INSPECCIÓN DE PRODUCTOS DE ORIGEN ANIMAL

Cinthya Aranditza Hernández Rodríguez

19 de octubre 2018

Western Blot

También es conocido como inmunoblot, Protein blotting, es una técnica analítica para
detectar proteínas especificas en una determinada muestra, mediante electroforesis en gen,
separando las proteínas dependiendo del criterio que se desee (peso molecular, estructura,
hidrofobicidad, etc.

Luego son transferidas a una membrana absorbente (normalmente de nitrocelulosa o de

PVDF) para buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. Finalmente
se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia entre otros
métodos, para poder estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad
relativa respecto a otras proteínas.

El Western Blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de

Stanford. El nombre le fue dado por W. Neal Burnette, el cual consiste en un juego de palabras
con una técnica análoga pero que usa DNA, el Suthern blot, que en este caso debe su nombre
a su descubridor, Edwin Southern. Otras técnicas que fueron nombradas siguiendo este
criterio son el Northern blot (en el que se separada e identifica el Eastern nlot, el
Sounthwestern blot.

Antes de la aparición del western blot, ya existían diversas técnicas que eran capaces de
detectar un antígeno determinado en una muestra (inmunoelectroforesis, inmunodifusión
doble de Ouchterlony, inmunoprecipitación)

L aparición de western blot fue posible hasta la aparición de las membranas. En 1975, Edwin
Southern demostró que la nitrocelulosa era capaz de capturar ácidos nucleicos separados
previamente por electroforesis, que permitía el análisis de una mezcla compleja de moléculas
de ADN, como un genoma tratado con enzimas de restricción.

Towbin (1979) y Burnette (1981) demostraron que también era capaz de unirse a proteínas.
En 1986, Millopore desarrollo la primera membrana de PVDF diseñada para la transferencia
de proteínas, la membrana de transferencia Immobilon TM PVDF y después fue llamada
immobilon-PTM para diferenciarse de otras membranas.

Esta técnica permite transferir las proteínas de un gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato
(SDS) a una membrana absorbente, siendo las proteínas transferida a la membrana una copia
exacta del gel donde han sido separadas por electroforesis, esta transferencia de gel a
membrana es una gran herramienta para poder detectar y caracterizar proteínas,
especialmente las que están en baja abundancia.
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Las ventajas especificas que supone la técnica de WB son las siguientes:

 Las membranas húmedas son flexibles y fáciles de manipular

 Las proteínas bloqueadas en la membrana son accesibles por los diferentes ligandos
 Se utilizan pocos reactivos para el análisis
 Se pueden mantener las membranas útiles durante más tiempo.
PROCEDIMIENTO
 Pequeña cantidad de tejido se introduce en un buffer de extracción, y después se
procede a homogenizarlos (licuadora, grandes volúmenes), o con un homogenizado
para muestras pequeñas, por último, se centrifuga para obtener las proteínas en el
sobrenadante, la fracción no precipitada.
 Las células pueden lisarse por estos métodos mecánicos. También pueden usarse
detergentes, sales que favorezcan la lisis y solubilicen las proteínas, aunque a veces
se le añaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la digestión por las
enzimas celulares de las proteínas y de las fosfoproteínas.

Los materiales deben estar a bajas temperaturas (-4°C) para evitar la desnaturalización
proteica
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a. Preparación de la muestra

Extracción de las proteínas de las muestras biológicas

mediante disrupción mecánica o química, pueden ser
plantas, tejidos de animales, células cultivadas,
levaduras o bacterias

La disrupción mecánica es con un homogenizador el cual

disgrega los tejidos.

Se usan tampones conteniendo detergentes para lisis

celular.

En la mayoría de los ensayos, las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o
mecánicos, el cual dependerá del tipo de muestra de partida, de la localización subcelular de
la proteína y de las condiciones óptimas que requiere el anticuerpo para reconocer el epítopo
proteico.

