Honey is the natural sweet substance produced by honey bees from the
nectar of plants or from secretions of living parts of plants or excretions of plant
sucking insects on the living parts of plants, which the bees collect, transform by combining with specific substances of their own, deposit, dehydrate, store and leave in the honey comb to ripen and mature (Council Directive 2001/110/EC). The majority of its components are derived from the plants, some are added by the bees and others are due to the maturation of the honey (Anklam, 1998). Honey possesses valuable nourishing, healing and prophylactic properties, which result from its chemical composition. It has potential therapeutic value in the treatment of heart disease, cancer, cataracts and several inflammatory diseases (Noor, Sarfraz, Ali, & Shahid, 2014). Although the major components of honey are sugar and water, it has a wide range of minor constituents, such as phenolic compounds, which may be responsible for the biological activities of honey (Jaganathan, & Mandal, 2009). Phenolic compounds, or polyphenols, are one of the important groups of phytochemicals that occur in plants, in which they are widely distributed. They are products of the secondary metabolism of plants, being fundamental for their normal development and an important key in their defence mechanism (Bravo, 1998). Flavonoids and phenolic acids (both benzoic and cinnamic-acid derivatives) constitute the most important classes of polyphenols and the most abundant on the diet, accounting for the 60 and 30 % of the total, respectively, with more than 8000 phenolic structures known. Flavonoids can be subdivided into 13 classes, including flavonols, flavanones, flavones, anthocyanidins and isoflavones (Robards, Prenzler, Trucker, Swatsitang, & Glover, 1999). Phenolic compounds contribute to the organoleptic properties, such as color, taste or flavour of honey. They also have antioxidant activities, together with other honey substances (e.g. enzymes (glucose oxidase, catalase), vitamins (ascorbic acid) or organic acids) (Gheldof, Wang, & Engeseth, 2002). Honey can serve as a source of natural antioxidants and the variations in the antioxidant activities of honey are due to the qualitative and quantitative nature of their phenolic constituents (Aljadi, & Kamaruddin, 2004). It has been found that phenolic compounds present in honey can come from flower nectar, pollen, propolis and/or beeswax (Gil, Ferreres, Ortiz, Subra, & Tomás-Barberán, 1995) and, consequently, it can be reasonably expected that the composition of honey will be different depending on its origin. As a matter of fact, the content of phenolic compounds in honey is strongly affected by the floral source and geographical origin, as well as by the climatic characteristics of the site of collection. Therefore, the analysis of phenolic compounds has been regarded as a very promising technique for studying the floral and geographical origins of honeys. The extraction of phenolics from the honey matrix is the first step involved in their analysis, and different protocols, including both liquid-liquid and solid-phase extraction strategies, have been employed for the isolation of this fraction. The use of non- ionic polymeric resins has the advantage of eliminating numerous polar and ionic interfering substances such as sugars and acids. Amberlite XAD type resins are polymeric adsorbents which have proved to be the best materials for extracting honey flavonoids with yields higher than 80 %. Amongst them, we have chosen amberlite XAD-4 because it has a higher surface area, and so a higher efficiency, compared with the XAD-2 type (Iurlina, Saiz, Fritz, & Manrique, 2009). Identification and quantification of polyphenols in honey have been carried out using different techniques: colorometric reactions, thin-layer chromatography (TLC), gas chromatography (GC), high-performance liquid chromatography (HPLC) and capillary electrophoresis (CE), the three later coupled to diverse detection systems (Pyrzynska, & Biesaga, 2009 ; Mattonai, Parri, Querci, Degano, & Ribechini, 2016). Moreover, UPLC-MS was used