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CAMPINAS
2015
CARLA GIANE LOSS
CAMPINAS
2015
DEDICATÓRIA
Elisete Kurmann Loss, pela presença e apoio em todas as etapas da minha vida.
Carlos Loss (in memoriam), que foi minha motivação para ir até ao final e não me
deixou desistir. Dedico esta dissertação à ele.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pela proteção e por me fazer cada vez mais
forte.
À minha mãe amada, pelas palavras de apoio, suporte e incentivo aos estudos.
Por estar sempre ao meu lado, nunca me deixando cair. Sem você não sou
nada.
Ao meu pai (in memoriam), pelo carinho e exemplo de dedicação. Sei que
sempre estará ao meu lado e nesse momento está comemorando junto a mim
esta vitória. Agradeço a você por todos os momentos preciosos.
Aos meus irmãos Giovani e Carlos pelo suporte familiar e por ser minha fonte
de inspiração para querer sempre mais.
À minha orientadora Nelci, pela orientação e suporte durante todo esse tempo.
Aos meus queridos amigos Taís, Ariane, Chanaisa, Rafaela e Lucas pela
amizade que perdura há 10 anos. Vocês são minha segunda família.
Ao meu querido amigo José, que ficou do meu lado durante todo esse período
me dando suporte técnico.
Aos meus queridos amigos, Bebel, Renata e Chico pela amizade, parceria e
anos de convivência dividindo a mesma casa.
As minhas primas amadas, Renata e Taís, por além de serem minha família,
melhores amigas, são quem me acompanham desde o dia em que sai de casa,
amo vocês.
A querida amiga Bebel, pelas incontáveis vezes que me ajudou, obrigada pela
amizade e parceria.
RESUMO
Cocaine (COC) is a widely use drug of abuse with strong stimulant properties.
COC consumption can be inspected in urine and blood but continuous use can
be detected in hair and nails. Advantages of testing nail samples include ease
and less invasiveness of collection. Such samples are also highly stable and
allows for the investigation of past and chronic exposures. We have propose a
new simple and fast method of extraction and quantify cocaine and its
metabolites in fingernails by liquid chromatography mass spectrometry (LC-
MS). Confidence parameters of validation of the method were: specificity,
linearity, intra- and inter-batch, limit of detection (LOD), limit of quantitation
(LOQ) and matrix effect. The LOD was 0.01 ng/mL and the LOQ was 0.5 ng/mL.
Linearity showed correlation coefficient (r) for COC, benzoylecgonine (BZE) and
cocaethylene (COE) higher than 0.99. Good intra- and inter-assay precision,
and specificity were also observed for all detected molecules and no major
matrix effect could be noted. When LC-MS/MS monitoring is applied, nails seem
indeed to offer quite useful surrogates for chronic and past use of COC.
Figura 10. Cromatograma de uma solução padrão de COC, BZE e COE antes
(a) e depois (b) da otimização das condições experimentais. Transições
selecionadas: 290>168 (benzoilecgonina); 304>182 (cocaína); 318>196
(cocaetileno). .................................................................................................. 65
Figura 16. Cromatogramas de: (a) Amostra de unha fortificada com a mistura
dos padrões e submetida à extração com acetato de etila por um período de 12
horas; (b) Amostra de unha fortificada com a mesma mistura dos padrões e
submetida à extração com metanol por um período de 12 horas. ................... 75
Figura 18. Amostra de unha fortificada com a mistura dos padrões de COC,
BZE e COE na concentração de 12,50 ng/mL, e padrões deuterados COC-D3 e
COE-D3 na concentração de 6,38 ng/mL, e submetida à extração com acetato
de etila por um período de 15 minutos em ultrassom. ..................................... 76
Figura 22. Gráfico de resíduos para (a) COC, (b) BZE e (c) COE .................. 80
BZE: Benzoilecgonina
COC: Cocaína
COE: Cocaetileno
ECG: Ecognina
NOR: Norcocaína
THC–COOH:11-Nor-9-carboxi-tetrahidrocanabinol
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 20
2. OBJETIVOS ............................................................................................. 24
3. REVISÃO DA LITERATURA..................................................................... 25
5. RESULTADOS ......................................................................................... 59
6. DISCUSSÃO ............................................................................................ 88
7. CONCLUSÃO ........................................................................................... 95
8. REFERÊNCIAS ........................................................................................ 96
ANEXO 1 .......................................................................................................104
ANEXO 2 .......................................................................................................107
ANEXO 3 .......................................................................................................110
ANEXO 4 .......................................................................................................113
ANEXO 5 .......................................................................................................114
20
1. INTRODUÇÃO
1.1. Justificativa
2. OBJETIVOS
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1. Cocaína
Além disso, a coleta pode ser conduzida sob condições controladas para evitar
a adulteração ou substituição de amostras (15). Especificamente, a unha e o
cabelo possuem uma larga janela de detecção, tornando possível a verificação
da exposição a drogas de abuso, o que as tornam importantes amostras de
estudo. Porém vale salientar que a escolha do material biológico a ser
analisado é crítica, uma vez que cada tipo de espécime pode contribuir para
uma determinada informação.
