Revista Colombiana de Química

ISSN: 0120-2804
orodriguez@unal.edu.co
Universidad Nacional de Colombia
Colombia

Rodríguez L., Danny; Díaz M., Amanda C.; Ahumada, Diego A.; Guerrero, Jairo A.
DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE UNA METODOLOGÍA MULTIRESIDUO POR MÉTODO
SIMPLEX PARA EL ANÁLISIS DE PLAGUICIDAS EN MIEL DE ABEJAS
Revista Colombiana de Química, vol. 42, núm. 1, 2013
Universidad Nacional de Colombia
Bogotá, Colombia

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=309032108002

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 DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE UNA METODOLOGÍA

MULTIRESIDUO POR MÉTODO SIMPLEX PARA EL ANÁLISIS DE

PLAGUICIDAS EN MIEL DE ABEJAS

DEVELOPMENT AND OPTIMIZATION OF A MULTI-RESIDUE METHOD

FOR PESTICIDE ANALYSIS IN HONEY BEE USING SIMPLEX METHOD

DESENVLOVIMIENTOE OTIMIZAÇÃO DE UMA METODOLOGIA DE

RESÍDUOS MÚLTIPLOS PARA O MÉTODO SIMPLEX PARA A ANÁLISE DE

PESTICIDAS EM ABELHAS

Danny Rodríguez L.1,Amanda C. Díaz M.2, Diego A. Ahumada1, Jairo A.

Guerrero1,3,

RESUMEN

La aplicación de plaguicidas en cultivos cercanos a las zonas de producción apícola

puede afectarla supervivencia de las abejas y la calidad de los productos derivados de la

colmena, por lo cual es de gran importancia realizar estudios de residualidad de estos

agroquímicos en mieles yen otros productos apícolas. Para esto es indispensable

desarrollar metodologías que permitan el análisis de estos contaminantes en productos

apícolas. Este trabajo muestra los resultados en el desarrollo y optimización de una

metodología multiresiduo para el análisis de 30 plaguicidas, incluyendo plaguicidas

organoclorados, organofosforados y piretroides en miel de abejas. El método consistió

1
Laboratorio de Análisis de Residuos de Plaguicidas. Departamento de Química. Universidad Nacional
de Colombia. Bogotá D.C., Colombia.
2
Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos-ICTA. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá
D.C., Colombia.
3
Autor de correspondencia: jaguerreod@unal.edu.co
en una extracción líquido-líquido, seguida de un paso de limpieza en fase solida usando

una columna cargada con silica gel/florisil. El análisis de los plaguicidas fue realizado

por cromatografía de gases con detectores de nitrógeno fósforo (NPD) y microcaptura

electrónica (µ-ECD).La optimización de las variables experimentales presentes en los

pasos de pre-tratamiento, extracción y limpieza se realizó mediante el empleo del

método simplex modificado. Con este fin, se escogieron 14 variables las cuales se

optimizaron en 21 experimentos. Los resultados mostraron que los porcentajes de

recuperación obtenidos para la mayoría de los plaguicidas se encuentran entre el 78.8%

y el 114.5%, con coeficientes de variación inferiores al 20%.

Palabras claves:Miel, contaminación, plaguicidas, Simplex

ABSTRACT

Pesticide application near to beekeeping areas can affect the survival of the bees and the

quality of the products derived of the hive, therefore it is of great importance to assess

the residual of these agrochemicals in honey and other bee products. So many methods

have been developed for determining pesticide residues in honey samples. Thus, a

multi-residue method to determine 30 pesticides, including organochlorine pesticides,

organophosphorus pesticides, and pyrethroids in honey bee has been developed and

optimized. The method is based on a liquid–liquid extraction followed by a clean-up

step on a silica gel/florisil solid-phase column. Pesticides were determined by

gaschromatography with micro-electron capture detection (µ-ECD) and

nitrogenphosphorus detection (NPD). The optimization process was performed using

the modified simplex method, to make this 14 variables were chosenand the

optimization was conducted in 21 experiments. The results indicated that the method

presents recoveries between 78.8 and114.5% and coefficients of variation below 20%.
Keywords: Honey, pollution, pesticides, Simplex.

RESUMO

A aplicação de pesticidas em áreas de cultivo próximos a apicultura pode afetar a

sobrevivência das abelhas ea qualidade dos produtos da colmeia, por isso é muito

importante estudar o efeito residual destes produtos químicos no mel e outros produtos

apícolas. Para isso é essencial para o desenvolvimento de metodologias para a análise de

contaminantes em produtos de abelha. Este documento mostra os resultados para o

desenvolvimento e optimização de um método de resíduos múltiplos para a análise de

30 pesticidas, incluindo pesticidas organoclorados, organofosforados e piretróides mel.

O método consistiu em uma extracção líquido-líquido, seguido por uma etapa de

limpeza, usando uma coluna de fase sólida, cheia de gel de sílica / florisil. Análise de

pesticidas foi realizada por cromatografia gasosa com detector de nitrogênio e fósforo

(NPD) e microcaptura eletrônico (μ-ECD). A optimização das variáveis experimentais

presentes nas etapas de pré-tratamento, de extracção e limpeza foi efectuada por

utilização do método simplex modificado. Para o efeito, foram escolhidas 14 variáveis

que foram optimizadas em 21 experiências. Os resultados mostraram que as

recuperações obtidas para a maioria dos pesticidas estão entre 78,8% e 114,5%, com

coeficientes de variação inferiores a 20%.

