PRACTICA 5

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

Burgos Saavedra Amanda del Carmen

1. INTRODUCCIÓN:

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un

medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y
multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura
adecuada para el crecimiento.

Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:

Que se efectúen asépticamente
Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados
Que se realicen solo los manipuleos indispensables
Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero
o bien Flujo laminar.

2. OBJETIVO:

Realizar una siembra por agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría

simple.
Realizar una siembra por difusión en placa o placa vertida
Obtener un cultivo puro de bacterias
3. METODOLOGÍA:
3.1. Siembra por agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría simple
Se realiza para obtener colonias individuales de bacterias a partir de una muestra
biológica.
 Tomar una alícuota de la muestra (inóculo) y depositarla en uno de los extremos
superiores de la placa de Petri que contiene medio de cultivo agar nutritivo previamente
servido y controlado.
 Realizar movimientos en zig – zag (estrías) muy juntos en el primer tercio de la placa
para agotar el inóculo. Posteriormente realizar estrías muy separadas de un extremo a otro
lado de la placa no tomando nuevo inóculo ni levantando el asa hasta concluida la siembra
en toda la placa.
 Incubar a 30 ºC (o la temperatura requerida por la bacteria) durante 24 horas.

3.2. Siembra por difusión en placa o placa vertida

Se utiliza para realizar el recuento total de bacterias de una muestra biológica.
 Depositar 0,1 mL (0,5 mL, 1 mL)) de la muestra sobre la superficie de una placa
de Petri estéril y vacía.
 Agregar 10 mL de agar nutritivo licuado y enfriado a 45 – 50 °C.
 Homogenizar por movimientos de rotación de la placa de Petri para la dispersión
de microorganismos en forma más o menos homogénea, hasta la solidificación.
 Incubar a 37 ºC durante 24 horas.
 Realizar el recuento de colonias.
3.3. Obtención de un cultivo puro de bacterias
a. Tratamiento de la muestra
Para estudiar las bacterias se necesita poder cultivarlas en condiciones de
laboratorio y por lo tanto inicialmente deben ser aisladas. Por ello, se debe disponer de
muestras biológicas que pueden ser de varios tipos:
a.1 Muestras que contienen abundante número y tipo de microorganismos en las
que previamente se deben realizar diluciones en solución salina fisiológica estéril. Ejemplo
suelo.
a.2 Muestras que no contienen suficiente cantidad del microorganismo que se desea
investigar, por lo que previamente se deben enriquecer para incrementar el número del
microorganismo requerido y disminuir el de los contaminantes. Ejemplo leche.
a.3 Muestras que naturalmente no presentan bacterias (incluyendo el
microorganismo investigado y los contaminantes) y que se siembran sin ningún pre-
tratamiento. Ejemplos sangre.

b. Aislamiento primario
Una vez que la muestra ha recibido o no tratamiento se procede al aislamiento
primario a través de la siembra en placa de Petri mediante la técnica de estría en la
superficie de medios enriquecidos (agar sangre), medios selectivos (agar Chapman) o
medios selectivos diferenciales (agar Mac Conkey). Después de un periodo de incubación
de 24 horas (puede variar en función del microorganismo), se observarán las colonias de
bacterias (masas constituidas por millones de bacterias que se aprecian a simple vista y
que han sido originadas a partir de una célula). Se observará el tamaño y el aspecto de
cada colonia que generalmente son constantes para cada género y especie bacteriana, por
lo que se les utiliza como característica diferencial. A continuación se realizará una tinción
de Gram para determinar la morfología y reacción tintorial de las bacterias constituyentes
de la colonia.
Experiencia en el Laboratorio de Microbiología:
SIEMBRA PRIMARIO AISLAMIENTO
a) Tenemos la muestra biológica, la muestra de biológico fue cebada diluida.
Prendemos el mechero y preparamos una placa de Petri en donde sembraremos la
muestra biológica.

b) Esterilizamos el aza y tomamos una pequeña muestra de cebada y lo sembramos

en la placa de Petri con la técnica de agotamiento y estría.
c) Acondicionamos la placa Petri y lo llevamos a la incubadora por 24 horas a 30°C.

d) Después de 24 horas de ser incubada la placa Petri podemos ver las colonias.
e) Entonces podemos hacer la prueba de la catalasa.

 Desengrasamos la lámina portaobjetos y esterilizamos la aza.

 Tomamos una pequeña muestra de una de las colonias en la placa Petri y lo

colocamos en la lámina portaobjetos.
  Luego agregamos una gota de peróxido de hidrógeno.

 La prueba produce oxígeno.

Resultado:
Al agregar peróxido de hidrógeno a la lámina con una pequeña muestra de la colonia,
empezó a burbujear.

Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan el peróxido de hidrógeno en agua y

oxígeno gaseoso, y como resultado se liberan burbujas de gas.
f) Describimos la colonia seleccionada en la placa de Petri.

Caracterización macroscópica de la colonia:

 Tamaño: Mediano.
 Forma: Irregular.
 Bordes: Ondulado.
 Elevación: Acuminada.
 Aspecto: Acuosa.
 Calor: No pigmentada.
g) Esterilizamos nuevamente la aza y tomamos una muestra de la colonia
seleccionada y la sembramos en un vial.

h) Incubamos el vial por 24 horas a 30° C.

i) Después de las 24 horas tenemos al cultivo puro de bacterias.

j) Identificamos el vial. Y mantenemos al vial en refrigeración.

4. CONCLUSION:
Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de
microbiología pues sirven para identificar las bacterias.
Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio líquido o en
la superficie de un medio sólido de agar. Al inocular debe trabajarse dentro del radio de un
mechero Bunsen (30 cm), o en el ambiente dentro de una campana de flujo laminar, ya que,
la corriente ascendente de aire que va por la llama, o la corriente de aire de flujo laminar
arrastra el polvo y otras partículas con el aire hacia arriba, o hacia afuera; impidiendo la
contaminación del medio de cultivo.

5. REFERENCIAS:
Sanz, S. (2° Ed.). (2011). Prácticas de microbiología. Argentina: Universidad de La Rioja.
Rojas, T. (2011). Conceptos y prácticas de microbiología general. Colombia: Universidad
Nacional de Colombia.