São escassas as publicações sobre os avanços nos estudos analíticos
que fazem o uso de matrizes alternativas (como mecônio, unha e lágrimas, por
exemplo) para determinação de várias classes de drogas, incluindo drogas
lícitas e ilícitas. A Figura 2 mostra o tempo de detecção para algumas das
matrizes biológicas.
MS) (17-20, 57). Ainda não foram encontrados trabalhos que fazem o uso da
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas
(LC-MS) para detecção destes compostos em amostras de unha.
Valente-Campos e colaboradores (20) detectaram qualitativamente e
quantitativamente a COC e seus metabólitos em amostras de unhas das mãos
e dos pés de voluntários (usuários de COC). Para este experimento o metanol
foi utilizado para liberar os analitos da matriz em refluxo a 40ºC por 16 horas e
após pré-concentração o resíduo obtido foi derivatizado com anidrido pentafluro
propíonico (PFPA). As unhas dos voluntários foram submetidas ao método
proposto e analisadas por CG-MS. Nesse estudo foi observado que quando
utilizado metanol no procedimento de extração foi possível recuperar mais de
67% dos analitos, mostrando que podem ocorrer perda desses analitos por
hidrólise ou decomposição.
Outro estudo utilizando como técnica o CG-MS para quantificação de
COC em unha, encontrou maiores concentrações de COC e BZE em unha,
quando comparado aos outros metabólitos (ECG, EME, COE, NOR), onde a
COC foi encontrada em 82,3% dos casos estudados, mostrando a importância
da detecção destes compostos (17).
Engelhart e Jenkins (18) detectaram COC e seus produtos de
biotransformação (BZE, NCOC, COE) em amostras de unhas post-mortem. O
método de extração utilizado para liberar os analitos da matriz foi baseado na
utilização de tampão fosfato (0,1 M, pH 5,0) acompanhado de sonicação por
uma hora e após mantido a temperatura ambiente durante 72 horas.
Posteriormente SPE foi utilizada e a derivatização foi conduzida seguido de
análise por CG-MS. Corroborando com o estudo de Garside (17), foram
observadas maiores concentrações de COC (0,20 a 140,17 ng/mg) e BZE (0,30
a 315,44 ng/mg) quando comparado aos outros metabólitos.
Cingolani e colaboradores (57) detectaram simultaneamente morfina, 6-
acetilmorfina e COC em amostras de unhas. As amostras foram submetidas a
digestão com ácido clorídrico (HCl 37%, v/v em água), incubadas a 100ºC
durante 30 minutos e após mantidas por 12 horas a temperatura ambiente. A
solução foi alcalinizada, submetida ao processo de extração LLE e SPE. A
37
CH
2
COCAÍNA
m/z 304
HIDRÓLISE CH CH
2 2
COCAETILENO
m/z 318
BENZOILECGONINA
m/z 290
uma molécula ou átomo medindo a razão massa/carga (m/z) dos íons gerados.
Os íons são gerados através da indução, perda ou o ganho de carga por uma
espécie eletricamente neutra. Uma vez formados, os íons são direcionados, por
forças eletrostáticas, para dentro do analisador de massas, separados de
acordo com suas razões m/z e finalmente detectados. O resultado da ionização
molecular, a separação e detecção de íons é o espectro de massas, que
mostra a intensidade relativa em função da m/z para cada íon (66).
A análise da massa de substâncias ionizadas por diferentes interfaces
são realizadas usando um ou dois analisadores de massas (MS-MS), que
consistem em armadilhas de íons ou predominantemente quadrupolos (67).
MS-MS é normalmente descrito por três quadrupolos, que são utilizados para
analisar a amostra em série. O primeiro filtra os íons do analito, permitindo
apenas a passagem de íons com a razão m/z desejada. A fragmentação do íon
escolhido (precursor) ocorre no segundo quadrupolo pelo impacto com
moléculas do gás de colisão para a formação dos íons produto, que podem ser
verificados pelo terceiro quadrupolo ou podem atingir seletivamente o detector,
como demonstra a Figura 4. As várias etapas da MS-MS eliminam
praticamente toda contaminação por compostos indesejados que podem
coeluir da coluna. Essas características ajudam a desvendar estruturas
moleculares complexas e elevar a confiança de identificação (63).
