UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

Y DE LA AGRICULTURA

MICROSCOPÍA
Nombre: Criollo Víctor
Fecha: 17/12/2018 NRC: 3802

The Development of the Electron Microscope and of Electron

Microscopy
A. Casa de padres, familia

Hace un mes, la Fundación Nobel me envió su anuario de 1985 aprendí que muchas
conferencias de Nobel son conferencias científicas, intercaladas con curvas, tablas
sinópticas y citas. Por lo tanto, no informaré tanto aquí sobre los detalles físicos y
técnicos y sus conexiones, sino más bien sobre las experiencias humanas, algunos
eventos alegres y muchas decepciones que no se nos han salvado ni a mí ni a mis
colegas en nuestro camino hacia el avance definitivo. Yo era el quinto, mi Hermano
Helmut el sexto. A él tuve relaciones particularmente estrechas y amistosas. Temprano,
los instrumentos ópticos nos causaron una fuerte impresión. En el segundo piso de
nuestra casa, mi padre tenía dos salas de estudio conectadas por una amplia puerta
corredera que generalmente estaba abierta.

Al tercer golpe, Helmut y yo tuvimos que ir a su habitación y quedarnos sentados en un

taburete bajo de madera, dos à dos, hasta una hora a 2 m de distancia de su escritorio.
Mientras lo hacíamos, veríamos en una mesa en la otra habitación la bonita caja de
madera amarillenta que albergaba el gran microscopio Zeiss de mi padre, que estaba
estrictamente prohibido tocar. Por lo tanto, nuestra primera relación con el valor de la
microscopía no fue únicamente positiva.

B. Escuela, elección vocacional

Mucho más positivo fue, varios años después, la excelente instrucción de biología que
mi hermano recibió a través de su maestro Adolf Leiber y la enseñanza muy completa
que recibí de mi maestro Karl Reinig. Incluso hoy recuerdo la profunda impresión que
me hicieron los comentarios de Reinig cuando explicó que el movimiento de los
electrones en un campo electrostático seguía las mismas leyes que el movimiento de
masa inerte en los campos gravitacionales. Incluso intentó explicarnos la limitación de
la resolución microscópica debido a la longitud de onda de la luz. En nuestro Colegio,
teníamos hasta 17 horas de latín, griego y francés por semana. En contraste con mi
padre, que tenía un gran talento para los idiomas, solo obtuve resultados muy pobres
en este campo. Mi padre, en ese momento el maestro en la misma escuela, aprendió
diariamente sobre mis esfuerzos negativos de sus colegas y me culpó por ser
demasiado perezoso, por lo que tuve algunos años de escuela tristes. Mi profesor de
griego, un compañero de estudios de mi padre, tenía una visión más realista de las
cosas: me dio para mi confirmación el libro Detrás de arado y tornillo del ingeniero
Suabia, Max Eyth. El impresionante libro de Max Eyth definitivamente me impulsó a
estudiar ingeniería.

C. El oscilógrafo de rayos catódicos y la bobina corta.

Después de haber estudiado ingeniería electrotécnica durante dos años en Munich, mi

padre recibió una llamada para ser director de un Instituto recién fundado.

La ecuación de Busch para la distancia focal del campo magnético de una bobina corta
implica que la distancia focal deseada podría producirse por el menor número de
amperios que se giran, el campo de la bobina estaba limitado a una región corta a lo
largo del eje, porque en ese caso el máximo del campo está incrementado. Las
mediciones en una bobina con un revestimiento de hierro, con un espacio anular en el
tubo interior demostraron que se había alcanzado la misma distancia focal con menos
giros de amperios. De esta manera una distancia focal más corta también puede
obtenerse, por supuesto, con un número igual de giros de amperios.

¿Por qué busqué la lente de electrones magnética para el microscopio electrónico? Por
qué buscaba un reemplazo electrostático para la concentración magnética del haz de
electrones divergente. Knoll sugirió una investigación experimental de una disposición
de electrodos de orificio con diferentes potenciales eléctricos. Discutimos la forma del
campo eléctrico entre estos electrodos, y sugerí que debido a la simetría de espejo del
campo electrostático de los electrodos a cada lado del centro de la lente, un efecto de
concentración de los planos equipotenciales curvados en el área del orificio no pudo
llevarse a cabo. Pasé por alto que, como consecuencia de la considerable variación de
la velocidad electrónica en el paso a través de tal disposición de campo, de hecho, debe
ocurrir una concentración del haz de electrones divergente. Hice que el haz de
electrones pasara por un condensador esférico con rejillas de forma de malla fina fijadas
en cada extremo del orificio. En analogía con la refracción de los rayos de luz en su
paso a través de la lente óptica en sus superficies ("Grenzflächen), quería usar, para la
lente eléctrica, los pasos potenciales en las superficies correspondientes, que tienen
forma de lentes de gafas. Por lo tanto, la energía de los haces de electrones se modifica
temporalmente, al igual que los haces de luz en el paso a través de lentes ópticas.