Palavras-chave: Mel, poluição, agrotóxicos Simplex.

INTRODUCCIÓN

En la actualidad, la contaminación ambiental es una de las áreas de mayor investigación

por parte de la comunidad científica, así como uno de los principales temas de discusión

en las diferentes organizaciones y/o entidades gubernamentales, que día a día emiten
nuevas legislaciones en pro de la conservación de los recursos naturales y la protección

de la flora y fauna. Adicionalmente, la creciente importancia por el consumo de

productos inocuos ha inducido a que muchos grupos de investigación centren sus

esfuerzos en evaluar la presencia de contaminantes en los alimentos de origen

agropecuario, a través de una amplia variedad de herramientas analíticas desarrolladas

para identificar y cuantificar la presencia de estas moléculas en dichas matrices.

Los alimentos de origen natural como los productos apícolas, además de hacer parte de

la dieta humana, son empleados como bioindicadores ambientales, debido a que se ha

demostrado por diversos estudios, que las abejas en el proceso de recolección de néctar

transportan una amplia variedad de contaminantes presentes en la zona, los cuales son

almacenados y concentrados en la colmena (1). En consecuencia, los productos

derivados de la colmena como la mielse contaminan con residuos de diversos

plaguicidas (2). Adicionalmente, el uso de productos químicos en la colmenautilizados

para el control de enfermedades, es otra fuente importante de contaminantes en los

productos apícolas(1, 3). De esta manera, para impedir que mieles contaminadas afecten

a los consumidores, algunas organizaciones han establecido límites máximos de

residuos para un extenso número de plaguicidas en este alimento(4).

Este panorama ha promovido el desarrollo de métodos multiresiduo que permitan la

determinación simultánea de más de un residuo en una extracción simple, reduciendo el

tiempo de análisis y el consumo de solventes (3, 5). Para obtener el mejor desempeño de

una metodología multiresiduo es indispensable realizar la optimización de las variables

experimentales involucradas. Para este fin, se pueden emplear métodos de optimización

auto-dirigidos como el método simplex, el cual permite estudiar y optimizar un proceso

de extracción multiresiduo que involucre más de una variable experimental, teniendo en

cuenta las posibles interacciones que existan entre las mismas; con un número de

ensayos razonable, respecto a otros métodos de optimización (6).

El método simplex, ha sido utilizado ampliamente para la optimización inequívoca de

diferentes procedimientos analíticos; particularmente en casos en que existe una

interdependencia de las variables que se desean optimizar. En comparación con otros

métodos de optimización basados en diseños experimentales o superficies de respuestas,

el método simplex generalmente permite llegar al punto óptimo de forma más simple y

rápida. Motivos por los cuales este método ha sido empleado exitosamente en la

optimización de diversos sistemas, tales como: condiciones de operación de

instrumentación analítica (7), métodos de separación cromatográfica(8), cristalización

de proteínas (9), extracción de contaminantes en suelos mediante fluidos supercríticos

(10), entre otros.

De esta manera, el presente trabajo describe los resultados obtenidos en el desarrollo de

una metodología multiresiduo para el análisis de plaguicidas en miel de abejas y

posterior optimización mediante el método simplex. La metodología se basa en una

extracción con metanol/acetato de etilo, limpieza con florisil/silica y análisis

cromatográfico por GC/μ-ECD/NPD.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales de referencia, reactivos y soluciones.

Se trabajó con estándares de plaguicidas de pureza mayor al 95%, proveniente de las

casas comerciales Dr. Ehrenstorfer y Chemservice. Las soluciones madre fueron

preparadas en concentraciones cercanas a 1000 µg/mL en acetato de etilo y

almacenadas en frascos ámbar a -20 ºC. La mezcla de plaguicidas se preparó tomando

diferentes volúmenes de cada una de las soluciones madre hasta obtener las

concentraciones que se presentan en la Tabla 1. Esta solución se almacenó en un frasco

ámbar a -20 ºC. Los solventes empleados en este estudio fueron J.T. Baker grado HPLC

y grado residuos.El florisil y la silica empleados corresponden a grado residuos (60-100

mesh), activados previamente con calentamiento a 150 °C por 4 horas. El sulfato de

sodio anhidro (12-60 mesh) igualmente fue secado a 150 °C por 4 horas.

Tabla 1. Concentración de la solución de plaguicidas empleada en el estudio.