45
3.4.1. Linearidade
3.4.2. Seletividade
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Materiais
4.1.1. Reagentes
4.2. Métodos
a) Parâmetros de ionização
b) Precisão do injetor
c) Condições cromatográficas
Tal análise foi realizada com o intuito de avaliar a contaminação por efeito
de memória entre uma análise e outra. Nesse sentido, realizou-se injeções
sequenciais de um branco (solvente) intercalado com a mistura de padrões
descrita anteriormente.
4.2.3.4.1. Linearidade
que apresentou CV ≤15%, na qual foi possível obter picos integrados pelo
equipamento que se diferenciaram do ruído, no mínimo 10 vezes (81).
6,38, 9,38 e 12,50 ng/mL) em três dias diferentes. As análises foram realizadas
em seis replicatas para cada concentração em cada dia.
5. RESULTADOS
Inten. (x1,000,000)
1,0 182,1
0,5
304,2
82,1 150,1
0,0
50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 m/z
Inten. (x100,000)
3,0
77,1
2,0
82,1
1,0
105,1
59,0
0,0
50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 m/z
Inten. (x10,000)
5,0
168,0
2,5
290,1
104,9 142,2 237,3
0,0
50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 m/z
Inten. (x10,000)
2,0
105,0
168,0
1,0 115,8
82,1
135,0 157,4 245,3 269,6
0,0
50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 m/z
Inten. (x100,000)
196,1
5,0
2,5 318,2
82,1
0,0
50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 m/z
Inten. (x100,000)
2,0 82,1
196,1
1,0 105,0
119,1 150,1
67,0 168,1
0,0
50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 m/z
Inten. (x100,000)
307,2
3,0 115,1
2,0
100,3
1,0
183,0 213,6 256,3
0,0
100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 350,0 375,0 m/z
Inten. (x1,000,000)
4,5 102,1
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
307,2
1,0
0,5
115,1
0,0
100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 350,0 375,0 m/z
Inten. (x100,000)
9,0
321,2
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0 100,1
115,1
1,0 365,1
0,0
100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 350,0 375,0 m/z
Inten. (x100,000)
5,5
321,2
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
105,0
1,0 115,1
365,2
0,5 183,1
0,0
100,0 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0 250,0 275,0 300,0 325,0 350,0 375,0 m/z
(a)
(b)
Figura 10. Cromatograma de uma solução padrão de COC, BZE e COE antes
(a) e depois (b) da otimização das condições experimentais. Transições
selecionadas: 290>168 (benzoilecgonina); 304>182 (cocaína); 318>196
(cocaetileno).
extração da COC foi com o uso de metanol como solvente de extração durante
16 horas a 40ºC.
COC COC
BZE
BZE
Amostra de unha
Moagem criogênica
Extração com
acetato de etila
Análise LC-MS
(a)
(b)
Figura 16. Cromatogramas de: (a) Amostra de unha fortificada com a mistura dos
padrões e submetida à extração com acetato de etila por um período de 16 horas; (b)
Amostra de unha fortificada com a mesma mistura dos padrões e submetida à extração
com metanol por um período de 16 horas. Unhas adicionadas de Padrão interno
deuterado.
76
Figura 17. Cromatograma da solução de uma mistura dos padrões de COC, BZE e
COE na concentração de 12,50 ng/mL, e padrões deuterados COC-D3 e COE-D3 na
concentração de 6,38 ng/mL diluídos em fase móvel (acetonitrila:água 5:95 v/v).
Figura 18. Amostra de unha fortificada com a mistura dos padrões de COC, BZE e
COE na concentração de 12,50 ng/mL, e padrões deuterados COC-D3 e COE-D3 na
concentração de 6,38 ng/mL, e submetida à extração com acetato de etila por um
período de 15 minutos em ultrassom.
77
5.3.1. Linearidade
(a) (b)
(c)
Figura 22. Gráfico de resíduos para (a) COC, (b) BZE e (c) COE
BENZOILECGONINA
C1 C2 C3 C4
Precisão intra-ensaio (CV%) 8,9 10,4 5,5 4,5
COCAETILENO
C1 C2 C3 C4
Precisão intra-ensaio (CV%) 5,6 2,9 3,8 2,5
Precisão inter-ensaio (CV%) 7,4 4,2 10,1 3,3
C1: 0,25 ng/mL; C2:0,75 ng/mL; C3:6,38 ng/mL; C4 9,38 ng/mL.
(a)
(b)
(c)
6. DISCUSSÃO
7. CONCLUSÃO
8. REFERÊNCIAS
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60. Lima ECd, Silva CLd. Cabelo como matriz analítica alternativa para a
determinação de drogas de abuso. NewaLab. 2007(82):156-69.
