko, P. E. & Swanson, L. W. (1983). The organization and biochemical
specificity of afferent projections to the paraventricular and supraoptic nuclei.
Prog.Brain Res. 60, 19-29.
Sbarbati, A., Zancanaro, C., Cinti, S., & Osculati, F. (1988). Marginal and folliculo-
stellate cells of the pituitary gland of the rat. A comparative morphometric study in
lactating animals. Acta Anat.(Basel) 131, 47-51.
Schlicker, E. & Kathmann, M. (2001). Modulation of transmitter release via presynaptic
cannabinoid receptors. Trends Pharmacol.Sci. 22, 565-572.
Schmeling, W. T. & Hosko, M. J. (1980). Effect of delta 9-tetrahydrocannabinol on
hypothalamic thermosensitive units. Brain Res. 187, 431-442.
Schneider, S. P., Eckert, W. A., III, & Light, A. R. (1998). Opioid-activated postsynaptic,
inward rectifying potassium currents in whole cell recordings in substantia gelatinosa
neurons. J Neurophysiol. 80, 2954-2962.
Schoffelmeer, A. N., De Vries, T. J., Hogenboom, F., Hruby, V. J., Portoghese, P. S., &
Mulder, A. H. (1992). Opioid receptor antagonists discriminate between presynaptic mu

235
and delta receptors and the adenylate cyclase-coupled opioid receptor complex in the
brain. J Pharmacol.Exp.Ther. 263, 20-24.
Schoffelmeer, A. N., De Vries, T. J., Hogenboom, F., & Mulder, A. H. (1993). Mu- and
delta-opioid receptors inhibitorily linked to dopamine-sensitive adenylate cyclase in rat
striatum display a selectivity profile toward endogenous opioid peptides different from
that of presynaptic mu, delta and kappa receptors. J Pharmacol.Exp.Ther. 267, 205-
210.
Schomerus, C., Maronde, E., Laedtke, E., & Korf, H. W. (1996). Vasoactive intestinal
peptide (VIP) and pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) induce
phosphorylation of the transcription factor CREB in subpopulations of rat pinealocytes:
immunocytochemical and immunochemical evidence. Cell Tissue Res. 286, 305-313.
Schomerus, E., Poch, A., Bunting, R., Mason, W. T., & McArdle, C. A. (1994). Effects
of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in the pituitary: activation of two
signal transduction pathways in the gonadotrope-derived alpha T3-1 cell line.
Endocrinology 134, 315-323.
Schreff, M., Schulz, S., Wiborny, D., & Hollt, V. (1998). Immunofluorescent
identification of endomorphin-2-containing nerve fibers and terminals in the rat brain
and spinal cord. Neuroreport 9, 1031-1034.
Schwartz, M. W., Dallman, M. F., & Woods, S. C. (1995). Hypothalamic response to
starvation: implications for the study of wasting disorders. Am J Physiol 269, R949-
R957.
Seidah, N. G., Chretien, M., & Day, R. (1994). The family of subtilisin/kexin like pro-
protein and pro-hormone convertases: divergent or shared functions. Biochimie 76,
197-209.
Seidah, N. G., Day, R., Marcinkiewicz, M., & Chretien, M. (1998). Precursor
convertases: an evolutionary ancient, cell-specific, combinatorial mechanism yielding
diverse bioactive peptides and proteins. Ann.N.Y.Acad.Sci. 839, 9-24.
Self, D. W. & Nestler, E. J. Relapse to drug-seeking: neural and molecular
mechanisms.

Shapira, M., Gafni, M., & Sarne, Y. (1998). Independence of, and interactions between,
cannabinoid and opioid signal transduction pathways in N18TG2 cells. Brain Res. 806,
26-35.
Sharma, S. K., Klee, W. A., & Nirenberg, M. (1977). Opiate-dependent modulation of
adenylate cyclase. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74, 3365-3369.
Sharma, S. K., Nirenberg, M., & Klee, W. A. (1975). Morphine receptors as regulators
of adenylate cyclase activity. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 72, 590-594.
Shen, M., Piser, T. M., Seybold, V. S., & Thayer, S. A. (1996). Cannabinoid receptor
agonists inhibit glutamatergic synaptic transmission in rat hippocampal cultures. J
Neurosci. 16, 4322-4334.
Shen, M. & Thayer, S. A. (1999). Delta9-tetrahydrocannabinol acts as a partial agonist
to modulate glutamatergic synaptic transmission between rat hippocampal neurons in
culture. Mol.Pharmacol. 55, 8-13.
Shen, S., Spratt, C., Sheward, W. J., Kallo, I., West, K., Morrison, C. F., Coen, C. W.,
Marston, H. M., & Harmar, A. J. (2000). Overexpression of the human VPAC2 receptor
in the suprachiasmatic nucleus alters the circadian phenotype of mice.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97, 11575-11580.