Concentración Concentración
Compuesto Compuesto
μg mL-1 μg mL-1
4,4’-DDD 0,72 Endosulfan β 0,78
4,4’-DDT 0,62 Fenitrotion 0,80
Acefato 26,65 Folpet 5,45
α-HCH 0,72 Flumetrina 5,28
Azoxixtrobin 6,14 τ-Fluvalinato 3,54
β-HCH 0,62 Heptenofos 11,44
Cimoxanil 19,53 Hexaconazol 1,44
Cipermetrina 3,19 Malation 1,42
Clorotalonil 0,26 Metalaxil 17,90
Clorpirifos 1,25 Metamidofos 7,78
Cumafós 3,66 Monocrotofos 12,49
Diclorvos 5,71 Parationmetil 1,01
Difenoconazol 3,20 Profenofos 0,30
Dimetoato 0,92 Propargite 154,18
Endosulfan α 0,78 Tiabendazol 45,65

Instrumentos y equipos

La extracción se realizó en un agitador de rotación universal marca Heidolph modelo

Reax-2. La determinación y cuantificación de los plaguicidas se realizó en un

cromatógrafo de gases HP6890 plus, equipado con un inyector automático 7683 Agilent

Technologies (Palo Alto, CA, EE.UU.) con control electrónico de presión y un inyector

split/splitless, el cual se conectó a través de una columna capilar sin fase estacionaria (1

m; 0.32 mm d.i) a un divisor de flujo de cuarzo en forma de “Y”, unido a una columna

capilar HP-5 (30 m; 0.32 mm d.i.; 0.25 μm) acoplada a un detector de micro-captura

electrónica 63Ni (μ-ECD) y a una columna capilar HP-50 (30 m; 0.32 mm d.i.; 0.25 μm)

acoplada a un detector de nitrógeno-fosforo (NPD) en paralelo. Las condiciones de

operación fueron: gas de transporte nitrógeno, volumen de inyección 2 μL, temperatura

del inyector de 256 °C, inyección en modo splitless pulsado con presión de pulso de 152

kPa durante 0.8 min, tiempo de purga de 0.6 min y flujo de purga de 40 mL/min. La

temperatura del detector μ-ECD fue de 310 °C con flujo de gas auxiliar (nitrógeno) de

10 mL/min. El detector NPD se trabajó a 330 °C con flujos constantes de gas auxiliar

(nitrógeno), hidrógeno y aire de 3,10 y 60 mL/min, respectivamente. El programa de

temperatura del horno inició a 52 ºC (0 min), incrementándose la temperatura a una

velocidad de 4 ºC/min hasta alcanzar 100 ºC, consecutivamente se aumentó la

temperatura hasta 110 ºC a 2 ºC/min, a continuación se incrementó hasta 130 ºC a una

velocidad de 20 ºC/min, luego se llevó hasta 195 ºC a 4 ºC/min y finalmente se llegó a

una temperatura de 280 ºC a una velocidad de 5 ºC/min.

Desarrollo de la metodología

Para los estudios realizados, se utilizó una muestra blanco compuesta por mieles

provenientes de cuatro regiones de Colombia. Estas muestras de miel fueron cosechadas

dentro de las regiones en estudio donde las aplicaciones de plaguicidas son muy bajas o

nulas. Igualmente, estas mieles fueron analizadas por cromatografía de gases y se

confirmó que no presentaban presencia de ninguno de los plaguicidas en estudio.

Para la fortificación de las muestras, se pesó 1,000 g de miel blanco en un tubo de fondo

cónico de 50 mL, se adicionaron 32 µL de la mezcla de plaguicidas que se presenta en

la Tabla 1, posterior a ello se dejaron las muestras en reposo por un tiempo de 20 min,

con el propósito de permitir la evaporación del solvente.

Pre-tratamiento:Esta etapa consistía en disolver la miel con el propósito de reducir su

viscosidad y mejorar la extracción de los plaguicidas. Para esto, se ensayó la adición de

diferentes cantidades de metanol, 1 mL de agua, 1mL de buffer de citratos (pH 5,5 y

concentración de 0,15 g/mL) y/o 1mL de buffer de citratos (pH 5,5 y concentración de

0,15 g/mL) con cloruro de sodio (0,5g/mL).

Extracción:Se realizaron diferentes ensayos en los que se evaluaron varias fases

extractantes, tales como acetato de etilo, metanol, hexano o mezclas acetato de etilo: n-

hexano (3:2, 4:1) y acetato de etilo: metanol (4:1, 1:1 y 1:4); en esta evaluación se encontró

que la fase extractante que mejores resultados ofrecía corresponde al acetato de etilo,

asimismo en estos ensayos se encontró que al realizar una doble extracción se obtiene el

mayor número de compuestos con porcentajes de recuperación superiores al 70% (11). De

esta manera, la extracción se realizó como se detalla a continuación: l a primera extracción

se realizó con 10 mL de acetato de etilo, y agitación mecánica por 15 min. Posterior a

ello, se centrifugó la mezcla de extracción y se recolectó la fase orgánica en un balón

pera. Para la segunda etapa de extracción se adicionó 5 mL acetato de etilo y se dejó

nuevamente en agitación. Se centrifugó la mezcla de extracción y se recolecto la fase

orgánica para ser combinada con el extracto de la primera extracción. Se concentró la

mezcla en rota-evaporador hasta obtener aproximadamente 1mL de extracto y se

adicionó 2 g de sulfato de sodio anhidro.