to study the phenolic acids and flavonoids contained in several unifloral honey samples; the developed method enabled the identification of 37 phenolic compounds within 14 min (Gasic et al., 2014 ; Trautvetter, Koelling-Speer, & Speer, 2009). Nevertheless, the method of choice for phenolic compounds analysis is reversed- phase (RP)-HPLC coupled to UV detector and, more recently, to mass spectrometry (MS). In RP-HPLC, the stationary phase consists of a non-polar octadecylsilane (C) bonded phase and the mobile phase is a 18polar solvent, so that the more polar the phenolic compounds, the earlier they will elute. Numerous mobile phases have been employed but binary systems comprising an aqueous component and a less polar organic solvent (acetonitrile or methanol) remain as the most common (Pyrzynska, & Biesaga, 2009). In general, gradient elution is usually used in recognition of the complexity of the phenolic profile of honey samples. Numerous flavonoids (such as apigenin, chrysin, galangin, kaempferol, luteolin, pinocembrin, pinobanksin, quercetin) and phenolic acids (caffeic, gallic, cinnamic, p-coumaric and protocatechuic acids) were identified in honey samples (Gasic et al., 2014). Caffeic and p- coumaric acids, chrysin, galangin, hesperetin, kaempferol, luteolin, pinocembrin and quercetin were detected in lemon and orange Spanish honeys (Escriche, Kadar, juan-Boras, & Domenech, 2011). In addition, a total of 43 polyphenols were identified in serbian unifloral honeys (Keckes, Gasic, Velickovic, Milojkovic-Opsenica, Natic, & Tesic, 2013). Several studies have revealed that the analysis of flavonoids and other phenolic compounds constitute a very promising technique to study the geographical and floral origin of honey. Flavonoids originating from propolis are not helpflul for the determination of the botanical origin of the honey, as the levels of such flavonoids depend on the presence and content of propolis in the honey. Pinocembrin, pinobanksin, galangin and chrysin are characteristic flavonoids of propolis and they are determined in european honey samples (Gasic et al., 2014; Tomas-Barberan et al., 2001, Yao, Datta, Tomas-Barberan, Ferreres, Martos, & Singanusong, 2003). Specific flavonoids have been described as markers of the botanical origin of unifloral honeys (Soler, Gil, García-Viguera, & Tomás-Barberán, 1995) as is the case of the flavanone hesperetin for citrus honey (Ferreres, García-Viguera, Tomás-Lorente, & Tomás Barberán,2008), the flavone kaempferol for rosemary honey (Gil et al., 1995) or the flavonol quercetin for sunflower honey (Tomás-Barberán, Martos, Ferreres, Radovic, & Anklam, 2001). Additionally, some phenolic acids have also been used as floral marker substances (Andrade, Ferreres, & Amaral, 1997); some examples include ellagic acid in heather honey (Ferreres, Andrade, Gil, & Tomás-Barberán, 1996), homogentisic acid in strawberry honey (Cabras et al., 1999) and gallic in the Eucalyptus one (Yao et al., 2004). Due to the significance of natural phenolic compounds as natural antioxidants and to their use as markers in plant chemotaxonomic studies, interest in their identification and quantification in honey samples has significantly increased in recent years (Bertoncelj, Polak, Kropf, Korošec, & Golob, 2011; Pyrzynska, & Biesaga, 2009; Martos, Ferreres, Yao, D’arcy, Caffin, & Tomás-Barberán, 2000; Michalkiewicz, Biesaga, & Pyrzynska, 2008 ; Yao et al., 2003). Honey production in Algeria has a very long tradition. However, its composition and bioactive properties have not been exhaustively analysed hitherto. There are publications dealing with the study of the pollen analysis, physico- chemical and antioxidant properties of Algerian honeys (Makhloufi, Kerkvliet, D’albore, Choukri, & Samar, 2010; Makhloufi, Kerkvliet, & Schweitzer, 2015; Mouhoubi-Tafinine, Ouchemoukh, & Tamandjari, 2016; Ouchemoukh, Louaileche, & Schweitzer, 2007; Ouchemoukh, Schweitzer, Bachir Bey, Djoudad-Kadji, & Louaileche, 2010). According to our knowledge, this is the first research of phenolic profiles in Algerian honeys. The major purpose of this study was the identification