236
Shen, Z., Larsson, L. T., Malmfors, G., Absood, A., Hakanson, R., & Sundler, F. (1992).
A novel neuropeptide, pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP), in
human intestine: evidence for reduced content in Hirschsprung's disease. Cell Tissue
Res. 269, 369-374.
Sheward, W. J., Lutz, E. M., & Harmar, A. J. (1995). The distribution of vasoactive
intestinal peptide2 receptor messenger RNA in the rat brain and pituitary gland as
assessed by in situ hybridization. Neuroscience 67, 409-418.
Shinohara, K., Funabashi, T., & Kimura, F. (1999). Temporal profiles of vasoactive
intestinal polypeptide precursor mRNA and its receptor mRNA in the rat
suprachiasmatic nucleus. Brain Res.Mol.Brain Res. 63, 262-267.
Shintani, N., Mori, W., Hashimoto, H., Imai, M., Tanaka, K., Tomimoto, S., Hirose, M.,
Kawaguchi, C., & Baba, A. (2002). Defects in reproductive functions in PACAP-
deficient female mice. Regul.Pept. 109, 45-48.
Shioda, S. (2000). Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its
receptors in the brain. Kaibogaku Zasshi 75, 487-507.
Shioda, S., Legradi, G., Leung, W. C., Nakajo, S., Nakaya, K., & Arimura, A. (1994).
Localization of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its messenger
ribonucleic acid in the rat testis by light and electron microscopic immunocytochemistry
and in situ hybridization. Endocrinology 135, 818-825.
Shioda, S., Ozawa, H., Dohi, K., Mizushima, H., Matsumoto, K., Nakajo, S., Takaki, A.,
Zhou, C. J., Nakai, Y., & Arimura, A. (1998a). PACAP protects hippocampal neurons
against apoptosis: involvement of JNK/SAPK signaling pathway. Ann.N.Y.Acad.Sci.
865, 111-117.
Shioda, S., Shuto, Y., Somogyvari-Vigh, A., Legradi, G., Onda, H., Coy, D. H., Nakajo,
S., & Arimura, A. (1997a). Localization and gene expression of the receptor for pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide in the rat brain. Neurosci.Res. 28, 345-354.
Shioda, S., Yada, T., Nakajo, S., Nakai, Y., & Arimura, A. (1998b). PACAP increases
cytosolic calcium in vasopressin neurons: synergism with noradrenaline.
Ann.N.Y.Acad.Sci. 865, 427-430.
Shioda, S., Yada, T., Nakajo, S., Nakaya, K., Nakai, Y., & Arimura, A. (1997b). Pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP): a novel regulator of vasopressin-
containing neurons. Brain Res. 765, 81-90.
Shippenberg, T. S., Bals-Kubik, R., & Herz, A. (1987). Motivational properties of
opioids: evidence that an activation of delta-receptors mediates reinforcement
processes. Brain Res. 436, 234-239.
Shippenberg, T. S. & Elmer, G. I. (1998). The neurobiology of opiate reinforcement.
Crit Rev Neurobiol. 12, 267-303.
Shire, D., Carillon, C., Kaghad, M., Calandra, B., Rinaldi-Carmona, M., Le Fur, G.,
Caput, D., & Ferrara, P. (1995). An amino-terminal variant of the central cannabinoid
receptor resulting from alternative splicing. J Biol.Chem. 270, 3726-3731.
Shivachar, A. C., Martin, B. R., & Ellis, E. F. (1996). Anandamide- and delta9-
tetrahydrocannabinol-evoked arachidonic acid mobilization and blockade by
SR141716A [N-(Piperidin-1-yl)-5-(4-chlorophenyl)-1-(2,4-dichlorophenyl)-4 -methyl-1H-
pyrazole-3-carboximide hydrochloride]. Biochem.Pharmacol. 51, 669-676.
Shivers, B. D., Gorcs, T. J., Gottschall, P. E., & Arimura, A. (1991). Two high affinity
binding sites for pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide have different tissue
distributions. Endocrinology 128, 3055-3065.

237
Showalter, V. M., Compton, D. R., Martin, B. R., & Abood, M. E. (1996). Evaluation of
binding in a transfected cell line expressing a peripheral cannabinoid receptor (CB2):
identification of cannabinoid receptor subtype selective ligands. J Pharmacol.Exp.Ther.
278, 989-999.
Shuto, Y., Somogyvari-Vigh, A., Shioda, S., Onda, H., & Arimura, A. (1995). Effect of
hypophysectomy on pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide gene expression
in the rat testis. Peptides 16, 1039-1044.
Sim, L. J., Hampson, R. E., Deadwyler, S. A., & Childers, S. R. (1996a). Effects of
chronic treatment with delta9-tetrahydrocannabinol on cannabinoid-stimulated
[35S]GTPgammaS autoradiography in rat brain. J Neurosci. 16, 8057-8066.
Sim, L. J., Selley, D. E., Xiao, R., & Childers, S. R. (1996b). Differences in G-protein
activation by mu- and delta-opioid, and cannabinoid, receptors in rat striatum. Eur J
Pharmacol. 307, 97-105.
Simmons, M. L. & Chavkin, C. (1996). k-Opioid receptor activation of a dendrotoxin-
sensitive potassium channel mediates presynaptic inhibition of mossy fiber
neurotransmitter release. Mol.Pharmacol. 50, 80-85.
Simon, E. J., Hiller, J. M., & Edelman, I. (1973). Stereospecific binding of the potent
narcotic analgesic (3H) Etorphine to rat-brain homogenate. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
70, 1947-1949.
Simonin, F., Valverde, O., Smadja, C., Slowe, S., Kitchen, I., Dierich, A., Le Meur, M.,
Roques, B. P., Maldonado, R., & Kieffer, B. L. (1998). Disruption of the kappa-opioid
receptor gene in mice enhances sensitivity to chemical visceral pain, impairs
pharmacological actions of the selective kappa-agonist U-50,488H and attenuates
morphine withdrawal. EMBO J 17, 886-897.
Simonneaux, V., Ouichou, A., & Pevet, P. (1993). Pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide (PACAP) stimulates melatonin synthesis from rat pineal gland. Brain Res.
603, 148-152.
Skaper, S. D., Buriani, A., Dal Toso, R., Petrelli, L., Romanello, S., Facci, L., & Leon, A.
(1996). The ALIAmide palmitoylethanolamide and cannabinoids, but not anandamide,
are protective in a delayed postglutamate paradigm of excitotoxic death in cerebellar
granule neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93, 3984-3989.
Slipetz, D. M., O'Neill, G. P., Favreau, L., Dufresne, C., Gallant, M., Gareau, Y., Guay,
D., Labelle, M., & Metters, K. M. (1995). Activation of the human peripheral
cannabinoid receptor results in inhibition of adenylyl cyclase. Mol.Pharmacol. 48, 352-
361.
Smart, D., Hirst, R. A., Hirota, K., Grandy, D. K., & Lambert, D. G. (1997). The effects
of recombinant rat mu-opioid receptor activation in CHO cells on phospholipase C,
[Ca2+]i and adenylyl cyclase. Br J Pharmacol. 120, 1165-1171.
Smart, D. & Lambert, D. G. (1996a). delta-Opioids stimulate inositol 1,4,5-
trisphosphate formation, and so mobilize Ca2+ from intracellular stores, in
undifferentiated NG108-15 cells. J Neurochem. 66, 1462-1467.
Smart, D. & Lambert, D. G. (1996b). The stimulatory effects of opioids and their
possible role in the development of tolerance. Trends Pharmacol.Sci. 17, 264-269.
Smart, D., Smith, G., & Lambert, D. G. (1994). mu-Opioid receptor stimulation of
inositol (1,4,5)trisphosphate formation via a pertussis toxin-sensitive G protein. J
Neurochem. 62, 1009-1014.

