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CURSO 2016
-
TRANSFORMACION DE CLOROPLASTOS
- Métodos de transformación
- Vectores
- Sistemas de selección
Transformación
de cloroplastos
La teoría de la endosimbiosis explica el origen de los plástidos
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Elysia chlorotica
Endosimbiosis secundaria
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Estructura del cloroplasto
Espacio
núcleo apoplástico
pared
vacuola
cloroplasto
citosol
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Microscopía de un cloroplasto
Los genomas
plastídico
y nuclear de
Arabidopsis Las líneas en verde
muestran las
thaliana proteínas de origen
contienen
procariota.
genes
Las líneas rojas
muestran el destino
de origen de las proteínas
codificada en el
bacteriano núcleo. Los números
entre paréntesis en
negro indican el
número total de
proteínas con un
determinado destino
y en verde las de
origen procariota.
Transformación
de cloroplastos
Transformación
de cloroplastos
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Mecanismos de importación de proteínas al cloroplasto
- Estroma
- Membrana tilacoidea
- Lumen
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Estructura del genoma plastídico
• Es un genoma circular
de ~120 a 160 Kb.
• Tiene alrededor de 150
genes codificados
en ambas cadenas.
• Los genes pueden
clasificarse en dos grupos:
- Genes involucrados
en la fotosíntesis
- Genes involucrados
en los procesos
de replicación, transcripción
y traducción
• Posee genes organizados
en operones.
Organización de los
genomas plastídicos de
distintas especies
vegetales
Tomados de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Flujo de la información genética en el cloroplasto
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Los genes platídicos son transcriptos por dos tipos de polimerasas: una monomérica
codificada por el genoma nuclear, y una multimérica codificada por el genoma plastídico.
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Flujo de la información genética en el cloroplasto
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
El flujo de la
información
genética
es regulado
a distintos
niveles
Transformación
de cloroplastos
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
El flujo de la
información
genética
es regulado
a distintos
niveles
Regulación
de la síntesis
proteica en el
cloroplasto
Transformación
de cloroplastos
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Regulación de la síntesis proteica en el cloroplasto
Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Ingeniería genética en cloroplastos
Transformación
de cloroplastos
El genoma
plastídico
se puede
transformar por
ADN pt
homóloga
ADN pt transformado
transformación:
comercial
(izquierda) y
biobalística
detalles del
dispositivo de
impulsión de los
microproyectiles
(abajo)
Transformación
de cloroplastos
Métodos de
transformación:
transformación
de protoplastos
Transformación
de cloroplastos
Se obtiene
homoplastía
por sucesivas
rondas de
regeneración
en medio de
selección
Transformación
de cloroplastos
Transformación
de cloroplastos
La homoplastía se obtiene por sucesivas rondas
de regeneración en medio de selección
Primera ronda de regeneración
Planta
transplastómica
Especies vegetales en que se logró
la transformación de plástidos
Diseños opcionales:
Genes selectores usados en la transformación de plástidos
Genes selectores: betaína aldehido deshidrogenasa
BADH
betaína aldehido glicinabetaína
a b c d e f
(aphA-6)
50 75 100
Colonias derivadas de protoplastos Selección no estricta Selección estricta
en distintas concentraciones de (5 semanas de cultivo (5 semanas de cultivo
kanamicina (mg/L) . en kanamicina 25 mg/L). en kanamicina 50 mg/L).
Control no Control no
transgénico transgénico
plCF637 plCF637
Transformación plCF599
de cloroplastos plCF6061
Estrategia:
Reconstituir el fenotipo fotosintético
en plantas mutantes deficientes en
Transformación
de cloroplastos
fotosíntesis (DpetA, Dycf3 y DrpoA)
por transformación de cloroplastos
(selección fenotípica). Planta DrpoA reconstituída
Tomado de: Klaus et al., The Plant Journal, 2003. fenotípicamente normal.
Eliminación
de genes
Deleciones observadas
selectores por
recombinación
P1
P1 y T1:
secuencias
cortas repetidas
directas
Transformación
de cloroplastos
replicación
+
recombinación
recombinación
asistida por Cre
Plastídico Nuclear
Correcto
Plegamiento y formación
Correcto (pasando por retículo
de puentes disulfuro
endoplasmático)
Glicosilación NO SI
Aplicaciones / Genes expresados
Transformación
de cloroplastos
Aplicaciones biotecnológicas
de la transformación de cloroplastos
La transformación Albúmina sérica humana (HSA)
de cloroplastos - Constituye el 60% de la proteína total en el suero.
permite
- Es la proteína intravenosa más usada para reemplazar volúmen
sobrexpresar sanguíneo en situaciones de trauma.
y simplificar - Actualmente es obtenida de la sangre.
la purificación - Se expresó en sistemas microbianos y en plantas transgénicas
de albúmina (transformación nuclear) y se obtuvieron muy bajos niveles proteicos.
sérica humana - La HSA es muy susceptible a la degradación proteolítica en los sistemas
recombinantes y su purificación es muy costosa.
Prrn
aadA HSA
Construcciones empleadas
Prrn SD 3´psbA
para transformar cloroplastos
de Nicotiana tabacum.