E. La invención del microscopio electrónico

Por lo tanto, pudo continuar con su posición no remunerada como médico y en el

instituto de alta calidad. Un aparato de este tipo con dos bobinas cortas se puso
fácilmente juntos y en abril de 1931 obtuve la prueba definitiva de que era posible. Este
aparato es considerado hoy como el primer microscopio electrónico, aunque su aumento
total de 3.6 x 4.8 = 14.4 fue extremadamente modesto. La primera prueba había sido
así, aparte de la luz y las lentes de vidrio, las imágenes de las muestras irradiadas
también se podían obtener mediante haces de electrones y campos magnéticos, y esto
incluso en más de una etapa de obtención de imágenes.

El límite de resolución del microscopio de luz debido a la longitud de la onda de luz

reconocida 50 años antes por Ernst Abbe y otros podría, por falta de luz, no ser
importante en tales aumentos. Como ingenieros aún no conocemos la tesis de la «onda
material» del físico francés de Broglie que se había presentado varios años
antes .Cuando lo escuchó por primera vez en el verano de 1931, se decepcionó mucho
que ahora, incluso en el microscopio electrónico, la resolución debería estar
nuevamente limitada por una longitud de onda . Por lo tanto, no había ninguna razón
para abandonar el objetivo de la microscopía electrónica de superar la resolución de la
microscopía de luz.

Heinz Otto Muller y Walter Glaser, entre 1937 y 1938 trabajaron en prototipos con
condensador por objetivo, la magnificación mázima fue 30000 x [20]. Uno de estos
instrumentos fue usado para la primera investigación biológica por Helmut Ruska y otros
colaboradores de medicina.

En 1940, Helmut Ruska mostró las primeras imágenes de bacteriófagos, las cuales
fueron obtenias de un laboratorio con 4 microscopios electrónicos. A partir de 1938,
empezó la venta de microscopios electrónicos, debido al interés que empezó a surgir en
la comunidad científica por este instrumento. En 1945 más de 30 microscopios habían
sido construidos y vendidos, para investigaciones médicas y distintas disciplinas
biológicas.

En Berlín empecé la segunda parte de mis estudios. Ahí, me especialice en técnicas de

alto voltaje y plantas eléctricas. Para el final del verano de 1928, el Profesor Adolf
Matthias me conto sobre su plan para crear un pequeño grupo de personas que
desarrollen el tubo Bran. Al ser un principiante en el grupo comencé con trabajos
relacionados con problemas técnicos de vacío cuales eran importante para todos
nosotros.

En orden de conseguir una mayor precisión de las propiedades de la oscilación del rayo
del cátodo producido por el cortocicuito de bobina, revise la teoría de lentes de Busch
con un experimento simple que con condiciones un poco inadecuadas, pero con una
imagen satisfactoria de la teoría de Busch. La razón por la que use una bobina del
tamaño de la bobina de Busch fue porque la distribución en el campo axial fue muy
amplia.

La ecuación de Busch para la distancia focal del campo magnético de una bobina corta
implica que la distancia focal deseada podría producirse por el menor número de
amperios que se giran, el campo de la bobina estaba limitado a una región corta a lo
largo del eje, porque en ese caso el máximo del campo está incrementado. Las
mediciones en una bobina con un revestimiento de hierro, con un espacio anular en el
tubo interior demostraron que se había alcanzado la misma distancia focal con menos
giros de amperios. De esta manera una distancia focal más corta también puede

F: Cómo surgió la producción industrial de microscopios electrónicos.