238
Smart, D., Smith, G., & Lambert, D. G. (1995). Mu-opioids activate phospholipase C in
SH-SY5Y human neuroblastoma cells via calcium-channel opening. Biochem.J 305 (Pt
2), 577-581.
Smith, F. L., Cichewicz, D., Martin, Z. L., & Welch, S. P. (1998). The enhancement of
morphine antinociception in mice by delta9-tetrahydrocannabinol.
Pharmacol.Biochem.Behav. 60, 559-566.
Smith, P. B., Compton, D. R., Welch, S. P., Razdan, R. K., Mechoulam, R., & Martin, B.
R. (1994a). The pharmacological activity of anandamide, a putative endogenous
cannabinoid, in mice. J Pharmacol.Exp.Ther. 270, 219-227.
Smith, P. B., Welch, S. P., & Martin, B. R. (1994b). Interactions between delta 9-
tetrahydrocannabinol and kappa opioids in mice. J Pharmacol.Exp.Ther. 268, 1381-
1387.
Sofuoglu, M., Portoghese, P. S., & Takemori, A. E. (1991). Differential antagonism of
delta opioid agonists by naltrindole and its benzofuran analog (NTB) in mice: evidence
for delta opioid receptor subtypes. J Pharmacol.Exp.Ther. 257, 676-680.
Sora, I., Takahashi, N., Funada, M., Ujike, H., Revay, R. S., Donovan, D. M., Miner, L.
L., & Uhl, G. R. (1997). Opiate receptor knockout mice define mu receptor roles in
endogenous nociceptive responses and morphine-induced analgesia.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 94, 1544-1549.
Spanagel, R., Herz, A., & Shippenberg, T. S. (1990). The effects of opioid peptides on
dopamine release in the nucleus accumbens: an in vivo microdialysis study. J
Neurochem. 55, 1734-1740.
Spengler, D., Waeber, C., Pantaloni, C., Holsboer, F., Bockaert, J., Seeburg, P. H., &
Journot, L. (1993). Differential signal transduction by five splice variants of the PACAP
receptor. Nature 365, 170-175.
Sreedharan, S. P., Patel, D. R., Huang, J. X., & Goetzl, E. J. (1993). Cloning and
functional expression of a human neuroendocrine vasoactive intestinal peptide
receptor. Biochem.Biophys.Res.Commun. 193, 546-553.
Stark, P. & Dews, P. B. (1980). Cannabinoids. I. Behavioral effects. J
Pharmacol.Exp.Ther. 214, 124-130.
Steenstrup, B. R., Alm, P., Hannibal, J., Jorgensen, J. C., Palle, C., Junge, J.,
Christensen, H. B., Ottesen, B., & Fahrenkrug, J. (1995). Pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide: occurrence and relaxant effect in female genital tract. Am J
Physiol 269, E108-E117.
Stein, C., Machelska, H., Binder, W., & Schafer, M. (2001a). Peripheral opioid
analgesia. Curr.Opin.Pharmacol. 1, 62-65.
Stein, C., Machelska, H., Binder, W., & Schafer, M. (2001b). Peripheral opioid
analgesia. Curr.Opin.Pharmacol 1, 62-65.
Steketee, J. D. & Kalivas, P. W. (1991). Sensitization to psychostimulants and stress
after injection of pertussis toxin into the A10 dopamine region.
Stella, N., Schweitzer, P., & Piomelli, D. (1997). A second endogenous cannabinoid
that modulates long-term potentiation. Nature 388, 773-778.
Stevens, C. W. & Yaksh, T. L. (1989). Time course characteristics of tolerance
development to continuously infused antinociceptive agents in rat spinal cord. J
Pharmacol.Exp.Ther. 251 , 216-223.

239
Stinus, L., Le Moal, M., & Koob, G. F. (1990). Nucleus accumbens and amygdala are
possible substrates for the aversive stimulus effects of opiate withdrawal. Neuroscience
37, 767-773.
Suda, K., Smith, D. M., Ghatei, M. A., & Bloom, S. R. (1992). Investigation of the
interaction of VIP binding sites with VIP and PACAP in human brain. Neurosci.Lett.
137, 19-23.
Sugiura, T., Kondo, S., Sukagawa, A., Nakane, S., Shinoda, A., Itoh, K., Yamashita, A.,
& Waku, K. (1995). 2-Arachidonoylglycerol: a possible endogenous cannabinoid
receptor ligand in brain. Biochem.Biophys.Res.Commun. 215, 89-97.
Sugiura, T., Kondo, S., Sukagawa, A., Tonegawa, T., Nakane, S., Yamashita, A.,
Ishima, Y., & Waku, K. (1996). Transacylase-mediated and phosphodiesterase-
mediated synthesis of N-arachidonoylethanolamine, an endogenous cannabinoid-
receptor ligand, in rat brain microsomes. Comparison with synthesis from free
arachidonic acid and ethanolamine. Eur J Biochem. 240, 53-62.
Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., & DiCicco-Bloom, E. (2001). PACAP is an anti-
mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat.Neurosci. 4, 123-124.
Sulcova, E., Mechoulam, R., & Fride, E. (1998). Biphasic effects of anandamide.
Pharmacol Biochem.Behav. 59, 347-352.
Sullivan, A. F. & Dickenson, A. H. (1991). Electrophysiologic studies on the spinal
antinociceptive action of kappa opioid agonists in the adult and 21-day-old rat. J
Pharmacol.Exp.Ther. 256, 1119-1125.
Sullivan, J. M. (1999). Mechanisms of cannabinoid-receptor-mediated inhibition of
synaptic transmission in cultured hippocampal pyramidal neurons. J Neurophysiol. 82,
1286-1294.
Sundler, F., Ekblad, E., Absood, A., Hakanson, R., Koves, K., & Arimura, A. (1992).
Pituitary adenylate cyclase activating peptide: a novel vasoactive intestinal peptide-like
neuropeptide in the gut. Neuroscience 46, 439-454.
Surprenant, A., Shen, K. Z., North, R. A., & Tatsumi, H. (1990). Inhibition of calcium
currents by noradrenaline, somatostatin and opioids in guinea-pig submucosal
neurones. J Physiol. 431, 585-608.
Suzuki, N., Harada, M., Hosoya, M., & Fujino, M. (1994). Enhanced production of
pituitary adenylate-cyclase-activating polypeptide by 1, N6-dibutyryladenosine 3',5'-
monophosphate, phorbol 12-myristate 13-acetate and by the polypeptide itself in
human neuroblastoma cells, IMR-32. Eur J Biochem. 223, 147-153.
Suzuki, T., Tsuji, M., Mori, T., Ikeda, H., Misawa, M., & Nagase, H. (1997). Involvement
of dopamine-dependent and -independent mechanisms in the rewarding effects
mediated by delta opioid receptor subtypes in mice. Brain Res. 744, 327-334.
Svoboda, M., Tastenoy, M., Ciccarelli, E., Stievenart, M., & Christophe, J. (1993).
Cloning of a splice variant of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide
(PACAP) type I receptor. Biochem.Biophys.Res.Commun. 195, 881-888.
Szabo, B., Muller, T., & Koch, H. (1999). Effects of cannabinoids on dopamine release
in the corpus striatum and the nucleus accumbens in vitro. J Neurochem. 73, 1084-
1089.
Szabo, B., Siemes, S., & Wallmichrath, I. (2002a). Inhibition of GABAergic
neurotransmission in the ventral tegmental area by cannabinoids. Eur J Neurosci. 15,
2057-2061.
Szabo, E., Nemeskeri, A., Heinzlmann, A., Suzuki, N., Arimura, A., & Koves, K.
(2002b). Cell immunoblot assay study demonstrating the release of PACAP from

