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Facultad de Ciencias
Escuela de Biología
Laboratorio de Biología Celular
Prof.: Carlos Torrealba
Existen diversas formas de evaluar una población bacteriana ya sea por métodos de
medición del crecimiento directos e indirectos. (2) En el conteo directo el crecimiento se
evalúa haciendo mediciones sucesivas en tiempos determinados de la población en estudio,
en cada momento se evalúa cual es la población en ese instante. El conteo de células viables
se basa en la consideración que el crecimiento implica el aumento de los microorganismos
capaces de formar colonias. El método más frecuentemente empleado es el conteo en placas,
por lo tanto se determinan por este método sólo las células microbianas viables en las
condiciones de trabajo. En un medio sólido cada bacteria se multiplicará formando una
colonia visible a simple vista que puede ser contada. Como las colonias pueden originarse
tanto de una célula como de un grupo de células, se utiliza el término: Unidades formadoras
de colonias (U.F.C). El método de medición de la densidad bacteriana es una técnica de
medición indirecta en la que se mide la cantidad de microorganismos en una suspensión. Para
ello se utiliza un espectrofotómetro y se mide la cantidad de luz que atraviesa en una
suspensión de microorganismos, en comparación con un blanco que es el medio esterilizado
y sin sembrar. Cuanto mayor es el número de células en suspensión, tanto menor es el
porcentaje de luz que atraviesa el medio. Estas metodologías fueron empleadas en este
ejercicio de práctica y de esta forma se evaluó el crecimiento bacteriano utilizando distintas
fuentes de carbono, distintas temperaturas y oxigenación.
OBJETIVOS DE LA PRÁCTCA
METODOLOGÍA
En la práctica realizada se emplearon dos tipos de metodologías para el contaje de
células procariotas utilizando como modelo biológico: Escherichia coli.
Método I:
Contaje indirecto de células procariotas Medio de cultivo: 10 mL totales en una
ertula que contenga medio mineral completo vitamina B1 5m/L + Fuente de carbono 10mM,
se le proporcionó al equipo Galactosa y Acetato. El medio es inoculado con una
dilución 1/10 de un cultivo de bacterias. Se incubó la ertula inoculada en un baño de agitación
a la temperatura de 37 grados centígrados. Después de inocular el medio y con intervalos
sucesivos de 20 minutos durante 3 horas se determinó la población bacteriana presente
realizando las siguientes operaciones:
1) Se midió la densidad óptica del cultivo ajustando la lectura del espectrofotómetro con
un blanco que contenga solo el medio nutritivo sin el cultivo bacteriano.
2) Se extrajo una muestra de 01 mL exactos del cultivo y se realizó una dilución global
de este en 1x10-6, debido a que se obtuvo con la primera medición de D.O a T0 una
extrapolación de una medida mayor a 40 unidades KLETT (UK)
3) Se tomaron 0,1 mL exactos de la dilución anterior obtenida en el paso 2 y se
distribuyó uniformemente sobre una placa de agar nutritivo estéril utilizando el
sembrado por arrastre como metodóloga de siembra.
Método II:
Contaje directo de células eucariotas Se suministró por el personal docente un
cultivo no patógeno de Leptomonas sp y se determinó el total de células por mililitro en el
cultivo original por vía de contaje directo de las células en una cámara de Neubauer.
MATERIALES Y EQUIPOS.
RESULTADOS Y DISCUSIONES.
D.O Plaqueo
Tiempo
Galactosa Acetato
T0 11:10 0,099 0,101 √
T1 11:30 0,126 0,132
T2 11:50 0,153 0,147 √
T3 12:10 0,155 0,149
T4 12:30 0,169 0,159 √
T5 12:50 0,219 0,196
T6 01:10 0,272 0,219 √
T7 01:30 0,299 0,24
T8 01:50 0,331 0,253 √
T9 02:10 0,356 0,26
1DO 500UK
cel
1UK 2 10 6
mL
1 DO 500UK
1 DO 500UK
0,4
0,35
0,3
D.O (Galactosa)
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
Tiempo (min)
Cuando se utiliza como única fuente de carbono el acetato E. coli obtiene la mayoría de su
energía metabólica por medio del ciclo de Krebs (3, 6) de este modo las rutas metabólicas
que utilizan glucosa como única fuente de carbono proporcionan mayor rendimiento
energético debido a que se degrada la molécula a glucosa vía glucólisis, mientras que con
acetato se obtiene menor rendimiento energético cuando la molécula va de manera directa al
ciclo de Krebs. Una molécula de acetato forma una molécula de Acetil-CoA (figura 4) que
se une al oxalacetato por medio de una reacción catalizada por una enzima de tipo transferasa
formado citrato en el paso 1 del ciclo de Krebs (figura 5).
Figura 4: Ruta de conversón de la molécula de Acetato a Acetil- Coa para su posterior entrada
al ciclo de Krebs.
Figura 5: Visión general del ciclo de Krebs. En la paso 1 una molécula de Acetil- coa se une al
oxalacetato para formar citrato.
0,3
0,25
0,2
D.O ( Acetato)
0,15
0,1
0,05
0
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
Tiempo (min)
0,35
T8
0,3
T6
0,25
D.O. (Galactosa)
0,2
T4
0,15 T2
0,1 T0
0,05
0
0 1E+10 2E+10 3E+10 4E+10 5E+10
Cél/mL
Si se sustituye en la ecuación anterior log 2 por su valor 0.3010, se tiene que 1/0.3010 = 3.3
𝒚
𝒏 = 𝟑, 𝟑 𝐥𝐨𝐠
𝒙
Por consiguiente, aplicando la ecuación anterior puede calcularse el número de
generaciones que han tenido lugar, siempre que se conozca la población inicial x, y la
población y después del tiempo t.
El tiempo de generación G es igual a t (tiempo transcurrido en fase exponencial para llegar
de x a y) dividido por el número de generaciones n, o sea:
G= t/n
La fase exponencial es el período de la curva de crecimiento en el cual el
microorganismo crece exponencialmente (figura 6), es decir que cada vez que pasa un
tiempo de generación la población se duplica bajo condiciones apropiadas de temperatura,
composición del medio de cultivo, etc.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
1) Tortora, G.J., Funke B.R. y C.L. Case. 2007. Introducción a la microbiología. Novena
edición. Editorial Pearson. Nueva York, E.E.U.U.
6) Voet, D. y J.G. Voet. 2004. Bioquímica. Sección 17-14: Regulación y control metabólico.
Tercera edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
ANEXO