UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA AMBIENTAL

DEA 07785 – LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA

Profa. Regina de Pinho Keller

Prof. Sérvio Túlio Alves Cassini
Prof. Celson Rodrigues
Prof. Paulo W. P. Antunes
Professores de Microbiologia

Marcos Vinicius Lavagnoli

Yohanna Gomes
Professores Convidados

Larissa Roldi
Lucas Bonine
Auxiliar Técnica
Sumário
NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS: ............................................................... 3

CONCEITOS BÁSICOS DE DESINFECÇÃO E ESTERILIZAÇÃO: ..................................................... 4

COMO TRABALHAR COM MICROSCÓPIO ....................................................................................... 5

COMO PREPARAR O RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS ............................................................... 7

AULA PRÁTICA I ................................................................................................................................. 8

MEIOS DE CULTURA, TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

AMBIENTAIS ....................................................................................................................................... 8

PARTE 01 –ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS DIVERSAS 10

PARTE 02 – ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS E

CULTURAS PURAS PELA TÉCNICA DE ESTRIAMENTO ............................................................... 10

AULA PRÁTICA II .............................................................................................................................. 13

ANÁLISE DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS TOTAIS (BHTs) EM AMOSTRAS LÍQUIDAS ......... 13

AULA PRÁTICA III ............................................................................................................................. 14

ISOLAMENTO DE FUNGOS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS ........................................... 14

AULA PRÁTICA IV ............................................................................................................................ 16

MICROSCOPIA E COLORAÇÃO DE GRAM ..................................................................................... 16

AULA PRÁTICA V ............................................................................................................................. 18

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS POR TESTES BIOQUÍMICOS .................................................... 18

AULA PRÁTICA VI ............................................................................................................................ 20

TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS – TSA (Antibiograma) ................................ 20

AULA PRÁTICA VII ........................................................................................................................... 22

DESINFECÇÃO MICROBIANA COM AGENTES FÍSICOS E QUÍMICOS ......................................... 22

PARTE 01 – DESINFECÇÃO COM AGENTES FÍSICOS .................................................................. 22

PARTE 02 – DESINFECÇÃO COM AGENTES QUÍMICOS .............................................................. 23

AULA PRÁTICA VIII .......................................................................................................................... 25

DETECÇÃO DE INDICADORES DE POLUIÇÃO FECAL EM ÁGUAS (MÉTODO

CROMOFLUOROGÊNICO) ............................................................................................................... 25

AULA PRÁTICA IX ............................................................................................................................ 28

AULA PRÁTICA XI ............................................................................................................................ 30

1
AULA PRÁTICA XIII .......................................................................................................................... 33

AULA PRÁTICA XV ........................................................................................................................... 35

ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS COM BACTÉRIAS Vibrio Fischeri

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 DEA 07785 - LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA E ECOTOXICIDADE

As aulas práticas de Microbiologia e Ecotoxicologia têm como objetivo ensinar os princípios gerais e métodos
utilizados nessa área de estudo. Nestas aulas teremos contato com uma variedade de bactérias, sendo que
algumas delas apresentam potencial patogênico para o homem, portanto é essencial que as normas sejam
seguidas a fim de se evitar contaminações acidentais.

NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS:

Cuidados Pessoais:

→ É indispensável o uso de JALECO no laboratório, que deve ser de mangas compridas e estar abotoado;

→ Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório;

→ Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e equipamentos;

→ Todo o material pessoal (bolsas, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho;

→Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático: roteiro de aula e caneta para anotações;

→ Evitar a desordem do ambiente e prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes e/ou
a contaminação indevida dos materiais esterilizados;

→ Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas,
etc), comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula.

Descarte de material:

→ Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA
deixá-los dispostos diretamente sobre bancadas ou pias;

→ Placas de petri, contaminadas ou não, deverão permanecer tampadas sobre a bancada;

→ Lâminas fornecidas para visualização deverão ser colocadas em recipiente próprio para posterior
descontaminação;

→ Tubos com culturas deverão ser devolvidos para as estantes.

Terminados os trabalhos práticos:

→ Esterilizar alças e fios de platina;

→ Após as aulas, as culturas de microorganismos deverão ser descontaminadas antes de serem descartadas;

→ Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas;

→ Desligar a lâmpada dos microscópios e após a limpeza, cobri-los com a capa;

→ Retirar as luvas e descartar em lixo próprio;

→ Tirar o jaleco e guardar;

→ Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou antisséptico.

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 CONCEITOS BÁSICOS DE DESINFECÇÃO E ESTERILIZAÇÃO:

A condição sanitária de uma dada população humana é determinada, em larga escala, por sua capacidade de
controlar eficazmente as populações microbianas. Os processos podem ser específicos, como o uso de
medicação capaz de eliminar os microrganismos infectantes, ou podem ser mais gerais, como as práticas
sanitárias de assepsia. As principais razões para desenvolver o controle de microrganismos são, em resumo:

1) prevenir a transmissão de doenças e infecções;

2) prevenir a contaminação ou crescimento de microrganismos nocivos

3) prevenir a deterioração e dano de materiais por microrganismos.

Os microrganismos podem ser removidos, inibidos ou mortos por agentes físicos ou químicos. Uma grande
variedade de técnicas e de agentes pode ser utilizada, agindo de modos diferentes e tendo seu próprio limite de
aplicação prática. Os termos a seguir são usados para descrever os processos físicos e os agentes químicos
destinados ao controle dos microrganismos:

LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfecção ou

esterilização.

DESINFECÇÃO: Consiste na destruição, remoção ou redução dos microrganismos presentes num material
inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou local.

ESTERILIZAÇÃO: Processo de destruição total ou remoção de todas as formas de vida de um material ou

ambiente, através de métodos físicos ou químicos. Do ponto de vista microbiológico, um material estéril está
completamente livre de todos os microrganismos.

ASSEPSIA:Conjunto de procedimentos que visam impedir a introdução de germes patogênicos em determinado

organismo, ambientee objetos. É o cuidado com a limpeza e higiene de tudo que nos cerca.

Anvisa 3.1.17: Assepsia: É o conjunto de medidas que visam à redução de microrganismos presentes em
superfícies em níveis seguros.

ANTISSEPSIA:Consiste na utilização de produtos (microbicidas ou microbiostáticos) sobre a pele ou mucosa

com o objetivo de reduzir os micro-organismos em sua superfície. (ANVISA). A principal diferença entre assepsia
e antissepsia está no fato desta última se tratar da desinfecção de um local, enquanto a primeira trata da
higienização preventiva.
Anvisa 3.1.13: Anti-sepsia: operação que visa à redução de microrganismos presentes na pele em
níveis seguros, mediante o uso de sabonete anti-séptico ou outro agente anti-séptico.

MICROBICIDA é um agente que mata os microorganismos. Os termos: bactericida,fungicida, viricida e

esporocida se referem aos agentes que matam as bactérias, os fungos, vírus e esporos, respectivamente.

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 COMO TRABALHAR COM MICROSCÓPIO

Em primeiro lugar é essencial que você conheça as partes ópticas e mecânicas dos microscópios:

- Mantenha o microscópio livre de poeira, vapores ácidos e do contato com reagentes. Para mantê-lo seco, cubra
com capa de flanela, pois evita o pó e a multiplicação de fungos Obs: as capas devem ser lavadas
periodicamente;

- Fazer a assepsia das luvas ou das mãos para manusear o microscópio;

- Não manusear o equipamento com as mãos sujas ou molhadas;

- Na remoção do equipamento, segure-o firmemente com uma das mãos no braço e outra na base, ou com as
duas no braço, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfície plana,
evitando qualquer movimentação brusca. Nunca desloque o aparelho com a lâmpada acesa ou logo após ter
sido apagada;

- Muita atenção é necessária quando se observa a preparação em meio líquido, pois há sempre o risco de molhar
a lente frontal da objetiva; portanto o conselho é retirar o excesso de líquido com papel de filtro, antes de colocar
a lâmina sobre a platina; em caso de acidente, enxugar imediatamente com papel absorvente macio;

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 UTILIZAÇÃO DAS LENTES

Na observação de uma preparação, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para focalizar com aquelas
de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma:

- Escolha uma estrutura na preparação, movendo a lâmina através do charriot até que o objeto fique exatamente
no centro do campo, mesmo que embaçado;

- Olhe pela ocular e eleve a mesa de platina com o ajuste macrométrico lentamente. Assim que a imagem
aparecer, mesmo confusa, pare e complete a focalização com o ajuste micrométrico.

A LENTE OBJETIVA DE IMERSÃO

- É a lente de maior aumento (100x) e seu uso é mais delicado, pois a distância focal entre a face da objetiva e a
parte superior da lamínula diminui quando a ampliação é aumentada.

- Em primeiro lugar, assegure-se da existência de algo no campo, posicionando a objetiva de menor aumento.

- Certifique-se que a iluminação e o objeto estão bem centrados, posicione o revólver entre uma lente e outra e
coloque uma gota de óleo no centro da operação. O óleo deve ter o mesmo índice de refração da lente objetiva;

- Coloque a lente objetiva de imersão em contato com a gota de óleo ainda convexa, até a mudança de forma da
mesma. Posicione os olhos nas oculares e complete a focalização com o micrométrico.

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 COMO PREPARAR O RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS

PÁGINA 01:

PÁGINAS SEGUINTES:

Introdução – Pequeno parágrafo introduzindo o leitor para o assunto que vai ser apresentado no relatório.

