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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

CARLA GIANE LOSS

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO PARA


QUANTIFICAÇÃO DE COCAÍNA E METABÓLITOS EM UNHAS POR LC-
MS/MS (PERFIL TOXICOLÓGICO POST-MORTEM DE UNHAS: UMA
FERRAMENTA NA INVESTIGAÇÃO CRIMINAL)

CAMPINAS

2015
CARLA GIANE LOSS

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO PARA


QUANTIFICAÇÃO DE COCAÍNA E METABÓLITOS EM UNHAS POR LC-
MS/MS (PERFIL TOXICOLÓGICO POST-MORTEM DE UNHAS: UMA
FERRAMENTA NA INVESTIGAÇÃO CRIMINAL)

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da


Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências
Médicas, Área de Concentração Ciências Biomédicas.

ORIENTADOR: PROFA. DRA. NELCI FENALTI HÖEHR


CO-ORIENTADOR: PROF. DR. MARCOS NOGUEIRA EBERLIN

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO


FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA CARLA GIANE LOSS, E ORIENTADO PELO
PROF. DRa._________________________

CAMPINAS

2015
DEDICATÓRIA

Aos meus queridos pais...

Elisete Kurmann Loss, pela presença e apoio em todas as etapas da minha vida.

Carlos Loss (in memoriam), que foi minha motivação para ir até ao final e não me
deixou desistir. Dedico esta dissertação à ele.
AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus pela proteção e por me fazer cada vez mais
forte.

À minha mãe amada, pelas palavras de apoio, suporte e incentivo aos estudos.
Por estar sempre ao meu lado, nunca me deixando cair. Sem você não sou
nada.

Ao meu pai (in memoriam), pelo carinho e exemplo de dedicação. Sei que
sempre estará ao meu lado e nesse momento está comemorando junto a mim
esta vitória. Agradeço a você por todos os momentos preciosos.

Aos meus irmãos Giovani e Carlos pelo suporte familiar e por ser minha fonte
de inspiração para querer sempre mais.

Ao meu namorado, melhor amigo e companheiro para todos os momentos,


Pedro, quem ficou do meu lado cada segundo dessa jornada, sempre me
apoiando e me dando forças para seguir em frente, meu muito obrigada.

À minha orientadora Nelci, pela orientação e suporte durante todo esse tempo.

Aos meus queridos amigos Taís, Ariane, Chanaisa, Rafaela e Lucas pela
amizade que perdura há 10 anos. Vocês são minha segunda família.

Ao meu co-orientador Marcos, pelo suporte analítico.

Aos meus colegas do laboratório ThoMSon de Espectrometria de Massas pela


companhia diária e por me auxiliarem.

Ao meu querido amigo José, que ficou do meu lado durante todo esse período
me dando suporte técnico.

Aos meus queridos amigos, Bebel, Renata e Chico pela amizade, parceria e
anos de convivência dividindo a mesma casa.

As minhas primas amadas, Renata e Taís, por além de serem minha família,
melhores amigas, são quem me acompanham desde o dia em que sai de casa,
amo vocês.

A querida amiga Bebel, pelas incontáveis vezes que me ajudou, obrigada pela
amizade e parceria.
RESUMO

A cocaína (COC) é uma droga de abuso com elevadas propriedades


estimulantes. O consumo de COC pode ser monitorado na urina e no sangue,
porém quando se trata do uso contínuo, as amostras alternativas como cabelo
e unhas podem ser utilizadas. As vantagens acerca do uso da matriz de unha
inclui a coleta fácil e não invasiva. Essa amostra apresenta-se estável e, além
disso, é possível detectar a exposição retrospectiva e crônica à determinadas
substâncias. O objetivo do presente trabalho foi propor um novo método,
simples e rápido de extração e quantificação da COC e seus metabólitos em
unhas pela técnica de Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de
Massas (LC-MS). A validação foi realizada estabelecendo a especificidade,
linearidade, precisão intra- e inter-ensaio, limite de detecção (LOD), limite de
quantificação (LOQ) e efeito de matriz. O LOD foi de 0,01 ng/mL e o LOQ foi de
0,5 ng/mL. Os valores de linearidade mostraram coeficiente de correlação (r)
para COC, benzoilecgonina (BZE) e cocaetileno (COE) maiores que 0,99.
Foram observados bons resultados de precisão intra e inter-ensaio e
especificidade para todos os analitos avaliados e não foi observado efeito de
matriz. Quando a técnica de LC-MS/MS é aplicada, observa-se que a unha
pode ser uma amostra útil para a determinação crônica e retrospectiva do uso
de COC.

Palavras-chave: cocaína; toxicologia; validação; unhas.


ABSTRACT

Cocaine (COC) is a widely use drug of abuse with strong stimulant properties.
COC consumption can be inspected in urine and blood but continuous use can
be detected in hair and nails. Advantages of testing nail samples include ease
and less invasiveness of collection. Such samples are also highly stable and
allows for the investigation of past and chronic exposures. We have propose a
new simple and fast method of extraction and quantify cocaine and its
metabolites in fingernails by liquid chromatography mass spectrometry (LC-
MS). Confidence parameters of validation of the method were: specificity,
linearity, intra- and inter-batch, limit of detection (LOD), limit of quantitation
(LOQ) and matrix effect. The LOD was 0.01 ng/mL and the LOQ was 0.5 ng/mL.
Linearity showed correlation coefficient (r) for COC, benzoylecgonine (BZE) and
cocaethylene (COE) higher than 0.99. Good intra- and inter-assay precision,
and specificity were also observed for all detected molecules and no major
matrix effect could be noted. When LC-MS/MS monitoring is applied, nails seem
indeed to offer quite useful surrogates for chronic and past use of COC.

Keywords: cocaine, toxicology, validation studies, fingernails


LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Principais vias de biotransformação da cocaína administrada em


humanos. Adaptado de (31). ........................................................................... 28

Figura 2. Tempo de detecção da maioria das drogas nas principais matrizes


biológicas (41). ................................................................................................ 31

Figura 3. Mecanismo da hidrólise da cocaína e cocaetileno à benzoilecgonina


........................................................................................................................ 41

Figura 4. Esquema de funcionamento do LC-MS/MS ..................................... 45

Figura 5. Espectro de massas obtido para solução de cocaína. Destaque para


o íon m/z 304, referente a cocaína protonada; e os íons m/z 82 e 77 referentes
aos fragmentos mais intensos da molécula de cocaína. ................................. 60

Figura 6. Espectro de massas obtido para solução de benzoilecgonina.


Destaque para o íon m/z 290, referente a benzoilecgonina protonada; e os íons
m/z 168 e 105 referentes aos fragmentos mais intensos da molécula de
cocaína. .......................................................................................................... 61

Figura 7. Espectro de massas obtido para solução de cocaetileno. Destaque


para o íon m/z 318, referente ao cocaetileno protonado; e os íons m/z 196 e 82
referentes aos fragmentos mais intensos da molécula de cocaetileno. ........... 61

Figura 8. Espectro de massas obtido para solução de cocaína deuterada


(Cocaína-D3). Destaque para o íon m/z 307, referente cocaína deuterada; e os
íons m/z 115 e 102 referentes aos fragmentos mais intensos da molécula de
cocaína-D3. ..................................................................................................... 62

Figura 9. Espectro de massas obtido para solução de cocaetileno deuterado


(Cocaetileno-D3). Destaque para o íon m/z 321, referente ao cocaetileno
deuterado; e os íons m/z 183 e 105 referentes aos fragmentos mais intensos
da molécula de cocaetileno-D3. ....................................................................... 63

Figura 10. Cromatograma de uma solução padrão de COC, BZE e COE antes
(a) e depois (b) da otimização das condições experimentais. Transições
selecionadas: 290>168 (benzoilecgonina); 304>182 (cocaína); 318>196
(cocaetileno). .................................................................................................. 65

Figura 11. Cromatogramas obtidos da injeção da mistura de padrão de BZE,


COC e COE e injeção de soluções brancos (sem adição da droga) ............... 67

Figura 12. Gráfico de interação entre as variáveis A: solvente e B: tempo de


extração, a uma temperatura de 40ºC para extração da cocaína. ................... 69
Figura 13. Gráfico de interação entre as variáveis A: solvente e B: tempo de
extração, em temperatura ambiente para extração da benzoilecgonina. ......... 71

Figura 14. Hidrólise da cocaína à benzoilecgonina quando o metanol é


utilizado como solvente extrator. ..................................................................... 72

Figura 15. Fluxograma do procedimento de preparo de amostra (unha) para


determinação de cocaína e metabólitos. ......................................................... 73

Figura 16. Cromatogramas de: (a) Amostra de unha fortificada com a mistura
dos padrões e submetida à extração com acetato de etila por um período de 12
horas; (b) Amostra de unha fortificada com a mesma mistura dos padrões e
submetida à extração com metanol por um período de 12 horas. ................... 75

Figura 17. Cromatograma da solução de uma mistura dos padrões de COC,


BZE e COE na concentração de 12,50 ng/mL, e padrões deuterados COC-D3 e
COE-D3 na concentração de 6,38 ng/mL diluídos em fase móvel
(acetonitrila:água 5:95 v/v) .............................................................................. 76

Figura 18. Amostra de unha fortificada com a mistura dos padrões de COC,
BZE e COE na concentração de 12,50 ng/mL, e padrões deuterados COC-D3 e
COE-D3 na concentração de 6,38 ng/mL, e submetida à extração com acetato
de etila por um período de 15 minutos em ultrassom. ..................................... 76

Figura 19. Curva de calibração obtida para cocaína ...................................... 78

Figura 20. Curva de calibração obtida para benzoilecgonina ......................... 79

Figura 21. Curva de calibração obtida para cocaetileno ................................. 79

Figura 22. Gráfico de resíduos para (a) COC, (b) BZE e (c) COE .................. 80

Figura 23. Cromatogramas das amostras reais de unhas provenientes do


Instituto Médico-Legal. .................................................................................... 87
LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Planejamento das condições experimentais para otimização do


método de extração de cocaína e seus metabólitos em unha. ........................ 55

Tabela 2. Resultado da otimização das condições de fragmentação para


determinação dos analitos no LC-MS/MS. A transição usada para quantificação
esta sublinhada. .............................................................................................. 60

Tabela 3. Gradiente da fase móvel utilizado no sistema cromatográfico para a


determinação de cocaína e metabólitos em unha. .......................................... 63

Tabela 4. Condições empregadas no sistema cromatográfico ........................ 64

Tabela 5. Resultados para a análise da precisão do injetor. ........................... 66

Tabela 6. Análise da variância dos resultados de extração de cocaína. ......... 68

Tabela 7. Análise da variância dos resultados de extração de benzoilecgonina.


........................................................................................................................ 70

Tabela 8. Melhores condições de extração para cocaína e benzoilecgonina


obtidas através do software Design-Expert®. ................................................. 71

Tabela 9. Resultados obtidos para calibração dos analitos de COC, BZE e


COE no sistema de LC-MS/MS ....................................................................... 78

Tabela 10. Resultados de LOD e LOQ, obtidos para os analitos em estudo


através do método desenvolvido. .................................................................... 80

Tabela 11. Resultados obtidos para efeito de matriz. ..................................... 81

Tabela 12. Estabilidade da cocaína na matriz de unha por um período de 5 dias


........................................................................................................................ 82

Tabela 13. Estabilidade da benzoilecgonina na matriz de unha por um período


de 5 dias ......................................................................................................... 82

Tabela 14. Estabilidade do cocaetileno na matriz de unha por um período de 5


dias ................................................................................................................. 83

Tabela 15. Estabilidade da cocaína na matriz de unha após ciclos de


congelamento e descongelamento .................................................................. 84

Tabela 16. Estabilidade da benzoilecgonina na matriz de unha após ciclos de


congelamento e descongelamento .................................................................. 84

Tabela 17. Estabilidade do cocaetileno na matriz de unha após ciclos de


congelamento e descongelamento .................................................................. 84
Tabela 18. Resultados obtidos para os ensaios de precisão do método ......... 86

Tabela 19. Concentrações (ng/mg) encontradas nas amostras de unha


analisadas ....................................................................................................... 87
LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Janela de detecção de drogas em diversas matrizes biológicas....17

Quadro 2. Determinação de drogas de abuso em unha...................................21


LISTA DE ABREVIATURAS

SNC: Sistema Nervoso Central

BZE: Benzoilecgonina

COC: Cocaína

COE: Cocaetileno

EME: Ecognina metil ester

ECG: Ecognina

NOR: Norcocaína

LC-MS: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de


Massas

HPLC: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CG-MS: Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas

CG: Cromatografia Gasosa

ESI: Ionização por Electrospray

PI: Padrão interno

SPE: Extração em Fase Sólida

LOD: Limite de Detecção

LOQ: Limite de Quantificação

LLE: Extração Líquido-Líquido

SPE: Extração em Fase Sólida

SPTC: Superintenência da Policia Técnico-Científica

PFPA: Anidrido pentafluro propinionico

CV: Coeficiente de Variação

DP: Desvio Padrão

DPR: Desvio Padrão Relativo

RT: Tempo de Retenção

CQB: Controle de qualidade baixo


CQA: Controle de qualidade alto

m/z: Relação massa/carga

THC–COOH:11-Nor-9-carboxi-tetrahidrocanabinol
SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 20

2. OBJETIVOS ............................................................................................. 24

2.1. Objetivos Gerais................................................................................. 24

2.2. Objetivos Específicos ......................................................................... 24

3. REVISÃO DA LITERATURA..................................................................... 25

3.1. Cocaína ............................................................................................. 25

3.1.1. Aspectos Sociais ......................................................................... 25

3.1.2. Aspectos toxicológicos ................................................................ 26

3.2. Matrizes biológicas utilizadas em análises toxicológicas .................... 29

3.2.1. Matrizes alternativas .................................................................... 29

3.2.2. A unha como matriz biológica alternativa..................................... 31

3.2.3. Detecção de cocaína e metabólitos em unhas............................. 35

3.3. Aspectos analíticos da detecção de cocaína em unhas ..................... 39

3.3.1. Métodos de extração da cocaína em unha .................................. 39

3.3.2. Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas (LC-


MS)....... .................................................................................................... 43

3.4. Validação de métodos cromatográficos .............................................. 46

3.4.1. Linearidade .................................................................................. 47

3.4.2. Seletividade ................................................................................. 47

3.4.3. Limite de detecção (LOD) e Limite de quantificação (LOQ) ......... 48

3.4.4. Precisão intra- e inter-ensaio ....................................................... 48

3.4.5. Estabilidade dos analitos na matriz .............................................. 48

3.4.6. Efeitos de matriz .......................................................................... 49

4. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................ 50


4.1. Materiais ............................................................................................ 50

4.1.1. Reagentes ................................................................................... 50

4.1.2. Soluções padrão .......................................................................... 50

4.1.3. Equipamentos e acessórios ......................................................... 50

4.2. Métodos ............................................................................................. 51

4.2.1. Amostra de unha ......................................................................... 51

4.2.2. Análise toxicológica em unhas ..................................................... 52

4.2.3. Desenvolvimento do método para extração e determinação de


cocaína e metabólitos em amostras de unha............................................ 52

4.2.4. Aplicação em amostras reais (correlação clínica) ........................ 58

5. RESULTADOS ......................................................................................... 59

5.1. Otimização das condições de operação do equipamento................... 59

5.2. Otimização das condições de extração da cocaína ............................ 68

5.3. Validação do método ......................................................................... 77

5.3.1. Linearidade .................................................................................. 77

5.3.2. Limite de detecção (LOD) e Limite de quantificação (LOQ) ......... 80

5.3.3. Efeito de matriz............................................................................ 81

5.3.4. Estabilidade de longa duração dos analitos na matriz ................. 81

5.3.5. Estabilidade dos analitos após ciclos de congelamento e


descongelamento ..................................................................................... 83

5.3.6. Precisão intra- inter-ensaio .......................................................... 85

5.3.7. Aplicação do método validade em amostra real........................... 86

6. DISCUSSÃO ............................................................................................ 88

7. CONCLUSÃO ........................................................................................... 95

8. REFERÊNCIAS ........................................................................................ 96

ANEXO 1 .......................................................................................................104

ANEXO 2 .......................................................................................................107
ANEXO 3 .......................................................................................................110