Limpieza: La limpieza de los extractos se realizó mediante el empleo de dos técnicas, la

primera correspondió a cromatografía de permeación en gel (CPG), cuyas condiciones

se encuentran reportadas en otros estudios (12). La segunda técnica que se empleó

correspondió a cromatografía clásica en columna (CCC), para lo cual se evaluaron

diferentes fases móviles y diferentes fases adsorbentes. El procedimiento general para

esta técnica se detalla a continuación: al interior de una columna de vidrio con llave

para el control del flujo y un tapón de algodón ubicado en la parte inferior, se

adicionó10 mL de n-hexano. A continuación se adicionóen la columna 2 g de sulfato de

sodio anhidro, 2,0 g de fase estacionaria (sílica gel desactivada y/o florisil) y 3 g de

sulfato de sodio anhidro, de tal forma que no quedaran burbujas de aire. El n-hexano en

exceso se expulsóde la columna sin permitir que la fase sólida se secará. Se cargó la

columna con el extracto orgánico y se eluyó con la fase móvil a evaluar. El extracto se

concentró en el rota-evaporador hasta alcanzar un volumen aproximado de 0,2 mL y

luego se llevó a un volumen de 1,0 mL.

Optimización de la metodología.

La construcción del simplex de partida se realizó con base a los resultados

experimentales obtenidos a partir de los ensayos realizados en el desarrollo de la

metodología, siguiendo el método descrito en la literatura (7, 13). La Tabla 2 muestra

las variables experimentales seleccionadas (k = 14), el tamaño de paso y las condiciones

de referencia utilizadas para la construcción del simplex de partida.

Tabla 2. Variables estudiadas, rangos, condiciones de partida y tamaño de paso

empleados para la construcción del simplex.

Condición Tamaño
Etapa Variable Parámetro experimental Unidades Rango
de partida de paso
A pH - 5,5 5-7 0,5
Pre- B Vol. de Buffer
mL 1 0-5 0,5
tratamient Citratos
o C Conc. buffer Citratos g/mL 0,15 0-1 0,1
D Vol. de metanol mL 1,5 0-3 0,5
Extracción E Vol. de AcOEt mL 10 0 - 30 1
1 F Tiempo de extracción min. 15 5 - 60 3
G Vol. de metanol mL 1,5 0-3 0,5
Extracción
H Vol. de AcOEt mL 5 0 - 30 1
2
I Tiempo de extracción min. 15 5 - 60 3
J Masa de silica g 1 0-5 1
K Desactivación de la
Limpieza % 15 0 - 70 2
silica
L Masa de florisil g 1 0-5 1
 M Vol. de hexano mL 7 0 - 20 2
N Vol. de AcOEt mL 7 0 - 20 2

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Desarrollo de la metodología: pre-tratamiento y extracción.

En el caso de la miel de abejas, algunos reportes de literatura concuerdan que durante el

proceso de extracción líquido-líquido (ELL), es posible aumentar el porcentaje de

recuperación de un amplio número de plaguicidas (14).Una de las principales opciones

consiste en la disolución previa de la miel de abejas en agua o en metanol. En este

sentido, se decidió ensayar la adición de metanol en el paso de pre-tratamiento con el

propósito de mejorar la recuperación de algunos compuestos, respecto a los

resultadosobtenidos de la ELL directa con diversos solventes(11). La Figura 1, presenta

un resumen de los resultados obtenidos en el pre-tratamiento con metanol previo a la

extracción para los 30 plaguicidas bajo estudio en miel.

La Figura 1, muestra que la adición de metanol durante el paso de pre-tratamiento de la

miel, aumenta el número de plaguicidas extraídos con porcentajes de recuperación entre

el 70% y el 120%. Esto se debe a la reducción de la viscosidad de la miel cuando es

disuelta en metanol, lo cual facilita el contacto entre la matriz y el solvente de

extracción; adicionalmente, la presencia de metanol durante el proceso de extracción,

aumenta la polaridad de la fase extractante, lo cual permite recuperar un mayor número

de plaguicidas polares y medianamente polares. La Figura 1 muestra que los mejores

desempeños se alcanzaron al usar 3 mL de metanol, siendo más eficiente la adición de

1,5 mL de metanol antes de la primera extracción y 1,5 mL de metanol antes de la

segunda extracción.Por último, se observa que adiciones superiores a 3 mL de metanol

generan un descenso en el número de plaguicidas recuperados, lo cual es atribuido a la

co-extracción de compuestos de la matriz que interfieren en la detección medianteμ-

ECD que impiden identificar y cuantificar algunos plaguicidas como 4,4’-DDT,

heptenofos, diclorvos, cimoxanil, α-HCH, β-HCH, dimetoato, clorotalonil,

metilparation yprofenofos.

Estos ensayos presentan un bajo desempeño en la extracción de los plaguicidas

organoclorados, razón por la cual se decidió realizar una modificación en la constante

dieléctrica del medio en la etapa de pre-tratamiento. Esta modificación se realizó

mediante la adición de 1 mL de agua, 1 mL de buffer de citratos (pH 5,5 y

concentración de 0,15 g/mL) y 1mL de buffer de citratos (pH 5,5 y concentración de

0,15 g/mL) con cloruro de sodio (0,5 g/mL), de igual manera, estos resultados se

presentan en la Figura 1.

Adicionalmente, la Figura 1 permite observar que los pre-tratamientos con agua y con

buffer citratos/NaCl mostraron un buen desempeño, sin embargo, la extracción con

buffer citratoofreció el mayor número de plaguicidas con porcentajes de recuperación

entre 70% -120%. Esto se atribuye a que la adición del buffer regula el pH y evita

pérdidas por hidrólisis de algunos plaguicidas, los cuales, en general son estables bajo

condiciones similaresen un rango de pH entre 5 y 7, adicionalmente, esta fase reduce la

viscosidad de la miel lo cual facilita el proceso de transporte de los plaguicidas desde la

matriz hasta la fase extractante.