Objetivos – Descrever os objetivos da aula prática.

Resultados e Discussão – Apresentar os resultados na forma de esquemas, fotos, desenhos, figuras, tabelas,
gráficos e etc. Discutir os resultados obtidos utilizando informações obtidas em livros-texto e artigos científicos.
Evitar o uso de referências obtidas em sites não científicos da internet.

Conclusão – Concluir o trabalho apresentado com base no que foi proposto nos objetivos da prática.

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 AULA PRÁTICA I
MEIOS DE CULTURA, TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE
MICRORGANISMOS AMBIENTAIS

I.INTRODUÇÃO

O estudo de microrganismos exige o prévio isolamento e identificação; para isso, são utilizados diversos meios
de cultura. Estes meios são misturas de nutrientes que possibilitam o crescimento e multiplicação in vitro dos
microrganismos. Em geral, os meios devem dispor de fontes de carbono (carboidratos) e fontes de nitrogênio
(proteínas) como requisitos mínimos para que os microrganismos possam sintetizar a sua própria energia. São
também necessários alguns sais inorgânicos e vitaminas.

Os meios de cultura podem ser classificados, basicamente, quanto à consistência (Líquidos, Semissólidos e
Sólidos) e quanto à função (Simples, Enriquecimento, Seletivo, Diferencial, Manutenção). Os meios de cultivo
devem ser preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade. Toda a manipulação
realizada em laboratório (com meios, cultura e material utilizado) requer certos cuidados para evitar a
contaminação. Esses procedimentos formamum conjunto de técnicas assépticas.

A inoculação é a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a transferência de microrganismos

para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam possibilitando sua identificação. A inoculação em
diferentes meios envolve diferentes técnicas de semeadura. Técnica de semeadura é o método pelo qual são
transferidos inóculos microbianos de um meio de cultura, ou do material a ser analisado (ex: secreções, alimentos
e etc.), para outro meio de cultura. A escolha da técnica para o cultivo de microrganismos varia de acordo com o
tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo.

Os meios de cultura, em geral, depois de preparados, são distribuídos em tubos de ensaio ou placas de Petri.
Para o preparo de um meio de cultura mínimo em tubos de ensaios, basta pesar os componentes do meio de
cultura (Tabela 01) e hidratá-los com H2O destilada, até volume final desejado. Em seguida, realiza-se a completa
dissolução dos componentes, por agitação ou aquecimento, e esterilização.

Tabela 01. Funções e massas dos componentes a serem pesados para o preparo de 1L de ágar nutriente.

COMPONENTES FUNÇÕES g

Extrato de Carne Carboidratos, compostos nitrogenados,vitaminas, sais. 3,0

Peptona Nitrogênio orgânico, algumas vitaminas 5,0

NaCl Íons e requerimento osmótico 8,0

Agar Solidificar 15,0

Após a completa dissolução dos componentes, o meio é distribuído nos tubos de ensaio, que em seguida são
tampados com algodão e colocados na posição vertical dentro de um recipiente, que é então fechado e
autoclavado para a esterilização do material. Em seguida os tubos são distribuídos sobre a bancada na posição
inclinada, para a solidificação do meio. É importante observar a posição do agar, este deve ocupar o terço inferior
do tubo.

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À semelhança do preparo dos tubos, para o preparo do meio mínimo em placas de Petri, os componentes da
tabela acima são pesados e hidratados com H2O destilada, até a completa dissolução em um erlenmayer,
conforme o item anterior. Em seguida o erlenmayer é fechado com papel e autoclavado. Após a esterilização do
meio é realizada a distribuição do meio pronto em placas previamente esterilizadas, ou em placas descartáveis
estéreis.

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS

O isolamento de bactérias consiste na obtenção de culturas chamadas puras, que contêm apenas os
microrganismos de interesse. Trata-se de um importante passo na determinação correta do microrganismo, pois
somente em colônias isoladas é que se consegue aplicar testes de identificação relacionados à morfologia da
colônia ou à produção de um metabólito específico.

Apesar da possibilidade de se utilizar microrganismos geneticamente modificados, ainda é possível encontrar

uma grande variedade de novos microrganismos no meio ambiente, sendo que muitos podem ser de alto interesse
comercial. A primeira etapa para a utilização destes microrganismos é a etapa de isolamento de uma colônia, já
que todo o seu estudo é dependente da possibilidade de cultivar e manter estes microrganismos viáveis em
laboratórios, através das culturas puras.

O metabolismo e as necessidades nutricionais específicas dos microrganismos variam de espécie para espécie,
sendo possível distinguir vários grupos de microrganismos, de acordo com o conhecimento, por exemplo, dos
nutrientes necessários para o seu crescimento ou pelos produtos específicos liberados ou consumidos durante o
metabolismo. Com o conhecimento destas particularidades é possível formular meios de cultura que promovam
o crescimento de um determinado microrganismo ou grupo de microrganismo no laboratório.

O isolamento se inicia com a escolha da fonte mais provável de conter o microrganismo desejado como solo,
água, ar, lodo, alimentos, partes do corpo, dentre outras fontes. Em seguida, as características específicas que
um organismo possui para se desenvolver em certo ambiente são usadas como fatores seletivos no processo de
isolamento. A pressão seletiva é utilizada no isolamento de microrganismos que se desenvolvem
preferencialmente em determinados substratos, na presença de certos compostos ou no cultivo sob condições
que são adversas a outros microrganismos que não são de interesse.

Ao final da prática, espera-se que os alunos tenham adquirido habilidades relacionadas ao procedimento de
semeadura dos microrganismos em o meio de cultura, bem como, a aplicação de técnicas de isolamento por
estrias.

II.MATERIAIS
- Tubos de ensaio esterilizados - Erlenmeyer esterilizado - Swabestéril

- Placas de Petri esterilizadas - Alças de semeadura - Lamparinas

- Água destilada esterilizada - Culturas de bactérias - Tubos com meio de cultura

estéril

- Salina esterilizada - Placas com meio de cultura

estéril

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III.METODOLOGIA

PARTE 01 –ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS DIVERSAS

- Identifique as placas contendo meio de cultura estéril de acordo com o grupo, data e tipo de amostra;

- Com uma caneta própria, faça uma divisão da placa em quadrantes desenhando no vidro da placa que contém
o ágar;

- Com o auxílio de um swab umedecido em salina, colete amostras de superfícies diversas, ex: couro cabeludo,
celular, mochila, torneiras, maçanetas, etc;

- Remova a tampa da placa e, gentilmente, passe o swab pela superfície do ágar no quadrante determinado para
cada amostra coletada;

Amostra 1: ___________________

Amostra 2: ___________________

Amostra 3: ___________________

Amostra 4: ___________________

- Cubra a placa com filme plástico e incube a 37ºC por 48 horas ou em temperatura ambiente por 7 dias.

- Uma placa aberta será disposta sobre a bancada durante a prática por 15 min para que seja coletada amostra
do ar ambiente;

OBS: As placas deverão ser incubadas invertidas para evitar que o meio se desidrate e que a água de
condensação caia sobre o meio.

- Após a incubação, retire as placas da estufa e observe o crescimento bacteriano nas diferentes áreas da placa.

PARTE 02 – ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS E CULTURAS

PURAS PELA TÉCNICA DE ESTRIAMENTO

O isolamento de bactérias em meios de cultura sólidos é realizado por meio de técnicas de estriamento, que
consistem no espalhamento de inóculos bacterianos na superfície do meio de cultura em diferentes direções e
de maneira organizada, de acordo com a disposição do meio. Nesta parte da aula deverão ser realizados
estriamentos, em tubos de ensaio e placas de Petri, de acordo com o representado nas figuras abaixo.

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2.1 AMOSTRAS AMBIENTAIS

- Identificar dois tubos contendo meio de cultura estéril de acordo com o grupo, data e tipo de amostra;

- Para o isolamento de bactérias provenientes de amostras ambientais serão utilizadas duas amostras, sendo
uma líquida e uma sólida;

- Em cada tubo de ensaio contendo meio de cultura inclinado, remova a tampa de algodão, próximo do bico de
Bunsen e realize estrias com auxílio da alça de repicagem;

AMOSTRA LÍQUIDA: ______________: Mergulhe a alça no líquido e, com cuidado, realize o estriamento como
mostra a figura anterior;

AMOSTRA SÓLIDA: _______________: Misture a amostra sólida em água esterilizada e retire uma alíquota com
a ponta da alça de repicagem e realize o estriamento de acordo com o indicado na figura anterior;

- Incube os tubos a 37ºC por 48 horas ou a temperatura ambiente por 7 dias;

- Após a incubação, retire os tubosda estufa e observe o crescimento bacteriano nas diferentes áreas do tubo.

2.2 CULTURAS PURAS

ESTRIAMENTO EM PLACAS DE PETRI

- Identifique uma placa de Petri contendo meio de cultura estéril de acordo com o grupo, a data e tipo de amostra;

- Todo o procedimento deve ser feito próximo à lamparina;

- Com uma alça previamente esterilizada, toque numa das colônias escolhidas com a ponta do alça e semeie em
placa de Agar nutriente seguindo os movimentos de estriamento, conforme se observa na figura abaixo;

- Após a primeira estria, flambe a alça e gire a placa cerca de 90˚ para puxar a nova estria. Repita esse passo
pelo menos mais 1 vez;

- Lembre-se de que a quantidade de material a ser inoculada deve ser mínima, caso contrário, pode haver a
justaposição das colônias impossibilitando seu isolamento;

- Após a semeadura, inverter as placas e incubá-las a 30-37°C, por 48 horas, ou à temperatura ambiente por até
7 dias.