ANEXO 4 .......................................................................................................113

ANEXO 5 .......................................................................................................114
20

1. INTRODUÇÃO

A cocaína (COC) é um alcaloide derivado da planta Erythroxylum coca,


usado nas antigas civilizações em cerimônias religiosas e sociais, para inibir a
fome, diminuir o cansaço e aumentar a resistência física. Este alcaloide de
origem natural, por possuir potente ação estimulante acelera a atividade
cerebral e outras partes do Sistema Nervoso Central (SNC), apresentando
assim, alto potencial como droga de abuso (1).
Segundo o Relatório Mundial Sobre Drogas, estima-se que cerca de 243
milhões de pessoas, ou 5 % da população mundial adulta, fez uso de alguma
droga ilícita, ao menos uma vez, no ano de 2014 (2).
No Brasil, a COC era legalmente comercializada até o inicio do século XX,
contudo, após o aparecimento de casos de intoxicação e mortes ocorridas pelo
uso da mesma, houve a restrição do seu uso, em 1921, através do decreto-lei
4292 (3).
O consumo de drogas no Brasil é o problema de saúde pública que mais
afeta no contexto social atual. Os intensos efeitos prazerosos propiciados para
o usuário fazem com que a COC seja uma droga que apresenta um dos
maiores potenciais de abuso e consequentemente esteja entre as grandes
preocupações mundiais em saúde pública devido a sua associação a práticas
delituosas (4).
A identificação da exposição à COC por meio das análises toxicológicas é
de especial interesse, pois possibilita que medidas de prevenção, controle e
tratamento possam ser desenvolvidas. Porém para a identificação e
quantificação de drogas, a ciência forense requer métodos de análise
caracterizados por alta seletividade, tornando o desenvolvimento de novos
métodos de suma importância.
Apesar do meio mais seguro para verificação da exposição à drogas de
abuso ser através de análises toxicológicas, ainda esta é um dos maiores
problemas enfrentados na prática pelos toxicologistas, devido à escassez de
técnicas padronizadas e dados para auxiliar na execução e interpretação dos
dados obtidos.
21

Com os resultados obtidos nessas análises é possível fazer a verificação


do uso de drogas no ambiente de trabalho, no esporte, na avaliação da eficácia
do tratamento da dependência. Além disso, estes resultados podem ser
utilizados com finalidade médico-legal a fim de auxiliar no estabelecimento da
causa mortis, de se entender a maneira em que se deu o óbito e todos os
elementos envolvidos, considerando que o composto em questão pode atuar
como o agente primário ou estar relacionado com o evento (5).
Além do mais, podem ser importantes perante processos judiciais,
evidenciando a violação da legislação, uma vez que os tribunais dependem dos
resultados de análises toxicológicas para decidir se um indivíduo estava sob
influência de drogas durante um determinado evento (estupro, roubo, acidentes
de trânsito e de trabalho) (6).
A COC vem sendo detectada em vários espécimes biológicos, sendo o
sangue e a urina os principais consagrados na literatura. A urina é a amostra
biológica de escolha na maioria das situações (7), porém esta matriz apresenta
várias desvantagens, sendo a principal o fato de que detecta somente o uso
recente da droga (2 a 4 dias). Já o sangue fornece os dados mais significativos
quando se trata de elucidação da causa mortis. Com essa matriz, é possível
correlacionar a concentração de droga e o estado clínico do indivíduo (8).
Porém além da coleta ser considerada invasiva, os dados obtidos através do
uso dessa amostra, representam informações relativas a exposição recente à
droga (algumas horas).
Além destas, a cocaína vem sendo analisada em uma série de outras
amostras, incluindo suor (9, 10), saliva (11), vísceras (12), humor vítreo (13),
mecônio (14, 15) e matrizes queratinizadas (16, 17) (15, 18-21). A análise
dessas amostras podem apresentar grandes vantagens e fornecer informações
que não seriam possíveis ao analisar amostras convencionais comumente
utilizadas, tornando o estudo das matrizes alternativas de suma importância.
Quando o objetivo é verificar a exposição retrospectiva ou crônica à
certas substâncias, as matrizes queratinizadas, tais como cabelo e unha,
mostram-se extremamente vantajosas, o que explica o aumento do interesse
pelo seu uso nos últimos anos.
22

A análise de unha é capaz de fornecer evidências retrospectivas do uso


de drogas de abuso, devido a essa matriz poder sequestrar xenobióticos e
seus produtos de biotransformação independentemente da fase de exposição,
sendo esta captação parte da distribuição do fármaco pelo corpo. Tal
deposição mostra-se irreversível e a droga pode ficar retida por tempo
indeterminado até o crescimento total dessa estrutura (20).

1.1. Justificativa

A proposta do uso da unha neste trabalho se baseia no fato dessa matriz


biológica fornecer evidências retrospectivas do uso de drogas de abuso. Esse
tecido queratinizado pode armazenar fármacos administrados por meses,
fornecendo informações sobre o uso passado de drogas que podem ter grande
relevância judicial, por exemplo. Dentre suas principais vantagens, está o fato
da coleta ser de fácil acesso e não invasiva, a coleta pode ser monitorada
impedindo adulterações e trocas de amostras, e os analitos são altamente
estáveis nessa matriz, mesmo que em temperatura ambiente.
A técnica de GC-MS (Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria
de Massas) é uma metodologia bastante utilizada para a detecção de cocaína
em matrizes biológicas e, portanto, é considerada uma técnica padrão ouro.
Porém recentemente, a técnica de LC-MS (Cromatografia Líquida Acoplada à
Espectrometria de Massas) vem sendo considerada uma alternativa devido às
suas vantagens, dentre elas: eliminação da etapa de derivatização da amostra,
a qual é indispensável na análise por CG-MS, permite determinações
simultâneas de drogas originalmente lipofílicas e metabólitos hidrofílicos e,
geralmente, emprega um preparo de amostra mais simplificado, além do tempo
curto de análise (8).
Em face do exposto, é relevante investigar a utilização da unha como
matriz biológica para verificar a exposição à drogas de abuso, como por a
COC, bem como realizar estudos a fim de desenvolver novos métodos de
extração rápidos e eficazes para o analito de interesse, e o desenvolvimento de
23

novas técnicas analíticas que forneçam resultados precisos e com tempo de


análise reduzido, como é possível obter através de LC-MS.
Sendo assim, essa pesquisa constitui uma importante ferramenta
científica na elucidação da causa mortis conjunta a área da patologia clínica,
com ênfase na toxicologia forense, devido a sua alta estabilidade em relação
ao período post-mortem.
24

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivos Gerais

O objetivo do presente trabalho foi propor um novo método, simples e


rápido de extração e quantificação da COC e seus metabólitos em unhas pela
técnica de Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas (LC-
MS).

2.2. Objetivos Específicos

 Comparar os métodos de extração previamente publicados na literatura


e propor um novo método de extração para cocaína;
 Padronização e validação de uma técnica para quantificação para a
cocaína e seus metabólitos;
 Aplicação do método padronizado e validado em amostras reais de
unha provenientes do Instituto Médico Legal (IML).
25

3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1. Cocaína

3.1.1. Aspectos Sociais

A COC foi classificada como a droga dos anos 80 e 90 devido a sua


popularidade. Essa é a segunda droga ilícita mais comumente usada no mundo
e é responsável pela maioria das mortes relacionadas ao uso de drogas. Os
usuários mais comuns são grupos de jovens com faixa etária entre 18 e 25
anos (22). É o principal alcaloide ativo encontrado nas folhas da Erythroxylum
coca, planta originária da zona tropical dos Andes, que cresce principalmente
em regiões de clima quente e úmido. Suas propriedades estimulantes já eram
conhecidas há mais de 4.000 anos na história da humanidade (23).
Durante milhares de anos, culturas nativas da América do Sul
costumavam mascar folhas de coca em ocasiões religiosas e sociais, para
inibir a fome, diminuir o cansaço e aumentar a resistência física. Vários artigos
foram publicados relatando achados de restos vegetais de plantas de coca do
Peru, bem como autores descreveram a detecção de benzoilecgonina (principal
metabólito da cocaína) em 114 amostras de cabelo de múmias de populações
pré-hispânicas no Chile, sendo as amostras mais antigas datadas entre 250 a
350 a.C (1).
No Brasil, a COC era legalmente comercializada até o início do século
XX, na forma pura ou fazendo parte de formulações farmacêuticas. Contudo,
após o aparecimento de casos de intoxicação ocorreu a sua restrição em 1921,
através do Decreto-Lei 4292, provavelmente decorrente da proibição imposta
nos Estados Unidos pelo chamado Harrison Act, conhecido como Lei Seca (3).
A partir deste momento a COC passou a representar uma real ameaça, devido
à sua associação com prática de ações delituosas.
O consumo e dependência da COC continuam sendo o problema de
saúde pública que mais afeta o contexto social atual, porque esse consumo
reflete não só na saúde, no convívio familiar e social, como também movimenta
26

milhões de reais por ano, constituindo um mercado financeiro ilícito não só no


Brasil, mas também em muitos outros países (4, 24).
Segundo o Relatório Mundial Sobre Drogas, estima-se que cerca de 243
milhões de pessoas, ou 5 % da população global entre 15 e 64 anos de idade,
fez uso de alguma droga ilícita, ao menos uma vez, no ano de 2014. O
documento relata ainda que o uso da COC permaneceu estável em relação aos
relatórios publicados nos anos anteriores, percebendo-se, porém, um aumento
do uso no Brasil (2).
Scheffer e colaboradores (25) fizeram um estudo sobre a prevalência de
transtornos psiquiátricos nos dependentes químicos de cocaína, crack e álcool.
Foi possível observar no seu estudo, a associação da dependência química
com a baixa escolaridade, fato este, que já é tratado na literatura como um
grave problema.
De forma geral, a possibilidade de uso abusivo de uma substância é
aumentada pela rapidez do início de sua ação. Os efeitos que ocorrem logo
após a administração desencadeiam uma série de eventos que levam à perda
de controle sobre o uso da substância. Assim, os fatores que determinam a
dependência são complexos e influenciados pelas características do indivíduo,
dose e frequência de uso. Apesar de qualquer tentativa de determinar um perfil
do usuário incorrer no risco de estigmação do indivíduo, ou mesmo em
interpretações errôneas, é fato que existe uma relação entre as drogas e a
delinquência, principalmente quando o fármaco de abuso constitui um
estimulante do sistema nervoso central (SNC) e apresenta alto potencial de
abuso, como é o caso da cocaína (5).

3.1.2. Aspectos toxicológicos

A COC, alcaloide natural de potente ação estimulante, acelera a


atividade cerebral e outras partes do SNC, causando euforia, hipercinesia,
vontade de falar, aumenta a autoconfiança e energia e, também, aumenta a
disposição de assumir riscos (26). Tais propriedades comportamentais da COC
têm sido atribuídas à sua capacidade de bloquear os transportadores de
27

dopamina, causando assim uma elevação sináptica de dopamina no núcleo


accumbens (27). Potencializa também as ações da noradrenalina e serotonina,
bloqueando a recaptura desses neurotransmissores nos terminais nervosos
pré-sinápticos. As altas concentrações de monoaminas (especialmente a
dopamina) na fenda sináptica estão estreitamente relacionadas com as
propriedades psicoestimulantes e de reforço positivo para uso da COC (11).
Dentre as consequências relacionadas ao uso abusivo da COC, os
eventos cardíacos e cerebrovasculares são os principais e de maior
severidade. Osterne e colaboradores analisaram casos de infarto do miocárdio
ocorridos após inalação de cocaína, mostrando que a cocaína é um importante
fator desencadeante do infarto agudo no miocárdio (28). Porém, podem ocorrer
ainda problemas gastrointestinais, pulmonares, geniturinário, neurológicos e
muscoesqueléticos (22).
Algumas complicações específicas estão diretamente associadas à via
de administração. Após aspiração frequente do cloridrato de cocaína pode
ocorrer rinite crônica, perfuração do septo nasal e perda do olfato. Quando a
COC é administrada por via intravenosa, doenças infecciosas como hepatite e
AIDS podem ser transmitidas (29).
A COC administrada em humanos é convertida quase em sua totalidade,
em produtos de biotransformação (metabólitos) e eliminada na urina como
benzoilecgonina (BZE) (15-50%), ecognina metil éster (EME) (15 a 35%),
ecognina (ECG) (1 a 8%) norcocaína (NOR) (2-6%) e na forma inalterada
(cerca de 3%) (Figura 1) (30).
28

Figura 1. Principais vias de biotransformação da cocaína administrada em humanos.


Adaptado de (31).

Qualquer que seja a via de introdução, a COC é extensivamente


metabolizada através de duas rotas: hidrólise (não enzimática e enzimática
com esterases) e oxidação por meio das oxidases. A hidrólise ocorre no
sangue e tecidos enquanto a oxidação ocorre principalmente no fígado (6).
A EME é obtida pela ação das esterases hepáticas e colinesterase
plasmática e a BZE é obtida por hidrólise espontânea (26). A ECG é um
produto da hidrólise não enzimática da EME e/ou enzimática da hidrólise da
BZE. A via oxidativa leva a N desmetilação da COC, onde o principal produto é
a NOR (30).
29

A combinação com etanol dá origem ao metabólito cocaetileno (COE),


um produto de transesterificação pela ação de carboxilesterases, o qual possui
ação farmacológica comparável à COC, sendo mais apolar permanecendo
mais tempo no organismo (6).
A análise clínica para verificar o uso da COC é ainda muito difícil e
alguns sintomas só aparecem após elevado grau de dependência. O meio mais
seguro para a verificação dessa exposição é através de análises toxicológicas,
tornando essas análises, um importante instrumento nas mais diversas áreas
de aplicação descritas (11).

3.2. Matrizes biológicas utilizadas em análises toxicológicas

3.2.1. Matrizes alternativas

A identificação de drogas em diferentes matrizes biológicas fornece uma


visão sobre a cinética e os mecanismos de distribuição da droga no corpo. A
compreensão desses processos auxilia no desenvolvimento de métodos
alternativos para a avaliação da exposição a drogas de um indivíduo (32).
Dependendo da finalidade da análise, diversas matrizes biológicas podem ser
utilizadas (11).
Nas últimas décadas, um crescente interesse tem sido observado na
determinação de fármacos e drogas em materiais biológicos alternativos,
principalmente devido ao intenso desenvolvimento de novas técnicas altamente
sensíveis e seletivas, especialmente utilizando a espectrometria de massas
(MS) (15).
As matrizes biológicas convencionais, como urina e sangue, já vêm
sendo estudadas há muito tempo e seu emprego já está consolidado. A urina,
por exemplo, é a matriz de escolha para se verificar a exposição a drogas de
abuso em programas de prevenção e controle do uso de drogas no trabalho e
em competições esportivas (33, 34). Apesar de existirem técnicas
reconhecidas, métodos facilmente disponíveis e valores de corte já
30

estabelecidos, a análise de urina detecta somente o uso recente da droga (2 a


4 dias), sendo essa uma das principais desvantagens do uso da mesma.
Os dados post mortem mais significativos são geralmente determinados
em amostras de sangue. Essa é a amostra de escolha para correlacionar a
concentração de droga e a evolução clínica, sendo muito importante também
no controle terapêutico e acompanhamento médico (8). Contudo, além da
coleta ser invasiva e a matriz ser de extrema complexidade em relação aos
seus constituintes, quando se trata de casos post mortem, nem sempre essa
amostra está presente, tornando assim, o estudo de matrizes alternativas às
convencionais de suma importância.
Tecidos post mortem, tais como rim e fígado, têm sido muito utilizados
em aplicações forenses especialmente nos casos em que o sangue não está
disponível. Como a maioria dos medicamentos são metabolizados no fígado,
tanto a substância precursora quanto seus metabólitos podem estar presentes
nesse tecido em altas concentrações. O rim também assume um papel
importante em análises toxicológicas, uma vez que drogas e metabólitos
devem passar por este órgão antes de serem excretados na urina (12).
A COC e seus metabólitos também foram detectados em amostras de
mecônio por diversos autores (14, 35, 36). Esta é uma matriz biológica que
possibilita a detecção não apenas de COC, mas de vários outros analitos como
álcool, nicotina, canabinóides, heroína, codeína, morfina, anfetaminas
pesticidas organofosforados e organoclorados, medicamentos e metais
pesados como cádmio, mercúrio e arsênio (37-40).
A amostra de mecônio, primeira excreção intestinal do neonato, é
considerada como material de escolha para avaliar a exposição fetal à drogas
terapêuticas ou drogas de abuso durante a gestação, devido a essa amostra
acumular informações de toda a gravidez até o nascimento (15), visto que as
drogas de abuso e demais substâncias são transferidas da mãe para o feto por
difusão passiva através dos vasos sanguíneos da placenta.
Quando se trata de matrizes biológicas alternativas, as mais importantes
incluem saliva, cabelo, suor, mecônio, unhas e lágrimas. Todas essas,
apresentam uma vantagem crucial que é a coleta praticamente não invasiva.
31

Além disso, a coleta pode ser conduzida sob condições controladas para evitar
a adulteração ou substituição de amostras (15). Especificamente, a unha e o
cabelo possuem uma larga janela de detecção, tornando possível a verificação
da exposição a drogas de abuso, o que as tornam importantes amostras de
estudo. Porém vale salientar que a escolha do material biológico a ser
analisado é crítica, uma vez que cada tipo de espécime pode contribuir para
uma determinada informação.
São escassas as publicações sobre os avanços nos estudos analíticos
que fazem o uso de matrizes alternativas (como mecônio, unha e lágrimas, por
exemplo) para determinação de várias classes de drogas, incluindo drogas
lícitas e ilícitas. A Figura 2 mostra o tempo de detecção para algumas das
matrizes biológicas.

