TCC - Bianca e Ana

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ENGENHARIA DE ALIMENTOS
Ana Cristina Bispo de Moura

Bianca Maria Martins Caetano
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
AVALIAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO EM CO-CULTURA COM

DIFERENTES ESPÉCIES DE Saccharomyces EM MOSTO SINTÉTICO DE UVA
GOIÂNIA – 2018

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao Curso de Engenharia de
Alimentos da Universidade Federal de
Goiáa – UFG, para obtenção do título de
Engenheiro de Alimentos.
Orientador: Prof.° Dr.° Gabriel Luis Castiglioni
GOIÂNIA – 2018

Aprovada em _____ de ______________ de ______, pela Banca Examinadora

constituída pelos seguintes professores:
__________________________________________________
Prof. Dr. Gabriel Luis Castiglioni
__________________________________________________
Profª. Drª. Fernanda Ferreira Freitas
__________________________________________________
Engª. Maryanna Moreira Viana
AGRADECIMENTOS
Agradecemos primeiramente a Deus, pelo dom da vida e por nos proporcionar

momentos ímpares durante nossa graduação e, principalmente, no decorrer deste ano de
convivência intensa, dividindo não somente lágrimas (que foram muitas!), mas também
muitos sorrisos, descobertas, sendo comemorado com muita vibração e entusiasmo cada uma
de nossas conquistas. Agradecemos, em especial, aos nossos pais, senhora Luciana Bispo,
senhora Sandra Caetano e senhor José Antonio Caetano por nos apoiar e principalmente nos
incentivar na busca dos nossos objetivos.
Nossa eterna gratidão ao nosso orientador e amigo, Prof. Dr. Gabriel Luis Castiglioni,
por todo suporte, pelos conselhos, paciência, confiança, incentivo, compreensão e imensa
calma para a realização dessa etapa tão importante nas nossas vidas. Somos imensamente
gratas pela maneira única e especial com que nos orientou e, sem dúvidas, levaremos seus
ensinamentos para sempre.
Aos nossos amigos, companheiros de curso, professores e técnicos dos laboratórios
que nos auxiliaram, direta ou indiretamente, ao longo da nossa caminhada: Muito Obrigada!
Somos gratas à Profª.Drª. Fernanda, por haver recebido com carinho e alegria nosso
convite para participar da banca do nosso TCC. E à Engª. Maryanna que, além de ser nossa
referência como profissional do ramo vitivinícola, é uma grande amiga, sempre esteve
disposta a nos auxiliar e, aceitou nosso convite com muito amor vindo de Belo Horizonte à
Goiânia apenas para participar da banca do nosso TCC. Muito Obrigada por todo esse carinho
e apoio recebido, queridas!
Agradecemos, ainda, aos nossos irmãos Ana Luisa Bispo, Luis Filipe Bispo e Bruna
Caetano por serem bênçãos em nossas vidas e nos motivarem a sermos seres humanos
melhores a cada dia. Ao príncipe Noah Diederik, por ser um filho maravilhoso e, mesmo em
meio à saudade, soube ser forte e aguardar a mamãe terminar o curso. Em breve, estaremos
juntos novamente, filho amado. Ao Roberto Sousa, um agradecimento especial, não pela
colaboração no projeto em si, mas pelo apoio na vida pessoal, por ser esse parceiro de vida
maravilhoso.
Finalizando, não poderíamos deixar de agradecer, à nossa companheira de curso e
querida amiga, Maria Carolina, que sempre esteve à disposição, não medindo esforços para
nos ajudar em tudo, desde o primeiro dia de análises, até a finalização deste projeto.
Somos gratas a todos vocês. Muito Obrigada por fazerem parte deste momento!
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................... i