De esta manera, la metodología de pre-tratamiento y la extracción incluyen la adición de

1,5 mL de metanol previo a la adición del acetato de etilo (en cada una de las etapas), la

adición de 1 mL de buffer de citratos (pH = 5,5 y Concentración= 0,15 g/mL), adición

de 10 mL de acetato de etilo en la primera extracción, agitación durante 15 min,

centrifugación, una segunda extracción con 5 mL de acetato de etilo, agitación por 15

min y centrifugación. Finalmente se reúnen los dos extractos de acetato de etilo, se

concentran hasta aproximadamente 1 mL en un evaporador rotatorio y se someten al

proceso de limpieza.

Bajo las condiciones desarrolladas previamente, se presentaron algunos inconvenientes

tales como la pérdida de los plaguicidas polares heptenofos, diclorvos, metamidofos,

acefato, cimoxanil y monocrotofos, al igual, que dificulta la identificación y

cuantificación de los compuestos organoclorados α-HCH, β-HCH, endosulfan α y

endosulfan β por la elución de interferentes.De esta manera, se decidió implementar un

proceso de limpieza con el propósito de reducir algunas de estas limitaciones.

Desarrollo de la metodología: limpieza.

En análisis de residuos de plaguicidas, la limpieza de los extractos previo al análisis

instrumental es uno de los pasos determinantes en el desarrollo de una metodología

analítica. Las técnicas más empleadas para esta etapa corresponden a la extracción

líquido-líquido (ELL), extracción en fase sólida (EFS), cromatografía en columna

clásica CCC y cromatografía de permeación en geles(CPG). Debido a la constante

dieléctrica del acetato de etilo y la diversidad de propiedades fisicoquímicas de los

analitos, se decidió no emplear la ELLcomo método de limpieza, pues es una de las

técnicas que presentan menor eficiencia(15). Por otro lado, la EFS con cartuchos se

descartó por los costos que implican, pues no se pueden emplear fases estacionarias

convencionales, sino que de acuerdo a previas publicaciones se emplean fases

estacionarias modificadas(15-17). Por lo cual, se decidió evaluar la CPG y la CCC

como técnicas de limpieza.

Los resultados mostraron que mediante CPG se obtenían porcentajes de recuperación

aceptables para la mayoría de los plaguicidas evaluados, sin embargo en el detector de

µ-ECD se presentaba una gran cantidad de interferentes que imposibilitan el análisis de

algunos compuestos como: heptenofos, diclorvos, cimoxanil, α-HCH, β-HCH

dimetoato, clorotalonil, clorpirifos, metilparation y fenitrotion; por lo cual el empleo de

CPG fue descartado.

La evaluación de CCC se realizó para diferentes combinaciones de fase estacionaria y

fase móvil, las cuales se escogieron de acuerdo a reportes de literatura (3, 14, 18).

Algunas de las fases móviles ensayadas corresponden a: acetonitrilo, n-hexano, acetato

de etilo, mezclas de acetato de etilo/n-hexano y acetato de etilo/metanol. El mejor

desempeño durante la evaluación de la limpieza por CCC se obtuvo al realizar la

elución con 15 mL de acetato de etilo/n-hexano (1: 1). La Figura 2, resume los

resultados de los diferentes ensayos de limpieza. Esta figura muestra que: i) las tres

fases estacionarias permiten obtener porcentajes de recuperación en el rango de

aceptación de la unión europea, no obstante, la fase estacionaria conformada por

Silica/Florisil (1: 1) presenta un mayor número de compuestos con porcentajes de

recuperación dentro de este rango, en comparación con las demás fases; ii) el número de

compuestos con porcentajes de recuperación entre 70% y 120% obtenidos con CPG es

el más bajo, debido al gran número de interferencias presentes durante la evaluación

cromatográfica; iii) el desempeño de la silica durante la limpieza es ligeramente inferior

al del florisil, esto se debe a que esta última fase estacionaria es capaz de retener un

mayor contenido de moléculas polares, entre estos los azucares.

De acuerdo a los resultados mostrados en la Figura 2, el mayor número de compuestos

con mejores porcentajes de recuperación se obtienen al emplear 2 g de florisil/silica(1:1)

como fase estacionaria y 15 mL de n-hexano-acetato de etilo (1:1)como solvente de

elución.

Finalmente, como resultado de los experimentos llevados a cabo en el desarrollo de la

metodología, las tres fases que la componen son: i) pre-tratamiento de la miel, el cual

consiste en la disolución de la miel en buffer citratosy en metanol, ii) Extracción 1 y 2,

realizadas con acetato de etilo y asistidas con agitación mecánica; y iii) limpieza por

CCC, empleando florisil y silica gel desactivada como fase estacionaria y n-hexano:

acetato de etilo como fase móvil para la elución

Optimización de la metodología.

Como se mencionó anteriormente, mediante los ensayos realizados en la etapa de

desarrollo del método, se logró establecer las variables de mayor impacto en el

desempeño de la metodología, al igual que las condiciones iniciales para construir el

simplex de partida.