Sin embargo, también me di cuenta de que el desarrollo adicional de un instrumento
de utilidad práctica con una mejor resolución requeriría un período de tiempo más
largo y costos enormes. En vista de los resultados obtenidos, había pocas esperanzas
de obtener apoyo financiero de ninguna parte por el momento. Estaba preparado para
un período seco más largo y decidí acercarme a la meta de un instrumento comercial
más adelante, junto con Bod o v. Borries y mi hermano Helmut. Por lo tanto, acepté
un puesto en Fernseh AG en Berlin-Zehlendorf, donde participé en el desarrollo de
tubos Braun para captación de imágenes y tubos de visualización. Con el fin de
coordinar mejor nuestros esfuerzos para obtener apoyo financiero para la producción
de microscopios electrónicos comerciales, convencí a Bodo v. Borries para que
renuncie a su puesto en el Rheinisch-Westfalische Elektrizitatswerke en Essen y
regrese a Berlín. Aquí, encontré un puesto en Siemens-Schuckert en 1934. Nos
dirigimos a muchas instalaciones de investigación industrial y gubernamental para
obtener ayuda financiera.
Durante este período, aparecieron las primeras micrografías electrónicas de las
especificaciones biológicas del s. H ein z Otto Müller (estudio en t en electrotecnia en
gin eer in g) y Friedrich Krause (estudiante de medicina) trabajó en el instrumento que
había construido en 1933, y publicaron resultados cada vez mejores (figuras 6 a 9).
Desafortunadamente, estos dos jóvenes científicos muy talentosos no sobrevivieron
al II. Guerra Mundial.
En Bruselas, Ladislaus Marton construyó su primer microscopio horizontal y obtuvo
aumentos relativamente bajos de muestras biológicas. En 1936 construyó un segundo
instrumento, esta vez con una columna vertical.

Fig. 6: Superficie del ala de la mosca doméstica.

(Primera fotografía interna, U = 60 kV, M e1 = 2200)
 Fig. 7: Diatomeas Amphipleura pellucida. (U = 53 kV, M eI = 3500, = 130 n m)

Fig. 8: Bacterias (infusión de cultivo), fijadas con formalina y embebidas en una película de soporte teñida
con una sal de metal pesado. (U = 73.5 kV, Mel = 2000)

A pesar de estas publicaciones más recientes, tardamos tres años en tener éxito en
nuestra búsqueda de apoyo financiero a través de la evaluación profesional del ex
docente clínico de Helmut Ruska, el profesor Dr. Richard Siebeck, Director de la Clínica
Médica I. Berlin Charité. Cito dos párrafos de su evaluación del 2 de octubre de 1936.

“Si estas cosas se hicieran realidad, no es necesario enfatizar que los avances en el
campo de la investigación sobre las causas de la enfermedad serían de inmediato
interés práctico para el médico. Afectaría profundamente los problemas reales
relacionados en gran medida con enfermedades de importancia clínica creciente y, por
lo tanto, de gran importancia para la salud pública.

Si las posibilidades de resolución microscópica superan los valores asumidos por un

factor de cien, las consecuencias científicas serían incalculables. Lo que parece
alcanzable ahora, considero tan importante, y el éxito me parece tan cercano, que estoy
listo y dispuesto a asesorar sobre el trabajo de investigación médica y a colaborar
poniendo a disposición los recursos de mi Instituto”.

Como consecuencia del falso razonamiento y la decepción experimental, decidió

continuar con la lente magnética. Solo informó esto con tanto detalle para demostrar
que ocasionalmente puede ser más una cuestión de suerte que de un vigor intelectual
superior para encontrar una mejor o quizás la única manera aceptable. El enfoque del
microscopio electrónico de transmisión de electrones con lentes de electrodos
electrostáticos, más tarde fue perseguido por los experimentadores en circulación en
otros lugares y condujo a un considerable éxito inicial. Después de obtener su título, la
situación económica se había vuelto muy difícil en Alemania y no parecía posible
encontrar una posición satisfactoria en una universidad o en la industria.

G. Desarrollo de la microscopía electrónica después de 1945.

En 1954, Siemens creo el "Elmiskop" tenía dos lentes condensadoras que permitían la
protección térmica de la muestra irradiando solo la pequeña región que se requiere para
la ampliación final deseada. Desde ahora, para un aumento final de 100 000 x un campo
de muestras de solo 1 pm se debe irradiar para obtener una imagen de 10 cm de
diámetro en contraste con áreas de irradiación anteriores de aproximadamente 1 mm
de diámetro, Las muestras se calientan hasta el punto de que la energía térmica
producida puede irradiarse a toda la región alrededor del objeto.