LISTA DE FIGURAS............................................................................................................... ii
LISTA DE QUADROS............................................................................................................ iii
LISTA DE EQUAÇÕES ......................................................................................................... iv
RESUMO................................................................................................................................... v
ABSTRACT ............................................................................................................................. vi
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1
2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 3
2 OBJETIVO GERAL ................................................................................................................ 3
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................... 3
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................. 4
3.1 VINHO ................................................................................................................................. 4
3.2 PROCESSO FERMENTATIVO ......................................................................................... 5
3.3 PARÂMETROS DE CONTROLE DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA ......................... 5
3.4 LEVEDURAS ...................................................................................................................... 6
3.4.1 Saccharomyces cerevisiae ................................................................................................. 7
3.4.2 Saccharomyces kudriavzevii .............................................................................................. 8
3.4.3 Saccharomyces uvarum ..................................................................................................... 9
3.5 CO-CULTURAS E CULTURAS MISTAS EM PROCESSOS .......................................... 9
3.6 DELINEAMENTO EXPERIMETAL .................................................................................. 9
4 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 10
4.1 MICRORGANISMO .......................................................................................................... 10
4.2 REPIQUE E MANUTENÇÃO DAS CEPAS ................................................................... 10
4.3 MOSTO SINTÉTICO ........................................................................................................ 11
4.4 PREPARO DO INÓCULO ................................................................................................ 15
4.5 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................................................................ 15
4.6 FERMENTAÇÃO .............................................................................................................. 16
4.7 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR ................................................ 17
4.8 DETERMINAÇÃO DE ETANOL, FRUTOSE, GLICOSE, GLICEROL E ÁCIDO
ACÉTICO ................................................................................................................................. 17
4.9 CÁLCULOS DOS PARÂMETROS CINÉTICOS DA FERMENTAÇÃO ...................... 17
4.9.1 Velocidades específicas de transformação ...................................................................... 17
4.9.2 Fator de conversão de substrato em células..................................................................... 18
4.9.3 Fator de conversão do substrato em produto ................................................................... 19
4.9.4 Produtividade do produto ................................................................................................ 19
4.9.5 Rendimento da fermentação ............................................................................................ 19
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................................................................... 21
5.1 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS DO PLANEJAMENTO
EXPERIMENTAL DE MISTURA .......................................................................................... 21
5.1.1 Avaliação dos Parâmetros Cinéticos dos ensaios com uma cepa .................................... 21
5.1.2 Avaliação dos Parâmetros Cinéticos dos ensaios mistos com duas cepas ...................... 29
5.1.3 Avaliação dos Parâmetros Cinéticos dos ensaios mistos com três e quatro cepas .......... 36
5.2 AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA DO PROCESSO FERMENTATIVO DAS MISTURAS
DE S. cerevisiae (MONASTRELL, T73), S. uvarum (BMV58) e S. kudriavzevii (CR85)
UTILIZANDO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL DE MISTURAS .............................. 42
6 CONCLUSÕES.................................................................................................................... 51
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 53
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 54
i
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Planejamento experimental de misturas simplex-centróide para quatro componentes