of the phenolic compounds contained in honey samples by means of RP-HPLC-ESI-TOF- MS. Madu adalah zat manis alami yang dihasilkan oleh lebah madu dari nektar tanaman atau dari sekresi bagian hidup tanaman atau ekskresi serangga penghisap tanaman pada makhluk hidup. bagian-bagian tanaman, yang dikumpulkan lebah, bertransformasi dengan menggabungkan dengan zat-zat tertentu dari mereka sendiri, menyimpan, mengeringkan, menyimpan dan meninggalkan dalam sisir madu untuk matang dan matang (Council Directive 2001/110 / EC). Mayoritas komponennya berasal dari tanaman, beberapa ditambahkan oleh lebah dan yang lainnya adalah karena pematangan madu (Anklam, 1998). Madu memiliki sifat bergizi, penyembuhan dan profilaksis yang berharga, yang dihasilkan dari komposisi kimianya. Ini memiliki nilai terapeutik potensial dalam pengobatan penyakit jantung, kanker, katarak dan beberapa penyakit radang (Noor, Sarfraz, Ali, & Shahid, 2014). Meskipun komponen utama madu adalah gula dan air, ia memiliki berbagai macam konstituen minor, seperti senyawa fenolik, yang mungkin bertanggung jawab untuk aktivitas biologis madu (Jaganathan, & Mandal, 2009). Senyawa fenolik, atau polifenol, adalah salah satu kelompok penting phytochemical yang terjadi pada tumbuhan, di mana mereka didistribusikan secara luas. Mereka adalah produk dari metabolisme sekunder tanaman, menjadi dasar bagi perkembangan normal mereka dan kunci penting dalam mekanisme pertahanan mereka (Bravo, 1998). Flavonoid dan asam fenolik (baik turunan benzoat dan sinamatik-asam) merupakan golongan polifenol yang paling penting dan paling banyak pada makanan, menyumbang 60 dan 30% dari total, masing-masing, dengan lebih dari 8000 struktur fenolik yang diketahui. Flavonoid dapat dibagi menjadi 13 kelas, termasuk flavonol, flavanones, flavones, anthocyanidins dan isoflavones (Robards, Prenzler, Trucker, Swatsitang, & Glover, 1999). Senyawa fenolik berkontribusi pada sifat organoleptik, seperti warna, rasa atau rasa madu. Mereka juga memiliki aktivitas antioksidan, bersama dengan zat madu lainnya (misalnya enzim (glukosa oksidase, katalase), vitamin (asam askorbat) atau asam organik) (Gheldof, Wang, & Engeseth, 2002). Madu dapat berfungsi sebagai sumber antioksidan alami dan variasi dalam aktivitas antioksidan madu adalah karena sifat kualitatif dan kuantitatif dari konstituen fenolik mereka (Aljadi, & Kamaruddin, 2004). Telah ditemukan bahwa senyawa fenolik yang ada dalam madu dapat berasal dari nektar bunga, serbuk sari, propolis dan / atau lilin lebah (Gil, Ferreres, Ortiz, Subra, & Tomás-Barberán, 1995) dan, akibatnya, dapat diharapkan bahwa komposisi madu akan berbeda tergantung pada asalnya. Sebagai soal fakta, kandungan senyawa fenolik dalam madu adalah sangat dipengaruhi oleh sumber bunga dan asal geografis, serta oleh iklim karakteristik situs koleksi. Oleh karena itu, analisis senyawa fenolik memiliki telah dianggap sebagai teknik yang sangat menjanjikan untuk mempelajari asal-usul bunga dan geografis dari madu. Ekstraksi fenolik dari matriks madu adalah langkah pertama yang terlibat dalam mereka analisis, dan protokol yang berbeda, termasuk ekstraksi cair-cair dan fase padat strategi, telah digunakan untuk isolasi fraksi ini. Penggunaan non-ionik resin polimer memiliki keuntungan menghilangkan banyak polar dan ion yang mengganggu zat seperti gula dan asam. Resin jenis Amberlite XAD adalah adsorben polimer yang telah terbukti menjadi bahan terbaik untuk mengekstrak flavonoid madu dengan hasil lebih tinggidari 80%. Di antara mereka, kami memilih amberlite XAD-4 karena memiliki permukaan yang lebih tinggi daerah, dan efisiensi yang lebih tinggi, dibandingkan dengan jenis XAD-2 (Iurlina, Saiz, Fritz, & Manrique, 2009). Identifikasi dan kuantifikasi polifenol dalam madu telah dilakukan menggunakan teknik yang berbeda: reaksi colorometric, thin-layer chromatography (TLC), gas kromatografi (GC), kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dan kapiler elektroforesis (CE), tiga kemudian digabungkan ke sistem deteksi beragam (Pyrzynska, & Biesaga, 2009; Mattonai, Parri, Querci, Degano, & Ribechini, 2016). Apalagi UPLC-MS digunakan