Figura 2. Tempo de detecção da maioria das drogas nas principais matrizes


biológicas (41).

Estudos sobre a estabilidade dessas três matrizes biológicas foram


realizados e revelaram que os compostos são estáveis na unha armazenada a
temperatura ambiente com exposição limitada a luz. As drogas examinadas
também foram estáveis em mecônio (mesmo depois de um ano) e em lágrimas
(até 200 dias) quando foram congeladas a baixas temperaturas (15).

3.2.2. A unha como matriz biológica alternativa

A placa da unha humana é uma estrutura muito mais complexa do que


parece, ela protege o leito da unha, possui irrigação de muitos vasos
sanguíneos, e a matriz ungueal (parte na superfície ventral proximal da unha) é
32

a responsável pela proliferação das células e crescimento da mesma. Ela


consiste principalmente em queratina, um material fibroso natural, 4/5 é a
queratina do cabelo do tipo rígido e 1/5 é queratina tipo de pele macia. Na
camada dorsal e ventral a pele forma uma rede de queratina e estes filamentos
são orientados paralela e perpendicularmente ao eixo de crescimento das
unhas (42), o qual é estabilizado por ligações cruzadas entre cadeias de
polipeptídios (20). Sua proliferação envolve o crescimento distal de uma taxa
de aproximadamente 0,1 mm/dia para as unhas das mãos e de
aproximadamente 0,03-0,04 mm/dia para as unhas dos pés (15).
Estudos têm demonstrado que as drogas podem ser depositadas nas
unhas, tanto na haste da matriz ou durante o processo de formação e
crescimento da mesma. Sendo assim, drogas podem ser detectadas nas unhas
entre um mês após a ingestão, muito tempo antes de o crescimento estar
completo (43).
A análise de cortes de unhas para detecção de drogas de abuso tem
recebido uma pequena atenção quando comparado à amostra de cabelo,
apesar de sua composição ser basicamente a mesma. Porém a unha já vem
sendo utilizada para a determinação da exposição voluntária e involuntária à
muitas substâncias. Especificamente, têm sido usada na determinação da
exposição a metais como arsênio (44), anfetaminas (45-47), antifúngicos (48) e
sedativos (43).
Tecidos queratinizados, como unhas, podem sequestrar xenobióticos e
seus metabólitos, irreversivelmente, independente da fase de exposição. Tal
captação de xenobióticos pela queratina humana não é um fenômeno químico,
e sim, parte da distribuição do fármaco como rotas de eliminação do corpo,
sendo que esta é resultado do contínuo crescimento dessa estrutura (8, 20).
O mecanismo de incorporação de drogas nas unhas ainda não é bem
elucidado, no entanto, acredita-se que possa ocorrer durante a sua formação e
crescimento devido ao fornecimento de sangue a partir da matriz germinal ou a
partir do leito da unha (17, 49).
Um fator muito importante na incorporação da droga na matriz é o caráter
básico da molécula. Enquanto o pH do plasma é aproximadamente 7,0, o pH
33

dos queratinóticos é ligeiramente mais ácido que o plasma, resultando num


gradiente de pH que favorece a transferência de bases (50). As substâncias de
caráter básico, como a cocaína, após difusão no sangue, atravessam a
membrana das células da matriz na forma não ionizada, sofrendo protonação
devido ao pH ácido existente do interior das células, o que as impede de se
difundirem novamente para o plasma acumulando-se nas mesmas, uma vez
que a difusão destas substâncias para as células se encontra favorecida pelo
gradiente de pH. Sendo assim, o pKa do composto, assim como o pH no
interior das células da matriz, revelam-se importantes para a taxa de
incorporação de compostos na unha (51).
A análise de unha é capaz de fornecer evidências retrospectivas do uso
de drogas de abuso. Assim como o cabelo, a unha pode armazenar fármacos
administrados por meses, bem como possui praticamente as mesmas
vantagens e desvantagens atribuídas a ele como matriz biológica para
verificação do uso de drogas de abuso (52). Alguns estudos, especialmente
aqueles que avaliam a detecção de drogas ilícitas (ex. cocaína, morfina,
cannabis, etc), incluindo seus metabólitos, confirmam a utilização da unha
como uma amostra alternativa e complementar ao cabelo, visto que em alguns
casos, as concentrações de cocaína são maiores nas unhas do que no cabelo
(15).
Porém se tratando principalmente das unhas das mãos, o problema de
contaminação externa é muito grande, devendo esta passar por um processo
de descontaminação cauteloso (15). Um dos maiores problemas dessa matriz
é o seu extenso preparo, o qual requer processos de descontaminação, cortá-
la em pequenos pedaços, digestão da amostra e usualmente extrações, como
por exemplo, Líquido-Líquido (LLE) ou Extração em Fase Sólida (SPE) (17, 18,
20). Contudo, são muitas as vantagens acerca do uso da matriz de unha para a
análise de drogas, tais como fornecer informações sobre o uso passado e/ou
crônico de drogas de abuso, a coleta de unha é de fácil acesso e não invasiva,
pode ser monitorada impedindo adulterações e trocas de amostras e os
analitos são altamente estáveis na matriz, ressaltando mais uma vez a
34

importância da realização de novos estudos acerca dessa matriz na área da


toxicologia.
O motivo do reconhecimento técnico-científico acerca do uso de
matrizes queratinizadas deve-se ao fato de que tanto a urina, sangue como a
saliva produzem espectros transitórios de uso de drogas por um período
relativamente curto refletindo o uso ocorrido horas antes da coleta da amostra.
Em contraste, os fâneros cutâneos, tais como a unha, composta basicamente
por queratina, são capazes de fornecer informações de uso ou abstinência por
um período relativamente bem maior, da ordem de semanas ou meses (53).
A comparação entre as principais matrizes que possam ser utilizadas para
a analise de drogas em relação à janela de detecção se encontra no Quadro 1.

Quadro 1. Janela de detecção de drogas em diversas matrizes biológicas


Tempo para
Matriz Principais Principais
detecção da
biológica vantagens desvantagens
droga
Técnica conhecida;
método facilmente Detecção de uso
Urina 2-4 dias
disponível; valores de recente de drogas
corte estabelecidos
Curto período de tempo
para detecção;
Fácil obtenção; amostras
contaminação por
Saliva 12-24 horas de fração de droga livre;
drogas de uso oral;
presença da droga em si
detecta somente uso
recente
Alto potencial para
Medida cumulativa do contaminação pelo
Suor 1-4 semanas
uso de drogas ambiente (falso
positivo)
Medida de longo prazo
de exposição à droga;
Alta positividade de
amostra semelhante
contaminação pelo
Unha e Cabelo Meses ou anos pode ser novamente
ambiente (falso
coletada; amostra
positivo)
estável a temperatura
ambiente
Fonte: Lowinson e colaboradores (54) apud Observatório Brasileiro de Informações
sobre drogas (adaptado).
35

No Quadro 1 é possível observar, que a principal desvantagem acerca


das amostras convencionais curto tempo de detecção (55).
O uso da análise da amostra de urina e sangue fornecem indícios do
consumo recente de drogas, porém é de grande interesse, para fins práticos,
ser associados à analise de cabelo e unha, por apresentarem maior janela de
detecção, o que abre as possibilidade para fazer diferentes correlações (56),
como por exemplo:
 Presença no sangue / ausência da unha: Uso recente da droga;
 Ausência no sangue / presença na unha: Exposição retrospectiva à
droga;
 Presença no sangue / presença na unha: Usuário crônico.
Até mesmo em situações “pós acidente”, tanto a urina como a saliva
(fluido oral) são os mais adequados para avaliar o comprometimento da
atenção do indivíduo. No entanto, um teste de cabelo ou unha pode ser útil por
ser capaz de possibilitar a verificação se o indivíduo que teve um teste de urina
ou fluido oral positivo é, na realidade, um usuário regular de drogas ou se o
resultado positivo reflete apenas a um único episodio de uso circunstancial
(53).
Nos casos de análise post-mortem o uso de amostras queratinizadas
revela ser um dos únicos métodos que possibilita a obtenção, de forma precisa,
sobre o histórico do cadáver em relação ao consumo de substâncias por um
período de semanas ou meses antes da morte. Vale salientar, que mesmo nos
casos em que o cadáver já se encontra em estado avançado de putrefação,
essas amostras queratinizadas se mantem estáveis podendo fornecer
informações importantes quanto ao histórico de uso de drogas.

3.2.3. Detecção de cocaína e metabólitos em unhas

Nos últimos anos, poucos trabalhos foram publicados utilizando amostras


de unhas para detecção de COC e seus metabólitos. Esses mostram
basicamente metodologias de extração, screening, e confirmação utilizando a
técnica de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-
36

MS) (17-20, 57). Ainda não foram encontrados trabalhos que fazem o uso da
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas
(LC-MS) para detecção destes compostos em amostras de unha.
Valente-Campos e colaboradores (20) detectaram qualitativamente e
quantitativamente a COC e seus metabólitos em amostras de unhas das mãos
e dos pés de voluntários (usuários de COC). Para este experimento o metanol
foi utilizado para liberar os analitos da matriz em refluxo a 40ºC por 16 horas e
após pré-concentração o resíduo obtido foi derivatizado com anidrido pentafluro
propíonico (PFPA). As unhas dos voluntários foram submetidas ao método
proposto e analisadas por CG-MS. Nesse estudo foi observado que quando
utilizado metanol no procedimento de extração foi possível recuperar mais de
67% dos analitos, mostrando que podem ocorrer perda desses analitos por
hidrólise ou decomposição.
Outro estudo utilizando como técnica o CG-MS para quantificação de
COC em unha, encontrou maiores concentrações de COC e BZE em unha,
quando comparado aos outros metabólitos (ECG, EME, COE, NOR), onde a
COC foi encontrada em 82,3% dos casos estudados, mostrando a importância
da detecção destes compostos (17).
Engelhart e Jenkins (18) detectaram COC e seus produtos de
biotransformação (BZE, NCOC, COE) em amostras de unhas post-mortem. O
método de extração utilizado para liberar os analitos da matriz foi baseado na
utilização de tampão fosfato (0,1 M, pH 5,0) acompanhado de sonicação por
uma hora e após mantido a temperatura ambiente durante 72 horas.
Posteriormente SPE foi utilizada e a derivatização foi conduzida seguido de
análise por CG-MS. Corroborando com o estudo de Garside (17), foram
observadas maiores concentrações de COC (0,20 a 140,17 ng/mg) e BZE (0,30
a 315,44 ng/mg) quando comparado aos outros metabólitos.
Cingolani e colaboradores (57) detectaram simultaneamente morfina, 6-
acetilmorfina e COC em amostras de unhas. As amostras foram submetidas a
digestão com ácido clorídrico (HCl 37%, v/v em água), incubadas a 100ºC
durante 30 minutos e após mantidas por 12 horas a temperatura ambiente. A
solução foi alcalinizada, submetida ao processo de extração LLE e SPE. A
37

amostra foi derivatizada e seguida de análise em CG-MS. Foi observado nesse


estudo que a COC e morfina se encontram presentes em concentrações
maiores nas unhas do que nas amostras de cabelo. Essa diferença de
distribuição pode ser explicada devido as diferentes taxas de crescimento
dessas matrizes queratinizadas e seus mecanismos de incorporação das
drogas.
No Quadro 2 estão listados os trabalhos encontrados na literatura que
utilizaram a amostra de unha para detectar COC e seus metabólitos. Também
estão listados os solventes, as condições de extração utilizadas, técnica de
detecção e quantificação utilizada e demais informações sobre cada
metodologia, as quais foram utilizadas no estudo da escolha do método de
extração proposto, afim de comparação com a metodologia proposta no
presente estudo.
38

Quadro 2. Determinação de drogas em unhas.


Quantidade
Quantidade Solvente de
Analito Condições de extração Método analítico de amostra Referência Bibliográfica
(ng/mg) extração
(mg)
Tampão Fosfato 72 horas em temperatura
COC 0,46-140,17 CG-MS 3-5
0,1M (pH 6.0) ambiente
Tampão Fosfato 72 horas em temperatura
BZE 4,09-315,44 CG-MS 3-5 (16)
0,1M (pH 6.0) ambiente
Tampão Fosfato 72 horas em temperatura
CE 0,73- 2,60 CG-MS 3-5
0,1M (pH 6.0) ambiente
Tampão Fosfato 72 horas em temperatura
COC 1,2-414,1 CG-MS 20-30
0,1M (pH 6.0) ambiente
Tampão Fosfato 72 horas em temperatura
BZE 1,4-170,3 CG-MS 20-30 (18)
0,1M (pH 6.0) ambiente
Tampão Fosfato 72 horas em temperatura
CE 0,1-2,9 CG-MS 20-30
0,1M (pH 6.0) ambiente
Incubadas à 100ºC por 30
0,10-1,10 HCl 37% (v/v em
COC minutos e após 12 horas em CG-MS 50 (57)
água)
temperatura ambiente
COC Metanol 16 horas à 40ºC CG-MS 5
3-9
(20)
BZE 3-9 Metanol 16 horas à 40ºC CG-MS 5
COE 3- 9 Metanol 16 horas à 40ºC CG-MS 5
COC <0,25-16,1 Metanol 16 horas à 40ºC CG-MS 7-50
BZE 0,27-10,0 Metanol 16 horas à 40ºC CG-MS 7-50 (17)
7-50
CE <0,25-1,03 Metanol 16 horas à 40ºC CG-MS
100
COC 28,7-34,5 HCl 0,1M Incubadas overnight à 55ºC CG-MS
100
BZE 7,3-17,9 HCl 0,1M Incubadas overnight à 55ºC CG-MS (19)
100
CE < LOD HCl 0,1M Incubadas overnight à 55ºC CG-MS
39

3.3. Aspectos analíticos da detecção de cocaína em unhas

Existem inúmeras técnicas aplicáveis à análise toxicológica forense,


cada uma com vantagens e desvantagens. Os tópicos a seguir abordam
algumas das técnicas consolidadas na literatura e as utilizadas no presente
estudo.