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ESTRIAMENTO EM TUBOS DE ENSAIO

- Identifique um tubo de ensaio contendo meio de cultura estéril de acordo com o grupo, a data e o tipo de amostra;

- Todo o procedimento deve ser feito próximo à lamparina;

- Com uma alça previamente esterilizada, toque numa das colônias escolhidas da cultura com a ponta do alça e
semeie no tubo de Agar nutriente fazendo movimento de estria do fundo do tubo para sua superfície, de acordo
com o mostrado anteriormente;

- Após a semeadura, incubar os tubos a 30-37°C, por 48 horas, ou à temperatura ambiente por até 7 dias.

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 AULA PRÁTICA II
ANÁLISE DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS TOTAIS (BHTs) EM AMOSTRAS LÍQUIDAS
I. INTRODUÇÃO

A determinação quantitativa de Bactérias Heterotróficas Totais (BHTS) é um parâmetro cada vez mais utilizado
como indicador da qualidade higiênica e sanitária de águas e alimentos. Em geral, as BHTs são definidas como
microrganismos que requerem carbono orgânico como fonte de nutrientes.

Para amostras de água, as técnicas adotadas para quantificar as BHTs visam atender as especificações do
Standard Methods for the Examination of Wastewater, (APHA, 2015). Na contagem destes microrganismos, uma
técnica comum é o método “Pour-Plate” em meio PCA (Plate Count Agar). Consiste na aplicação de uma alíquota
de 1,0 mL da amostra com os microrganismos (ou de sua diluição) em uma Placa de Petri estéril sem o meio de
cultura. Em seguida adiciona-se o meio por cima da amostra e realiza-se movimentos circulares para a
homogeneização. Após o período de incubação, a análise do resultado se baseia nos seguintes princípios:

- Cada colônia originada é resultado do crescimento e multiplicação de 1 célula bacteriana.

- As placas devem conter de 30 a 300 colônias e para isso é necessário o plaqueamento de diluições seriadas
(mínimo 03 diluições)

Do ponto de vista microbiológico, a vigilância da qualidade da água é de grande importância por fornecer
informações sobre a eficácia de métodos de tratamento para a eliminação de determinados grupos de
microrganismos. A Portaria MS 2.914/2011 estabelece que deve ser feita a contagem de bactérias heterotróficas
em 20% das amostras mensais de água tratada, no sistema de distribuição, não devendo essa contagem exceder
500 UFC/mL.

II. OBJETIVO

O objetivo desta atividade prática e realizar a contagem de Bactérias Heterotróficas Totas (BHTs).

III. MATERIAS

- Água Fosfatada; Micropipeta volumétrica 1000 e 100 µL; Tubos de ensaios; Ponteiras de 1000 e 100 µL; Placas
de petri; Banho maria e Incubadora BOD.

IV. METODOLOGIA

1.1. Transferir 1000 µL de amostra com uma micropipeta estéril para um tubo contendo 9,0 mL de água de diluição
(diluição 10-1) (OBS: caso a amostra apresente alta concentração, realizar diluições seriadas 10-2;10-3; 10-4 e 10-
5, seguindo o mesmo procedimento);

1.2. Transferir, com uma micropipeta estéril, 100 µL de amostra diluída para a placa de petri esterilizada;
1.3. Adicionar o meio de cultivo à placa, na temperatura de 44-48°C (manter o meio em banho-maria);
1.4. Homogeneizar o conteúdo da placa em movimento em forma de “infinito”;
1.5. Após a solidificação do meio, incubar a placa na posição invertida a 35 ± 0,5°C, por 48h;
Água de diluição: (obs: aplicada quando a densidade de colônias de bactérias por placa for maior que
300 UFC): 1,25 mL de Solução de KH2PO4 (34 g/L); 5,0 mL de Solução de MgCl2.6H2O (81,1 g/L); -
H2ODESTILADA q.s.p. p/ 100 mL; Aferir pH para 7,2; Transferir 90 mL para frascos de diluição e autoclavar.
Meio de cultura de Bactérias Heterotróficas: 11,8 g de Meio Plate Cont. Agar; H2ODESTILADA q.s.p. p/
500 mL; Transferir para um erlenmayeres de 1000 mL e autoclavar.
1.6. Após período de incubação verificar a formação de unidades formadoras de colônias bacterianas (UFC);
1.7. Realizar a contagem de UFCs (obs: caso a contagem seja < 30 UFCs, realizar a contagem na diluição menor
ou > 300 UFCs, realizar a contagem na diluição maior);
1.8. Expressar o valor em UFC/100 mL da amostra.O

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 AULA PRÁTICA III
ISOLAMENTO DE FUNGOS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS

I.INTRODUÇÃO

Os fungos são microrganismos unicelulares (leveduras) ou multicelulares (filamentosos), formados por células
eucarióticas, podendo apresentar reprodução sexuada (forma teleomórfica), reprodução assexuada (forma
anamórfica), ou ambas. São aclorofilados, heterotróficos (quimiorganotróficos), portanto incapazes de realizar
fotossíntese ou sintetizar a matéria a partir de elementos simples. A nutrição dos fungos ocorre por absorção,
através da liberação de exoenzimas sobre o substrato, cujas moléculas são “quebradas” em formas mais simples,
ocorrendo a absorção por qualquer parte do sistema vegetativo ou por estruturas especiais. Os fungos necessitam
de C, N, P, K, Ca e Mg, além dos micronutrientes. De modo geral são aeróbios (filamentosos), entretanto alguns
estão envolvidos nos processos fermentativos (leveduras). A temperatura de crescimento varia entre 0 a 35 oC,
sendo a maioria mesófilos. O pH varia entre 3-8, mas normalmente toleram pH ácido. Sob o ponto de vista
morfológico, as formas filamentosas apresentam as células tubulares, denominadas de hifas, sendo o conjunto
de hifas denominadas de micélio. As hifas podem ser contínuas, simples ou ramificadas, sendo também não
septadas (cenocíticas) ou septadas (apocíticas) e constituem a estrutura somática ou vegetativa dos fungos. A
estrutura reprodutiva normalmente corresponde aos esporos, com morfologia extremamente variada, de acordo
com a espécie. Quando isolados em meio de cultura apropriado os fungos formam colônias cujo crescimento é
concêntrico (crescimento em diâmetro e indeterminado).

Os fungos exercem uma função crítica importante e contínua no ambiente: reciclam a matéria orgânica que muitas
vezes se constitui num poluente e/ou contendo nutrientes em formas não aproveitáveis pelos outros organismos.
O fungo atua na matéria viva (parasita, em humanos, animais ou plantas), na matéria morta (saprófitos) ou na
matéria viva inicialmente (biotróficos) e continua a decompor depois de morta (necrotrófico) ou ainda quando
parasita outros fungos (hiperparasita). Quando causa a morte do hospedeiro denomina-se de parasitóide. Fungos
podem ser parasitas obrigatórios (não cultivado in vitro) ou facultativos (sapróbios/ parasitas). Alguns fungos
podem formar associações com plantas (micorrizas) ou com algas (líquenes) ou são utilizados como alimentos
(cogumelos) ou em processos biotecnológicos e ou em biorremediação ambiental.

O isolamento de fungos em meio de cultura permite a obtenção de culturas pura, pré-requisito para sua
caracterização, identificação e utilização em inúmeras atividades científicas e tecnológicas, dependendo da
finalidade. Deve assim, nos seus aspectos mais simples e básicos, ser de conhecimento dos estudantes de
graduação em Engenharia Ambiental e, portanto, ao final da prática, os alunos devem ter adquirido habilidades
relacionadas ao procedimento de isolamento de fungos a partir de amostras ambientais em tecido vegetal
necrosado, pelos métodos de isolamento direto e indireto.

II.MATERIAIS

- Amostras ambientais (terriço e tecidos vegetais necrosados por fungos);

- Placas de Petri com o meio de cultura Sabouraud Dextrose Ágar + Antibióticos (SDA+A*);

*A = Sulfato de estreptomicina e Cloranfenicol (250 mg de cada/litro de meio de cultura);

- Solução de Hipoclorito de Sódio 1%;

- Canetas vitrográficas; filme plástico transparente;

- Pinças, estiletes metálicos de ponta fina, alças microbiológicas descartáveis.

14
III. METODOLOGIA

III.1. ISOLAMENTO DE FUNGOS A PARTIR DE TECIDOS VEGETAIS NECROSADOS

III.1.1. ISOLAMENTO DIRETO

01. Selecionar tecido vegetal que apresente esporulação fúngica sobre as lesões (necroses), visíveis a olho nu
ou sob microscópio estereoscópico;

02. Pegar uma placa de Petri contendo o meio de cultura SDA+A e com caneta vitrográfica marcar cinco pequenos
círculos equidistantes seu fundo;

03. Deslizar uma alça microbiológica descartável (esterilizada) sobre o local esporulado no tecido vegetal
necrosado e, em seguida, abrindo o mínimo possível a placa de Petri, transferir o conteúdo (esporos fúngicos)
para um dos círculos marcados. Repetir o procedimento para os demais círculos. Nesta etapa, todo o trabalho
deve ser conduzido próximo à chama da lamparina;

04. Proceder à identificação da placa preparada (amostra, responsável e data);

05. Aplicar uma fita de PVC, parafilme ou equivalente sobre toda a lateral da placa ou sobre toda a placa (para
evitar a desidratação rápida do meio);

06. Incubar em BOD a 28°C ou em condições ambientais de laboratório (bancada), em local reservado para tal,
durante 7 dias.