2n-1 mais um ponto central ........................................................................................................ 16
Tabela 2- Parâmetros cinéticos encontrados em 236 horas para os Ensaios de 1 a 4 (Culturas
puras das cepas: MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85). ..................................................... 27
Tabela 3- Parâmetros cinéticos encontrados para as fermentações com combinações de duas
cepas na proporção 1:1, durante 236 horas. ............................................................................. 35
Tabela 4- Parâmetros cinéticos encontrados para as fermentações com combinações de três e
quatro cepas nas proporções 1:1:1 e 1:1:1:1, respectivamente, durante 236 horas. ................. 41
ii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Resultados de Crescimento Celular (A), Glicose Residual (B), Frutose Residual
(C), Formação de Etanol (D), Glicerol (E) e Ácido Acético (F) nos Ensaios 1 ao 4 em culturas
puras com as leveduras MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 durante 236h h de
fermentação. ............................................................................................................................. 22
(C), Formação de Etanol (D), Glicerol (E) e Ácido Acético (F) nos Ensaios 5 ao 10 com duas
cepas na proporção de 1:1 das leveduras MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 durante 236h
de fermentação .......................................................................................................................... 29
(C), Formação de Etanol (D), Glicerol (E) e Ácido Acético (F) nos Ensaios 11 ao 15 com três
e quatro cepas na proporção de 1:1:1 e 1:1:1:1, respectivamente, das leveduras
MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 durante 236h h de fermentação. ............................... 36
Figura 4- Regiões de contorno da resposta concentração de biomassa para a combinação
quaternária utilizada no planejamento experimental para misturas simplex centroide. ........... 43
Figura 5- Regiões de contorno da resposta concentração de etanol para a combinação
Figura 6- Regiões de contorno da resposta concentração residual de glicose para a
combinação quaternária utilizada no planejamento experimental para misturas simplex
centroide. .................................................................................................................................. 45
Figura 7- Regiões de contorno da resposta concentração residual de frutose para a
combinação quaternária utilizada no planejamento experimental para misturas simplex
centroide. .................................................................................................................................. 46
Figura 8- Regiões de contorno da resposta concentração de glicerol para a combinação
Figura 9- Regiões de contorno da resposta concentração de ácido acético para a combinação
iii
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Composição do Meio GPY sólido para manutenção das cepas ............................. 11
Quadro 2- Composição química do mosto de uva .................................................................. 12
Quadro 3- Composição química da solução de aminoácidos ................................................. 12
Quadro 4- Composição química da solução de vitaminas ................................................ 13
Quadro 5- Composição química da solução de elementos traços .......................................... 14
Quadro 6- Composição do Meio GPY líquido para manutenção das cepas .......................... 15
iv
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 01- Estequiometria da fermentação alcoólica e dos açúcares redutores .................... 6

Equação 02- Velocidade específica de crescimento celular .................................................... 18
Equação 03- Velocidade específica de produto ...................................................................... 18
Equação 04- Fator de conversão do substrato em células ....................................................... 18
Equação 05- Fator de conversão do substrato em produto ...................................................... 19
Equação 06- Produtividade do produto final .......................................................................... 19
Equação 07- Rendimento prático ........................................................................................... 20
Equação 08- Rendimento teórico ............................................................................................ 20
Equação 09- Eficiência fermentativa ...................................................................................... 20
v
DE MOURA, A.C.B1; CAETANO, B.M.M1;. AVALIAÇÃO DO PROCESSO

FERMENTATIVO EM CO-CULTURA COM DIFERENTES ESPÉCIES DE
Saccharomyces EM MOSTO SINTÉTICO DE UVA. Trabalho de Conclusão de Curso –
Curso de Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Goiás.
RESUMO
O consumo de vinhos no mundo vem se elevando gradativamente, assim como as
exigências dos consumidores e busca por produtos de altíssima qualidade. Desta forma, as
indústrias vinícolas têm buscado estratégias para o desenvolvimento de vinhos com maior
quantidade de glicerol e redução do teor alcoólico, sendo vinhos mais encorpados e mais
suaves, geralmente aromáticos, características sensoriais de grande apreço por parte dos
consumidores. Neste contexto, foi proposto um delineamento de mistura com quatro cepas
diferentes, sendo duas delas Saccharomyces cerevisiae (MONASTRELL e T73), além da
Saccharomyces kudriavzevii (CR85) e Saccharomyces uvarum (BMV58), visando analisar o
comportamento de cada cepa individualmente e também em co-culturas, identificando
interações entre elas, a partir das respostas dos parâmetros cinéticos (etanol, glicerol, ácido
acético, açúcares residuais e biomassa). O estudo mostrou que as características inerentes das
leveduras e a proporção que as mesmas são analisadas podem influenciar diretamente no
comportamento dos parâmetros cinéticos do cultivo. Apresenta, ainda, de forma detalhada a
cinética de crescimento, consumo de substrato e produção de etanol e metabólitos secundários
de cepas que não haviam sido estudadas anteriormente, como é o caso da BMV58,
recentemente descoberta no ramo da vitivinicultura. A partir do delineamento de mistura,
observou-se que as combinações com três cepas obtiveram os melhores resultados para o
alcance dos objetivos deste trabalho.
Palavras-chave: Vinho, MONASTRELL, BMV58, T73, CR85, Parâmetros