240
individual anterior pituitary cells of rats and the effect of PACAP on LH release.
Regul.Pept. 109, 75-81.
Szabo, G., Macsai, M., Schek, E., & Telegdy, G. (1998). The effect of vasoactive
intestinal polypeptide and pituitary adenylate cyclase activating polypeptide on
tolerance to morphine and alcohol in mice. Ann.N.Y.Acad.Sci. 865, 566-569.
Tabarin, A., Chen, D., Hakanson, R., & Sundler, F. (1994). Pituitary adenylate cyclase-
activating peptide in the adrenal gland of mammals: distribution, characterization and
responses to drugs. Neuroendocrinology 59, 113-119.
Takahashi, K., Totsune, K., Murakami, O., Satoh, F., Sone, M., Ohneda, M., Sasano,
H., & Mouri, T. (1994). Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP)-like
immunoreactivity in human hypothalamus: co-localization with arginine vasopressin.
Regul.Pept. 50, 267-275.
Takeuchi, K., Takehara, K., Kato, S., & Yagi, K. (1997). PACAPs stimulate duodenal
bicarbonate secretion at PACAP receptors in the rat. Am J Physiol 272, G646-G653.
Tanda, G., Munzar, P., & Goldberg, S. R. (2000). Self-administration behavior is
maintained by the psychoactive ingredient of marijuana in squirrel monkeys.
Nat.Neurosci. 3, 1073-1074.
Tanda, G., Pontieri, F. E., & Di Chiara, G. (1997). Cannabinoid and heroin activation of
mesolimbic dopamine transmission by a common mu1 opioid receptor mechanism.
Science 276, 2048-2050.
Tatsuno, I., Gottschall, P. E., & Arimura, A. (1991a). Specific binding sites for pituitary
adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in rat cultured astrocytes: molecular
identification and interaction with vasoactive intestinal peptide (VIP). Peptides 12, 617-
621.
Tatsuno, I., Gottschall, P. E., Koves, K., & Arimura, A. (1990). Demonstration of
specific binding sites for pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in
rat astrocytes. Biochem.Biophys.Res.Commun. 168, 1027-1033.
Tatsuno, I., Somogyvari-Vigh, A., & Arimura, A. (1994). Developmental changes of
pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and its receptor in the rat
brain. Peptides 15, 55-60.
Tatsuno, I., Somogyvari-Vigh, A., Mizuno, K., Gottschall, P. E., Hidaka, H., & Arimura,
A. (1991b). Neuropeptide regulation of interleukin-6 production from the pituitary:
stimulation by pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and calcitonin gene-
related peptide. Endocrinology 129, 1797-1804.
Tatsuno, I., Yada, T., Vigh, S., Hidaka, H., & Arimura, A. (1992). Pituitary adenylate
cyclase activating polypeptide and vasoactive intestinal peptide increase cytosolic free
calcium concentration in cultured rat hippocampal neurons. Endocrinology 131, 73-81.
Telegdy, G. & Kokavszky, K. (2000). The action of pituitary adenylate cyclase
activating polypeptide (PACAP) on passive avoidance learning. The role of
transmitters. Brain Res. 874, 194-199.
Teng, B., Murthy, K. S., Kuemmerle, J. F., Grider, J. R., & Makhlouf, G. M. (1998).
Selective expression of vasoactive intestinal peptide (VIP)2/pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide (PACAP)3 receptors in rabbit and guinea pig gastric and tenia
coli smooth muscle cells. Regul.Pept. 77, 127-134.
Terenius, L. (1973). Stereospecific interaction between narcotic analgesics and a
synaptic plasm a membrane fraction of rat cerebral cortex. Acta Pharmacol. Toxicol.
(Copenh) 32, 317-320.

