El aceite de soja (Glycine max (L.

) Merrill) representa actualmente el segundo mercado de

aceites vegetales más grande del mundo, con aproximadamente el 30% de la producción
mundial (USDA 2017). En los tejidos de reserva de las semillas de soja, el aceite se acumula
principalmente en forma de triacilglicerol (TAG). Los principales constituyentes de los ácidos
grasos de los TAG de soja son:

ácido palmítico (16: 0) - 13%, ácido esteárico (18: 0) - 4%, ácido oleico (18: 1 Δ9) - 18%, ácido
linoleico (18: 2 Δ9,12) - 55% y linolénico ácido (18: 3 Δ9,12,15) - 10%.

La alta concentración de ácidos grasos poliinsaturados (linoleico y linolenicácidos) reduce la

estabilidad oxidativa del aceite de soja. Los procesos de oxidación disminuyen la calidad
sensorial de los aceites vegetales y el tiempo de almacenamiento de la materia prima y los
productos derivados (Regitano Neto et al. 2016). La baja estabilidad oxidativa del aceite de
soja también afecta la producción de biodiesel. El combustible producido a partir de aceite con
una alta concentración de ácidos grasos poliinsaturados tiene un bajo índice de cetano y un
mayor valor de yodo, lo que reduce la calidad tecnológica del biodiesel (Knothe 2007). Por lo
tanto, hay un gran interés en el desarrollo de cultivares de soja con

ácidos linoléicos y linoleicos bajos (Knothe 2007, Santos et al. 2013).

Aunque la herencia del contenido de ácidos grasos se trata de manera cuantitativa, se logran
modificaciones genéticas

por selección de genes principales (Pinto et al. 2013). La enzima ω-3 desaturasa es responsable
de la síntesis de 18: 3 mediante el uso de

ácido linoleico como sustrato para agregar una insaturación a la cadena de carbono en la
posición Δ9 (Baud y Lepiniec 2010). Los genes de la familia GmFAD3A, GmFAD3B y GmFAD3C
codifican esta enzima. Diferentes combinaciones de mutaciones en estos tres genes pueden
producir soja con un bajo nivel de ácido linolénico (1%) (Bilyeu et al. 2011).

Los marcadores moleculares asociados con los genes de desaturasa se usan ampliamente en la
selección de genotipos con contenido reducido

de ácido linolénico (Bilyeu et al. 2005, 2006, 2011). Una eliminación detectada en el gen
FAD3A derivado de la línea A5 permite

Detección del alelo mutante para el bajo contenido de ácido linolénico (Bilyeu et al. 2005).
Bilyeu et al. (2006) identificaron el polimorfismo de singlenucleótido (SNP) en los genes FAD3B
y FAD3C de la línea A29. Desarrollaron marcadores codominantes para la detección alélica
mediante RFLP-PCR. Sin embargo, este proceso es costoso, requiere más tiempo y no permite
pruebas paralelas, por lo que solo es posible caracterizar un locus por ensayo.

Hayden et al. (2009) describen la reacción en cadena de la polimerasa de cambio de

temperatura (PTS) como un método rápido para el genotipado

SNP. TSP utiliza la amplificación por PCR basada en la hibridación con cebadores específicos de
alelos para la discriminación de alelos por agarosa

electroforesis en gel. Las pruebas de marcadores TSP se realizan de forma rápida y con poca
tecnología, lo que permite el uso de información SNP

en programas de mejoramiento para la selección asistida por marcadores (MAS). Por lo tanto,
este estudio fue desarrollado para identificar y validar.
SNP en genes candidatos asociados con el contenido de ácidos grasos de soja. Además, los
marcadores TSP fueron diseñados para la discriminación de alelos con el objetivo de aplicar
MAS para reducir los ácidos grasos poliinsaturados en la soja.

Mariales y metodos

Se seleccionaron cuatro genes candidatos (ABI3, FAD2-1B, ARAF y PDAT) en función de su

relación con la síntesis y regulación del contenido de ácidos grasos en la soja (Heppard et al.
1996, Wei et al. 2008, Baud y Lepiniec 2010) . La búsqueda in silico para la selección de
secuencias de cada gen candidato se basó en los siguientes criterios: (i) ser una sola copia o un
máximo de dos copias; (ii) valor e presente igual o cercano a cero; y iii) proporcionar anotación
funcional en Phytozome. Además, utilizamos los genes GmFAD3B y GmFAD3C que codifican las
desaturasas ω-3 asociadas con la acumulación de ácido linolénico en la soja.

Las secuencias parciales de genes candidatos o genes homólogos se compilaron de GenBank.

Secuencias genéticas completas (regiones promotoras, elementos reguladores, regiones
terminadoras, intrones y exones), incluidos los genes GmFAD3B (Glyma02g39230) y GmFAD3C
(Glyma18g06950), se determinaron realizando. El procedimiento BLASTn (Herramienta de
búsqueda básica de alineación local) en la base de datos de Phytozome.