De esta forma, la Tabla 2 muestra las 14 variables incluidas en la optimizaciónde los

tres pasos analíticos. Enesta tabla es posible observar que lostamaños de paso

empleados para las diferentes variables fueron establecidos de tal manera que el

desplazamiento en el sistema fuera moderado, debido a que los ensayos preliminares

realizados durante el desarrollo de la metodología multiresiduo indicaron que se estaba

trabajando a condiciones cercanas al punto óptimo, pues se estaban recuperando la

mayoría de los plaguicidas, sin embargo el método presentaba coeficientes de variación

altos y un gran número de interferentes en la detección por µ-ECD.

En la Tabla 3 se muestran los 15 experimentos que conforman el simplex de partida, al

igual que las proyecciones resultantes realizadas durante el proceso de optimización de

la metodología.
Tabla 3. Valores experimentales que conformaron los vértices del simplex para el

proceso de optimización de la metodología multiresiduo para analizar plaguicidas en

miel.

Proceso PRE-TRATAMIENTO EXTRACCIÓN 1 EXTRACCIÓN 2 LIMPIEZA

Variables A B C D E F G H I J K L M N
Vértices - mL g/mL mL mL min mL mL min g % g mL mL
S1 5,5 1,0 0,15 1,5 10,00 15,0 1,5 5 15,0 1 15 1 7 7
S2 5,9 1,1 0,16 1,57 10,15 15,4 1,57 5,15 15,4 1,15 15,29 1,15 7,3 7,3
S3 5,6 1,4 0,16 1,57 10,15 15,4 1,57 5,15 15,4 1,15 15,29 1,15 7,3 7,3
S4 5,6 1,1 0,24 1,57 10,15 15,4 1,57 5,15 15,4 1,15 15,29 1,15 7,3 7,3
Simplex de partida SI

S5 5,6 1,1 0,16 1,93 10,15 15,4 1,57 5,15 15,4 1,15 15,29 1,15 7,3 7,3
S6 5,6 1,1 0,16 1,57 10,85 15,4 1,57 5,15 15,4 1,15 15,29 1,15 7,3 7,3
S7 5,6 1,1 0,16 1,57 10,15 17,6 1,57 5,15 15,4 1,15 15,29 1,15 7,3 7,3
S8 5,6 1,1 0,16 1,57 10,15 15,4 1,93 5,15 15,4 1,15 15,29 1,15 7,3 7,3
S9 5,6 1,1 0,16 1,57 10,15 15,4 1,57 5,85 15,4 1,15 15,29 1,15 7,3 7,3
S10 5,6 1,1 0,16 1,57 10,15 15,4 1,57 5,15 17,6 1,15 15,29 1,15 7,3 7,3
S11 5,6 1,1 0,16 1,57 10,15 15,4 1,57 5,15 15,4 1,85 15,29 1,15 7,3 7,3
S12 5,6 1,1 0,16 1,57 10,15 15,4 1,57 5,15 15,4 1,15 16,70 1,15 7,3 7,3
S13 5,6 1,1 0,16 1,57 10,15 15,4 1,57 5,15 15,4 1,15 15,29 1,85 7,3 7,3
S14 5,6 1,1 0,16 1,57 10,15 15,4 1,57 5,15 15,4 1,15 15,29 1,15 8,7 7,3
S15 5,6 1,1 0,16 1,57 10,15 15,4 1,57 5,15 15,4 1,15 15,29 1,15 7,3 8,7
Sn Sw
S16 S15 5,6 1,1 0,17 1,61 10,23 15,7 1,61 5,23 15,7 1,23 15,45 1,23 7,4 5,8
Reflexiones

S17 S3 5,6 0,7 0,17 1,62 10,24 15,7 1,62 5,24 15,7 1,24 15,47 1,24 7,5 7,0
S18 S1 5,7 1,1 0,19 1,71 10,42 16,2 1,71 5,42 16,2 1,42 15,83 1,42 7,8 7,3
S19 S13 5,7 1,0 0,18 1,65 10,31 15,9 1,65 5,31 15,9 1,31 15,62 0,50 7,6 7,0
S20 S5 5,7 1,0 0,18 1,25 10,31 15,9 1,65 5,31 15,9 1,31 15,62 1,31 7,6 7,0
S21 S8 5,7 1,0 0,19 1,45 10,39 16,2 1,70 5,39 16,2 1,39 15,78 1,39 7,8 6,9
A: pH; B: Volumen Buffer Citratos; C: Concentración buffer Citratos; D y G: Volumen de metanol; E, H y N: Volumen de AcOEt;
F e I: Tiempo de extracción; J: Masa de silica; K: Desactivación de la silica; L: Masa de florisil; M: Volumen de hexano.
Sn: Vértices producto de la reflexión; Sw: Vértices descartados por baja respuesta

Para la optimización con simplex, es fundamental definir una respuesta que permita

evaluar los diferentes ensayos y así, continuar con las proyecciones correspondientes

(6). De esta manera la expresión 1, corresponde a la respuesta empleada para evaluar

cada uno de los vértices del simplex.