241
Terenius, L. & Wahlstrom, A. (1974). Inhibitor(s) of narcotic receptor binding in brain
extracts and cerebrospinal fluid. Acta Pharmacol. Toxicol. 35, 15.
Terwilliger, R. Z., Ortiz, J., Guitart, X., & Nestler, E. J. (1994). Chronic morphine
administration increases beta-adrenergic receptor kinase (beta ARK) levels in the rat
locus coeruleus. J Neurochem. 63, 1983-1986.
Thorat, S. N. & Bhargava, H. N. (1994). Evidence for a bidirectional cross-tolerance
between morphine and delta 9-tetrahydrocannabinol in mice. Eur J Pharmacol. 260, 5-
13.
Tognetto, M., Amadesi, S., Harrison, S., Creminon, C., Trevisani, M., Carreras, M.,
Matera, M., Geppetti, P., & Bianchi, A. (2001). Anandamide excites central terminals of
dorsal root ganglion neurons via vanilloid receptor-1 activation. J Neurosci. 21, 1104-
1109.
Torii, H., Tamaki, K., & Granstein, R. D. (1998). The effect of neuropeptides/hormones
on Langerhans cells. J Dermatol.Sci. 20, 21-28.
Tornwall, J., Uusitalo, H., Hukkanen, M., Sorsa, T., & Konttinen, Y. T. (1994).
Distribution of vasoactive intestinal peptide (VIP) and its binding sites in labial salivary
glands in Sjogren's syndrome and in normal controls. Clin.Exp.Rheumatol. 12, 287-
292.
Traynor, J. R., Hunter, J. C., Rodriguez, R. E., Hill, R. G., & Hughes, J. (1990). Delta-
opioid receptor binding sites in rodent spinal cord. Br J Pharmacol. 100, 319-323.
Trujillo, K. A., Bronstein, D. M., Sanchez, I. O., & Akil, H. (1995). Effects of chronic
opiate and opioid antagonist treatment on striatal opioid peptides. Brain Res. 698, 69-
78.
Tsou, K., Brown, S., Sanudo-Pena, M. C., Mackie, K., & Walker, J. M. (1998a).
Immunohistochemical distribution of cannabinoid CB1 receptors in the rat central
nervous system. Neuroscience 83, 393-411.
Tsou, K., Mackie, K., Sanudo-Pena, M. C., & Walker, J. M. (1999). Cannabinoid CB1
receptors are localized primarily on cholecystokinin-containing GABAergic interneurons
in the rat hippocampal formation. Neuroscience 93, 969-975.
Tsou, K., Nogueron, M. I., Muthian, S., Sanudo-Pena, M. C., Hillard, C. J., Deutsch, D.
G., & Walker, J. M. (1998b). Fatty acid amide hydrolase is located preferentially in
large neurons in the rat central nervous system as revealed by immunohistochemistry.
Neurosci.Lett. 254, 137-140.
Tsou, K., Patrick, S. L., & Walker, J. M. (1995). Physical withdrawal in rats tolerant to
delta 9-tetrahydrocannabinol precipitated by a cannabinoid receptor antagonist. Eur J
Pharmacol. 280, R13-R15.
Tsu, R. C., Lai, H. W., Allen, R. A., & Wong, Y. H. (1995). Differential coupling of the
formyl peptide receptor to adenylate cyclase and phospholipase C by the pertussis
toxin-insensitive Gz protein. Biochem.J 309 (Pt 1), 331-339.
Tsujii, T., Attardi, B., & Winters, S. J. (1995). Regulation of alpha-subunit mRNA
transcripts by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in pituitary
cell cultures and alpha T3-1 cells. Mol.Cell Endocrinol. 113, 123-130.
Tulunay, F. C., Ayhan, I. H., & Sparber, S. B. (1982). The effects of morphine and
delta-9-tetrahydrocannabinol on motor activity in rats. Psychopharmacology (Berl) 78,
358-360.
Tzavara, E. T., Davis, R. J., Perry, K. W., Li, X., Salhoff, C., Bymaster, F. P., Witkin, J.
M., & Nomikos, G. G. (2003). The CB1 receptor antagonist SR141716A selectively

242
increases monoaminergic neurotransmission in the medial prefrontal cortex:
implications for therapeutic actions. Br J Pharmacol 138, 544-553.
Tzavara, E. T., Perry, K. W., Rodriguez, D. E., Bymaster, F. P., & Nomikos, G. G.
(2001). The cannabinoid CB(1) receptor antagonist SR141716A increases
norepinephrine outflow in the rat anterior hypothalamus. Eur J Pharmacol 426, R3-R4.
Tzavara, E. T., Valjent, E., Firmo, C., Mas, M., Beslot, F., Defer, N., Roques, B. P.,
Hanoune, J., & Maldonado, R. (2000). Cannabinoid withdrawal is dependent upon PKA
activation in the cerebellum. Eur J Neurosci. 12, 1038-1046.
Uchida, D., Arimura, A., Somogyvari-Vigh, A., Shioda, S., & Banks, W. A. (1996).
Prevention of ischemia-induced death of hippocampal neurons by pituitary adenylate
cyclase activating polypeptide. Brain Res. 736, 280-286.
Uddman, R., Luts, A., Absood, A., Arimura, A., Ekelund, M., Desai, H., Hakanson, R.,
Hambreaus, G., & Sundler, F. (1991a). PACAP, a VIP-like peptide, in neurons of the
esophagus. Regul.Pept. 36, 415-422.
Uddman, R., Luts, A., Arimura, A., & Sundler, F. (1991b). Pituitary adenylate cyclase-
activating peptide (PACAP), a new vasoactive intestinal peptide (VIP)-like peptide in
the respiratory tract. Cell Tissue Res. 265, 197-201.
Ueda, N., Kurahashi, Y., Yamamoto, S., & Tokunaga, T. (1995). Partial purification and
characterization of the porcine brain enzyme hydrolyzing and synthesizing
anandamide. J Biol.Chem. 270, 23823-23827.
Uhl, G. R., Childers, S., & Pasternak, G. (1994). An opiate-receptor gene family
reunion. Trends Neurosci. 17, 89-93.
Ukai, M., Kobayashi, T., & Kameyama, T. (1993a). Dynorphin A-(1-13) attenuates
basal forebrain-lesion-induced amnesia in rats. Brain Res. 625, 355-356.
Ukai, M., Mori, K., Hashimoto, S., Kobayashi, T., Sasaki, Y., & Kameyama, T. (1993b).
Tyr-D-Arg-Phe-beta-Ala-NH2, a novel dermorphin analog, impairs memory
consolidation in mice. Eur J Pharmacol. 239, 237-240.
Ukai, M., Takada, A., Sasaki, Y., & Kameyama, T. (1997). Stimulation of delta1- and
delta2-opioid receptors produces amnesia in mice. Eur J Pharmacol. 338, 1-6.
Ulku, E., Ayhan, I. H., Tulunay, F. C., Uran, B., & Kaymakcalan, S. (1980). Effect of
delta 9-tetrahydrocannabinol on the morphine-induced hyperactivity of mice.
Psychopharmacology (Berl) 69, 201-205.
Usdin, T. B., Bonner, T. I., & Mezey, E. (1994). Two receptors for vasoactive intestinal
polypeptide with similar specificity and complementary distributions. Endocrinology
135, 2662-2680.
Vale, W., Spiess, J., Rivier, C., & Rivier, J. (1981). Characterization of a 41-residue
ovine hypothalamic peptide that stimulates secretion of corticotropin and beta-
endorphin. Science 213, 1394-1397.
Valjent, E. & Maldonado, R. (2000). A behavioural model to reveal place preference to
delta 9-tetrahydrocannabinol in mice. Psychopharmacology (Berl) 147, 436-438.
Valjent, E., Mitchell, J. M., Besson, M. J., Caboche, J., & Maldonado, R. (2002).
Behavioural and biochemical evidence for interactions between Delta 9-
tetrahydrocannabinol and nicotine. Br J Pharmacol. 135, 564-578.
Valjent, E., Pages, C., Rogard, M., Besson, M. J., Maldonado, R., & Caboche, J.
(2001). Delta 9-tetrahydrocannabinol-induced MAPK/ERK and Elk-1 activation in vivo
depends on dopaminergic transmission. Eur J Neurosci. 14, 342-352.