3.3.1. Métodos de extração da cocaína em unha

O uso de técnicas analíticas avançadas é importante para isolar


eficientemente e detectar drogas e seus metabólitos presentes em matrizes
biológicas, especialmente em pequenas concentrações. O preparo da amostra
é realizado em múltiplos estágios e esse processo pode ter vários objetivos,
incluindo remoção de substâncias endógenas não desejadas que possam
interferir na determinação do analito alvo, liberação do analito da matriz,
extração, solubilização dos compostos, concentração ou estabilização dos
analitos, separação e/ou remoção de líquidos visando melhorar a seletividade e
sensibilidade (8).
Seja qual for a técnica selecionada para identificação e quantificação dos
analitos, a análise de matrizes biológicas requer um pré-tratamento devido à
sua complexidade. Como por exemplo, a presença de proteínas que tornam-se
interferentes endógenos incompatíveis com as colunas cromatográficas e
também devido às baixas concentrações das substâncias a serem analisadas.
Assim, as técnicas de extração e/ou pré-concentração permitem que a análise
dos componentes de interesse se torne possível, tendo como meta final a
obtenção de uma sub-fração da amostra original enriquecida com substâncias
de interesse analítico. Dessa forma é obtida uma separação cromatográfica
livre de interferentes, com detecção adequada e um tempo razoável de análise
(58).
Embora os processos analíticos usados na analise de drogas em unha
sejam semelhantes aos métodos usados em matrizes convencionas, as
concentrações encontradas na unha são muito mais baixas do que os valores
40

encontrados em uma análise de urina, por exemplo, o que requer o uso de


tecnologias compatíveis com a análise nessas concentrações.
Sendo assim, é de suma importância utilizar métodos de extração
eficazes, sempre evitando a hidrólise dos compostos de interesse durante este
procedimento.
Os preparos da amostra de unha publicados na literatura envolvem várias
etapas de preparo, com elevada manipulação e tempo de preparo da amostra,
seguindo basicamente os seguintes passos:
-Descontaminação;
-Diminuição do diâmetro (para aumentar a superfície de contato na
extração);
-Digestão (ácida, básica ou metanólica) e/ou extração (LLE e SPE) (15).
Vários procedimentos de extração de COC na amostra de unha já foram
publicados. Entre esses, pode-se observar o uso de solução Tampão (16, 18),
hidrólise ácida com ácido clorídrico (HCl) (19, 57), e solventes orgânicos, tais
como metanol (17, 20), sendo que a escolha do método é crucial a fim de
garantir que não estejam ocorrendo reações de transformação ou até mesmo
perda do analito, uma vez que a facilidade da conversão, tanto da COC quanto
do COE ao perder seus grupamentos durante a reação de hidrólise e serem
convertidos a BZE, como podemos observar na Figura 3.
41

CH
2

COCAÍNA
m/z 304

HIDRÓLISE CH CH
2 2

COCAETILENO
m/z 318

BENZOILECGONINA
m/z 290

Figura 3. Mecanismo da hidrólise da cocaína e cocaetileno à benzoilecgonina

A amostra de unha é uma amostra sólida, sendo possível a realização da


digestão da matriz utilizando ácidos ou bases fortes ou através da hidrólise
enzimática, bem como é possível, ainda, realizar diretamente a extração com
solventes orgânicos. Vale salientar, que nos casos onde a cocaína é o analito
de interesse, a hidrólise em meio alcalino, com hidróxido de Sódio (NaOH) é
pouco utilizada, devido a degradação deste composto (59), fazendo com que
haja a conversão de COC para BZE, sob pena dos resultados finais não
refletirem corretamente a concentração relativa de cada um dos analitos na
amostra inicial.
No caso do emprego de solventes orgânicos (extração líquido-líquido, por
exemplo) o solvente a ser utilizado deve alcançar os sítios onde as moléculas
da droga estão particularmente localizadas; não deve decompor os analitos;
deve ter um ótimo coeficiente de partição solvente/matriz, de acordo com os
princípios de extração em fase sólida (60).
42

Os métodos de extração comumente utilizados incluem a extração


líquido-líquido (LLE) e extração em fase sólida (SPE). A LLE é considerada um
método clássico de preparo de amostras. Sua eficiência depende da afinidade
do soluto pelo solvente, da razão das fases e do número de extrações.
Apresenta a vantagem de ser simples e poder usar diversos tipos de solventes.
Porém apresenta uma série de desvantagens, como o alto consumo de
solventes orgânicos de alta pureza; exposição do analista a compostos tóxicos;
várias etapas para sua execução; formação de emulsão entre as fases; e uso
de grandes volumes de amostras e de solventes (61). Em contrapartida, a SPE
apresenta uma variedade de fases extratoras que possibilitam diferentes tipos
de interações com os analitos, favorecendo a seletividade, especificidade;
remoção de interferentes; e diminuição do consumo de solventes.
A SPE é amplamente utilizada como uma técnica de preparo seletivo de
amostra que consiste na passagem de fluídos biológicos através de um
adsorvente, separando os interferentes dos analitos de interesse. Os analitos
devem ter uma maior afinidade pela fase sólida do que pela matriz de amostra,
ficando então retidos. Os compostos interferentes são eliminados por lavagem
com um solvente apropriado e os analitos são removidos da fase sólida eluindo
com solvente ou mistura de solventes. Finalmente, o solvente é eliminado e a
amostra reconstituída para analise instrumental. Os princípios de separação
envolvem forças intermoleculares entre os analitos, os sítios ativos do
adsorvente (fase sólida) e a fase líquida ou amostra (62).
Ambas as técnicas, LLE e SPE, apesar de terem seu uso difundido no
preparo de matrizes biológicas para detecção de drogas, pode-se observar que
fazem uso elevado de solventes, necessita de vários passos durante a
extração, e consequentemente, um maior trabalho do analista.
Sendo assim, faz-se necessário a busca de novos métodos analíticos
que visem a diminuição do preparo e manuseio da amostra a fim de se obter
uma melhor eficiência de extração, porém com custo e tempo de análises
menores.
43

3.3.2. Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas


(LC-MS)

Amostras biológicas são conhecidas pela complexidade de sua


composição e têm sido amplamente utilizadas na análise de drogas de abuso
por oferecer diferentes informações sobre o tempo e extensão da exposição do
usuário. O método utilizado para análise depende dos resultados que se quer
obter e das drogas que se quer encontrar. As técnicas podem ser utilizadas
sequencialmente para detecção, identificação e quantificação de drogas
presentes em matrizes biológicas. O método de separação de maior
importância e mais empregado no teste de drogas de abuso é a cromatografia
(63).
A cromatografia é um método físico-químico de separação dos
componentes de uma mistura, realizada através da distribuição desses
componentes em duas fases, que estão em contato íntimo: a fase móvel e a
fase estacionária (64).
Na cromatografia líquida os constituintes da amostra a serem separados
são particionados entre a fase estacionária e a fase móvel líquida. O HPLC é
uma técnica de separação que, em menos de 30 anos, passou a ser uma das
técnicas analíticas mais utilizadas para fins qualitativos e quantitativos. As
razões para este crescimento estão relacionadas à sua adaptabilidade para
determinações quantitativas com boa sensibilidade e a possibilidade de se
separar espécies não voláteis e termicamente instáveis (65).
As separações cromatográficas acopladas à espectrometria de massas
são mundialmente utilizadas na toxicologia forense, pois permitem a
separação, a identificação e determinação dos componentes químicos em
misturas complexas em amplas faixas de concentração (66). Além do mais, são
considerados métodos de escolha por serem muito sensíveis, específicos,
universais e rápidos (67).
Atualmente, a espectrometria de massas é considerada a melhor técnica
de detecção para a cromatografia, utilizada para o estudo das massas de
átomos, moléculas ou fragmentos de moléculas, desde que estes estejam
eletricamente carregados. Um espectrômetro de massas determina a massa de
44

uma molécula ou átomo medindo a razão massa/carga (m/z) dos íons gerados.
Os íons são gerados através da indução, perda ou o ganho de carga por uma
espécie eletricamente neutra. Uma vez formados, os íons são direcionados, por
forças eletrostáticas, para dentro do analisador de massas, separados de
acordo com suas razões m/z e finalmente detectados. O resultado da ionização
molecular, a separação e detecção de íons é o espectro de massas, que
mostra a intensidade relativa em função da m/z para cada íon (66).
A análise da massa de substâncias ionizadas por diferentes interfaces
são realizadas usando um ou dois analisadores de massas (MS-MS), que
consistem em armadilhas de íons ou predominantemente quadrupolos (67).
MS-MS é normalmente descrito por três quadrupolos, que são utilizados para
analisar a amostra em série. O primeiro filtra os íons do analito, permitindo
apenas a passagem de íons com a razão m/z desejada. A fragmentação do íon
escolhido (precursor) ocorre no segundo quadrupolo pelo impacto com
moléculas do gás de colisão para a formação dos íons produto, que podem ser
verificados pelo terceiro quadrupolo ou podem atingir seletivamente o detector,
como demonstra a Figura 4. As várias etapas da MS-MS eliminam
praticamente toda contaminação por compostos indesejados que podem
coeluir da coluna. Essas características ajudam a desvendar estruturas
moleculares complexas e elevar a confiança de identificação (63).
45

Figura 4. Esquema de funcionamento do LC-MS/MS (66).

Devido ao exposto, o acoplamento da cromatografia líquida com a


espectrometria de massas tem se tornado um procedimento útil e alternativo ao
CG-MS para a análise de compostos orgânicos polares e termicamente
instáveis, reduzindo a manipulação excessiva da amostra (68).
Porém a maioria das metodologias para a detecção de COC em
matrizes biológicas alternativas ainda são baseadas na técnica de CG-MS.
Esta é largamente aceita como o método analítico definitivo (padrão ouro)
devido à sua sensibilidade e seletividade e à facilidade de identificação dos
compostos por espectrometria de massas, porém, requer uma etapa de
derivatização (principalmente para metabólitos polares) para suas análises a
fim de melhorar as propriedades cromatográficas.
Enquanto a cromatografia gasosa pode ser facilmente acoplada à
espectrometria de massas, a cromatografia líquida requer o uso de interfaces
sofisticadas. Desde 1970, diferentes tipos de interfaces para LC-MS foram
desenvolvidas a fim de remover a fase móvel e ionizar o analito, como o
bombardeamento de átomos rápidos, ionização da matriz assistida por
dessorção a laser (MALDI), ionização química a pressão atmosférica (APCI) e
a eletronebulização (electrospray, ESI). Essas duas últimas são consideradas
as técnicas mais robustas para LC-MS (69).
46

A ionização por ESI é a técnica de ionização mais comumente utilizada.


Os compostos mais importantes na toxicologia possuem propriedades básicas,
como a COC, sendo assim, a ionização por ESI no modo positivo é geralmente
aplicada para esse composto (70).
Nos últimos anos a técnica de LC-MS tem recebido um aumento na
popularidade devido a vários fatores, tais como não requerer o passo de
derivatização e permitir determinações simultâneas de drogas originalmente
lipofílicas e metabólitos hidrofílicos. Além do mais, geralmente emprega um
preparo de amostra mais simplificado e tempo menor de análise (8).
Um crescente número de métodos vem sendo reportados para análise
de COC e seus metabolitos por LC-MS e LC-MS/MS (70-73) e a maioria
desses métodos utilizam SPE para o preparo da amostra, indicando o potencial
do uso conjunto destas para análises forenses. Devido à boa precisão e
robustez, aliadas à possibilidade de obtenção de limites de detecção na ordem
de ng/mL e/ou pg/mL, esta técnica vem sendo largamente utilizada na
detecção e quantificação deste analito em diversas matrizes, como em fluídos
biológicos (74), cabelo (71), saliva (11) tecidos como cérebro (75), mecônio
(76), etc.

3.4. Validação de métodos cromatográficos

Para garantir que um novo método analítico gere informações confiáveis


e interpretáveis sobre a amostra, ele deve ser submetido a uma avaliação
denominada validação, visando diminuir ou controlar os fatores que levam à
imprecisão ou inexatidão de um dado gerado (77) e permitir a quantificação de
compostos endógenos ou exógenos de matrizes biológicas.
Segundo Ribani (77), a validação de um método é um processo contínuo
que começa no planejamento da estratégia analítica e continua ao longo de
todo o seu desenvolvimento, sendo que um processo de validação bem
definido e documentado oferece às agências reguladoras evidências objetivas
de que os métodos e os sistemas são adequados para o uso desejado.
47

A Resolução RDC nº 27, de 17 de maio de 2012 define validação como a


confirmação por ensaio e fornecimento de evidência objetiva de que os
requisitos específicos para um determinado uso pretendido são atendidos.
Métodos analíticos seletivos e sensíveis para a avaliação quantitativa de
drogas e seus metabólitos (analitos) são pontos críticos fundamentais para o
êxito da condução de um estudo clínico. A validação de métodos bioanalíticos
incluem todos os procedimentos que demonstram que um método em particular
utilizado para medidas quantitativas de analitos em uma determinada matriz
biológica, como sangue, urina e etc, devendo ser confiável e reprodutível para
o uso pretendido. A aceitação dos dados analíticos corresponde diretamente
com os critérios utilizados para validação do método (78).
Os parâmetros fundamentais que serão utilizados para validação incluem:
linearidade, sensibilidade (LOD (limite de detecção); LOQ (limite de
quantificação)), exatidão/precisão, seletividade, efeito de matriz, efeito residual
(carryover) e estabilidade dos analitos em solução. Todos os ensaios foram
seguidos de acordo com a RDC nº 27, de 17 de maio de 2012 que dispõem
sobre os requisitos mínimos para a validação de métodos bioanalítico.

3.4.1. Linearidade

A linearidade é definida como a capacidade de uma metodologia


analítica de demonstrar que os resultados obtidos são diretamente
proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo
especificado. Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela analise
de, no mínimo, 5 concentrações diferentes. O critério mínimo aceitável do
coeficiente de correlação (r) deve ser igual a 0.99.

3.4.2. Seletividade

A seletividade e/ou especificidade de um método bioanalítico é um


importante parâmetro a ser avaliado para garantir que a quantificação do
48

analito de interesse não seja afetada pela presença de metabólitos, produtos


de degradação, fármacos coadministrados ou compostos endógenos (79).
A seletividade refere-se a um método que permite a análise de várias
substâncias químicas que podem ou não ser distinguíveis. É medida através do
tempo de retenção, parâmetro utilizado em técnicas cromatográficas (80).

3.4.3. Limite de detecção (LOD) e Limite de quantificação (LOQ)

O limite de detecção é definido como a menor quantidade do analito


presente em uma amostra que pode ser detectado, porém não
necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas.
O limite de detecção é estabelecido por meio da análise de soluções de
concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível
detectável.
E o Limite de Quantificação é a menor quantidade do analito em uma
amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as
condições experimentais estabelecidas.

3.4.4. Precisão intra- e inter-ensaio

Segundo a Resolução nº 899, de 29 de maio de 2003, a precisão é dada


como a concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos
em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.
Para a determinação da precisão intermediária recomenda-se um mínimo de 2
dias diferentes.

3.4.5. Estabilidade dos analitos na matriz

A avaliação da estabilidade dos analitos é realizada a fim de assegurar


que a integridade do composto seja mantida durante todo o processamento,
sendo que determinados testes de estabilidade devem ser realizados durante
os estágios de desenvolvimento do método (81).
49

3.4.6. Efeitos de matriz

O efeito de matriz é um estudo de seletividade que objetiva averiguar


possíveis interferências causadas pelas substâncias que compõem a matriz
amostral gerando, basicamente, fenômenos de diminuição ou ampliação do
sinal ou resposta instrumental (82).
50

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Materiais
4.1.1. Reagentes

- Metanol, grau HPLC, 99,8%, (J. T. Baker®);


- Acetonitrila, grau HPLC, 99,8%, (J. T. Baker®);
- Ácido fórmico 98-100%, (Merk®);
- Formiato de amônio (≥99,995%), (Sigma Aldrich®);
- Fosfato de potássio bibásico, (Vetec®);
- Fosfato de potássio monobásico, (Vetec®);
- Acetato de Etila (grau HPLC), (Tedia®).