(1)

En la ecuación 1, N, es el número de plaguicidas extraídos con porcentaje de

recuperación entre el 70% y el120%, el cual es el criterio de aceptación del documento

SANCO de la Unión Europea para el análisis de residuos de plaguicidas en

alimentos(19); Pr, es el valor promedio del porcentaje de recuperación de los

plaguicidas extraídos y R, es el ruido normalizado obtenido al dividir el ruido

cromatográfico de los blancos de miel, por el ruido cromatográfico del acetato de etilo

en los rangos de tiempo que eluyen los plaguicidas. Como se observa en la ecuación 1,

la respuesta del simplex es adimensional.

La ecuación 1 muestra que cada uno de los términos incluidos en esta respuesta

permiten evaluar algún parámetro de interés. Por ejemplo, como se trata de una

extracción multiresiduo se hace necesario tener una medida del número de compuestos

que el método pueda extraer adecuadamente, por lo cual se incluyó el término N. Por

otro lado, como el rango de 70% a 120% resulta muy amplio, se adicionó a la ecuación

el promedio de los porcentajes de recuperación obtenidos, así al tratarse de una

optimización, se tiene en cuenta el número de plaguicidas recuperados yla eficiencia del

método para extraer dichos compuestos. Finalmente, se decidió incluir el ruido presente

en los perfiles cromatográficosdebido a que por la baja especificidad y selectividad del

detector µ-ECD los compuestos presentes en la miel que se coextraen, generalmente

ocasionan interferencias en la detección. De esta manera, mediante la inclusión de esta

relación de ruidos se asegura que se obtenga un método más específico, lo que a su vez

asegura unos mejores límites de detección.

En la Figura 3 se muestra la respuesta obtenida para cada vértice efectuado, después de

realizar la extracción e inyección cromatográfica del simplex de partida. La Figura 3,

muestra que solamente lospuntos S3y S15 exhiben una respuesta inferior a la obtenida

para el punto de partida S1. Esto indica que la adición de un alto volumen de buffer en

la extracción (Ver Tabla 3, S3) o un aumento considerable de la polaridad de la fase de

elución durante la limpieza (Ver Tabla 3, S15), reducen la eficiencia de estas dos etapas

experimentales.

De igual manera, en la Figura 3 se puede observar que la respuesta obtenida paralas

reflexiones supera en valor de cualquiera de los vértices del simplex de partida.

Además, la reflexión S16 aumentó la respuesta al doble, si se compara con el punto de

partida S1. Esto implica que los movimientos del simplex generaron una mejora

considerable del sistema.A pesar de esto, los últimos 5 experimentos no presentaron una

tendencia creciente, por lo cual se decidió detener el simplexen el vértice S21 y tomar las

condiciones experimentales de S16 como las condiciones definitivas para el método

multiresiduo.

Evaluación de la optimización.

La evaluación de la optimización se realizó comparando los resultados obtenidos para

las condiciones experimentales de partida contra las condiciones determinadas en el

vértice S16 (Ver Tabla 3). De esta manera, el primer punto a comparar corresponde a la

especificidad de la metodología, la Figura 4 muestra los cromatógramas obtenidos para

la muestra blanco mediante las dos condiciones mencionadas.

La Figura 4muestra como en el vértice S16 se redujo considerablemente el número de

interferencias presentes en el detector μ-ECD,siendo notable para los tiempos de

retención entre 10 minutos y 32 minutos. Este cambio indica que el simplex permitió

obtener una mejora en el paso de limpieza del método multiresiduo. Esta reducción de

coeluyentes en el análisis instrumental tiene un impacto directo en los valores obtenidos

para los límites de detección y cuantificación de la metodología, al igual, que reduce

considerablemente el deterioro del sistema cromatográfico, pues la miel es una matriz

con un alto contenido de carbohidratos y otros compuestos que suelen acumularse en el

sistema de inyección (20).

Las Figuras 5 y 6 muestran los porcentajes de recuperación y los coeficientes de

variación de los plaguicidas obtenidos bajo las condiciones experimentales de partida y

las condiciones que generaron la mejor respuesta S16. En la Figura 5 se observa que

mediante el método optimizado se logró obtener porcentajes de recuperación dentro del

rango de aceptación del documento SANCO para los plaguicidas cimoxanil, α-HCH, β-

HCH,endosulfan α, profenofos, endosulfan β, fenitrotion y difenoconazol. Así mismo,

se mejoró considerablemente la recuperación de los plaguicidas organoclorados 4,4’-

DDD y 4,4’-DDT en comparación con el método inicial. Por otro lado, en la Figura 5,

se encuentra que compuestos muy polares como acefato, diclorvos, heptenofos,

monocrotofos y metamidofos presentaron recuperaciones bajas, lo cual se atribuye a su

alta polaridad; sin embargo, al comparar los valores obtenidos se encuentra que en todos

los casos mediante el método optimizado se obtienen mayores recuperaciones, respecto

a las condiciones de partida.

Finalmente, la Figura 6 muestra que para la mayoría de los casos, a excepción de

dimetoato y profenofos, se presentan coeficientes de variación más bajos mediante el

método optimizado. Asimismo, se observa que para algunos compuestos como

cimoxanil, metamidofos, metilparatión, entre otros, mediante la optimización se logran

disminuir los coeficientes de variación a valores inferiores al 20%, criterio de

aceptación de la Unión Europea.