243
Valverde, O., Maldonado, R., Valjent, E., Zimmer, A. M., & Zimmer, A. (2000).
Cannabinoid withdrawal syndrome is reduced in pre-proenkephalin knock-out mice. J
Neurosci. 20, 9284-9289.
Valverde, O., Noble, F., Beslot, F., Dauge, V., Fournie-Zaluski, M. C., & Roques, B. P.
(2001). Delta9-tetrahydrocannabinol releases and facilitates the effects of endogenous
enkephalins: reduction in morphine withdrawal syndrome without change in rewarding
effect. Eur J Neurosci. 13, 1816-1824.
Van Ree, J. M. (1979). Reinforcing stimulus properties of drugs. Neuropharmacology
18, 963-969.
Van Ree, J. M. & Ramsey, N. (1987). The dopamine hypothesis of opiate reward
challenged. Eur J Pharmacol. 134, 239-243.
Vanderschuren, L. J. & Kalivas, P. W. (2000a). Alterations in dopaminergic and
glutamatergic transmission in the induction and expression of behavioral sensitization:
a critical review of preclinical studies. Psychopharmacology (Berl) 151, 99-120.
Vanderschuren, L. J. & Kalivas, P. W. (2000b). Alterations in dopaminergic and
glutamatergic transmission in the induction and expression of behavioral sensitization:
a critical review of preclinical studies. Psychopharmacology (Berl) 151, 99-120.
Varvel, S. A. & Lichtman, A. H. (2002). Evaluation of CB1 receptor knockout mice in
the Morris water maze. J Pharmacol.Exp.Ther. 301, 915-924.
Vaughan, C. W., Connor, M., Bagley, E. E., & Christie, M. J. (2000). Actions of
cannabinoids on membrane properties and synaptic transmission in rat periaqueductal
gray neurons in vitro. Mol.Pharmacol. 57, 288-295.
Vaughan, C. W., McGregor, I. S., & Christie, M. J. (1999). Cannabinoid receptor
activation inhibits GABAergic neurotransmission in rostral ventromedial medulla
neurons in vitro. Br J Pharmacol. 127, 935-940.
Vela, G., Ruiz-Gayo, M., & Fuentes, J. A. (1995). Anandamide decreases naloxone-
precipitated withdrawal signs in mice chronically treated with morphine.
Neuropharmacology 34, 665-668.
Vertongen, P., Schiffmann, S. N., Gourlet, P., & Robberecht, P. (1998).
Autoradiographic visualization of the receptor subclasses for vasoactive intestinal
polypeptide (VIP) in rat brain. Ann.N.Y.Acad.Sci. 865, 412-415.
Vigh, S., Arimura, A., Gottschall, P. E., Kitada, C., Somogyvari-Vigh, A., & Childs, G. V.
(1993). Cytochemical characterization of anterior pituitary target cells for the
neuropeptide, pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP), using
biotinylated ligands. Peptides 14, 59-65.
Vigh, S., Arimura, A., Koves, K., Somogyvari-Vigh, A., Sitton, J., & Fermin, C. D.
(1991). Immunohistochemical localization of the neuropeptide, pituitary adenylate
cyclase activating polypeptide (PACAP), in human and primate hypothalamus.
Peptides 12, 313-318.
Villalba, M., Bockaert, J., & Journot, L. (1997). Pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide (PACAP-38) protects cerebellar granule neurons from apoptosis by
activating the mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) pathway. J Neurosci. 17,
83-90.
Vogel, Z., Barg, J., Levy, R., Saya, D., Heldman, E., & Mechoulam, R. (1993).
Anandamide, a brain endogenous compound, interacts specifically with cannabinoid
receptors and inhibits adenylate cyclase. J Neurochem. 61, 352-355.
Wachtel, S. R. & de Wit, H. (2000). Naltrexone does not block the subjective effects of
oral Delta(9)-tetrahydrocannabinol in humans. Drug Alcohol Depend. 59, 251-260.