4.1.2. Soluções padrão

Soluções-padrão certificados de cocaína, cocaetileno e benzoilecgonina


foram obtidas da Cerilliant® na concentração de 1 mg/mL em acetonitrila e seus
respectivos deuterados (cocaína-D3, cocaetileno-D3) foram obtidos da Cerilliant®
na concentração de 100 µg/mL em acetonitrila.
A partir dessas soluções, foram preparadas soluções de trabalho,
utilizando como solvente a fase móvel de composição acetonitrila : água (95:5
v/v) nas concentrações de 1µg/mL de cada substância. As soluções foram
armazenadas a -20ºC.

4.1.3. Equipamentos e acessórios

- Cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado à espectrometro de massas


(Triploquadrupolo) modelo LC-MS 8040, (Shimadzu®);
- Coluna cromatográfica Kinetex®, fase estacionária C18, tamanho do poro 100
Å, tamanho da partícula 2.6µ, comprimento 100mm e diâmetro interno de
3.00mm, lote nº 596153-94;
51

- Pipetas de volume variável, (Eppendorf®);


- Agitador orbital tipo Vortex (Ika®);
- Banho de ultrasom (modelo Ultrasonic Cleaner (Unique®);
- Gases especiais para LC-MS/MS: nitrogênio 5,0 e argônio 5,0;
- Balança analítica, modelo Q-500L210C (min 1mg; máx 210g) (Quimis®);
- Filtro Millex 0,25µm;

4.2. Métodos

4.2.1. Amostra de unha

As amostras de unhas foram concedidas pela Superintendência da Polícia


Técnico Científica (SPTC) da cidade de São Paulo, coletadas nos institutos
Médico Legal (IML) da zona oeste e sul, com aprovação da comissão científica
do IML e sob autorização de familiar responsável legal através de Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo 1). Quando a amostra for
coletada de cadáveres indigentes, onde não há família para assinar o TCLE,
este é dispensado. O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética e
Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de
Campinas-UNICAMP.
Amostras controles negativos foram coletadas de voluntários doadores
sob autorização através de Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
(Anexo 2).
Foram analisadas um total de 10 amostras. Para tal, foram coletadas a
borda livre de aproximadamente 4 unhas de cada cadáver com auxílio de
cortadores de unhas, as amostras foram armazenadas em embalagem plástico,
devidamente esterilizado e identificado, e posteriormente foram armazenadas a -
15ºC até o momento da análise.
52

4.2.2. Análise toxicológica em unhas

Antes de validar qualquer método analítico é necessário que seja realizado


um desenvolvimento prévio de todos os parâmetros envolvidos, incluindo
extração, otimização de operação do equipamento e condições cromatográficas,
para que, somente após realizado este, o método possa ser devidamente
validado.

4.2.3. Desenvolvimento do método para extração e determinação de


cocaína e metabólitos em amostras de unha

4.2.3.1. Otimização das condições do equipamento

Para determinação de cocaína e seus metabólitos em unha foi utilizado


um equipamento de cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de
massas com analisador triplo quadrupolo, modelo LC-MS 8040 (Shimadzu). O
espectrômetro de massas é equipado com uma fonte de ionização electrospray
(ESI), no modo positivo. A coluna empregada foi Kinetex 2.6µ C18 (100 x
3,0mm) e as fases móveis foram água (solução A- 0,01% de ácido fórmico +
5mM de formiato de amônio) e acetonitrila (solução B- 0,01% de ácido fórmico).
As condições de operação do equipamento que foram otimizadas encontram-se
descritas a seguir:

a) Parâmetros de ionização

Buscando obter a maior intensidade do sinal e, consequentemente uma


melhor sensibilidade na análise, realizou-se a otimização dos parâmetros de
ionização avaliando as condições da fonte. Os fatores avaliados foram:
temperatura de dessolvatação (200, 250 e 260 ºC), fluxo do gás nebulizante (2,5
e 3,0 L min-1) e fluxo do gás de secagem (8 a 17 L min-1).
53

b) Precisão do injetor

A fim de verificar a repetibilidade dos dados obtidos, realizou-se um teste


de precisão do injetor. Para tal, foram realizadas injeções sequenciais de seis
amostras da mistura de padrões contendo COC (150 ng/mL), BZE (200 ng/mL) e
COE (10 ng/mL), intercaladas com amostra de branco (solvente).

c) Condições cromatográficas

A fim de promover uma melhor separação dos analitos foram avaliados os


seguintes parâmetros: volume de injeção (1 µL, 2 µL, 3 µL e 5 µL), fluxo da fase
móvel (0,1 a 0,5 mL/min) e gradiente de fase móvel.

d) Efeito de memória (Carryover)

Tal análise foi realizada com o intuito de avaliar a contaminação por efeito
de memória entre uma análise e outra. Nesse sentido, realizou-se injeções
sequenciais de um branco (solvente) intercalado com a mistura de padrões
descrita anteriormente.

4.2.3.2. Preparo da matriz biológica-unha

A fim de realizar uma completa descontaminação das unhas, proveniente


da manipulação da droga ou contaminação ambiental, as amostras foram
submetidas a um processo de limpeza de acordo com Valente-Campos(20):
amostras de unha (~10 mg) foram pesadas e lavadas com 3 mL de água sob
agitação em vórtex por 15 segundos. Em seguida foram lavadas três vezes com
3 mL de metanol durante 15 segundos sob agitação em vórtex. O metanol de
cada lavagem foi transferido para outro tubo, evaporado até ± 0,8mL e
armazenado para análises posteriores.
As unhas foram secas em estufas a 40ºC por 2 horas e posteriormente
submetidas ao processo de moagem criogênica visando a pulverização das
54

amostras para aumentar a superfície de contato durante o procedimento de


extração dos analitos de interesse. Para a realização da moagem criogênica, as
amostras foram congeladas com nitrogênio líquido a uma temperatura de -196ºC
e trituradas com auxílio de um pistilo em gral de porcelana.
Após obtenção das unhas pulverizadas, as mesmas foram submetidas
aos métodos de extração estudados descritos a seguir.

4.2.3.3. Estudo do método de extração da cocaína em unhas

Alguns fatores podem influenciar na eficiência de extração da COC e seus


metabólitos em matrizes biológicas. Com a finalidade de otimizar esses fatores e
obter a máxima eficiência do método de extração, foi empregado delineamento
experimental de triagem, isto é, planejamento fatorial.
O planejamento fatorial é uma ferramenta estatística importante e simples,
porém pouco empregada e explorada. A observação dos efeitos de variáveis e
interações entre elas é de extrema importância para entender os processos que
estão sendo monitorados em um determinado sistema (83).
A partir dos estudos preliminares foram selecionadas as variáveis
descritas na Tabela 1. Foi realizado um planejamento fatorial 23 resultando em
oito experimentos para avaliar o efeito das variáveis sobre a eficiência de
extração. Todos os ensaios foram realizados em duplicata. O software utilizado
para análise estatística foi o Design-Expert®.
55

Tabela 1. Planejamento das condições experimentais para otimização do


método de extração de cocaína e seus metabólitos em unha.
Ensaio Fatores codificados Fatores originais
Tempo
N=2 F (1) F(2) F(3) Solvente extrator Temperatura (ºC)
(horas)
1 +1 -1 -1 Metanol 16 25
2 +1 -1 +1 Metanol 16 40
3 +1 +1 -1 Metanol 72 25
4 +1 +1 +1 Metanol 72 40
5 -1 -1 -1 Tampão fosfato 0,1M pH 5.0 16 25
6 -1 -1 +1 Tampão fosfato 0,1M pH 5.0 16 40
7 -1 +1 -1 Tampão fosfato 0,1M pH 5.0 72 25
8 -1 +1 +1 Tampão fosfato 0,1M pH 5.0 72 40

Amostras de unhas controle negativas foram fortificadas com a mistura de


padrões com concentração conhecida de COC, BZE e COE, e posteriormente
submetidas às condições de extração descritas na Tabela 1
A escolha da melhor condição de extração para COC e seus metabólitos
foi obtida através da medida da área dos picos na análise em LC-MS.
Após a seleção da técnica de extração mais eficiente e viável, fez-se o
desenvolvimento de um novo método de extração utilizando acetato de etila
como solvente extrator em banho de ultrassom, visando obter um método mais
rápido, reduzindo o tempo e preparo de amostra. Para tal, unhas controle
negativa foram fortificadas com as mesmas concentrações dos analitos e
posteriormente realizou-se extrações em tempos decrescentes, até obtenção de
um menor tempo em que se mostrou eficiente e viável.

4.2.3.4. Validação do método

O método de análise previamente desenvolvido e otimizado foi validado


estabelecendo os valores de linearidade, precisão intra e interensaio, limite de
detecção, limite de quantificação e estabilidade dos analitos na matriz e efeito de
matriz. Todas as amostras foram adicionadas de padrão interno (PI) deuterado
(cocaína-D3 (COC-D3) e cocaetileno-D3 (COE-D3)) antes do procedimento de
preparo de amostra.
56

4.2.3.4.1. Linearidade

Para realização da curva de calibração foram feitas análises de uma


amostra branco (matriz de unha isenta de padrão dos metabólitos), uma amostra
zero (matriz biológica com adição de PI na concentração de 6.38 ng/mL) e
amostras contendo o padrão dos metabólitos e PI de acordo com as
concentrações descritas abaixo.
O estudo de linearidade foi realizado pela análise dos extratos de amostra
de unha fortificados com concentrações para COC, BZE e COE de 0,50, 0,75,
3,00, 6,38, 9,38 e 12,50 ng/mL e PI (COE-D3 e COC-D3) na concentração 6,38
ng/mL. O estudo de linearidade foi realizado pela análise das amostras de unha
submetidas ao método em triplicata. Curvas de calibração foram construídas e
os coeficientes de correlação calculados. A adequação do modelo foi avaliada
através da análise de resíduos.

4.2.3.4.2. Limite de detecção (LOD) e Limite de quantificação (LOQ)

O limite de detecção (LOD), definido como a menor concentração de um


analito que o procedimento bioanalítico consegue diferenciar com confiança do
ruído de fundo, ou ainda, a menor concentração da substância em exame que
pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, utilizando um
determinado procedimento experimental. O LOD foi definido através da análise
de quatro amostras negativas de unhas que foram fortificadas com soluções de
padrões em concentrações decrescentes. Foi considerado como LOD aquele
referente à menor concentração na qual foi possível obter picos integrados pelo
equipamento que se diferenciaram do ruído, no mínimo 3 vezes, em quatro
replicatas, nas condições especificadas e que apresentou coeficiente de
variação (CV) ≤20% (81).
O limite de quantificação (LOQ), definido como a menor concentração
para medidas quantitativamente precisas, foi determinado através da análise de
quatro amostras negativas de unhas fortificadas com soluções de padrões em
concentrações decrescentes e foi considerado como LOQ a menor concentração
57

que apresentou CV ≤15%, na qual foi possível obter picos integrados pelo
equipamento que se diferenciaram do ruído, no mínimo 10 vezes (81).

4.2.3.4.3. Efeito de matriz

O efeito de matriz (efeito dos constituintes da matriz na resposta


cromatográfica) foi avaliado. Para isso foram preparadas duas séries de solução
padrão contendo COC, BZE e COE nas concentrações 0,75 e 9,38 ng/mL. A
primeira série foi preparada diluindo os analitos em fase móvel e a segunda série
foi preparada pela diluição da solução de trabalho em um extrato da matriz sem
adição do analito (matriz branca).
O efeito de matriz foi avaliado comparando as áreas obtidas para cada
uma das matrizes estudadas, sendo aprovado quando CV ≤15%.

4.2.3.4.4. Estabilidade dos analitos na matriz

Amostras de unha contendo COC, BZE e COE nas concentrações 0,75 e


9,38 ng/mL foram armazenadas e analisadas através do método padronizado
em três replicatas para cada concentração. Também foi estudada a estabilidade
dos analitos em 3 (três) ciclos de congelamento e descongelamento por 3 (três)
dia. A estabilidade dos analitos em unha foi avaliada por meio da comparação da
resposta obtida no tempo zero com a resposta obtida após o período de
armazenamento de 5 dias em condições de temperatura ambiente e a 4ºC
(geladeira).

4.2.3.4.5. Precisão intra- e inter-ensaio

A precisão intra- e inter-ensaio, foi determinada indiretamente pelo cálculo


de imprecisão através da determinação do CV. O estudo foi conduzido
analisando amostras negativas de unha fortificadas com os analitos (COC, BZE
e COE) nas mesmas concentrações para o teste de linearidade (0,50, 0,75, 3,00,
58

6,38, 9,38 e 12,50 ng/mL) em três dias diferentes. As análises foram realizadas
em seis replicatas para cada concentração em cada dia.

4.2.4. Aplicação em amostras reais (correlação clínica)

Para comprovar a eficiência do método de análise validado, o mesmo


será aplicado em amostras reais de corpos periciados provenientes do Instituto
Médico-Legal (IML).
Todos os cálculos utilizados na validação do método foram realizados
com o auxílio do Microsoft Excel® do programa Microsoft Office XP
Professional 2007.
59

5. RESULTADOS

5.1. Otimização das condições de operação do equipamento

Para a operação do espectrômetro de massas, o analisador utilizado foi


um triplo quadrupolo configurado para o monitoramento de reações múltiplas
(MRM) e equipado com fonte de ionização ESI, no modo positivo.
Para a fonte de ionização, foi observado que os parâmetros que
proporcionaram um ganho significativo na intensidade do sinal foram: fluxo do
gás de nebulização de 3 L/min, temperatura de dessolvatação de 250ºC e fluxo
do gás de secagem de 9 L/min. As melhores condições de fragmentação dos
íons monitorados foram: voltagem do capilar de 4,5 kV e voltagem do detector
de 1,92 kV.
A Tabela 2 apresenta os resultados de energia de colisão, tempo de
retenção e os íons de quantificação e confirmação selecionados. Para cada
composto foram selecionados dois fragmentos característicos. O fragmento mais
intenso (mais estável) foi escolhido para quantificação do composto e o segundo
fragmento mais intenso para confirmação do mesmo. As Figura 5, Figura 6 e
Figura 7 apresentam os espectros de massas obtidos através da injeção direta
das soluções dos analitos no espectrômetro de massas, de onde foi possível
obter os resultados de fragmentação. Na figura 5 está representada a
fragmentação da cocaína, destaque para o íon m/z 304, referente a cocaína
protonada; e os íons m/z 82 e 77 referentes aos fragmentos mais intensos da
molécula de cocaína. Na figura 6 está representada a fragmentação da
benzoilecgonina, destaque para o íon m/z 290, referente a benzoilecgonina
protonada; e os íons m/z 168 e 105 referentes aos fragmentos mais intensos da
molécula de cocaína. Na figura 7 está representada a fragmentação do
cocaetileno, destaque para o íon m/z 318, referente ao cocaetileno protonado; e
os íons m/z 196 e 82 referentes aos fragmentos mais intensos da molécula de
cocaetileno.
60

Tabela 2. Resultado da otimização das condições de fragmentação para


determinação dos analitos no LC-MS/MS. A transição usada para quantificação
esta sublinhada.
Tempo de Energia de
Composto MRM
retenção (min) colisão (eV)
304>182 -19
Cocaína 6,1
304>77 -54
290>168 -17
Benzoilecgonina 5,4
290>105 -28
318>196 -20
Cocaetileno 6,6
318>82 -32

Inten. (x1,000,000)

1,0 182,1

0,5
304,2
82,1 150,1
0,0
50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 m/z

Inten. (x100,000)
3,0
77,1
2,0

82,1
1,0
105,1
59,0
0,0
50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 m/z

Figura 5. Espectro de massas obtido para solução de cocaína.


61

Inten. (x10,000)
5,0
168,0

2,5
290,1
104,9 142,2 237,3
0,0
50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 m/z

Inten. (x10,000)
2,0
105,0
168,0
1,0 115,8
82,1
135,0 157,4 245,3 269,6
0,0
50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 m/z

Figura 6. Espectro de massas obtido para solução de benzoilecgonina.