63. Wong RC, TSE HY. Drug of abuse: body fluid testing. Steven B. Karch
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65. Tonhi E, Collins KE, Jardim ICSF, Collins CH. Fases estacionárias para
cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR) baseadas
em superfícies de óxidos inorgânicos funcionalizados. Química Nova.
2002;25(4):616-23.
77. Marcelo Ribani CBGB, Carol H. Collins e Isabel Cristina Sales Fontes
Jardim, Lúcio Flávio Costa Melo. Validação em métodos cromatográficos e
eletroforéticos. Química Nova. 2004;27(5):771-80.
79. Cassiano NM, Barreiro JC, Martins LRR, Oliveira RV, Cass QB.
Validação em métodos cromatográficos para análise de pequenas moléculas
em matrizes biológicas. Química Nova. 2009;32(4):1021-30.
84. Migliato KF, Corrêa MA, Salgado HRN, Tognolli JO, Sacramento LVS,
Mello JCPd, et al. Planejamento experimental na otimização da extração dos
frutos de Syzygium cumini (L.) skeels. Química Nova. 2011;34(4):695-9.
ANEXO 1
Grupos de cadáveres
termo de consentimento livre esclarecido, pois, mesmo que a amostra requerida para o
projeto seja denotada como amostra de descarte, trata-se de vidas que devem ser
respeitadas, por isso, compulsória a petição de autorização dos familiares para o seu
uso.
ATENÇÃO
-O nome do participante não será vinculado aos resultados desse estudo quando os
mesmos forem publicados, porque os dados serão avaliados e divulgados de forma
coletiva.
-As informações sobre presença de substâncias na unha e cabelo serão acessadas por
um código de identificação impessoal e utilizadas apenas pelo grupo de pesquisadores
deste projeto.
RISCOS E BENEFÍCIOS: Não há riscos previstos, bem como não haverá benefícios
diretos ao cadáver
PARA DEMAIS INFORMAÇÕES você poderá entrar em contato com a Dra. Nelci
Fenalti Höehr pelo telefone 19- 3521-9455 ou com seus alunos Júlio César Santos
juliocsj@fcm.unicamp.br e carlagiane@gmail.com.
106
Endereço Rua Tessália Vieira de Camargo, 126, Bairro Barão Geraldo, campinas-SP.
UNICAMP.
____________________________________________ __/___/___
Assinatura do responsável legal Data
____________________________ ________________________
__/__/___
Nome do responsável pela coleta Assinatura Data
ANEXO 2
Grupo VIVO
- ATENÇÃO:
A sua participação neste estudo é totalmente voluntária e sua identidade será
mantida em sigilo.
Algumas perguntas poderão lhe gerar um certo desconforto, por isso mesmo que tenha
concordado em participar desta pesquisa, você poderá desistir a qualquer momento,
sem ter que dar qualquer justificativa ou explicação.
RISCOS E BENEFÍCIOS: Não há riscos previstos, bem como não haverá benefícios
diretos ao participante.
O seu nome não será vinculado aos resultados desse estudo quando os mesmos forem
publicados, porque os dados serão avaliados e divulgados de forma coletiva.
Sinta-se à vontade para esclarecer quaisquer dúvidas antes de decidir sobre a sua
participação no estudo.
PARA DEMAIS INFORMAÇÕES você poderá entrar em contato com a Dra. Nelci
Fenalti Höehr pelo telefone 19- 3521-9455 ou com seus alunos Júlio César Santos
Júnior e Carla Giane Loss pelos telefones 19-99423826 e 19-982146928,
respectivamente (em horário comercial) ou através dos e-mails:
juliocsj@fcm.unicamp.br e carlagiane@gmail.com.
109
Endereço Rua Tessália Vieira de Camargo, 126, Bairro Barão Geraldo, campinas-SP.
CEP 13083881. Faculdade de Ciências Médicas - Departamento de Patologia Clínica,
UNICAMP.
O Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) recebe reclamações e denúncias sobre os
aspectos éticos deste estudo pelo telefone 19-35218936 ou pelo e-mail
cep@fcm.unicamp.br
Endereço Rua Tessália Vieira de Camargo, 126. Bairro Barão Geraldo, Campinas-SP.
CEP 13.083-887
_____________________________ __/___/___
Assinatura do participante Data
________________________________ __/___/___
Assinatura do familiar responsável legal Data
___________________________________ __/__/___
Nome do responsável pela coleta Data
ANEXO 3
111
112
113
ANEXO 4
114
ANEXO 5
Coordenadora
Número CAAE:
17753813.3.0000.5404
alunos Júlio César Santos Júnior e Carla Giane Loss no ano de 2013, a
do presente projeto, uma vez que ele faz parte do tema da dissertação de
Atenciosamente
Nelci F. Höehr