III.1.2. ISOLAMENTO INDIRETO

01. Lavar, com água de torneira, o tecido vegetal necrosado;

02. Cortar com bisturi, lâmina de barbear inoxidável ou tesoura, fragmentos vegetais correspondentes aos bordos
das lesões necróticas do vegetal;

03. Colocar os fragmentos dentro de placa com hipoclorito de sódio a 1%, por 2 minutos;

04. Transferir, utilizando uma pinça previamente flambada e resfriada, os fragmentos para uma placa de Petri
contendo água destilada esterilizada (remoção do excesso de hipoclorito);

05. Transferir cinco fragmentos da placa com água, para outra placa de Petri contendo o meio de cultura SDA+A,
distribuindo-os de forma pentagonal e distanciados de aproximadamente 2 cm dos bordos da placa. Esta etapa
deve ser trabalhada próximo à chama da lamparina;

06. Proceder à identificação da placa preparada (amostra, responsável e data);

07. Aplicar uma fita de PVC, parafilme ou equivalente sobre toda a lateral da placa ou sobre toda a placa (para
evitar a desidratação rápida do meio) incubando-a, em seguida, em BOD a 28°C ou em condições ambientais de
laboratório (bancada), em local reservado para tal, durante 7 dias.

15
 AULA PRÁTICA IV

MICROSCOPIA E COLORAÇÃO DE GRAM

I.INTRODUÇÃO

A morfologia individual e as reações colorimétricas constituem, em geral, os critérios preliminares para

identificação e posterior classificação das bactérias. O exame microscópico de um microrganismo é, em geral,
suplementado com o uso de corantes, que além de facilitar sua observação, permite a visualização de importantes
estruturas. Porém, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por
simples exposição ao ar ou secagem na chama.

Os corantes são sais compostos por radicais iônicos cromóforos. Podem ser básicos quando tem a cor do seu
íon positivo ou ácido, quando tem a cor do seu íon negativo. A célula bacteriana é negativamente carregada,
portanto, atrai corantes básicos. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta, azul de metileno e a
safranina.

Existem inúmeros métodos para coloração, porém o método de Gram é o método de coloração de bactérias mais
utilizado. Consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes:
cristal violeta, iodo, etanol-acetona e fucsina básica. Está técnica permite a separação de amostras bacterianas
em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das bactérias observadas.
A coloração de Gram é uma coloração diferencial, pois não cora todos os tipos de células igualmente. Aquelas
bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta com o iodo coram-se em violeta (Gram
positivas), enquanto as que não retêm o complexo coram-se em vermelho (Gram negativas) com a fucsina.

Ao final da prática, os alunos devem ter adquirido habilidades relacionadas à aplicação da coloração de Gram,
identificação e diferenciação de bactérias gram-positivas e gram-negativas.

II.MATERIAIS

- Cristal Violeta - Fucsina diluída 1:10 - Lâminas

- Lugol (iodo ou iodeto de potássio) - Cultura de bactérias - Microscópio

- Mistura álcool-acetona - Pipetas de Pasteur - Alças de

semeadura

III.METODOLOGIA

III.1.PREPARO DE ESFREGAÇO A PARTIR DE MEIO SÓLIDO

- Colocar 1 gota de água ou solução fisiológica sobre a lâmina limpa.

- Atentar para as precauções de assepsia. Tomar uma pequena porção da cultura com a alça estéril.

- Espalhar a cultura na gota suficientemente para obter um esfregaço fino.

- Secar a preparação ao ar ou na chama da lamparina.

- Deixar a lâmina esfriar completamente para poder corá-la.

16
III.2.COLORAÇÃO

- Cobrir o esfregaço seco e fixado com solução de cristal violeta;

- Após 1 minuto, lavar a lâmina com água destilada, em jato suave, deixando escorrer o cristal violeta;

- Cobrir a lâmina com solução de lugol e aguardar 1 minuto;

- Desprezar a solução de lugol e lavar a lâmina com água destilada corrente;

- Inclinar a lâmina e gotejar álcool-acetona 95% (agente descolorante) até que não haja desprendimento de
corante;

- Lavar a lâmina rapidamente em água corrente;

- Cobrir o esfregaço com a solução de fucsina e aguardar 30 segundos;

- Lavar a lâmina rapidamente com água, secar a temperatura ambiente;

- Examinar a preparação ao microscópio.

17
 AULA PRÁTICA V
IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS POR TESTES BIOQUÍMICOS

I.INTRODUÇÃO

Para identificar grupos ou espécies de bactérias ou leveduras, os microbiologistas investigam, por exemplo, as
atividades metabólicas destes microrganismos “in vitro”. Os Testes, ou Provas, Bioquímicas servem para auxiliar
a identificação do microrganismo através da verificação das transformações químicas, que ocorrem na célula,
pela ação de suas enzimas. Comomuitas vezes, um microrganismo possui um sistema enzimático específico,
promovendo transformação bioquímica específica, os testes bioquímicos podem ser utilizados na prática para a
sua caracterização.

Para a realização dos testes bioquímicos é necessário utilizar meios de cultivo especiais contendo o substrato a
ser analisado e fornecer ao microrganismo as condições nutritivas e ambientais necessárias ao seu
desenvolvimento. Sendo assim, após a prática, os alunos devem ter desenvolvido habilidades relacionadas à
identificação de microrganismos por diferentes testes bioquímicos, além de ter adquirido conhecimento sobre
alguns meios de cultivos especiais utilizados nestes testes.

II.MATERIAIS
- Alça de semeadura flambável - Tubos com meio para produção de H2S

- Lamparina -Tira de papel com acetato de chumbo 10%

- Cultura da bactéria a ser identificada - Tubos com meio para redução do nitrato

- Lâminas de vidro -Reagentes A e B de Griess-slova

- Água oxigenada - Meio para formação de Indol
- Tubos com meio gelatina - Reagente de kovacs
- Meio para Voges-Proskauer (VP) - Meio para Vermelho de Metila (VM)

- Soluções A e B para VP - Indicador vermelho de metila

III.METODOLOGIA

- Realizar os testes bioquímicos, de acordo com a tabela abaixo;

Testes bioquímicas Reagente Procedimento

Transferir algumas colônias da

cultura para uma lâmina de vidro e
Catalase Água oxigenada
pingar até 3 gotas da água
oxigenada sobre a colônia;

Transferir uma colônia da cultura

Hidrolise da gelatina Gelatina para o meio mergulhando a alça
até o fundo do tubo;

18
 Tranferir uma colônia para o meio
mergulhando a alça neste;
Produção de H2S Tira de papel com acetato de chumbo 10% Posicionar a tira de papel na
beirada do tubo, entre o algodão e
o vidro;

Transferir uma colônia para o meio

Redução do nitrato Reagentes de Griess-Slova
mergulhando a alça neste;

Transferir uma colônia para o meio

Indol (triptofanase) Kovacs
mergulhando a alça neste;

Transferir uma colônia para o meio

Vermelho metila (VM) Vermelho de metila em álcool etílico
mergulhando a alça neste;

Transferir uma colônia para o meio

Voges-Proskauer (VP) Alfa naftol 5% em álcool absoluto
mergulhando a alça neste;

Transferir uma colônia para o meio

Citrato Citrato pela técnica de estriamento em
tubo;

- Inocular as bactérias nos diferentes meios de cultura e incubar por 24 horas. Observar o crescimento das
bactérias e discutir os resultados utilizando a tabela de identificação em anexo.

19
 AULA PRÁTICA VI
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS – TSA (Antibiograma)

I.INTRODUÇÃO

O teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) ou antibiograma determina o perfil de sensibilidade do

microrganismo a uma determinada droga. Normalmente indicados para organismos patogênicos, o TSA é
utilizado para selecionar a droga mais eficiente no tratamento, uma vez que o sucesso na terapêutica
antimicrobiana de uma infecção bacteriana depende da sensibilidade do agente à droga utilizada.

A seleção dos antimicrobianos para a realização dos antibiogramas de rotina deve seguir alguns princípios. Um
deles baseia-se no reconhecimento de que alguns agentes antimicrobianos podem ser agrupados em classes,
devido ao seu espectro de atividade. Assim, um só representante de classe necessita ser testado, a não ser
quando dentro de uma mesma classe de antimicrobianos não exista a possibilidade de equivalência.

Uma bactéria é considerada sensível a um antimicrobiano quando o seu crescimento é inibido, in vitro, por uma
determinada concentração. Esta concentração inibitória do antimicrobiano pode ser determinada direta ou
indiretamente. A determinação direta é feita pelos chamados métodos da diluição, e, a indireta, pelo método de
difusão em placa com discos impregnados com as drogas.

No método de diluição, meios com concentrações variadas do antibiótico, obtidas por diluição, são inoculados
com o microrganismo. A menor concentração que evita o crescimento após a incubação de 12 a 24 horas é a
concentração inibitória mínima. No método de difusão, discos de papel impregnados com o antibiótico são
colocados uniformemente na superfície do meio sólido semeado com o microrganismo. Após a aplicação forma-
se um gradiente de concentração pela difusão do antibiótico a partir do disco, com consequente inibição do
crescimento do microrganismo sensível ao antibiótico. Devido à sua simplicidade e por poderem ser realizados
rapidamente, os métodos de difusão com disco têm preferência sobre os de diluição para os testes de rotina.