Inten. (x100,000)
196,1
5,0

2,5 318,2

82,1
0,0
50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 m/z

Inten. (x100,000)
2,0 82,1

196,1
1,0 105,0
119,1 150,1
67,0 168,1
0,0
50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 m/z

Figura 7. Espectro de massas obtido para solução de cocaetileno.

E as figuras Figura 8 e Figura 9 apresentam os espectros dos padrões


internos deuterados utilizados (COC-D3 e COE-D3). Na figura 8 está
62

representada a fragmentação da cocaína deuterada (cocaína-D3), destaque


para o íon m/z 307, referente cocaína deuterada; e os íons m/z 115 e 102
referentes aos fragmentos mais intensos da molécula de cocaína-D3. Na
figura 9 está representada a fragmentação do cocaetileno deuterado
(cocaetileno-D3), destaque para o íon m/z 321, referente ao cocaetileno
deuterado; e os íons m/z 183 e 105 referentes aos fragmentos mais intensos
da molécula de cocaetileno-D3.

Inten. (x100,000)

307,2
3,0 115,1

2,0
100,3
1,0
183,0 213,6 256,3
0,0
100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 350,0 375,0 m/z
Inten. (x1,000,000)

4,5 102,1

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5
307,2
1,0

0,5
115,1
0,0
100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 350,0 375,0 m/z

Figura 8. Espectro de massas obtido para solução de cocaína deuterada


(Cocaína-D3).
63

Inten. (x100,000)
9,0
321,2
8,0

7,0

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0 100,1
115,1
1,0 365,1

0,0
100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 350,0 375,0 m/z
Inten. (x100,000)
5,5
321,2
5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5
105,0
1,0 115,1
365,2
0,5 183,1

0,0
100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 350,0 375,0 m/z

Figura 9. Espectro de massas obtido para solução de cocaetileno deuterado


(Cocaetileno-D3).

Definidos os parâmetros no espectrômetro de massa, realizou-se a


otimização das condições de separação cromatográfica. Após definir a
melhor proporção da fase móvel (Tabela 3) e tempo de corrida no modo de
eluição com gradiente, foi possível obter uma adequada separação dos picos,
bem como picos definidos.

Tabela 3. Gradiente da fase móvel utilizado no sistema cromatográfico para a


determinação de cocaína e metabólitos em unha.
Concentração A Concentração B
Etapas Tempo (minutos)
(%) (%)
1 2 95 5
2 5,5 60 40
3 7,0 60 40
4 8,0 0 100
5 9,0 95 5
A: Água (0,01% ácido fórmico+5mM de formiato de amônio); B: Acetonitrila(0,01% Ácido
fórmico
64

A Figura 10 apresenta o cromatograma obtido no modo de ionização


positivo de uma solução da mistura de padrões de COC, BZE e COE nas
concentrações de 150, 200 e 10 ng/mL, respectivamente, antes e após o
procedimento de padronização e otimização das condições analíticas. O tempo
total da análise foi de 10 minutos de acordo com as condições cromatográficas
descritas nas Tabela 3 e Tabela 4.

Tabela 4. Condições empregadas no sistema cromatográfico


Parâmetros Condições empregadas
Coluna analítica Kinetex® 2.6µ C18 100ª (100 x 3.0mm)
Água (0,01% ácido fórmico + 5mM de formiato de
Fase Móvel
amônio): Acetonitrila(0,01% Ácido fórmico)
Vazão 0,4 mL/minuto
Volume de injeção 5 µL
65

(a)

(b)

Figura 10. Cromatograma de uma solução padrão de COC, BZE e COE antes
(a) e depois (b) da otimização das condições experimentais. Transições
selecionadas: 290>168 (benzoilecgonina); 304>182 (cocaína); 318>196
(cocaetileno).

Após otimização de todos os parâmetros descritos acima, observou-se


um ganho significativo de intensidade do sinal, bem como obteve-se melhores
simetrias de picos (Figura 10) ótima separação cromatográfica, o que resultou
em aumento da sensibilidade do método e consequentemente, possibilitou a
obtenção de menores LOD e LOQ na validação do método, mostrando a
importância da otimização de todas as condições experimentais antes da
validação dos métodos analíticos.
Na avaliação do efeito de memória e contaminação cruzada foi possível
observar que a injeção da mistura de padrões descrita anteriormente, seguido
da injeção de uma triplicata de brancos não apresentou esse efeito como
apresentado na Figura 11.
66

Também foi avaliada a precisão do injetor com o intuito de verificar a


repetibilidade das injeções. Para tal fez-se a injeção da mistura dos padrões de
COC, BZE e COE e os resultados foram avaliados através do desvio padrão
obtido. Os resultados estão demonstrados na Tabela 5, onde é possível
observar uma boa repetibilidade das injeções, para ambos os metabólitos com
CV< 5,0.

Tabela 5. Resultados para a análise da precisão do injetor.


Área do Analito
Injeção
COC BZE COE
1 110620,0 31346,0 106118,0
2 104201,0 30834,0 98869,0
3 106956,0 31271,0 98688,0
4 112066,0 30012,0 99409,0
5 109077,0 31410,0 101899,0
6 104387,0 34507,0 99294,0

Média 107884,5 31563,3 100712,8

CV (%) 3,0 4,9 2,9


COC (cocaína); BZE (benzoilecgonina); COE (cocaetileno); CV (coeficiente de variação)
67

Figura 11. Cromatogramas obtidos da injeção da mistura de padrão de BZE,


COC e COE e injeção de soluções brancos (sem adição da droga).
68

5.2. Otimização das condições de extração da cocaína

Para determinação das melhores condições de extração, em termos de


solvente, tempo e temperatura foi realizado um planejamento fatorial com
objetivo de obter máxima eficiência de extração ao comparar os métodos
disponíveis na literatura. Os resultados desse estudo foram analisados através
de análise de variância (ANOVA).
Segundo Migliato e colaboradores (84), as variáveis podem ser divididas
em duas categorias, quantitativas e qualitativas. Portanto, para o presente
estudo os solventes de extração metanol e solução tampão fosfato são as
variáveis qualitativas e o tempo e a temperatura de extração são as variáveis
quantitativas, uma vez que são valores numéricos e expressam quantidade
(84).
A análise de variância (ANOVA) para extração da COC indica que as
interações entre as variáveis consideradas (solvente, tempo e temperatura de
extração) são significativos entre si (p<0,05) (Tabela 6).

Tabela 6. Análise da variância dos resultados de extração de cocaína.


Fontes de
GL SQ F P
variação
A 1 5.689 187.78 <0.0001*
B 1 4.733 156.23 <0.0001*
C 1 1.038 342.75 <0.0001*
AB 1 5.234 172.78 <0.0001*
AC 1 7.931 261.79 <0.0001*
BC 1 1.152 38.04 0.0003*
ABC 1 3.677 121.37 <0.0001*
Erro 8 2.424
Total 15 3.904
Desvio Padrão (DV): 1740.53; Coeficiente de Variação (CV): 7,11; R2 = 99,38%; R2
(ajustado)= 98,84%. GL: grau de liberdade; SQ: soma dos quadrados; F: valor de teste F; P:
valor de significância; A: solvente; B: tempo de extração; C: temperatura de extração.
*Valores significativos quando p<0,05.

A Figura 12 apresenta os efeitos de interação entre as variáveis solvente


e tempo de extração, sendo possível observar que a melhor condição de
69

extração da COC foi com o uso de metanol como solvente de extração durante
16 horas a 40ºC.

Figura 12. Gráfico de interação entre as variáveis A: solvente e B: tempo de


extração, a uma temperatura de 40ºC para extração da cocaína.

Assim como para a COC, a análise de variância (ANOVA) para


extração de BZE indica que as interações entre as variáveis consideradas
(solvente, tempo e temperatura de extração) são significativos entre si
(p<0,05) (Tabela 7).
70

Tabela 7. Análise da variância dos resultados de extração de


benzoilecgonina.
Fontes de
GL SQ F P
variação
A 1 1.091 14.27 0.0004*
B 1 1.176 21.94 0.0011*
C 1 1.227 0.024 0.8812
AB 1 4.537 9.12 0.0145*
AC 1 9.234 18.57 0.0020*
BC 1 1.665 33.47 0.0003*
ABC 1
Erro 8 4.387
Total 15 7.705
2 2
Desvio Padrão (DV): 1740.53; Coeficiente de Variação (CV): 7,11; R = 99,38%; R
(ajustado)= 98,84%. GL: grau de liberdade; SQ: soma dos quadrados; F: valor de teste F; P:
valor de significância; A: solvente; B: tempo de extração; C: temperatura de extração.
*Valores significativos quando p<0,05.

A Figura 13 apresenta os efeitos de interação entre as variáveis solvente


e tempo de extração, onde podemos observar que a melhor condição de
extração para a BZE foi com o uso de tampão fosfato como solvente extrator
durante 16 horas a 24ºC.
Foram mensurados somente os dados de BZE e COC uma vez que o
metabólito COE apresenta as mesmas condições de extração da BZE e COC.
Apesar das diferentes condições ideais de extração obtidas para cada
composto, ao analisar ambos os compostos (COC e BZE), foram obtidas
quatro possíveis condições de extração, como apresentado na Tabela 8. A
condição sublinhada foi selecionada como a melhor condição dada pelo
software, visto que esta é resultado da predição de uma condição otimizada
para ambos os metabólitos em um único método.
71

Figura 13. Gráfico de interação entre as variáveis A: solvente e B: tempo de


extração, em temperatura ambiente para extração da benzoilecgonina.

Tabela 8. Melhores condições de extração para cocaína e benzoilecgonina


obtidas através do software Design-Expert®.
Solvente Tempo Temperatura BZE COC
Número
(horas) (ºC)
1 Metanol 46,30 40 28982,4 43995,3
2 Metanol 48,64 40 29400,2 42433,9
Tampão
3 16,00 24 40370,7 19315,5
fosfato
Tampão
4 72,00 40 30618,2 21908
fosfato
BZE: benzoilecgonina; COC: cocaína.

Contudo, vale salientar, que cada vez mais há a necessidade do


desenvolvimento de metodologias que sejam relativamente rápidas, para que
possa se aplicado em uma rotina laboratorial. Para tal, os métodos precisam
ter o mínimo de preparo de amostra possível, serem rápidos, obtendo o
máximo de eficiência de extração.
72

Além do mais, sabe-se que preparos de amostra em que usam elevados


tempos de preparo e temperatura de extração, já é de se esperar que possam
ocorrer hidrólise dos compostos, e o software não é capaz de analisar essas
variáveis.
Através da análise de dados obtidos pelo software Design Expert®, foi
visível a ocorrência de reações de hidrólise em ambos os procedimentos,
observando-se as áreas obtidas para este onde a área da BZE aumenta na
mesma proporção que a área da COC diminui, podendo então, excluir nesse
estudo o uso do tampão como opção de escolha para solvente extrator
(Tabela 8).
Bem como, na melhor condição de extração selecionada através do
software (metanol, 40ºC por 46 horas) também foi possível observar a
hidrólise da COC, como esta demonstrando a Figura 14.

(a) Metanol 16 hs (b) Metanol 72 hs


40ºC 40ºC

COC COC

BZE
BZE

Figura 14. Hidrólise da cocaína à benzoilecgonina quando o metanol é


utilizado como solvente extrator.

Diante do exposto, realizou-se o estudo de um método que vise obter a


mesma eficiência de extração, prevenindo a ocorrência de reações de
hidrólise, porém com um menor tempo de preparo de amostra. Para esse fim,
realizamos a extração com acetato de etila que se mostrou um bom solvente
73

extrator. Um fluxograma foi desenhado para demonstrar a preparação das


amostras de unha (Figura 15).

Amostra de unha

Descontaminação Fração do metanol


(Metanol) da
descontaminação

Moagem criogênica

Extração com
acetato de etila

Análise LC-MS

Figura 15. Fluxograma do procedimento de preparo de amostra (unha) para


determinação de cocaína e metabólitos usando acetato de etila como solvente
extrator.

Para proceder tal estudo, unhas consideradas como controle negativo


foram fortificadas com as mesmas concentrações dos analitos e
posteriormente foram realizadas duas extrações, ao mesmo tempo, utilizando
metanol e acetato de etila em banho de ultrassom por um período de 12
horas. Na Figura 16 estão representados os cromatogramas obtidos após as
extrações com (a) acetato de etila e (b) metanol e na Figura 17 o
74

cromatograma obtido da solução de uma mistura de padrões na mesma


concentração da solução utilizada para fortificar as amostras de unha controle
negativo, onde é possível observar um perfil muito parecido entre e o
cromatograma obtido através da extração com acetato de etila (a) (Figura 16).
Após comprovação da eficiência do solvente acetato de etila como
solvente extrator, um novo estudo foi realizado, a fim de diminuir esse tempo
de extração ao máximo. Para tal, fez-se extrações sequenciais, em tempo
decrescente, até encontramos o menor tempo possível capaz de fornecer os
mesmos resultados obtidos quando realizada a extração por 12 horas.
Finalmente, o método de extração selecionado, onde foi possível obter
valores de eficiência de extração melhores do que os obtidos anteriormente.
O método seguiu de duas extrações com 500µL de acetato de etila em banho
de ultrassom por um período de 15 minutos. Após a centrifugação, o
sobrenadante foi transferido para um novo eppendorf que foi evaporado em
atmosfera de nitrogênio. O resíduo foi dissolvido em 1 mL de fase móvel para
posterior injeção no LC-MS.
75

(a)

(b)

Figura 16. Cromatogramas de: (a) Amostra de unha fortificada com a mistura dos
padrões e submetida à extração com acetato de etila por um período de 16 horas; (b)
Amostra de unha fortificada com a mesma mistura dos padrões e submetida à extração
com metanol por um período de 16 horas. Unhas adicionadas de Padrão interno
deuterado.
76

Figura 17. Cromatograma da solução de uma mistura dos padrões de COC, BZE e
COE na concentração de 12,50 ng/mL, e padrões deuterados COC-D3 e COE-D3 na
concentração de 6,38 ng/mL diluídos em fase móvel (acetonitrila:água 5:95 v/v).

Figura 18. Amostra de unha fortificada com a mistura dos padrões de COC, BZE e
COE na concentração de 12,50 ng/mL, e padrões deuterados COC-D3 e COE-D3 na
concentração de 6,38 ng/mL, e submetida à extração com acetato de etila por um
período de 15 minutos em ultrassom.
77

5.3. Validação do método

Todos os ensaios foram realizados de acordo com a RDC nº 27, de 17


de maio de 2012.

5.3.1. Linearidade

As curvas de calibração foram construídas incluindo a análise da


amostra branco, da amostra zero e de 6 pontos de calibração em diferentes
concentrações do padrão dos analitos adicionados e do PI, como preconiza a
RDC nº 27.
Os resultados obtidos para linearidade através da realização de curvas
analíticas dos extratos de unha fortificados com a mistura dos padrões e seus
respectivos padrões deuterados indicaram boa linearidade em toda a faixa
estudada (0,50 – 12,50 ng/mL). Na Tabela 9 estão representados os
resultados obtidos para a calibração dos analitos (COC, BZE e COE) no
equipamento de LC-MS e nas Figura 19, Figura 20 e Figura 21, encontram-se
suas respectivas curvas de calibração.
78

Tabela 9. Resultados obtidos para calibração dos analitos de COC, BZE e


COE no sistema de LC-MS/MS
Curva analítica na matriz de
Analito unha
r / r2
y=0,2668x+0,2092
Dia 1 2
r :0,9990 / r= 0,9994
y=0,2719x+0,1816
Cocaína Dia 2 2
r =0,9985 / r=0,9992
y=0,2701x+0,2182
Dia 3 2
r =0,9972 / r=0,9988
y=0,063x+0,0177
Dia 1 2
r =0,9916 / r=0,9958
y=0,0633x+0,0134
Benzoilecgonina Dia 2 2
r =0,9937 / r=0,9968
y=0,0668x+0,0157
Dia 3 2
r =0,9920 / r=0,9960
y=0,473x+0,0551
Dia 1 2
r =0,9973 / r=0,9986
y=0,4587x+0,1411
Cocaetileno Dia 2 2
r =0,9902 / r=0,9951
y=0,47074x+0,1072
Dia 3
r2=0,9964 / r=0,9982

Figura 19. Curva de calibração obtida para cocaína


79

Figura 20. Curva de calibração obtida para benzoilecgonina

Figura 21. Curva de calibração obtida para cocaetileno

Através dos resultados obtidos para a construção das curvas analíticas


representadas acima, pode-se observar valores de coeficiente de correlação
(r) maiores de 0,99, estando de acordo com os valores preconizados pela
ANVISA, a qual recomenda que o valor de r seja maior ou igual a 0,99. O
gráfico da análise de resíduos a fim que avaliar a adequação do modelo está
representado na Figura 22.
80

(a) (b)

(c)

Figura 22. Gráfico de resíduos para (a) COC, (b) BZE e (c) COE

5.3.2. Limite de detecção (LOD) e Limite de quantificação (LOQ)

A otimização do método foi crucial para o aumento da sensibilidade do


método e consequentemente obtenção de valores de LOD e LOQ mais
baixos.
Os valores obtidos para LOD foram de aproximadamente 0,010 ng/mL
para todos os analitos em estudo, e o LOQ foi de 0,50 ng/mL como pode ser
visto na Tabela 10.

