Micropropagarea “in vitro” la speciile cu înmulţire vegetativă

1. Terminologie
Agar – produs extras din alge, utilizat pentru solidificarea mediilor de cultură
Auxine – substanţe regulatoare de creştere, implicate în:
- alungirea celulei vegetale
- dominanţa apicală
- iniţierea rizogenezei (formării rădăcinilor)
Citochinine – substanţe regulatoare de creştere, responsabile de:
- diviziunea celulară
- diferenţierea celulelor
- formarea de muguri
- eliminarea dominanţei apicale a mugurelui terminal
Clonă –grup de indivizi descendenţi dintr-un unic individ, fără fecundare, pe cale
vegetativă, identici d.p.v. genetic între ei şi cu organismul mamă
Explant – fragment dintr-un organism (apex, organ sau fragment de organe), detaşat de
locul de origine şi care, prin cultivare, poate genera un organism nou
In vitro – proces desfăşurat în condiţii sterile şi controlate de cultură, pe medii artificiale,
în recipienţi de sticlă sau plastic
Meristem – ţesut vegetal tânăr de la extremitatea organelor, în care celulele se înmulţesc
continuu, asigurând creşterea organismelor
Mediu de cultură de bază – mediu de control al unei culturi, cu compuşi organici şi
anorganici de creştere de bază, fără regulatori de creştere şi vitamine
Mediu de cultură – totalitatea factorilor pt. supravieţuirea explantului “in vitro” ,
regenerarea celulară şi evoluţia sa în direcţia propusă (macroelemente, microelemente,
componente organice, regulatori de creştere, apă, stabilizatori osmotici şi de pH,
antioxidanţi etc.)
Micropropagare – propagarea sau înmulţirea pe cale asexuată/vegetativă a plantelor “in
vitro” (microînmulţire)
Plantulă, vitroplantulă – tulpiniţă generată “in vitro”şi înrădăcinată ori embrionul
germinat

2. Amenajarea şi dotarea laboratorului de culturi “in vitro”

Condiţii de mediu şi facilităţi:
- lipsa poluării
- spaţii de aclimatizare (sere, solarii) amplasate în apropiere
- apă potabilă, curent electric, gaz metan, evacuarea apei reziduale
- aer condiţionat (încălzire, ventilare-aerisire)
- spaţii interioare etanşeizate, pardosite cu materiale ce pot fi spălate şi dezinfectate
Constructiv, laboratorul se amenajează pe un singur nivel şi va avea delimitate 3 zone sau
spaţii distincte:
- zona nesterilă (spălător, depozite, camere pt autoclave, distilatoare apă, laborator
foto, birouri)
- zona sterilă (boxe sau nişe aseptice cu flux de aer laminar, laborator de pregătire a
mediilor de cultură, camere frigorifice)
- zona de creştere şi aclimatizare (rafturi climatizate, instalaţii de iluminat etc)
Dotarea laboratorului: instalaţii, mobilier, aparatură, materiale, instrumente şi substanţe
chimice
- Aparatură: balanţe, agitatoare magnetice, plite electrice, băi marine, pH-metre,
microscoape, lupe binoculare, autoclave, distilatoare şi bidistilatoare pentru apă,
maşină de spălat sticlărie de laborator, frigidere, congelatoare, pipete, seringi, vase de
 sticlă/plastic, instrumente de laborator (stative, pensete, ace spatulate, anse, foarfece,
becuri de gaz, bidoane etc)
- Etichete şi markere speciale pentru vasele de cultură
- Substanţe chimice pentru prepararea mediilor de cultură, sterilizare etc:
- macroelemente (azotat de amoniu, sulfat de amoniu, clorură de calciu, azotat de
calciu, sulfat de magneziu, clorură de potasiu, azotat de potasiu)
- microelemente (acid boric, clorură de cobalt, sulfat de cupru, sulfat de mangan,
iodură de potasiu, molobdat de sodiu, sulfat de zinc, sulfat de fier, natri fier EDTA,
acid clorhidric, acid natriuetilendiaminotetraacetic)
- glucide şi polialcooli (fructoză, zaharoză, glucoză, manitol, sorbitol)
- vitamine şi aminoacizi (biotină, tiamină, riboflavină, glicină, acid ascorbic, acid
nicotinic, acid folic, piridoxină)
- regulatori de creştere (auxine: acid clorfenoxiacetic, acid 2,4 diclorfenoxiacetic,
acid β-indolilacetic, acid indolilbutiric, acid α-naftilacetic, acid β-naftoxiacetic,
citochinine şi gibereline: adenină, sulfat de adenină, 6-benziladenină, 6-
dimetilalilaminopurină, 6-furfurilaminopurină, zeatină, acid giberelinic)
- agar
- extract de drojdie
- hidrolizat de cazeină
- cărbune activ
3. Etapele tehnologiei de cultivare “in vitro”
- Alegerea materialului biologic donator de explante şi sterilizarea acestuia
- Izolarea şi prelevarea explantelor
- Inocularea şi incubarea (transferarea pe mediul de cultură) explantelor
- Multiplicarea într-un număr variabil de cicluri a materialului biologic
- Aclimatizarea plantulelor (trecerea de la condiţiile de mediu aseptice şi total
controlate din laborator la condiţii de seră sau solar)
4. Importanţa (avantajele) utilizării culturilor “in vitro”
- Micromultiplicarea (clonarea) rapidă, pe cale vegetativă, a plantelor
- Obţinerea de material biologic liber de agenţi patogeni (viroze etc)
- Introducerea rapidă în cultură a soiurilor noi la speciile cu înmulţire vegetativă
- Folosirea culturilor “in vitro” în ameliorare (
- Folosirea culturilor “in vitro” în fitopatologie
- Obţinerea de haploizi şi hibrizi somatici
- Obţinerea de linii celulare cu randament sporit în sinteza unor produşi metabolici
secundari (medicină)
- Obţinerea organismelor modificate genetic (OMG)
- Crioconservarea culturilor “in vitro”