A prática pretende desenvolver nos alunos a habilidade em avaliar o perfil de susceptibilidade de microrganismos
Gram-positivos e Gram-negativos às drogas antimicrobianas. A presença ou ausência de crescimento da amostra
bacteriana em torno dos discos é interpretada como resistência ou sensibilidade do microrganismo ao
antimicrobiano. Os halos são medidos e comparados com valores padronizados pelo CLSI – Chemical Laboratory
and Standards Institute.

II.MATERIAIS

- Swab estéril - Pinça de aço

- Discos impregnados com antimicrobianos - Tubos com suspensão de bactérias em salina

- Placas contendo ágar Muller Hinton estéreis

III.METODOLOGIA

III.1. PREPARO DO INÓCULO (MÉTODO DA SUSPENSÃO DIRETA)

- Em um tubo de ensaio contendo 3 mL da solução salina esterilizada, foram suspensas 3 colônias de mesma
morfologia, retiradas da cultura de bactérias, com alça estéril;

20
- A turbidez da suspensão foi ajustada gotejando-se salina até o ponto 0,5 da escala de MacFarland.

III.3.INOCULAÇÃO NAS PLACAS

- Identificar as placas de petri, contendo meio sólido, com a data e o nome ou iniciais dos alunos;

- Proceder a semeadura introduzindo um swab estéril na suspensão bacteriana e eliminar o excesso de líquido
por compressão na parede do tubo, em até 15 min após o preparo do inóculo. Espalhar o inóculo uniformemente
(três direções diferentes), de modo a cobrir toda a superfície do ágar;

- Aguardar de 5 a 15 minutos, à temperatura ambiente, para que o inóculo seja completamente absorvido pelo
ágar antes de aplicar os discos.

III.4.APLICAÇÃO DOS DISCOS

- Com uma pinça flambada e resfriada, retirar um disco de antimicrobiano do frasco, abrir a placa próximo à
lamparina, colocar o disco e comprimi-lo gentilmente contra o ágar para que fique aderido à superfície;

- Tomar nota dos antibióticos também pelo código impresso na superfície dos discos.

III.5.INCUBAÇÃO DAS PLACAS

- Aguardar por até 15 minutos após aplicação dos discos e incubar as placas invertidas por 16 a 18 horas a 35ºC.

III.6.LEITURA E INTERPRETAÇÃO DAS PLACAS

- Após o tempo de incubação, verificar a presença de halos ao redor dos discos de antimicrobianos. Medir o
diâmetro dos halos de inibição do crescimento bacteriano e anotar os resultados. Comparar os resultados obtidos
com a tabela de sensibilidade.

21
 AULA PRÁTICA VII
DESINFECÇÃO MICROBIANA COM AGENTES FÍSICOS E QUÍMICOS

PARTE 01 – DESINFECÇÃO COM AGENTES FÍSICOS

I.INTRODUÇÃO

A condição sanitária da população humana é determinada, em larga escala, por sua capacidade de controlar
populações microbianas de forma eficiente. Toda as formas de prevenção de transmissão de doenças,
contaminação por microrganismos nocivos ou deterioração e danos de materiais por microrganismos estão
diretamente associados aos processos específicos ou gerais de práticas sanitárias de assepsia.

Os microrganismos podem ser removidos, inibidos ou mortos por agentes físicos ou químicos. Uma grande
variedade de técnicas e de agentes pode ser utilizada, agindo de modos diferentes e tendo seu próprio limite de
aplicação prática. As técnicas de esterilização, por exemplo, promovem a eliminação ou destruição completa das
formas de vida de todos os microrganismos presentes em determinado material ou ambiente. Mesmo aqueles
que apresentam formas de resistência denominadas esporos, podem ser totalmente destruídos tornando os
materiais ou ambientes estéreis. Porém na maioria das atividades, o que se exige é a aplicação de práticas
sanitárias de desinfecção. Os diferentes processos de desinfecção não têm o objetivo de tornar os ambientes ou
os materiais estéreis, mas sim, eliminar a sua potencialidade infecciosa.

Os processos de desinfecção que utilizam agentes físicos são os mais comuns, devido ao baixo custo e não
formação de produtos tóxicos. O calor e a radiação ultravioleta são os principais exemplos. O calor, em geral,
acima da temperatura ideal de crescimento, promove a desnaturação de proteínas estruturais e enzimas, levando
à perda da integridade celular e, consequentemente, à morte. Já a radiação ultravioleta é capaz de provocar os
mesmos efeitos finais, porém sua ação se dá em nível do material genético celular, provocando a destruição das
moléculas de DNA.

Ao final da prática, espera-se que os alunos tenham adquirido habilidades relacionadas à aplicação de métodos
de esterilização e desinfecção física e avaliação do crescimento microbiano sobre a ação do calor e da luz
ultravioleta.

II.MATERIAIS

- Tubos esterilizados - Banho-maria - Ponteiras esterilizadas

- Pipetas esterilizadas - Placas com ágar - Pipetador automático

- Tubos contendo meio A1 + E. coli - Alça de Drigalski

III.METODOLOGIA

III.1.TESTE DE AÇÃO DA TEMPERATURA SOBRE BACTÉRIAS

- Identificar 2 tubos esterilizados e 3 placas contendo meio A1+ágar com o nome do grupo, data e condição de
teste;

- Adicionar 2,0 mL de cultura de bactérias (Escherichia coli) a cada tubo e submetê-los aos seguintes tratamentos:

22
TUBO 1: colocar durante 10 minutos em banho maria a 600C, retirar uma alíquota de 0,1mL, aplicar na superfície
de uma placa contendo meio A1 + Agar, espalhar a suspensão bacteriana por toda a superfície da placa com
uma alça de Drigalski e incubar a placa invertida por 24 h a 370C;

TUBO 2: colocar durante 10 minutos em banho maria a 1000C, retirar uma alíquota de 0,1mL, aplicar na superfície
de uma placa contendo meio A1 + Agar, espalhar a suspensão bacteriana por toda a superfície da placa com
uma alça de Drigalski e incubar a placa por 24 h a 370C;

TUBO 3 (CONTROLE POSITIVO): Retirar uma alíquota de 0,1mL da cultura inicial, aplicar na superfície de uma
placa contendo meio A1 + Agar e espalhar por toda a superfície da placa com uma alça de Drigalski. Incubar a
placa por 24 h a 370C.

III.2.TESTE DE AÇÃO DA LUZ UV SOBRE BACTÉRIAS

- Identificar 3 placas contendo meio A1+ágar com o nome do grupo, data e condições de teste;

- Retirar alíquotas de 0,1mL de tubos de cultura de bactérias (Escherichia coli), aplicar na superfície das placas
e espalhar com uma alça de vidro.

- Expor as placas sob a luz UV da seguinte forma:

- Colocar as três placas dentro do fluxo laminar, ascender a lâmpada UV.

- Retirar uma placa após 5, 15 e 30 minutos de exposição.

- Incubar todas as placas por 24 horas a 37°C.

PARTE 02 – DESINFECÇÃO COM AGENTES QUÍMICOS

I.INTRODUÇÃO

Os agentes químicos são utilizados para controlar o crescimento de microrganismos tanto em tecidos vivos com
em objetos inanimados. Em caso de materiais sensíveis ao calor, como, por exemplo, bolsas de sangue para
transfusão, seringas plásticas descartáveis, entre outros, alguns agentes químicos especiais são utilizados e
denominados de esterilizantes químicos. Porém a maioria dos agentes químicos somente reduz a população
bacteriana, sendo mais utilizados em processos sanitários de desinfecção e anti-sepsia.

Os principais grupos de agentes químicos desinfetantes e anti-sépticos aplicados no controle de microrganismos

são os álcoois, halogênios (iodo e cloro) e detergentes. Os álcoois (etílicos, isopropílicos, combinados com iodo)
são utilizados, em geral, na concentração de 70% por 10 minutos, para a anti-sepsia da pele e desinfecção de
superfícies. Quando combinados com o iodo (0,5 a 20%), os álcoois têm seu poder de penetração na parede
celular elevado, potencializando as suas ações anti-sépticas. Os halogênios são representados principalmente
pelos compostos clorados (ex: hipocloritos 0,5 a 20 g/L de cloro livre) e agem a nível celular, desnaturando
proteínas e enzimas e inativando os ácidos nucléicos. São utilizados na desinfecção de água, superfícies em
geral, equipamentos de laticínios, restaurantes e domésticos. Já os detergentes com suas ações tensoativas,
umectante e emulsionante, causam transformações em proteínas e lipídeos, desestabilizando a membrana e
desnaturando as proteínas microbianas.

23
Ao final da prática, espera-se que os alunos tenham adquirido habilidades relacionadas à aplicação de métodos
de esterilização e desinfecção química e avaliação do crescimento microbiano sob a ação de soluções de álcool
70%, hipoclorito de sódio e detergente.

II.MATERIAIS

- Tubos esterilizados - Ponteiras esterilizadas - Alça de Drigalski - Álcool 70%

- Pipetas esterilizadas - Pipetador automático - Detergente - Álcool 92%

- Placas com ágar + meio - Tubos contendo A1 + - Hipoclorito - Hipoclorito 1:100

A1 Escherichia coli

III.METODOLOGIA

- Teste da eficácia antisséptica dos agentes químicos sobre as bactérias.