Sin embargo, el nuevo instrumento fue una gran decepción al principio cuando se dieron
cuenta de que en esta "pequeña región de radiación", la imagen de los campos de la
muestra, que ya no estaba caliente, se volvió tan oscura en segundos que todos los
detalles inicialmente visibles desaparecieron. Felizmente, también este obstáculo
podría, después de algún tiempo, superarse con medios relativamente simples: todo el
entorno de la muestra se enfrió con aire líquido, de modo que la muestra todavía estaba
más caliente que su entorno, incluso sin que el rayo la calentara. Por lo tanto, los gases
residuales de los hidrocarburos se condensan en los planos de bajo enfriamiento y ya
no en la muestra. Junto con la solución exitosa de este problema, otra dificultad, la del
espesor de la muestra, también fue sorprendentemente superada por los
"ultramicrotomos". El desarrollo de estos nuevos ultramicrotomos redujo
considerablemente la limitación en la elección de muestras para microscopía
electrónica.

Desde hace 25 años, casi todas las disciplinas promovidas por microscopía de luz
también han podido beneficiarse de la microscopía electrónica.

En 1932, Knoll y Ruska se atrevieron a hacer un pronóstico del límite de resolución del
microscopio electrónico. Suponiendo que la ecuación para el límite de resolución del
microscopio de luz es válida también para la onda material de los electrones. De ese
modo, al principio se les ocurrió un límite de resolución de 2.2 Å = 2.2 x 10-10 m, un valor
que de hecho se obtuvo 40 años después. En ese momento, este enfoque no fue tomado
en serio por la mayoría de los expertos.

En contraste con muchos biólogos y científicos médicos, Helmut creía en un progreso

considerable en estas disciplinas. En un paso siguiente, se demostró que era posible
obtener aumentos suficientemente altos para demostrar una resolución de microscopio
mejor que la luz. Para este efecto, se desarrolló una forma de bobina cuyo campo
magnético se comprimiera a una longitud tan pequeña como el eje de la bobina para
permitir distancias focales cortas, como se necesita para imágenes altamente
magnificadas a una distancia no demasiado grande detrás de la bobina. Se completó en
agosto de 1933, obteniendo mediciones con distancias focales de 3 mm para rayos de
electrones de 75 kV de aceleración.

Ruska solo pudo hacer algunas imágenes con este instrumento que aumentó 12000X,
pero notó un hecho decisivo: incluso las muestras muy delgadas produjeron un contraste
suficiente, pero ya no por absorción sino únicamente por difracción de los electrones.

Los últimos tiempos las técnicas de microscopia electrónica han avanzado a través de
nuevas ideas y procedimientos. Como el condensador de campo únicos que permite al
espécimen en el campo máximo de una lente magnética. El campo magnético se
comporta como un condensador de distancia focal corta y la región de campo
decreciente detrás de la muestra como un objetivo de distancia focal, haciendo que la
lente tenga una aberración esférica pequeña. Este instrumento se implementó una
plaqueta de cristal de oro luego en “Japan Electron” desarrollo un instrumento de voltaje
de 3MV. Los principales problemas son los costos extremadamente altos, la
estabilización de la tensión de aceleración, y la protección contra los rayos “X”
superando estos problemas y a través de longitud de electrones más cortas se pueden
estudiar muestras más delgadas. La crio tecnología de Fernández-Moran, es una
técnica que permite estudiar muestras enfriadas a temperaturas muy bajas ya que son
muy resistentes a dosis más de electrones.

Debido a que las muestras se destruyen con una dosis normal de haz, no es posible
obtener una imagen con suficiente contraste. Por lo que se evalúa el microorganismo
de la siguiente forma: en primer lugar, se digitaliza mediante el densitómetro para que a
cada punto de la imagen se le asigne un número que describa la densidad óptica, y
mediante procesamiento a través de computadora la imagen resultante corresponde a
una micrografía suficientemente expuesta, esto convierte a la computadora en una
herramienta muy poderosa. Incluso es posible obtener imágenes de cristales de
proteínas tridimensionales con una resolución muy alta.

En el desarrollo de la microscopía electrónica se ha dado una batalla muy dura en contra

de las consecuencias no deseadas por parte de los rayos de electrones. Por ejemplo
para obtener una buena resolución se utiliza una alta energía de electrones que causa
daño al espécimen, por otro lado la desviación en el campo magnético también puede
limitar la resolución. El superar estas dificultades y muchas más ha hecho que muchas
disciplinas científicas obtengan grandes beneficios.