Método Descripción Tipo de muestra

Licuadora Se tritura mediante cuchillas Gran cantidad de tejido
rotatorias
Homogenizador Douce Tubo de vidrio con pistón Células tisulares útil para
ajustado maja las células por
protocolos de
acción de corte enriquecimiento de proteínas
mitocondriales o nucleares
Homogenizador de Ondas de sonido emitidas Células, tejidos, bacterias
ultrasonidos por una sonda para romper
las membranas celulares
Pulverización en nitrógeno La muestra se pulveriza Tejido animal o vegetal
líquido utilizando un mortero y una
almirez refrigerados
Perlas de vidrio La ruptura celular se produce Levaduras
por agitación de las perlas de
vidrio

b. Electroforesis en gel de acrilamida

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las proteínas en el extracto se separan

de acuerdo con su tamaño por
electroforesis. Se prepara el gel de
acrilamida, bisacrilamida, dodeculsulfato
de sodio (SDS) añadido al gel se une a
las proteínas, y confiere de forma
proporcional a la masa de cada proteína,
una carga negativa a cada una de ellas.

Se añade un colorante de carga, asi la migración de la muestra se monitorea, se utiliza una

pipeta para cargar las muestras en los pocillos del gel, el gel se coloca en un tanque de
electroforesis de tampón, que conduce la corriente, las proteínas con cargar negativa migran
desde el ánodo. Una fuente de alimentación proporciona el voltaje
c. Transferencia electroforética a una membrana

las proteínas son

transferidas
electroforéticamente a un
soporte rígido o membrana
donde quedan
inmovilizados.

El gel y la membrana se
coloca entre papel de filtro y almohadillas de esponja, un cartucho aplica presión y mantiene
un estrecho contacto entre el gel y la membrana, se aplica voltaje en el tanque de transferencia
y las proteínas migran desde el gel o la membrana.
d. Hibridación del anticuerpo

La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con
ausencia de proteínas y evitar la unión no especifica de los anticuerpos. Se incuba con un
anticuerpo primario dirigido contra el epítopo especifico de la proteína diana. Tras varias
lavadas de la membrana, se adición un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma
específica al anticuerpo primario, proporcionando una forma de detección.
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e. Detección de bandas

Después de un lavado de la
membrana para eliminar el anticuerpo
no unido, se procede a detectar la
localización de la banda en la
membrana. Para la detección de
quimioluminiscencia, se utiliza un
anticuerpo secundario conjugado con
la enzima peroxidasa (HRP), que
provoca una reacción enzimática que
da como resultado la emisión de luz,
que puede ser detectada en una película de rayos X, o de forma digital, mediante un sistema
de captación de imágenes. La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz
emitida por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario.
PCR

Consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de ADN especifico, para llevarlo acabo

esnecesario conocer, al menos parcialmente, la secuencia del fragmento a amplificar,
básicamente se trata de replicar el mismo fragmento de ADN y para ello se realiza in vitro lo
que hacen las células in vivo para replicar su ADN.

Desnaturalización: se eleva la temperatura del tubo de reacción hasta 94°C durante un

minuto (el tiempo puede variar hasta dos minutos).
Alineamiento: Se desciende la temperatura hasta que oscile entre 40-60°C de diversos
parámetros como la secuencia de los primers, la duración de este paso puede oscilar entre
1.5 y 2 minutos.
Extensión: se aumenta la temperatura hasta 72°C y se deja actuar a la Taq polimerasa
durante 1 o 2 minutos.
Literatura
 Análisis de proteinas. Manual de laboratorio de la empresa advansta. Electroforesis,
transferencia e inmunoprecipitación. Disponible en: http://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdf
 Calderón Pascacio Rocio Vanessa. (2007). Instituto de biotecnología. Universidad Nacional
Autónoma de México.
 Laskibar Iñaki (2009). Manejo de la técnica Western blot. Determinaciones relacionadas con
obesidad y diabetes.