III.1.ÁLCOOL 70% e 92%

- Identificar uma placa contendo meio A1 + ágar com o nome do grupo, data e condições de teste;

- Adicionar 5,0 mL de álcool na concentração escolhida em um tubo de ensaio e adicionar 0,5 mL da cultura;

- Após 10 minutos, retirar 0,1 mL do tubo, adicionar à placa contendo meio A1+Agar, espalhar as células com
uma alça de Drigalski e incubar as placas a 37o C por 24h;

III.2.HIPLOCLORITO DE SÓDIO (ÁGUA SANITÁRIA) CONCENTRADA E DILUÍDA 1:100

- Identificar 2 placas contendo meio A1 + ágar com o nome do grupo, data e condições de teste;

- Adicionar 5,0 mL da concentração escolhidade hipoclorito em um tubos de ensaio esterilizado e adicionar uma
alíquota de 0,5 mL da cultura. Após 2 minutos, retirar 0,1 mL do tubo e adicionar à placa contendo meio A1+Agar.
Espalhar as células com uma alça de Drigalski e incubar as placas a 37o C por 24h;

- Repetir todo o procedimento após 10 minutos.

III.3. DETERGENTE

- Adicionar 5,0 mL de detergente em um tubo de ensaio, adicionar uma alíquota de 0,5 mL da cultura. Após 2
minutos, retirar 0,1 mL de cada tubo, adicionar em uma placa contendo meio A1+Agar. Espalhar a suspensão
bacteriana com uma alça de vidro e incubar as placas a 37o C por 24h;

- Repetir todo o procedimento após 15 minutos.

24
 AULA PRÁTICA VIII
DETECÇÃO DE INDICADORES DE POLUIÇÃO FECAL EM ÁGUAS (MÉTODO
CROMOFLUOROGÊNICO)

I.INTRODUÇÃO

A água, por possuir múltiplos usos, como abastecimento público, recreação, produção de energia, paisagismo e
etc, é de fundamental importância para a vida. A água merece uma atenção especial, pois pode conter diferentes
contaminantes químicos e ainda veicular diversos microorganismos, como vírus, bactérias, fungos e protozoários.
A detecção e quantificação de contaminantes e microrganismos em águas é uma das formas de se avaliar a sua
qualidade, permitindo a sua caracterização como apropriada ou não para os diferentes usos.

Podemos quantificar os microrganismos, em especial bactérias, de forma direta ou indireta. A forma direta de
quantificação é a contagem em placa, e a indireta mais utilizada é a técnica do NMP (Número Mais Provável). A
contagem de colônias em placas é uma técnica quantitativa direta aonde cada colônia crescida numa placa de
Agar corresponde a uma unidade formadora de colônia (UFC) proveniente do material. A técnica do número mais
provável é um método indireto de contagem em meio líquido, onde a partir de uma evidência da presença de uma
bactéria ou grupo de bactérias é possível se estimar o número mais provável desta no material analisado. Dentre
os muitos microrganismos que podem ser quantificados incluem-se: contagem total de bactérias, coliformes,
StaphylococcusBacillus, etc.

Como seria muito caro e trabalhoso avaliar diretamente todos os patógenos nas amostras de águas, uma
alternativa para a avaliação da qualidade sanitária da água é a pesquisa de bioindicadores, ou seja, organismos
não patogênicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de sangue quente, que quando
encontrados indicam a ocorrência de contaminação fecal, evidenciando o risco da presença de patógenos. Fezes
humanas contêm de 20-30% de resíduos alimentares não digeridos, sendo o restante constituído de água e
bactérias. No indivíduo saudável essas bactérias constituem os habitantes normais do intestino, onde a
Escherichia coli é a representante característica. Assim, a presença de Escherichia coli em água caracteriza a
contaminação fecal e é indicativa da presença de patógenos entéricos.

Ao final da prática, os alunos devem ser capazes de realizar o método cromofluorogênico, identificar e quantificar
os indicadores de poluição fecal (E.colie Coliformes totais) presentes em amostras de águas.

II.MATERIAIS

- Frascos para coleta de - Meio de cultura para coliformes - Incubadora

amostras (higienizados)
- Frascos para diluição do meio - Água destilada estéril - Lâmpada UV
de cultura
- Máquina seladora de cartelas - Pipetas estéreis - Cartelas para colimetria

25
III.METODOLOGIA

- Coletar amostras (água, esgoto, etc.) utilizando frascos estéreis;

- Com o auxílio de uma pipeta graduada, diluir serialmente as amostras coletadas para frascos de diluição
previamente preparados (10-1, 10-2, 10-3, etc.);

- Para amostras de esgotos pré tratados, diluir até 10-4. No caso de esgotos brutos (EB) fazer a diluição até 10-6.
Para água mineral e água de torneira, diluir só até 10-1;

- Adicionar 2,35 g do meio de cultivo MUG às três últimas diluições da série e agitar até a solubilização total do
meio;

- Identificar no verso de cada cartela a amostra, a diluição, a data e o nome da dupla. Em seguida, verter o
conteúdo de cada frasco para a cartela correspondente;

- Selar a cartela na seladora e incubar a 37 ºC, por 16-20 horas;

- Avaliar a coloração de cada poço nas cartelas. A cor amarela indica a presença de coliformes totais. Cartelas
com poços amarelos devem ser expostos à radiação UV (lâmpada UV portátil) para observar os poços com
fluorescência indicando a presença de E.coli;

- Anotar o número de poços grandes e pequenos positivos para coliformes totais e E.coli;

- Utilizar a tabela, em anexo, para leitura do Número Mais Provável (NMP) referente aos poços grandes x
pequenos. Este número deve ser multiplicado pelo fator de diluição utilizado;

- LEITURA FINAL: número de microrganismos (CT ou E.coli)/100 mL de amostra. Comentar este resultado frente
à legislação pertinente.

26
27
 AULA PRÁTICA IX

CIANOBACTÉRIAS – CONTAGEM E DETECÇÃO DE CIANOTOXINAS

I.INTRODUÇÃO
As cianobactérias são microorganismos procariotos, aeróbios e fotoautotróficos. Estes microorganismos são
altamente diversos e possuem grande capacidade de adaptação. Podemos encontrá-los em ambientes de água
doce, marinho, solos úmidos, estuários e em ambientes extremos tais como geleiras e desertos ou em simbiose
com fungos. As cianobactérias são gram-negativas, podendo ser encontrados nas formas unicelulares, coloniais
ou filamentosas (Figura 1).

(a) unicelular em processo de

divisão;
(b)colonial;
(c) filamentosa com
bainhamucilaginosa;
(d) filamentosa com formação
de heterocito.
A diversidade de habitats das cianobactérias pode ser explicada pela tolerância às altas temperaturas, a alta
radiação solar (UVB e UVC), a resistência à dessecação e por apresentar adaptações como, por exemplo, células
diferenciadas denominadas de heterocitos (capazes de fixar o nitrogênio), acinetos (células de resistência às
condições adversas do ambiente) e a camada de mucilagem no entorno da célula (auxilia na flutuabilidade e na
retenção de CO2, quando este se encontra em baixa concentração no ambiente).
A maioria das espécies de cianobactéria apresenta melhor crescimento em águas neutro alcalinas (pH 6-9), em
temperatura de 15 a 30°C e alta concentração de nutrientes, principalmente nitrogênio e fósforo.
florações de cianobactérias – Por que isso acontece?
A crescente eutrofização dos ambientes aquáticos tem sido produzida por atividades humanas, causando um
enriquecimento artificial desses ecossistemas. As principais fontes de contaminação são as descargas de esgotos
domésticos e industriais dos centros urbanos e das regiões agriculturáveis.
O enriquecimento de nutrientes na água causado pela eutrofização artificial leva a formação de florações de
microalgas e cianobactérias. A floração caracteriza-se pelo intenso crescimento desses microorganismos na
superfície da água, formando uma densa camada de células com vários centímetros de profundidade. Este
fenômeno produz mudanças na qualidade da água incluindo a redução de oxigênio dissolvido, aumento do custo
de tratamento, morte extensiva de peixes e aumento da incidência de florações de microalgas e cianobactérias.
As florações de cianobactérias vêm recebendo maior atenção devido à capacidade destes organismos a
produziram toxinas. Estas toxinas são denominadas cianotoxinas e estão divididas em três grupos, hepatotoxina,
neurotoxina e dermatotoxina, de acordo com os efeitos que provocam em mamíferos.

II. MATERIAIS
- Lâmina de vidro - Solução de Lugol - Pipetador automático
- Lamínula de vidro - Câmara de Neubauer - Microscópio óptico de bancada
- Amostra ambiental contendo cianobactérias

28
III. METODOLOGIA
Procedimentos para observação de cianobactérias:
III.1 – VISUALIZAÇÃO
1. Pingar duas gotas da amostra sobre lâmina de vidro e cobrir com lamínula;
2. Levar ao microscópio e utilizando a objetiva de 4X, focar;
3. Troque as objetivas para os maiores aumentos e procure as colônias de cianobactérias;
4. Fotografe ou esquematize-os para que sejam identificados;
5. Volte para a objetiva de 4X e retire a lâmina do microscópio;
6. Pingue umas 5 gotas de lugol na amostra;
7. Repita o procedimento de observação.
8. Ilustre as espécies observadas.