Los cebadores para la amplificación de fragmentos de genes candidatos se diseñaron

utilizando el Programa de Entrada de Primera. Los amplicones que comprenden las regiones
reguladoras 5 'UTR y 3' UTR se utilizaron para investigar los polimorfismos de los genes
candidatos ABI3 (Glyma08g47240.1 y Glyma18g38490), ARAF (Glyma19g30450.1 y
Glyma03g27460.2) y PDAT (Glyma13g16790.1 y Glyma03g27460.2) ). Se diseñaron cinco
conjuntos de cebadores para amplificar y secuenciar todo el gen FAD2-1B (Glyma20g24530.1).
Utilizamos el mismo conjunto de cebadores descrito por Bilyeu et al. (2006) para la
amplificación de los genes GmFAD3B (Glyma02g39230) y GmFAD3C (Glyma18g06950). Los
cebadores se diseñaron de acuerdo con los siguientes parámetros: i) el fragmento a amplificar
varía de 600 a 1000 pb; ii) tamaño del cebador de 18 a 23 pb; iii) Temperatura de recocido de
59 ° C a 61 ° C; y iv) contenido de GC del 40% al 60%.

El volumen final de la reacción de PCR se ajustó a 30 µL utilizando 1U Platinum®Taq ADN

polimerasa, TrisHCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 0,2 µM
de cada cebador y 30 ng de plantilla de ADN. La plantilla de ADN utilizada se obtuvo de los
padres A29, Tucunaré, FA22 y CD219RR, como se describe a continuación. Los pasos del ciclo
de PCR se realizaron en un termociclador Eppendorff (AG-22331) en las siguientes condiciones:
paso inicial de desnaturalización a 94 ° C durante 2 min, seguido de 35 ciclos de 94 ° C durante
30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 60 segundos. Los productos
generados por amplificación se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa (1,7%)
que contenía bromuro de etidio (0,2 µg mL-1) y se fotografiaron bajo luz UV utilizando el
sistema L-PIX (Loccus Biotechnology, São Paulo, Brasil).
Se desarrollaron dos poblaciones segregantes para los niveles de ácido oleico y linolénico para
la asociación del SNP con la soja.

Contenido de ácidos grasos. La primera población obtenida del cruce entre FA22 x CD219
consistió en 259 recombinantes

Líneas endogámicas (RILs) en la generación F6. La segunda población, formada por 185 líneas
F2: 3, se obtuvo del cruce A29 x Tucunaré. El genotipo A29 (1% de ácido linolénico) se obtuvo
por hibridación y selección de cepas mutantes para bajo contenido de ácido linolénico (Ross et
al. 2000). La línea FA22 se seleccionó para niveles más altos de ácido oleico (~ 50%) (Altet al.
2005). CD219RR y Tucunaré (cultivares adaptados a las condiciones en el centro de Brasil)
tienen ácido linolénico y ácido oleico

Concentraciones del 8% y 19%, respectivamente. Toda la progenie y las líneas parentales se

cultivaron en un invernadero bajo control

Condiciones de temperatura y humedad. Las prácticas de cultivo fueron las mismas que las
recomendadas para el cultivo.

Los tejidos de las hojas se recolectaron de los padres, la progenie F2 (A29 x Tucunaré) y los RIL
(FA22 x CD219) 15 días después de la siembra. Para la extracción de ADN genómico, utilizamos
el método propuesto por Doyle y Doyle (1990). La concentración y la calidad del ADN se
determinaron utilizando el espectrofotómetro NanoDrop (NanoDrop Technologies,
Wilmington, DE, EE. UU.).

El ADN obtenido se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para la evaluación de la

calidad. Basado en el estimado concentración, las muestras se diluyeron a una concentración
final de 15 ng μL-1.

Sobre la base de los polimorfismos SNP identificados en los genes ABI3, ARAF, FAD2-1, FAD3B
y FAD3C, se diseñaron cebadores TSP para el genotipado en las poblaciones de estudio
(Hayden et al. 2009). Los cebadores TSP fueron diseñados con la ayuda de los programas
Primer 3 y Primer Select. Las reacciones de TSP se realizaron en 15 µl que contenían
Platinum®Taq 1U ADN polimerasa, Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, 1,5 mM MgCl2, 0,1 µg
μL-1 de albúmina de suero bovino, Tween-20 al 0,01%, formador de 1,0%, 0.2 mM de cada
dNTP (dATP, dTTP, dGTP y dCTP), cebador específico de sitio de 0.083 µM, 0.83 µM de cebador
informativo y 30 ng de ADN de plantilla. Las reacciones de PCR se realizaron en un
termociclador Eppendorff (modelo AG-22331).

Para la PCR, utilizamos un paso inicial a 94 ° C durante 2 minutos, seguido de 10 ciclos a 94 ° C

durante 30 segundos, 58 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 60 segundos; 5 ciclos a 94 °
C durante 10 segundos y 45 ° C durante 30 segundos; y 15 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos,
53 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 5 segundos. Los productos obtenidos se
visualizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% que contenía bromuro de etidio (0,2 µg
mL-1) bajo UV usando el sistema L-PIX.