Tabela 10. Resultados de LOD e LOQ, obtidos para os analitos em estudo


através do método desenvolvido.
Analito LOD (ng/mL) LOQ (ng/mL)
Cocaína 0,01 0,50
Benzoilecgonina 0,01 0,50
Cocaetileno 0,01 0,50
81

5.3.3. Efeito de matriz

Na avaliação do efeito de matriz, feita através da injeção da matriz


fortificada com os analitos COC, BZE e COE nas concentrações de 0,75 e
9,38 ng/mL, comparando com os resultados obtidos para os analitos em
solução (fase móvel), foi possível obter valores de CV < 15%, ou seja, foi
possível comprovar que nenhum analito presente na matriz esta interferindo
na análise do método validado. Os resultados obtidos para o efeito de matriz
estão representados na Tabela 11.

Tabela 11. Resultados obtidos para efeito de matriz.


Analito
COC BZE COE
Média FMN* 1.03 0.97 0.97
Desvio Padrão 0.06 0.08 0.05
CV (%) 5.9 8.2 5.1
*FMN: Fator de matriz normalizado
FMN = Resposta do analito em matriz / Resposta do PI em matriz
Resposta do analito em solução / Resposta do PI em solução

5.3.4. Estabilidade de longa duração dos analitos na matriz

Para o estudo da estabilidade de longa duração dos analitos na matriz


de unha adotou-se um período de 5 dias em condições de armazenamento de
geladeira, e a análise foi feita através da comparação com o tempo zero.
Os analitos mostraram-se estáveis após o armazenamento em geladeira
durante o período estudado de 5 dias, obtendo valores de CV < 15%.
Segundo a RDC 27, a estabilidade é demonstrada quando não se
observa desvio superior a 15 % da média das concentrações, portanto, os
analitos em estudo, mostram-se estáveis frente as condições analisadas.
Nas tabelas 12, 13 e 14 estão demonstrados os valores obtidos para a
análise da estabilidade de COC, BZE e COE na matriz de unha.
82

Tabela 12. Estabilidade da cocaína na matriz de unha por um período de 5


dias
Análise 1 (amostra Análise 2 (amostra
recém fortificada) fortificada após 5
dias)
Média 107741.0 104940.0
DV (%) 3990.8 9415.3
CQB
CV (%) 3.7 9.0
Cocaína CV (%) 6,25
Média 710970.7 635247.3
DV (%) 10490.3 21820.1
CQA
CV (%) 1.5 3.4
CV (%) 6,56
CQB: controle de qualidade baixo; CQA: controle de qualidade alto.

Tabela 13. Estabilidade da benzoilecgonina na matriz de unha por um período


de 5 dias
Análise 1 Análise 2
(amostra recém (amostra
fortificada) fortificada após 5
dias)
Média 28705.7 30665.7
DV (%) 3411.5 955.9
CQB
CV (%) 11.9 2.8
Benzoilecgonina CV (%) 12,49
Média 121025.7 133936.0
DV (%) 6060.3 3265.9
CQA
CV (%) 5.0 2.1
CV (%) 13,48
CQB: controle de qualidade baixo; CQA: controle de qualidade alto.
83

Tabela 14. Estabilidade do cocaetileno na matriz de unha por um período de


5 dias
Análise 1 (amostra Análise 2 (amostra
recém fortificada) fortificada após 5
dias)
Média 98988.7 97723.3
DV (%) 375.1 672.0
CQB
CV (%) 0.4 0.7
Cocaetileno CV (%) 0,86
Média 857409.0 805486.3
DV (%) 24257.0 19811.9
CQA
CV (%) 1.0 2.5
CV (%) 4,16
CQB: controle de qualidade baixo; CQA: controle de qualidade alto.

5.3.5. Estabilidade dos analitos após ciclos de congelamento e


descongelamento

Para o estudo da estabilidade dos analitos na matriz de unha após ciclos


de congelamento e descongelamento, adotou-se como padrão para estudo a
realização de 3 ciclos de congelamento e congelamento em 3 dias diferentes.
Os analitos mostraram-se estáveis após os ciclos estudados, obtendo
valores de CV < 15%, e os resultados foram interpretados da mesma forma
do estudo de estabilidade de longa duração (item 5.3.4.).
Nas tabelas 15, 16 e 17 estão demonstrados os valores obtidos para a
análise da estabilidade de COC, BZE e COE na matriz de unha após os ciclos
estudados.
84

Tabela 15. Estabilidade da cocaína na matriz de unha após ciclos de


congelamento e descongelamento
Análise Análise Análise
(ciclo 1) (ciclo 2) (ciclo 3)
Média 107741,0 97639,0 104940,0
DV (%) 3990,8 6126,1 9415,3
CQB
CV (%) 3,7 6,3 9,0
Cocaína CV (%) 7,22
Média 717030,7 595277,0 647149,0
DV (%) 7071,4 15870,3 21081,3
CQA
CV (%) 1,0 2,7 3,3
CV (%) 8,36

Tabela 16. Estabilidade da benzoilecgonina na matriz de unha após ciclos de


congelamento e descongelamento
Análise Análise Análise
(ciclo 1) (ciclo 2) (ciclo 3)
Média 30897,7 27741,7 36191,0
DV (%) 770,2 3655,6 2195,5
CQB
CV (%) 2,5 13,2 6,1
Benzoilecgonina CV (%) 13,55
Média 116799,7 101578,7 132754,7
DV (%) 1899,5 9864,1 1838,7
CQA
CV (%) 1,6 9,7 1,4
CV (%) 12,33

Tabela 17. Estabilidade do cocaetileno na matriz de unha após ciclos de


congelamento e descongelamento
Análise Análise Análise
(ciclo 1) (ciclo 2) (ciclo 3)
Média 98988,7 99323,0 97723,3
DV (%) 375,1 6296,5 672,0
CQB
CV (%) 0,4 6,3 0,7
Cocaetileno CV (%) 3,29
Média 829003,0 811422,0 807572,3
DV (%) 3517,7 16584,5 20387,3
CQA
CV (%) 0,4 2,0 2,5
CV (%) 2,02
85

5.3.6. Precisão intra- inter-ensaio

Os resultados de precisão intra e inter-ensaio foram determinados


indiretamente pelo cálculo de imprecisão do desvio padrão relativo (RSD %),
onde foram feitas análises de amostras de unha fortificadas com 4 (quatro)
níveis de concentração diferentes dos analitos. Os resultados foram
expressos em CV (%), não se admitindo valores superiores a 15%, exceto
para a menor concentração avaliada (0,25 ng/mL), para a qual se admite
valores menores ou iguais a 20%.
Foram obtidos CV < 15% para todos os analitos, para todos os níveis de
concentração estudados. Todos os valores obtidos apresentam-se dentro
desse intervalo e, portanto, o método esta de acordo com os parâmetros
exigidos pela RDC 27.
Os resultados obtidos para a análise de precisão do método estão
apresentados na Tabela 18.
86

Tabela 18. Resultados obtidos para os ensaios de precisão do método


Parâmetro Valor
COCAÍNA
C1 C2 C3 C4
Precisão intra-ensaio (CV%) 8,8 5,6 4,4 3,6
Precisão inter-ensaio (CV%) 13,3 6,9 5,2 7,1

BENZOILECGONINA
C1 C2 C3 C4
Precisão intra-ensaio (CV%) 8,9 10,4 5,5 4,5

Precisão inter-ensaio (CV%) 14,9 13,8 15 15

COCAETILENO
C1 C2 C3 C4
Precisão intra-ensaio (CV%) 5,6 2,9 3,8 2,5
Precisão inter-ensaio (CV%) 7,4 4,2 10,1 3,3
C1: 0,25 ng/mL; C2:0,75 ng/mL; C3:6,38 ng/mL; C4 9,38 ng/mL.

5.3.7. Aplicação do método validade em amostra real

A fim de comprovar a eficiência do método desenvolvido e validado, o


mesmo foi aplicado em amostras de unhas reais provenientes do Instituto
Médico Legal – IML de São Paulo. O método foi aplicado para um total de 10
amostras e todas as amostras de unha foram adicionadas do padrão interno
deuterado.
Na Figura 23 estão representados os cromatogramas referentes as
amostras de unhas analisadas em que os resultados foram positivos para a
análise de COC. Dentre as amostras analisadas, a COC e BZE foram
detectadas em três amostras analisadas (a-c). Em dois desses casos
positivos, o COE também foi detectado (a,b), indicando o uso concomitantes
da COC com o álcool.
Na Tabela 19 estão representadas as concentrações (ng/mg) obtidas na
análise das amostras de unhas provenientes do IML.
87

Tabela 19. Concentrações (ng/mg) encontradas nas amostras de unha


analisadas
Amostra COC (ng/mg) BZE (ng/mg) COE (ng/mg)0
A 0,789 < LOQ < LOQ
B 2,479 3,046 < LOQ
C 1,250 0,575 N.D
< LOQ: valores encontrados abaixo do limite de quantificação do método (0,50ng/mg)

(a)

(b)

(c)

Figura 23. Cromatogramas das amostras reais de unhas provenientes do


Instituto Médico-Legal.
88

6. DISCUSSÃO

Ainda são escassos os estudos com objetivo de detectar o uso de


drogas de abuso em matrizes queratinizadas, principalmente na amostra de
unha. Contudo, considerando a dificuldade relatada por toxicologistas na
detecção de COC e seus metabólitos em matrizes alternativas, um estudo
detalhado do desenvolvimento de novas metodologias, bem como a
interpretação desses dados são extremamente necessários.
Vários são os fatores que devem ser considerados no momento da
análise a fim de assegurar a confiabilidade dos dados obtidos. Em primeiro
lugar, a otimização das condições experimentais faz-se necessária antes da
validação de qualquer método analítico.
Na otimização das condições operacionais do espectrômetro de massas
foram selecionados os melhores parâmetros que proporcionaram um ganho
significativo na intensidade do sinal, bem como foram selecionados os
fragmentos mais intensos para serem utilizados como íons de quantificação
do método e os menos intensos para confirmação dos achados. A seleção
desses fragmentos é uma vantagem fornecida pelo analisador de massas
sequencial (LC-MS/MS) utilizado, que separa os íons gerados através da sua
relação m/z.
Para estar em conformidade com os critérios para identificação de
compostos desconhecidos é importante que duas transições sejam
monitoradas (85). Embora os compostos deste estudo não sejam
desconhecidos, pois já foram detectados em outros estudos e outras
amostras, uma segunda transição (cocaína: 304>182; 304>77;
benzoilecgonina: 290>168; 290>105; cocaetileno: 318>196; 318>82) foi
monitorada a fim de confirmar nossos achados e aumentar a confiabilidade do
método proposto.
As condições cromatográficas otimizadas, tais como a escolha da
composição e proporção da fase móvel, fluxo, volume de injeção utilizado,
bem como a escolha da coluna analítica adequada, permitiram uma adequada
89

separação e identificação dos compostos em um tempo menor que 10


minutos.
Acetonitrila e água com adição de aditivos voláteis tais como ácido
fórmico e formiato de amônio foram os solventes escolhidos como fases
móveis, pois permitiram uma satisfatória separação dos analitos. A
acidificação da fase móvel foi necessária pois o menor pH proporcionou a
protonação do grupo amina dos analitos alvos, favorecendo a ionização no
modo positivo.
Além do mais, após ajustado todos os parâmetros citados acima, foi
possível obter picos definidos e um ganho de intensidade do sinal
significativamente maior, o que acarretou em um método mais sensível e,
consequentemente, na obtenção de valores de LOD e LOQ menores.
Outro fator muito importante a ser considerado ao analisar amostras de
unhas é o fato de que durante a manipulação da droga pelo usuário pode
ocorrer uma contaminação externa, na qual o indivíduo não necessariamente
ingeriu a droga, porém essa foi depositada na base da unha. Sendo assim, tal
fator deve ser considerado antes da escolha do método de extração a ser
utilizado, a fim de eliminar todos os interferentes.
O procedimento de descontaminação é uma etapa de extrema
importância, principalmente pelo fato da coleta ser feita das unhas das mãos.
Estas são muito mais propensas à contaminação externa devido à
manipulação da droga, tornando essa etapa de descontaminação crucial
antes da realização da etapa de extração. O procedimento é baseado na
lavagem das amostras em solvente, com objetivo de eliminar qualquer traço
da droga proveniente de contaminação externa.
A escolha do melhor procedimento de lavagem e descontaminação das
unhas foi feito através da busca de trabalhos na literatura, sendo que o uso do
metanol parece ser consenso de uso entre os autores (20).
Em trabalho realizado por Palmeri e colaboradores (49), observaram que
após realizar a lavagem com metanol, foi possível remover aproximadamente
98% da contaminação, mostrando então, que a realização de 2 ou 3 lavagens
90

já se mostram suficientemente eficientes no processo de descontaminação


externa.
No estudo realizado por Tsanaclis (86) em amostras de cabelo,
observou que o metanol é um solvente apropriado para realizar o
procedimento de descontaminação. Ainda, observou que tempos superiores a
1 minuto não devem ser empregados devido ao risco de iniciar o processo de
extração (86). Tais estudos foram considerados e a descontaminação com o
uso do metanol foi adotada para o presente estudo.
Para escolha do melhor solvente extrator de cocaína na matriz de unha,
primeiramente optou-se por fazer um estudo acerca dos principais métodos
de extração existentes na literatura. Para tal, fez-se um planejamento fatorial,
a fim de estudar as principais variáveis interferentes em um processo de
extração, para posteriormente, encontrar a melhor condição para os analitos
em estudo.
Ao fazer o estudo através do planejamento fatorial foi possível obter uma
melhor condição de extração para cocaína dada pelo software de tratamento
de dados utilizado (Software Design Expert®), porém fez-se necessário um
segundo estudo minucioso acerca desses resultados obtidos, a fim de
verificar todas as demais variáveis que o software não é capaz de analisar.
A condição de extração estabelecida através do planejamento estatístico
foi o uso de metanol, a 40ºC por um período de 46 horas, tempo este, que
além de ser inviável na pratica de um laboratório, foi possível observar
também a ocorrência de reações de hidrólise da COC durante o processo de
extração, fato este já esperado quando se usam elevados tempos de extração
no preparo da amostra.
Ainda, pode-se observar que o software fornece como melhor condição
de extração para a BZE o uso de tampão como solvente extrator por 16 horas
a 24ºC. Porém se analisarmos as áreas obtidas para este (Tabela 8) é
possível observar que a área da BZE aumenta na mesma proporção em que
a área da COC diminui, tal fato comprova que nessa condição de extração
esta ocorrendo reações de hidrólise, ou seja, a COC esta sendo quebrada e
transformada em BZE.
91