244
Wagner, J. A., Varga, K., Jarai, Z., & Kunos, G. (1999). Mesenteric vasodilation
mediated by endothelial anandamide receptors. Hypertension 33, 429-434.
Wagner, J. J., Terman, G. W., & Chavkin, C. (1993). Endogenous dynorphins inhibit
excitatory neurotransmission and block LTP induction in the hippocampus. Nature 363,
451-454.
Walter, L., Franklin, A., Witting, A., Wade, C., Xie, Y., Kunos, G., Mackie, K., & Stella,
N. (2003). Nonpsychotropic cannabinoid receptors regulate microglial cell migration. J
Neurosci. 23, 1398-1405.
Wang, B., Gonzalo-Ruiz, A., Sanz, J. M., Campbell, G., & Lieberman, A. R. (1999).
Immunoelectron microscopic study of gamma-aminobutyric acid inputs to identified
thalamocortical projection neurons in the anterior thalamus of the rat. Exp.Brain Res.
126, 369-382.
Wang, L., Liu, J., Harvey-White, J., Zimmer, A., & Kunos, G. (2003). Endocannabinoid
signaling via cannabinoid receptor 1 is involved in ethanol preference and its age-
dependent decline in mice. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 100, 1393-1398.
Wang, Z., Gardell, L. R., Ossipov, M. H., Vanderah, T. W., Brennan, M. B.,
Hochgeschwender, U., Hruby, V. J., Malan, T. P., Jr., Lai, J., & Porreca, F. (2001).
Pronociceptive actions of dynorphin maintain chronic neuropathic pain. J Neurosci. 21,
1779-1786.
Waschek, J. A., Bravo, D. T., & Richards, M. L. (1995). High levels of vasoactive
intestinal peptide/pituitary adenylate cyclase-activating peptide receptor mRNA
expression in primary and tumor lymphoid cells. Regul.Pept. 60, 149-157.
Watanabe, T., Masuo, Y., Matsumoto, H., Suzuki, N., Ohtaki, T., Masuda, Y., Kitada,
C., Tsuda, M., & Fujino, M. (1992). Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide
provokes cultured rat chromaffin cells to secrete adrenaline.
Biochem.Biophys.Res.Commun. 182 , 403-411.
Way, W. L., Fields, H. L., & Way, E. L. (1998). Opiod Analgesics and Antagonists. In
Basic and Clinical Pharmacology, ed. Katzung, B. G., pp. 505. Appleton-Lange.
Wei, E. (1973). Assessment of precipitated abstinence in morphine- dependent rats.
Psychopharmacologia. 28, 35-44.
Weidenfeld, J., Feldman, S., & Mechoulam, R. (1994). Effect of the brain constituent
anandamide, a cannabinoid receptor agonist, on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis
in the rat. Neuroendocrinology 59, 110-112.
Weisskopf, M. G., Zalutsky, R. A., & Nicoll, R. A. (1993). The opioid peptide dynorphin
mediates heterosynaptic depression of hippocampal mossy fibre synapses and
modulates long-term potentiation. Nature 362, 423-427.
Welch, S. P. (1993). Blockade of cannabinoid-induced antinociception by
norbinaltorphimine, but not N,N-diallyl-tyrosine-Aib-phenylalanine-leucine, ICI 174,864
or naloxone in mice. J Pharmacol.Exp.Ther. 265, 633-640.
Welch, S. P. (1994). Blockade of cannabinoid-induced antinociception by naloxone
benzoylhydrazone (NalBZH). Pharmacol.Biochem.Behav. 49, 929-934.
Welch, S. P. (1997). Characterization of anandamide-induced tolerance: comparison to
delta 9-THC-induced interactions with dynorphinergic systems. Drug Alcohol Depend.
45, 39-45.
Welch, S. P., Thomas, C., & Patrick, G. S. (1995). Modulation of cannabinoid-induced
antinociception after intracerebroventricular versus intrathecal administration to mice:
possible mechanisms for interaction with morphine. J Pharmacol.Exp.Ther. 272, 310-
321.

245
Wenger, T., Jamali, K. A., Juaneda, C., Leonardelli, J., & Tramu, G. (1997).
Arachidonyl ethanolamide (anandamide) activates the parvocellular part of
hypothalamic paraventricular nucleus. Biochem.Biophys.Res.Commun. 237, 724-728.
Whistler, J. L., Chuang, H. H., Chu, P., Jan, L. Y., & von Zastrow, M. (1999). Functional
dissociation of mu opioid receptor signaling and endocytosis: implications for the
biology of opiate tolerance and addiction. Neuron 23, 737-746.
Whistler, J. L. & von Zastrow, M. (1998). Morphine-activated opioid receptors elude
desensitization by beta-arrestin. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 95, 9914-9919.
Wiley, J., Balster, R., & Martin, B. (1995). Discriminative stimulus effects of
anandamide in rats. Eur J Pharmacol. 276, 49-54.
Williams, J. T., Christie, M. J., & Manzoni, O. (2001). Cellular and synaptic adaptations
mediating opioid dependence. Physiol Rev 81, 299-343.
Willner, P. (1997). Validity, reliability and utility of the chronic mild stress model of
depression: a 10-year review and evaluation. Psychopharmacology (Berl) 134, 319-
329.
Willner, P. (2003). Dopamine D2/D3 receptors as a potential target for antidepressant
drug action. Clin Neuropharmacol 18, S49-S56.
Wilson, R. I., Kunos, G., & Nicoll, R. A. (2001). Presynaptic specificity of
endocannabinoid signaling in the hippocampus. Neuron 31, 453-462.
Wilson, R. I. & Nicoll, R. A. (2001). Endogenous cannabinoids mediate retrograde
signalling at hippocampal synapses. Nature 410, 588-592.
Winters, S. J., Dalkin, A. C., & Tsujii, T. (1997). Evidence that pituitary adenylate
cyclase activating polypeptide suppresses follicle-stimulating hormone-beta messenger
ribonucleic acid levels by stimulating follistatin gene transcription. Endocrinology 138,
4324-4329.
Wise, R. A. & Bozarth, M. A. (1985). Brain mechanisms of drug reward and euphoria.
Psychiatr.Med. 3, 445-460.
Wong, A. O., Leung, M. Y., Shea, W. L., Tse, L. Y., Chang, J. P., & Chow, B. K. (1998).
Hypophysiotropic action of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)
in the goldfish: immunohistochemical demonstration of PACAP in the pituitary, PACAP
stimulation of growth hormone release from pituitary cells, and molecular cloning of
pituitary type I PACAP receptor. Endocrinology 139, 3465-3479.
Wood, P. L., Stotland, M., Richard, J. W., & Rackham, A. (1980). Actions of mu, kappa,
sigma, delta and agonist/antagonist opiates on striatal dopaminergic function. J
Pharmacol.Exp.Ther. 215, 697-703.
Wray, V., Kakoschke, C., Nokihara, K., & Naruse, S. (1993). Solution structure of
pituitary adenylate cyclase activating polypeptide by nuclear magnetic resonance
spectroscopy. Biochemistry 32, 5832-5841.
Wray, V., Nokihara, K., Naruse, S., Ando, E., Kakoschke, C., & Wei, M. (1995).
Synthesis, solution structure and biological action of PACAP-related peptide.
Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids 1, 77-82.
Xie, W., Samoriski, G. M., McLaughlin, J. P., Romoser, V. A., Smrcka, A., Hinkle, P.
M., Bidlack, J. M., Gross, R. A., Jiang, H., & Wu, D. (1999). Genetic alteration of
phospholipase C beta3 expression modulates behavioral and cellular responses to mu
opioids. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 96, 10385-10390.