Bibliografie
Creţu L., 2004 – Culturi “in vitro”, Ed. Ion Ionescu de la Brad, Iaşi.
Blidar C.F., Petruş –Vancea Adriana, 2006 – Biotehnologie, Lucrări practice de
laborator, Universitatea din Oradea.
 Mediul MURASHIGE-SKOOG (MS), 1962
A.Soluţia de MACROELEMENTE
Concentraţia în soluţia normală Soluţia STOC concentrată de 10 ori
Macroelemente
mg/l mM g/l mg/1000 ml
NH4NO3 1650 20,6 16,5 16.500
K NO3 1900 18,8 19,0 19.000
CaCl2 x 2H2O 440 30 Se prepară separat soluţia stoc 15 g/100 ml
MgSO4x 7 H2O 370 1,5 3,7 3700
KH2 PO4 170 1,25 1,7 1700

B. Soluţia de MICROELEMENTE
Concentraţia în soluţia normală Soluţia STOC concentrată de 10 ori
Microelemente
mg/l mM g/l mg/1000 ml
H3BO3 6,2 100 6200 620
Mn SO4x 4H2O 22,3 100 22300 2230
ZnSO4x 7 H2O 8,6 30 8600 860
NaMoO4x 2H2O 0,25 1,0 250 25
CuSO4x 5H2O 0,025 0,1 25 2,5
CaCl x 6 H2O 0,025 0,1 25 2,5
KI 0,83 5 Se prepară separat soluţia
Stoc 75 mg/100 ml

C. Soluţia de VITAMINE
Soluţia STOC concentrată de 1000
Concentraţia în soluţia normală
Vitamine de ori
mg/l mg/100 ml
Acid nicotinic 0,5 50
Piridoxină HCl 0,5 50
Tiamină HCl 0,1 10
Mezo-inozitol 100 10000

D. Soluţia FeEDTA 40 mg/l, se prepară separat soluţia stoc

Soluţia STOC concentrată de 1000
Concentraţia în soluţia normală
FeEDTA de ori
mg/l mg/100 ml
FeSO4×7H2O 27,8 5,57
Na2EDTA 37,3 4,45

E. Soluţia de AMINOACIZI:
Soluţia STOC concentrată de 1000
Concentraţia în soluţia normală
Aminoacizi de ori
mg/l mg/100 ml
Glicina 2

F. Soluţii de REGULATORI DE CREŞTERE

Soluţia STOC concentrată de 1000
Concentraţia în soluţia normală
Regulatori creştere de ori
mg/l mg/100 ml
AIA 1 – 30 50,0
Chinetină 0,04 - 10 21,5

G. Zaharoză/Sucrose 30%
H. Difco Bacto 9 Agar 10 g/l