Na melhor condição de extração selecionada através do software, a qual


utiliza o metanol como solvente extrator em uma temperatura de 40ºC por 46
horas, também foi possível observar a hidrólise da COC, sendo que na
medida em que aumenta o tempo de extração, consequentemente aumenta a
área de BZE, sugerindo tal hidrólise, mesmo que em menores quantidades
quando comparado ao uso do tampão. Tais resultados vão de encontro com
os dados obtidos por Valente-Campos, onde o solvente que mostrou melhor
desempenho na extração foi o metanol, por um período de 16 horas, tempo
este em que os valores de hidrólise da COC são considerados aceitáveis.
Com tais resultados, pode-se concluir que entre os métodos de extração
estudados, o metanol é o solvente extrator de escolha, porém o tempo deve
ser reduzido para 16 horas a fim de controlar as reações de hidrólise. Sendo
assim, a ocorrência dessas reações deve ser avaliada de forma criteriosa na
escolha do solvente extrator.
Diante do exposto, esses elevados tempos de extração obtidos não se
tornam viáveis na prática da rotina de um laboratório, tornando necessário o
estudo de um método que vise obter a mesma eficiência de extração,
prevenindo a ocorrência de reações de hidrólise, porém com um menor tempo
de preparo de amostra. Para esse fim, realizou-se o estudo do acetato de etila
como solvente de extração.
Na Figura 16 estão representados os cromatogramas obtidos após as
extrações com (a) acetato de etila e (b) metanol.
Se compararmos o perfil do cromatograma obtido na extração com
acetato de etila (a) na Figura 16 com o cromatograma obtido da solução de
uma mistura de padrões (Figura 17) podemos observar um perfil muito
parecido entre eles, o que indica que não estão ocorrendo perdas por
hidrólise quando o acetato de etila é utilizado na extração durante o período
estudado. Resultado este que não foi observado ao comparar o perfil do
cromatograma obtido na extração com acetato de etila (a) com o obtido na
extração com metanol (b) (Figura 16), onde neste último é facilmente visível a
diminuição da área dos picos de COC e COE e consequente aumento no pico
92

de BZE, indicando a conversão do COE e COC à BZE, comprovando assim,


que acetato de etila mostra-se vantajoso quando comparado ao metanol,
Porém ainda fez-se necessário o estudo para a diminuição do tempo de
preparo de amostra. Após extrações sequenciais, em tempos decrescentes,
foi possível obter valores de eficiência de extração semelhantes aos obtidos
anteriormente, contudo, foi possível reduzir o tempo de 16 horas para
somente duas extrações de 15 minutos, ou seja, foi possível reduzir em mais
de 90% do preparo de amostra ao compararmos com as metodologias
existentes na literatura para extração de COC em unha.
Após obtenção de um método com as condições de operação
devidamente otimizadas e procedimento de preparo de amostra selecionado,
o próximo passo é realizar a validação do método analítico.
Os resultados obtidos na validação do método foram satisfatórios. Todos
os analitos em estudo (COC, BZE e COE) apresentaram boa linearidade, com
coeficiente de correlação (r) maiores de 0,99, podendo então concluir que
modelo de regressão linear apresenta-se adequado para as determinações
analíticas em estudo. O limite de quantificação do método foi de 0,5 ng/mL
para todos os analitos, enquanto o limite de detecção foi de 0,01 ng/mL.
Além do mais, foram obtidos bons resultados de precisão intra- e inter-
ensaio, o método mostrou-se específico para os analitos em estudo e não foi
observado nenhum efeito de matriz.
A eficiência do método foi comprovada ao aplicá-lo em amostras de
unhas reais provenientes de cadáveres periciados no Instituto Médico Legal –
IML de São Paulo.
Como demonstra a Figura 23, a COC e BZE foram detectadas em três
amostras analisadas (a-c). Em dois desses casos positivos, o COE também
foi detectado (a,b), indicando o uso concomitante da COC com o álcool.
A COC foi encontrada em uma faixa de 0,7 a 2,4 ng/mg, a BZE foi
encontrada em uma faixa de 0,5 a 3,0 ng/mg e o metabólito COE foi
detectado, porém com valores abaixo do limite de quantificação do método
desenvolvido, como demonstra a Tabela 19.
93

Adicionalmente, a fim de investigar a ocorrência de contaminação


externa, a fração metanólica obtida no processo de descontaminação foi
analisada. Os resultados mostraram a presença da COC e BZE nas três
frações de metanol analisadas, sendo que a BZE mostrou-se presente em
menores concentrações em relação a COC. Os resultados das frações de
metanol de lavagem obtidos para as amostras controle mostraram-se
negativas para todos os analitos.
No caso da cocaína, é normal que os seus metabólitos sejam
incorporados na matriz queratinizada em quantidades relativamente pequenas
em comparação com as drogas precursoras e podem apresentar
concentrações inferiores aos limites de detecção dos métodos analíticos, o
que faz com que os metabólitos possam não ser detectáveis devido às baixas
doses das drogas utilizadas (53), oque explica o fato de não termos
encontrado, em concentrações quantificáveis, o COE e ter encontrado valores
abaixo do LOQ para BZE no caso “a”.
Um fator muito importante a ser consideração na incorporação das
drogas na matriz é a estrutura molecular da droga estudada, assim como
suas propriedades físico-químicas. A permanência das drogas na estrutura da
matriz pode ser explicada pela interação entre a droga e as proteínas
presentes na fibra queratinizada (60). Um exemplo, são as concentrações de
COC e do 11.Nor-D9-THC-9-Ácido Carboxílico (THC COOH – metabólito da
planta cannabis) encontrados nas matrizes queratinizadas, aonde é notável a
diferença de concentração entre cocaína e o THC COOH. Esta diferença se
deve a taxa de incorporação dos analitos na matriz que contem queratina,
sendo a cocaína com uma capacidade 3.600 vezes maior de incorporação do
que o THC COOH, devido às particularidades de cada analito (53).
Sendo assim, antes da realização de qualquer análise é muito
importante ter conhecimento das particularidades dos analitos de interesse,
bem como qual é a resposta desejada, para posteriormente realizar a escolha
adequada método e matriz ao fim que se deseja.
A análise de unha não é adequada para avaliar o uso recente da droga,
e ainda, não é possível atribuir que o uso da droga tenha ocorrido em um
94

determinado dia ou estabelecimento de nexo casual que se correlacione


categoricamente entre a droga detectada e um evento particular (53). Porém
o uso dessa matriz associada a outras pode se mostrar extremamente
vantajosa, como por exemplo, para um teste de urina ou sangue que se
mostrou positivo, a análise conjunta com a matriz de unha pode elucidar se
este é um usuário regular ou se o resultado positivo foi o resultado de um
único episódio, tornando então a análise de diferentes matrizes
complementares umas as outras de acordo com a finalidade a que se destina
o achado.
Vale salientar ainda, que é preciso, também, considerar que um
resultado de um teste isolado, em alguns casos, pode não ser suficiente para
produzir uma interpretação definitiva (53).
Sendo assim, ainda são necessários mais estudos acerca de auxiliar
na interpretação dos resultados obtidos nas análises da matriz de unha,
podendo esta ser útil como uma matriz alternativa ao cabelo, auxiliando na
interpretação dos resultados obtidos em um conjunto de análises.
95

7. CONCLUSÃO

A análise de unha através do método otimizado e validado por LC-


MS/MS utilizando acetato de etila como solvente extrator, mostrou ser rápido,
eficiente e aumentou significativamente os valores de LOD da cocaína e
metabólitos. As condições cromatográficas otimizadas permitiram a separação
e identificação da COC e seus dois metabólitos em um tempo menor que 10
minutos. O uso da técnica de LC-MS se mostrou vantajosa ao comparar com
a técnica de CG-MS, comumente utilizada, visto que o passo de derivatização
é evitado e o tempo de análise é relativamente mais curto. Um método rápido,
eficiente e seletivo desenvolvido através do uso de LC-MS para quantificação
de COC e seus metabólitos em unhas mostrou ser viável para fins de
documentar o uso retrospectivo e/ou crônico a cocaína para os mais diversos
fins de aplicação, seja no ambiente de trabalho, clinico, forense,
epidemiológico, esporte e histórico.
96

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104

ANEXO 1

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO (TCLE)

Grupos de cadáveres

Título do projeto Nº cadastro

PERFIL TOXICOLÓGICO POST-MORTEM DE UNHAS E


CABELOS: UMA FERRAMENTA METABOLÔMICA NA
INVESTIGAÇÃO CRIMINAL

AUTORIZAÇÃO DE COLETA DE AMOSTRA POR MEMBRO


FAMILIAR

O nosso OBJETIVO é avaliar a presença de substâncias como maconha,


cocaína e anfetaminas nas matrizes de unhas e cabelo de cadáveres a fim de
desenvolver novos métodos de detecção dessas substâncias.

Sendo assim, essa pesquisa constitui uma importante ferramenta científica na


elucidação da causa mortis conjunta a área da patologia clínica, com ênfase na
toxicologia forense, devido a sua alta estabilidade em relação ao período post-mortem.

COMO FAREMOS ISSO?

-Utilizaremos amostra de unha ou cabelo, por meio de autorização do


responsável legal do falecido, para verificação da presença/ausência de drogas.

-Destaca-se que a coleta não é invasiva e é relativamente fácil, tornando-a um


importante objeto de estudo, perante isso, venho através desse solicitar a utilização do
105

termo de consentimento livre esclarecido, pois, mesmo que a amostra requerida para o
projeto seja denotada como amostra de descarte, trata-se de vidas que devem ser
respeitadas, por isso, compulsória a petição de autorização dos familiares para o seu
uso.

ATENÇÃO

-A autorização da coleta de amostra para participação neste estudo é totalmente


voluntária e a identidade do cadáver será mantida em sigilo.

-Todas as informações de identificação pessoal coletadas serão mantidas de forma


confidencial.

-O nome do participante não será vinculado aos resultados desse estudo quando os
mesmos forem publicados, porque os dados serão avaliados e divulgados de forma
coletiva.

-As informações sobre presença de substâncias na unha e cabelo serão acessadas por
um código de identificação impessoal e utilizadas apenas pelo grupo de pesquisadores
deste projeto.

RISCOS E BENEFÍCIOS: Não há riscos previstos, bem como não haverá benefícios
diretos ao cadáver

RESSARCIMENTO: Não haverá ressarcimento.

PARA DEMAIS INFORMAÇÕES você poderá entrar em contato com a Dra. Nelci

Fenalti Höehr pelo telefone 19- 3521-9455 ou com seus alunos Júlio César Santos

Júnior e Carla Giane Loss pelos telefones 19-994238260 e 19-982146928,

respectivamente (em horário comercial) ou através dos e-mails:

juliocsj@fcm.unicamp.br e carlagiane@gmail.com.
106

Endereço Rua Tessália Vieira de Camargo, 126, Bairro Barão Geraldo, campinas-SP.

CEP 13083881. Faculdade de Ciências Médicas - Departamento de Patologia Clínica,

UNICAMP.

O Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) recebe reclamações e denúncias sobre os


aspectos éticos deste estudo pelo telefone 19-35218936 ou pelo e-mail
cep@fcm.unicamp.br
Endereço Rua Tessália Vieira de Camargo, 126. Bairro Barão Geraldo, Campinas-SP.
CEP 13.083-887

Declaro, ter lido e discutido o conteúdo do presente Termo de Consentimento e


concordo em autorizar a coleta de amostra para esse estudo de forma livre e
esclarecida. Também declaro ter recebido cópia deste termo.

____________________________________________ __/___/___
Assinatura do responsável legal Data

____________________________ ________________________
__/__/___
Nome do responsável pela coleta Assinatura Data

Campinas, ___ de ___________ de____.


107

ANEXO 2

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO (TCLE)

Grupo VIVO

Título do projeto Nº cadastro

PERFIL TOXICOLÓGICO POST-MORTEM DE UNHAS E


CABELOS: UMA FERRAMENTA METABOLÔMICA NA
INVESTIGAÇÃO CRIMINAL

VOCÊ está sendo CONVIDADO a participar de uma pesquisa desenvolvida pela


Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP. Os pesquisadores responsáveis são
a Dra. Nelci Fenalti Höehr junto com seus alunos Júlio César Santos Júnior e Carla
Giane Loss.

O nosso OBJETIVO é avaliar a presença de substâncias como maconha, cocaína e


anfetaminas nas unhas e cabelo de pessoas, a fim de desenvolver novas técnicas
analíticas para detectar drogas nesses materiais.

COMO FAREMOS ISSO?


- Utilizaremos amostras de unhas ou cabelo fornecidas pelo voluntário, onde
auxiliaremos na coleta do material, para verificar a presença de drogas.

A SUA PARTICIPAÇÃO CONSISTIRÁ EM:


1) Doar amostras de unhas e/ou cabelo;
2) Responder algumas perguntas, através de uma entrevista, sobre sua idade e histórico
de uso de drogas nos últimos meses.
108

- O TEMPO necessário para realizar a coleta e responder as perguntas é de


aproximadamente dez (10) minutos.

- ATENÇÃO:
A sua participação neste estudo é totalmente voluntária e sua identidade será
mantida em sigilo.

Algumas perguntas poderão lhe gerar um certo desconforto, por isso mesmo que tenha
concordado em participar desta pesquisa, você poderá desistir a qualquer momento,
sem ter que dar qualquer justificativa ou explicação.

RISCOS E BENEFÍCIOS: Não há riscos previstos, bem como não haverá benefícios
diretos ao participante.

RESSARCIMENTO: Não haverá ressarcimento ao participante.

Todas as informações de identificação pessoal coletadas serão mantidas de forma


confidencial.

O seu nome não será vinculado aos resultados desse estudo quando os mesmos forem
publicados, porque os dados serão avaliados e divulgados de forma coletiva.

As informações sobre presença de substâncias de unha e cabelo serão acessadas por


um código de identificação impessoal e utilizadas apenas pelo grupo de pesquisadores
deste projeto.

Sinta-se à vontade para esclarecer quaisquer dúvidas antes de decidir sobre a sua
participação no estudo.

PARA DEMAIS INFORMAÇÕES você poderá entrar em contato com a Dra. Nelci
Fenalti Höehr pelo telefone 19- 3521-9455 ou com seus alunos Júlio César Santos
Júnior e Carla Giane Loss pelos telefones 19-99423826 e 19-982146928,
respectivamente (em horário comercial) ou através dos e-mails:
juliocsj@fcm.unicamp.br e carlagiane@gmail.com.
109

Endereço Rua Tessália Vieira de Camargo, 126, Bairro Barão Geraldo, campinas-SP.
CEP 13083881. Faculdade de Ciências Médicas - Departamento de Patologia Clínica,
UNICAMP.
O Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) recebe reclamações e denúncias sobre os
aspectos éticos deste estudo pelo telefone 19-35218936 ou pelo e-mail
cep@fcm.unicamp.br
Endereço Rua Tessália Vieira de Camargo, 126. Bairro Barão Geraldo, Campinas-SP.
CEP 13.083-887

Declaro, ter lido e discutido o conteúdo do presente Termo de Consentimento e


concordo em participar desse estudo de forma livre e esclarecida. Também declaro ter
recebido cópia deste termo.

_____________________________ __/___/___
Assinatura do participante Data

________________________________ __/___/___
Assinatura do familiar responsável legal Data

___________________________________ __/__/___
Nome do responsável pela coleta Data

Campinas, ___ de ___________ de____


110

ANEXO 3
111
112
113

ANEXO 4
114

ANEXO 5

Professora Nelci F. Höehr


Faculdade de Ciências
Médicas UNICAMP
Departamento de Patologia
Clínica
Caixa Postal 6111
13084-971 - CAMPINAS- S.P.
Telefone: 019-3521-9455
E-mail: nelci@fcm.unicamp.br

Campinas, 07 de maio de 2013

Professora Fátima Aparecida Bottcher Luiz

Coordenadora

Número CAAE:
17753813.3.0000.5404

Prezada Professora Fátima

Venho através desta solicitar à V.S.a senhoria, conforme a reunião com os

alunos Júlio César Santos Júnior e Carla Giane Loss no ano de 2013, a

oficialização da participação da aluna Carla Giane Loss como aluna associada

do presente projeto, uma vez que ele faz parte do tema da dissertação de

mestrado da referida aluna.

Atenciosamente

Nelci F. Höehr

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