III.2 – CONTAGEM
1. Prepare a câmara de Neubauer: umedeça os lados esmerilados com água e coloque a lamela (Fig.6).
2. Toque com a pipeta que contêm a suspensão de células num dos lados da câmara, junto à lamela. Deixe sair
a quantidade estritamente necessária para preencher por difusão o espaço de contagem, mas não deixe sair
solução em excesso para não inutilizar a contagem.
3. Coloque a câmara no microscópio e deixe-a repousar a câmara no mínimo durante 3 minutos.
4. Conte as células usando o microscópio invertido.
5. Calcule a concentração de células na suspensão fornecida (número de células contadas por unidade de
volume, cél/ml).
N° de células/mL = (número total de células ÷ número de subquadrículas contadas) x 10.000

29
 AULA PRÁTICA XI

ANÁLISE DE BIOAEROSOL EM AMBIENTES INTERIORES.

INTRODUÇÃO

As condições físico-químicas da atmosfera (Temperatura, Pressão, Concentração de Oxigênio Livre, Quantidade

de água e Radiação Ultravioleta) não favorecem a sobrevivência dos microrganismos. Porém, apesar de não
crescerem no ar, os esporos dos microrganismos são facilmente carreados em partículas de poeira e gotículas
de água presentes no ar. Sendo assim, a microbiota atmosférica é transitória e variável. O número e os tipos de
agentes microbianos presentes no ar são diretamente determinados pelas várias fontes de contaminação
existentes no ambiente.

Além dos microrganismos presentes no ar externo (atmosfera), oriundos da dispersão de aerossóis microbianos,
a partir da superfície da terrestre e de instalações agrícolas e industriais (ex: irrigação de lavouras com água
contaminada, filtros gotejadores de ETEs, Lagoas de matadouros, Incineradores mal operados e etc), existem os
microrganismos presentes no ar interno. Ambientes fechados, climatizados ou não, devido a fatores como taxas
de ventilação, número de pessoas ocupando o ambiente, natureza e grau das atividades exercidas podem
apresentar um aumento no nível de contaminação do ar. Os microrganismos expelidos em gotículas do nariz e
da boca durante o espirro, tosse ou até mesmo no ato de falar podem sobreviver por tempo relativamente longo
na poeira veiculada pelo ar, potencializando os riscos de infecção por bacilos da tuberculose, difteria e
estreptococos hemolíticos, particularmente em áreas hospitalares.

Atos domésticos diários, como arrumar as camas ou varrer o piso, podem suspender partículas de poeira e
esporos microbianos responsáveis por problemas respiratórios como: alergias, asma e diferentes doenças
infecciosas do trato respiratório. Além de esporos de fungos, agentes de doenças de plantas e saprofíticos,
responsáveis pela degradação acelerada de tecidos lesados.

A maior preocupação está relacionada com o grande número de infecções humanas veiculadas pelo ar, devido a
penetração do agente etiológico pelo trato respiratório do hospedeiro. Trata-se de infecções com alto potencial
de ser tornarem epidemias, aparecendo explosivamente e atingindo um grande número de indivíduos em curto
espaço de tempo. Agentes etiológicos como Vírus, Bactérias e Fungos causam importantes doenças transmitidas
de pessoa a pessoa pela inalação de partículas áreas contaminadas (ex: Vírus: Catapora, Gripe, Sarampo,
Caxumba, Varíola, Rubéola, Bactérias: Coqueluche, Meningite, Pneumonia, Difteria, Tuberculose, Lepra,
Fungos: Psitacose, Doença do Legionário, Alveolite alérgica Aguda, Aspergilose, Coccidioidomicose,
Histoplasmose).

Uma variedade de técnicas tem sido desenvolvida com o objetivo de se determinar o conteúdo microbiano,
sobretudo de ambientes hospitalares, Escolas, ETEs e estações de compostagem. Há três métodos principais
para a coleta de partículas nos ensaios de avaliação da microbiota do ar: impactação, filtragem e sedimentação.
Os métodos de impactação e filtragem são considerados técnicas de amostragem ativa e exigem coleta de volume
de ar conhecido. Já o método de sedimentação é a coleta passiva de contaminação viável no ar por deposição
em uma placa de Petri aberta. Em todas as técnicas, os microrganismos são colhidos diretamente na superfície
sólida de um meio à base de ágar nutriente, para avaliar bactérias, ágar sabouraud, para fungos ou de membranas
filtrantes.

Em termos de Legislação Brasileira, pode-se destacar a Portaria MS N° 3.523/98 e a Resolução da ANVISA N°

09/2003. A Portaria MS estabelece uma série de procedimentos técnicos necessários para a avaliação da

30
qualidade do ar interior, com destaque para necessidade de se implementar e manter disponível o PMOC – Plano
de Manutenção, Operação e Controle adotado para o sistema de condicionamento de ar, contendo informações
de segurança baseadas na NBR 13.971/97 – Sistemas de Refrigeração, Condicionamento de Ar e Ventilação –
Manutenção programada e NBR 14.679/2001 - Sistemas de Condicionamento de ar e Ventilação – Execução de
Serviços de Higienização. A Resolução da ANVISA estabelece padrões referenciais de qualidade do ar interior,
em ambientes climatizados artificialmente de uso público e coletivo. Segundo esta resolução, ao realizar uma
amostragem ativa, o ambiente será considerado seguro se apresentar valores menores que o Valor Máximo
Recomendado – VMR, o qual deve ser ≤ 750 UFC/m 3 de fungos, para a relação I/E ≤ 1,5, onde “I” é a quantidade
de fungos no ambiente interno e “E” é a quantidade de fungos no ambiente externo. Quando o VMR for
ultrapassado ou a relação I/E for > 1,5 é necessário realizar um diagnóstico de fontes poluente para uma
intervenção corretiva.

OBJETIVO

Realizar pesquisa, monitoramento e controle ambiental da possível colonização, multiplicação e disseminação de

fungos em ar ambiental interior.

MATERIAS

Amostrador de Impacto tipo Andersen, Placas de Petri contendo meios água nutriente e Sabouraud e Incubadora
tipo BOD.

PROCEDIMENTO

Amostragem Externa:

1.1. Selecionar 01 amostra de ar exterior localizada fora da estrutura predial na altura de 1,5 m do nível da rua;

1.2. Realizar a montagem do Amostrador do tipo Andersen, determinado os seguintes parâmetros:

- Altura do solo: 1,5 m

- Taxa de vazão: 28,3 L/min (ou entre 25 e 35 L/min)

1.3. Posicionar uma placa de petri contendo meio de cultivo Agar Sabouraud Dextrose 4% estéril no
compartimento do Amostrador de Impacto do tipo Andersen;

1.4. Ligar a bomba do Amostrador de Impacto e manter pelo tempo de amostragem entre 5 e 15 minutos (obs: o
tempo deve ser definido de acordo com as especificações do Amostrador, para a coleta de um volume mínimo
de 140 L ou máximo de 500 L).

1.5. Após o período de amostragem a placa deve ser devidamente selada e identificada.

1.6. Em seguida, a placa deverá ser incubada a 25°C, por 07 dias, para permitir o total crescimento de fungos.

Amostragem Interna:

1.1. Definir o número de amostras de ar interior, tomando por base a área construída climatizada dentro de uma
mesma edificação e razão social, segundo tabela abaixo:

ÁREA CONSTRUÍDA (m2) NÚMERO MÍNIMO DE AMOSTRAS

Até 1.000 1
1.000 a 2.000 3
2.000 a 3.000 5
3.000 a 5.000 8
5.000 a 10.000 12

31
 10.000 a 15.000 15
15.000 a 20.000 18
20.000 a 30.000 21
Acima de 30.000 25
Obs: as unidades funcionais dos estabelecimentos com características epidemiológicas diferenciadas, tais como
serviço médico, restaurantes, creches e outros, deverão ser amostrados isoladamente.

1.2. Realizar a montagem do Amostrador do tipo Andersen, determinado os seguintes parâmetros:

- Altura do solo: 1,5 m

- Taxa de vazão: 28,3 L/min (ou entre 25 e 35 L/min)

Obs: os pontos amostrais deverão ser distribuídos uniformemente e coletados com o amostrador localizado no
centro do ambiente ou em zona ocupada.

1.3. Posicionar uma placa de petri contendo meio de cultivo Agar Sabouraud Dextrose 4% estéril no
compartimento do Amostrador de Impacto do tipo Andersen;

1.4. Ligar a bomba do Amostrador de Impacto e manter pelo tempo de amostragem entre 5 e 15 minutos (obs: o
tempo deve ser definido de acordo com as especificações do Amostrador, para a coleta de um volume mínimo
de 140 L ou máximo de 500 L).

1.5. Após o período de amostragem a placa deve ser devidamente selada e identificada.

1.6. Em seguida, a placa deverá ser incubada a 25°C, por 07 dias, para permitir o total crescimento de fungos.

32
 AULA PRÁTICA XIII

ANÁLISE DE BIOAEROSOL EM AMBIENTES INTERIORES.

INTRODUÇÃO

A Biomassa é toda matéria orgânica, morta ou viva, existente nos organismos vivos de uma determinada
comunidade ou ecossistema. Trata-se de toda a matéria derivada da atividade celular, capaz de sofrer
decomposição natural, portanto, biodegradável. Resíduos agrícolas, pecuários, florestais, urbanos, industriais, de
Estações de Tratamento de Esgoto (lodo) são grandes fontes de biomassa, as quais são convencionalmente
destinadas como fertilizantes dos solos para a agricultura e para a produção de energia primária.