ó
Transformación
de cloroplastos aadA HSA
pLDApsbAHSA
pLDApsbAHSA
pLDApsbAHSA
pLDApsbAHSA
pLDApsbAHSA
500 ng HSA
parcialmente
pzrcialmente
al comienzo
40 ng HSA
purificado
purificado
control
control
control
C D
MM
97 KDa
97 KDa 66 KDa
66 KDa HSA
Inmunodetección de HSA en
extractos vegetales
LSU
45 KDa
SDS-Page
revelado con plata
Tomado de: Fernandez-San Millán et al., Plant Biotechnology Journal, 2003
Producción de hormona de crecimiento humana (hGH)
en cloroplastos de tabaco
Transformación
de cloroplastos Tomado de: Staub et al., Nature Biotechnology, 2000.
antimicrobiano
- Participan en el control de la flora bacteriana normal
y en la defensa contra patógenos.
para el control - Fueron aislados de diversos organismos (batracios, insectos,
de bacterias
células de mamíferos).
- El péptido MS1-99 es un análogo de la magainina-2
y hongos secretado por la piel del anuro Xenopus laevis.
Orf131
trnI 16SrDNA trnV rps12
Orf70B
TransgénicaT0 No transformada
Se cuantificó por DO el crecimiento bacteriano Se inocularon las hojas con distinto número
T1 y T2: generaciones de plantas transgénicas de células de Pseudomanas syringae pv tabaci;
10A, 11A y 13A: líneas de plantas transgénicas. se evaluaron los síntomas a los 5 días.
Expresión plastídica de un péptido antimicrobiano
para el control de bacterias y hongos fitopatógenos
Ensayos in vitro de actividad
antifúngica de extractos vegetales Resistencia antifúngica in planta
No transformada Transgénica
Resultados:
Se obtuvieron altos niveles de expresión
de la toxina (aproximadamente 2-3 % de peso
total soluble) asociados a una alta tasa de
mortalidad (~100 %) para Heliothis virescens,
Helicoverpa zea y Spodoptera exigua en los
ensayos de infestación.
- Se expresaron policistrones
conteniendo estos genes en
cloroplastos para aumentar la
acumulación de entomotoxina.
Cristales de Cry2Aa2
en cloroplastos
Tomado de: De Cosa et al., Nature Biotechnology, 2000.
aadA
Prrn TpsbA
Selección primaria de Propagación de líneas
callos de tomate de tomate resistentes a
Acumulación de aadA en hojas, frutos verdes y rojos
resistentes a espectinomicina
espectinomicina
(maduros) de plantas transplastómicas de tomate
C D
Frutos
Hojas verdes rojos
Nt control
Le control
Le control
Nt iycf9
Le-aadA
Le-aadA
Le-aadA
Le-aadA
Le-aadA
Le control
Le-aadA
D. extracelular D. citoplasmático
1 22 1033 1053 1207
ss hEGF Tr N-glic. pre-pro-hEGF
(114 Kda)
971 53 1023
Nicotiana tabacum
cloroplasto
155.393 pb
Sitio de inserción
Secuencias flanqueantes
Procesamiento y splicing del operon de los ARN ribosomales
Plásmidos para la transformación de
cloroplastos de tabaco
Sac II Sac II
16S
Prrn 16S Prrn
aadA aadA
5’ UTR
pBSWGUS RBS
(psbA) pBSWUTRGUS 5’ UTR Nde I
Nde I
(8163 pb) (8357 pb)
uidA uidA
M WT Nu R1 R3 R5 R1 BSA
0,1 1 2 ug
SUBUNIDAD
MAYOR
RUBISCO
Northern blot
Southern blot
<
<
VP- βGUS
Rubisco L
<
<
p135-160
VP5* VP8*
Rotavirus
bovino
VP8*
Inmunización y
desafío
Anticuerpos en las hembras
Protección de
los lactantes
Otras aplicaciones de la transformación
de cloroplastos
Transformación
de cloroplastos
RESISTENCIA A PATOGENOS
Transformación de plástidos de tabaco con genes antimicrobianos
Construcciones utilizadas
Ensayos en invernáculo con Rizoctonia solani
wt GUS
Rhizoctonia solani
Peronospora hyoscyami
f. sp. tabacina
Phytophthora parasitica
var. nicotianae
Biomasa del patógeno
qPCR
Rhizoctonia solani
Peronospora hyoscyami
f. sp. tabacina
Phytophthora parasitica
var. nicotianae
AP15 Glu4 Glu7 Der21 AP/Glu6 AP/Glu2 AP/Glu7 Der/Glu5 Gus PH/WT
María Eugenia Segretin
Mauro Miguel Morgenfeld
Ezequiel Matías Lentz
Federico Alfano
Sonia Wirth INGEBI-CONICET
Noelia Boccardo
Federico Mirkin
Fernando Bravo Almonacid
María
María José
José Dus
Dus Santos
Santos INTA-CASTELAR
INTA-CASTELAR
Marina Valeria Moz Instituto
Marina Mozgovoj Instituto de
de Virología
Virología
Demian
Demian Bellido
Bellido
Andrés Wigdorovitz
Andrés Wigdorovitz
Ingrid Hernández
Osmany Chacón CIGB-HABANA-CUBA
Yunior López
Orlando Borrás-Hidalgo
CIGB