CONCLUSIONES.
Se desarrolló una metodología multiresiduo para el análisis de plaguicidas en miel

basada en una doble extracción con acetato de etilo y limpieza mediante cromatografía

clásica de columna, empleando como fase estacionaria una mezcla de sílica-florisil

(1:1). El análisis de los extractos se realizó mediante cromatografía de gases con

detectores NPD y -ECD en paralelo.

La optimización mediante el método simplex permitió determinar las condiciones

experimentales capaces de duplicar el desempeño del método de extracción en

comparación con las condiciones de partida. Para este fin se requirieron 21 ensayos,

dentro de los cuales, 6 correspondieron a movimientos de proyección. El experimento

S16 mostró los mejores resultados respecto a especificidad, precisión y exactitud, puesto

que se logró una reducción de la cantidad de interferentes en el análisis instrumental,

aumentaron los porcentajes de recuperación para 9 de 30 plaguicidas y disminuyeron

los coeficientes de variación para 25 de los 30 plaguicidas extraídos. Finalmente,

después de la optimización el método multiresiduo permite el análisis adecuado de 27

de los 30 plaguicidas extraídos en miel.

AGRADECIMIENTOS

Expresamos nuestros agradecimientos al proyecto “Selección de Indicadores

Fisicoquímicos Mediante Aplicación de Nariz Electrónica para la Catalogación de

Productos Apícolas” financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo

Rural.

BIBLIOGRAFÍA

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20.Walorczyk, S.,Gnusowski, B. Development and validation of a multi-residue method
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23
22
21 21
20 20
18 18
16

13

1,5 / 0,5 1,5 / 1,0 1,5 / 1,5 1,5 / 2,0 2,0 / 1,0 2,0 / 1,5 2,0 / 2,0 1,5 / 1,5 1,5 / 1,5 1,5 / 1,5
1,0 Agua 1,0 Buffer 1,0
Buffer/NaCl
Volumen de Metanol (mL) y fases acuosas
Pre-tratamiento 1 / Pre-tratamiento 2

Figura 1. Número de plaguicidas con porcentajes de recuperación entre el 70 y 120%

en función de la adición de metanol y de agua, buffer citratos y buffer citratos/NaCl

para el pre-tratamiento del proceso de extracción.

 86,7%
80,0%
76,7%
71,0%

CPG CCC Silica CCC Florisil CCC Silica/Florisil (1:1)

Figura 2. Porcentajes de plaguicidas con porcentajes de recuperación entre 70 y 120%,

obtenidos para cada uno de los ensayos de limpieza mediante CPG y CCC.

35

30

25
Respuesta simplex

20

15

10

0
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21

Puntos del simplex

Figura 3. Respuesta obtenida para los diferentes ensayos realizados en la optimización

por método simplex (n=3).

 % de Recuperación

100
120
140

0
20
40
60
80
Heptenofos µECD

simplex.
Diclorvos µECD
Diclorvos NPD
Metamidofos NPD
Cimoxanil µECD
Punto S1
Punto S16

Acefato NPD
α-HCH µECD
β-HCH µECD
metilparation µECD
Fenitrotion µECD
Monocrotofos NPD
Malation µECD
Clorpirifos µECD
Dimetoato NPD
Folpet µECD
Endosulfan α µECD
Metil paration NPD
Metalaxil NPD
Hexaconazol µECD
Clorpirifos NPD
Profenofos µECD

Condiciones de Partida
Fenitrotion NPD
Malation NPD
Endosulfan β µECD

S16
4,4´-DDD µECD
4,4´-DDT µECD
Profenofos NPD
Propargite µECD
Tiabendazol NPD
Cipermetrina µECD
Difenoconazol µECD
Azoxistrobin µECD
Difenoconazol NPD
Fluvalinato I ECD

metodología inicial y la optimizada mediante simplex (Señales por µ-ECD y NPD).

Cumafos NPD
Flumetrina I ECD

Figura 5. Comparación de los porcentajes de recuperación obtenidos para la

Figura 4.Cromatógramas(μ-ECD) de condiciones iniciales y óptimas determinado con
 % de Coeficiente de variación

0
5
10
15
20
25
30
35

Heptenofos µECD
Diclorvos µECD
Diclorvos NPD
Metamidofos NPD
Cimoxanil µECD
Acefato NPD
α-HCH µECD
β-HCH µECD
metilparation µECD
Fenitrotion µECD
Monocrotofos NPD
Malation µECD
Clorpirifos µECD
Dimetoato NPD
Folpet µECD
Endosulfan α µECD
Metil paration NPD
Metalaxil NPD
Hexaconazol µECD
Clorpirifos NPD
Profenofos µECD
Condiciones de Partida

Fenitrotion NPD
Malation NPD
Endosulfan β µECD
S16

4,4´-DDD µECD
4,4´-DDT µECD
Profenofos NPD
Propargite µECD
inicial y la optimizada mediante simplex (Señales por µ-ECD y NPD).

Tiabendazol NPD
Cipermetrina µECD
Difenoconazol µECD
Azoxistrobin µECD
Difenoconazol NPD
Fluvalinato I ECD
Cumafos NPD
Flumetrina I ECD
Figura 6. Comparación de los coeficientes de variación obtenidos para la metodología