A biomassa pode ser avaliada quanto a sua biodegradabilidade, ecotoxicidade e potencial energético por meio
dos testes metabólicos. Os testes respirométricos aeróbios avaliam os substratos orgânicos, principalmente,
àqueles considerados poluentes, quanto à sua biodegradabilidade e toxicidade. Já visando o potencial energético,
os testes respirométricos anaeróbicos, avaliam a capacidade máxima de conversão dos substratos orgânicos em
biogás.

OBJETIVO

O objetivo desta atividade prática e avaliar o potencial de produção de biometano de diferentes biomassas por
meio da Atividade Metanogênica Específica (AME).

PRINCÍPIO DO MÉTODO

O método consiste na montagem de reatores anaeróbicos, utilizando inóculo anaeróbico, biomassa e solução
nutriente. Os reatores são conectados ao instrumento analítico automático (AMPTS) para a realização da medida
do potencial de produção de biometano, a partir do substrato orgânico, em tempo real.

MATERIAS

Sistema de Avaliação Automática de Potencial de Biometanto (AMPTS); Frasco de borossilicato de 500 Ml;
Proveta de 100 mL e Pipeta automática

PROCEDIMENTO

1. PREPARO DO INÓCULO ANAERÓBICO

1.1. Calcular o volume de lodo necessário para o inóculo anaeróbico, utilizando o valor de sólidos suspenso volátil
(SSV).

1600 VLODO = volume de lodo (mL)

VLODO = SSVLODO = sólido suspenso volátil do lodo

SSVLODO
(g/L)

1.2. Adicionar o volume de lodo (CFINAL = 4 g de SSV de lodo/L), no frasco de borossilicato de 500 mL.

2. PREPARO DA BIOMASSA

2.1. Calcular o volume de Biomassa a ser adicionada no reator, utilizando o valor de sólidos suspenso volátil
(SSV).

33
 2400 VBIOMASSA = volume de Biomassa (mL)

VBIOMASSA = SSVBIOMASSA = sólido suspenso volátil da

SSVBIOMASSA
Biomassa (g/L)

2.2. Adicionar o volume de Biomassa (CFINAL = 6 g de SSV de lodo/L), no frasco de borossilicato de 500 mL.

3. SOLUÇÃO NUTRIENTE

3.1. Adicionar as soluções nutrientes no frasco de borossilicato de 500 mL, de acordo com a tabela abaixo:

REAGENTE VOLUME (mL) CONCENTRAÇÃO FINAL

Cloreto de Amônio - NH4Cl 10 g/L 20 0,5 g/L
Bicarbonato de Sódio - NaHCO3 10 g/L 40 1,0 g/L
Solução Macronutriente
- KH2PO4 13 g/L 0,65 g/L
- K2HPO4 3 g/L 0,15 g/L
20
- MgCl2 2 g/L 0,10 g/L
- CaCl2.2H2O 2 g/L 0,10 g/L
- Na2S.7H2O 1 g/L 0,05 g/L
Solução Micronutriente
- FeCl3.6H2O 400 mg/L 2 mg/L
- ZnCl2 10 mg/L 0,05 mg/L
- CuCl2.2H2O 6 mg/L 0,03 mg/L
- MnCl2.4H2O 100 mg/L 0,5 mg/L
2
- (NH4)6Mo7O24.4H2O 10 mg/L 0,05 mg/L
- AlCl3.6H2O 10 mg/L 0,05 mg/L
- CoCl2.6H2O 400 mg/L 2 mg/L
- NiCl2.6H2O 10 mg/L 0,05 mg/L
- H3BO3 2 mg/L 0,01 mg/L
HCl 1:10. 8 1 mL/L

3.2. Completar o volume do reator com H2O destilada até o volume final de 400 mL.

3.3. Discutir os dados obtidos

34
 AULA PRÁTICA XV

ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS COM BACTÉRIAS Vibrio Fischeri

I.INTRODUÇÃO

O monitoramento da poluição especialmente em ambientes aquáticos pode ser realizado pelos parâmetros
tradicionais, Turbidez, DBO, DQO, Nitrogênio, Fósforo, além dos parâmetros microbiológicos como, por exemplo,
a avaliação de coliformes totais (método cromofluorogênico). Em alguns casos, além da poluição, pretende-se
avaliar a presença de contaminantes que, em geral, apresentam toxicidade ao meio ambiente. A avaliação da
toxicidade é realizada por ensaios ou testes toxicológicos. Há, essencialmente, dois tipos de testes ecotox: testes
agudos e testes crônicos. Para testes agudos mais frequentemente utiliza-se microcrustáceos (Daphnia) ou
bactérias luminescentes (Vibrio fischeri) com o analisador Microtox© 500.

Os ensaios no Microtox© 500 consistem em testes de toxicidade aguda de simples execução baseados na análise
da luminescência emitida pelas bactérias (Vibrio fischeri) em amostras com diferentes diluições. O analisador de
toxicidade Microtox©500 é um fotômetro controlador de temperatura que mantém as condições adequadas de
ensaios para os reagentes e as amostras (aproximadamente 15°C). O sistema é calibrado para registrar a
luminescência emitida por bactérias, sendo um teste rápido (15 min.). A partir da diferença entre as intensidades
de luminescência de cada amostra diluída é atribuída a toxicidade à amostra.

Ao final da prática, os alunos devem ter adquirido habilidades relacionadas à aplicação do método de análise
toxicológica aguda, utilizando bactérias Vibrio fischeri, além de ser capaz de avaliar os efeitos toxicológicos a
partir dos resultados obtidos na análise no Microtox © 500.

II.MATERIAIS

- Reagentes para Microtox 500: Solução Diluente, Solução de Ajuste osmótico (OAS), Reagente de reconstituição
para bactéria e Bactéria Vibrio fischeri liofilizada.

- Tubos, micropipetas e ponteiras estéreis.

III.METODOLOGIA

- Ligar o equipamento cerca de 20 minutos antes de iniciar o teste para estabilizar a temperatura.

III.1.PREPARO DA AMOSTRA

- Medir os seguintes parâmetros da amostra: pH, turbidez, salinidade e oxigênio dissolvido (OD).

Teste de pH: entre 6,0 e 8,5 (se o pH estiver fora ajustar para 7±0,2 com HCl 1N ou NaOH 1N, porém a sol.
adicionada não pode exceder 5% do volume total da amostra)

Turbidez: limite 100 NTUs

Salinidade: mínima de 20g/L de NaCl

OD: maior que 0,5 mg/L

35
III.2.ENSAIO TOXICOLÓGICO

- Escolher a opção Basic test no software Microtox OMNI (duas amostras com quatro diluições cada).

- Posicionar as cubetas no termobloco;

- Adicionar 1,0 mL do reagente de reconstituição na posição “reagent well”;

- Adicionar 500 µL de solução diluente nas cubetas B1 - B5 e D1 – D5;

- Adicionar 1,0 mL de solução diluente nas cubetas A1 - A4 e C1 – C4;

- Adicionar 250 µL de solução OAS + 2.500 µL da amostra 01 em A5 e da amostra 02 em C5;

- Misturar e depois descartar 750 µL das cubetas;

- Fazer uma diluição seriada (1:2) transferindo 1,0 mL:

- A5 para A4; A4 para A3; A3 para A2

- C5 para C4; C4 para C3, C3 para C2

- Descartar 1,0 mL de A2 e 1,0 mL de C2;

- Esperar 5 minutos

III.2.1.REATIVAÇÃO DA BACTÉRIA

- Retirar a ampola com a bactéria liofilizada do congelador;

- Abrir a ampola com o mínimo de manuseio para não alterar a temperatura;

- Transferir o reagente de reconstituição pré-resfriado da posição “reagent well” para a ampola;

- Misturar utilizando a micro pipeta, retornar a solução para a cubeta e posicioná-la no “reagent well”.

- Transferir 10 µL da cubeta para B1 a B5; e D1 a D5;

- Esperar 15 minutos

- Colocar a cubeta B1 na posição de leitura e pressionar o botão SET e verificar a fluorescência;

- Pressionar START no programa Microtox OMNI para iniciar a sequência de leituras do teste e seguir as
instruções indicadas na tela;

- Colocar a cubeta em destaque na tela na cavidade de leitura e pressionar o botão READ;

- Fazer a leitura das cubetas B1 a B5 e D1 a D5;

36
 - Após as leituras transferir imediatamente as amostras de:

- A1 para B1; A2 para B2; ........ A5 para B5;

- C1 para D1; C2 para D2; ........ C5 para D5

- Pressionar START para iniciar a contagem do tempo

- Quando chegar a 5 minutos realizar a leitura das cubetas B1 a B5 e D1 a D5 novamente;

- Repetir esse passo depois, quando a contagem atingir 15 minutos.

III.2.2.LEITURA E INTERPRETAÇÃO DAS LEITURAS

- Tabela de leitura da luminescência em cada diluição nos tempos 0, 5 e 15 minutos. Preencher com os valores
obtidos no teste.

AMOSTRA
Amostra 01 Amostra 02

Diluições Diluições

1= 2= 3= 4= 1= 2= 3= 4=

T0

T5

T15

EC50

37