untuk mempelajari asam fenolik dan flavonoid yang terkandung dalam beberapa madu unifloral sampel; metode yang dikembangkan memungkinkan identifikasi 37 senyawa fenolik dalam 14 menit (Gasic dkk., 2014; Trautvetter, Koelling-Speer, & Speer, 2009). Namun demikian, metode pilihan untuk analisis senyawa fenolik dibalik-fase (RP) -HPLC digabungkan ke Detektor UV dan, baru-baru ini, untuk spektrometri massa (MS). Dalam RP-HPLC, stasioner fase terdiri dari fase terikat oktadesilsilane (C) non-polar dan fase gerak adalah pelarut 18polar, sehingga semakin polar senyawa fenolik, semakin awal mereka akan mengelusi.Banyak fase gerak telah digunakan tetapi sistem biner terdiri dari berair komponen dan pelarut organik kurang polar (asetonitril atau metanol) tetap sebagai yang paling umum (Pyrzynska, & Biesaga, 2009). Secara umum, elusi gradien biasanya digunakan dalam pengakuan kompleksitas profil fenolik sampel madu.Banyak flavonoid (seperti apigenin, chrysin, galangin, kaempferol, luteolin, pinocembrin, pinobanksin, quercetin) dan asam fenolik (caffeic, gallic, cinnamic, p-coumaric dan asam protocatechuic) diidentifikasi dalam sampel madu (Gasic et al., 2014). Caffeic dan p- asam coumaric, chrysin, galangin, hesperetin, kaempferol, luteolin, pinocembrin dan quercetin terdeteksi dalam jeruk lemon dan jeruk Spanyol (Escriche, Kadar, juan-Boras, & Domenech, 2011). Selain itu, total 43 polifenol diidentifikasi di Serbia unifloral honeys (Keckes, Gasic, Velickovic, Milojkovic-Opsenica, Natic, & Tesic, 2013). Beberapa penelitian telah mengungkapkan bahwa analisis flavonoid dan senyawa fenolik lainnya merupakan teknik yang sangat menjanjikan untuk mempelajari asal geografis dan bunga dari madu. Flavonoid yang berasal dari propolis tidak membantu untuk penentuan botani asal usul madu, karena kadar flavonoid tersebut bergantung pada keberadaan dan kandungan propolis dalam madu. Pinocembrin, pinobanksin, galangin dan chrysin adalah flavonoid karakteristik propolis dan mereka ditentukan dalam sampel madu Eropa (Gasic et al., 2014; Tomas-Barberan dkk., 2001, Yao, Datta, Tomas-Barberan, Ferreres, Martos, & Singanusong, 2003). Flavonoid spesifik telah digambarkan sebagai penanda asal botani unifloral honeys (Soler, Gil, García- Viguera, & Tomás-Barberán, 1995) seperti halnya flavanone hesperetin untuk madu jeruk (Ferreres, García-Viguera, Tomás-Lorente, & Tomás Barberán, 2008), kaempferol flavon untuk rosemary honey (Gil et al., 1995) atau quercetin flavonol untuk madu bunga matahari (Tomás- Barberán, Martos, Ferreres, Radovic, & Anklam, 2001). Selain itu, beberapa asam fenolik juga telah digunakan sebagai zat penanda bunga (Andrade, Ferreres, & Amaral, 1997); beberapa contoh termasuk asam ellagic dalam madu heather (Ferreres, Andrade, Gil, & Tomás-Barberán, 1996), asam homogentisic dalam madu stroberi (Cabras et al., 1999) dan gallic di Eucalyptus one (Yao et al., 2004) . Karena pentingnya senyawa fenolik alami sebagai antioksidan alami dan untuk digunakan sebagai penanda dalam studi chemotaxonomic tanaman, minat dalam identifikasi dan kuantifikasi dalam sampel madu telah meningkat secara signifikan dalam beberapa tahun terakhir (Bertoncelj, Polak, Kropf, Korošec, & Golob, 2011 ; Pyrzynska, & Biesaga, 2009; Martos, Ferreres, Yao, D'arcy, Caffin, & Tomás-Barberán, 2000; Michalkiewicz, Biesaga, & Pyrzynska, 2008; Yao et al., 2003). Produksi madu di Aljazair memiliki tradisi yang sangat panjang. Namun, komposisi dan sifat bioaktifnya belum dianalisis secara mendalam sampai sekarang. Ada publikasi yang berurusan dengan studi tentang analisis serbuk sari, sifat fisikokimia dan antioksidan dari madu Aljazair (Makhloufi, Kerkvliet, D'albore, Choukri, & Samar, 2010; Makhloufi, Kerkvliet, & Schweitzer, 2015; Mouhoubi-Tafinine, Ouchemoukh, & Tamandjari, 2016; Ouchemoukh, Louaileche, & Schweitzer, 2007; Ouchemoukh, Schweitzer, Bachir Bey, Djoudad-Kadji, & Louaileche, 2010). Menurut pengetahuan kami, ini adalah penelitian pertama profil fenolik dalam madu Aljazair. Tujuan utama dari penelitian ini adalah identifikasi senyawa fenolik yang terkandung dalam sampel madu dengan menggunakan RP-HPLC-ESI-TOF-MS.