246
Xie, X., Liaw, J. S., Baudry, M., & Berger, T. W. (1997). Novel expression mechanism
for synaptic potentiation: alignment of presynaptic release site and postsynaptic
receptor. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 94, 6983-6988.
Yada, T., Sakurada, M., Ihida, K., Nakata, M., Murata, F., Arimura, A., & Kikuchi, M.
(1994). Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide is an extraordinarily potent
intra-pancreatic regulator of insulin secretion from islet beta-cells. J Biol.Chem. 269,
1290-1293.
Yaksh, T. L. & Rudy, T. A. (1977). Studies on the direct spinal action of narcotics in the
production of analgesia in the rat. J Pharmacol.Exp.Ther. 202, 411-428.
Yamaguchi, N. & Lamouche, S. (1999). Enhanced reactivity of the adrenal medulla in
response to pituitary adenylate cyclase activating polypeptide1-27 (PACAP) during
insulin-induced hypoglycemia in anesthetized dogs. Can.J Physiol Pharmacol. 77, 819-
826.
Yamamoto, K., Hashimoto, H., Hagihara, N., Nishino, A., Fujita, T., Matsuda, T., &
Baba, A. (1998). Cloning and characterization of the mouse pituitary adenylate cyclase-
activating polypeptide (PACAP) gene. Gene 211, 63-69.
Yamamoto, T. & Tatsuno, I. (1995). Antinociceptive effect of intrathecally administered
pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) on the rat formalin test.
Neurosci.Lett. 184, 32-35.
Yamauchi, K., Murakami, Y., Nishiki, M., Tanaka, J., Koshimura, K., & Kato, Y. (1995).
Possible involvement of vasoactive intestinal polypeptide in the central stimulating
action of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide on prolactin secretion in the
rat. Neurosci.Lett. 189, 131-134.
Yon, L., Breault, L., Contesse, V., Bellancourt, G., Delarue, C., Fournier, A., Lehoux, J.
G., Gallo-Payet, N., & Vaudry, H. (1998). Pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide receptors in the fetal human adrenal gland. Ann.N.Y.Acad.Sci. 865, 416-
419.
Yon, L., Feuilloley, M., Chartrel, N., Arimura, A., Conlon, J. M., Fournier, A., & Vaudry,
H. (1992). Immunohistochemical distribution and biological activity of pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in the central nervous system of the
frog Rana ridibunda. J Comp Neurol. 324, 485-489.
Yuwiler, A., Brammer, G. L., & Bennett, B. L. (1995). Interaction between adrenergic
and peptide stimulation in the rat pineal: pituitary adenylate cyclase-activating peptide.
J Neurochem. 64, 2273-2280.
Zadina, J. E., Hackler, L., Ge, L. J., & Kastin, A. J. (1997). A potent and selective
endogenous agonist for the mu-opiate receptor. Nature 386, 499-502.
Zhang, J., Ferguson, S. S., Barak, L. S., Bodduluri, S. R., Laporte, S. A., Law, P. Y., &
Caron, M. G. (1998a). Role for G protein-coupled receptor kinase in agonist-specific
regulation of mu-opioid receptor responsiveness. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 95, 7157-
7162.
Zhang, Y., Danielsen, N., Sundler, F., & Mulder, H. (1998b). Pituitary adenylate
cyclase-activating peptide is upregulated in sensory neurons by inflammation.
Neuroreport 9, 2833-2836.
Zhang, Y., Malmberg, A. B., Sjolund, B., & Yaksh, T. L. (1996a). The effect of pituitary
adenylate cyclase activating peptide (PACAP) on the nociceptive formalin test.
Neurosci.Lett. 207, 187-190.
Zhang, Y. Z., Hannibal, J., Zhao, Q., Moller, K., Danielsen, N., Fahrenkrug, J., &
Sundler, F. (1996b). Pituitary adenylate cyclase activating peptide expression in the rat

247
dorsal root ganglia: up-regulation after peripheral nerve injury. Neuroscience 74, 1099-
1110.
Zhang, Y. Z., Sjolund, B., Moller, K., Hakanson, R., & Sundler, F. (1993). Pituitary
adenylate cyclase activating peptide produces a marked and long-lasting depression of
a C-fibre-evoked flexion reflex. Neuroscience 57, 733-737.
Zhou, C. J., Shioda, S., Shibanuma, M., Nakajo, S., Funahashi, H., Nakai, Y., Arimura,
A., & Kikuyama, S. (1999). Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptors
during development: expression in the rat embryo at primitive streak stage.
Neuroscience 93, 375-391.
Zhou, C. J., Shioda, S., Yada, T., Inagaki, N., Pleasure, S. J., & Kikuyama, S. (2002).
PACAP and its receptors exert pleiotropic effects in the nervous system by activating
multiple signaling pathways. Curr.Protein Pept.Sci. 3, 423-439.
Zhu, Y., King, M. A., Schuller, A. G., Nitsche, J. F., Reidl, M., Elde, R. P., Unterwald,
E., Pasternak, G. W., & Pintar, J. E. (1999). Retention of supraspinal delta-like
analgesia and loss of morphine tolerance in delta opioid receptor knockout mice.
Neuron 24, 243-252.
Zimmer, A., Valjent, E., Konig, M., Zimmer, A. M., Robledo, P., Hahn, H., Valverde, O.,
& Maldonado, R. (2001). Absence of delta -9-tetrahydrocannabinol dysphoric effects in
dynorphin-deficient mice. J Neurosci. 21, 9499-9505.
Zimmer, A., Zimmer, A. M., Hohmann, A. G., Herkenham, M., & Bonner, T. I. (1999).
Increased mortality, hypoactivity, and hypoalgesia in cannabinoid CB1 receptor
knockout mice. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 96, 5780-5785.
Zito, K. A., Vickers, G., & Roberts, D. C. (1985). Disruption of cocaine and heroin self-
administration following kainic acid lesions of the nucleus accumbens.
Pharmacol.Biochem.Behav. 23, 1029-1036.
Zuardi, A. W., Shirakawa, I., Finkelfarb, E., & Karniol, I. G. (1982). Action of cannabidiol
on the anxiety and other effects produced by delta 9-THC in normal subjects.
Psychopharmacology (Berl) 76, 245-250.
Zupan, V., Hill, J. M., Brenneman, D. E., Gozes, I., Fridkin, M., Robberecht, P., Evrard,
P., & Gressens, P. (1998). Involvement of pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide II vasoactive intestinal peptide 2 receptor in mouse neocortical
astrocytogenesis. J Neurochem. 70, 2165-2173.

248