Cinéticos, Fermentação.
vi
ABSTRACT
The consumption of wines in the world has been increasing gradually, as well as the
demands of consumers and search for products of the highest quality. In this way, the wine
industry has sought strategies for the development of wines with a higher amount of glycerol
and a reduction in alcohol content, being wines that are fuller and softer, generally aromatic,
sensorial characteristics that are highly appreciated by consumers. In this context, an
experimental design was proposed from the design of the mixture with four different strains,
two of them Saccharomyces cerevisiae (MONASTRELL and T73), Saccharomyces
kudriavzevii (CR85) and Saccharomyces uvarum (BMV58), in order to analyze the behavior
of each (ethanol, glycerol, acetic acid, residual sugars and biomass), and to identify
interactions among them. The study showed that the inherent characteristics of the yeasts and
the proportion that they are analyzed can directly influence the behavior of the kinetic
parameters of the culture. It also presents in detail the kinetics of growth, substrate
consumption and ethanol production and secondary metabolites of strains that had not been
studied previously, as is the case of BMV58, recently discovered in the wine sector. From the
design of the mixture, it was observed that the combinations with three strains obtained the
best results to reach the objectives of this work.
Key words: Wine, MONASTRELL, BMV58, T73, CR85, Kinetic Parameters,

Fermentation.
1
1. INTRODUÇÃO
O vinho é um produto único que resulta das interações complexas entre fungos
filamentosos, bactérias e leveduras, desde a vinha até ao armazenamento, passando pelo
processo de fermentação (FLEET, 2003). Esta bebida, é um produto natural, fruto de reações
bioquímicas, que se iniciam durante a maturação da uva e se estendem até ao engarrafamento
(ROMANO et al., 2003).
Processo tradicional de obtenção do vinho, a fermentação natural (espontânea) do
mosto de uva é realizada por uma sequência de diferentes espécies de leveduras. Inúmeras
leveduras, como as do gênero Saccharomyces, Kloeckera, Candida, Hansenula,
Hanseniospora, Pichia, Zigossacharomyces, entre outras, fazem parte da microflora da uva e
podem iniciar a fermentação (HEARD; FLEET, 1986).
O crescimento destas leveduras durante a fermentação é influenciado por diferentes
fatores como pH, concentração de nitrogênio e açúcar, concentração de SO2, conteúdo de
álcool e ainda pela temperatura de fermentação (HEARD; FLEET, 1988).
Os processos mais importantes na produção de vinho são a fermentação alcoólica,
conduzida pelas leveduras, e a fermentação malolática, conduzida pelas bactérias láticas
(GENISHEVA et al., 2014). Durante a fermentação alcoólica os açúcares do mosto de uva,
nomeadamente a glucose e a frutose, são transformados, em sua maioria, em etanol, glicerol e
dióxido de carbono (ARANDA et al., 2005). A fermentação malolática, atua como uma
segunda fermentação, que reduz a acidez e leva a uma maior estabilidade a nível biológico
dos vinhos, além de aumentar as características organolépticas deste produto (LONVAUD-
FUNEL, 1999; VERSARI et al., 1999; FUGELSANG e EDWARDS, 2007; LERM et al.,
2010) .
Assim, as principais leveduras causadoras de alterações no vinho são as pertencentes
aos géneros Brettanomyces/Dekkera, Candida, Hanseniaspora, Pichia, Saccharomycodes,
Schizosaccharomyces e Zygosaccharomyces (LOUREIRO; FERREIRA, 2003). Os efeitos
comuns de contaminação são a formação de filmes nos vinhos armazenados, turvação,
produção de sedimentos e gases em vinhos engarrafados e aparecimento de odores e aromas
estranhos (TOIT et al., 2000; LOUREIRO et al., 2003).
Sacharomyces cerevisiae é a levedura dominante ao longo do processo de
fermentação e só é associada a levedura de contaminação quando existe uma re-fermentação
em vinhos engarrafados (LOUREIRO E MALFEITO-FERREIRA, 2003; ENRIQUE et al.,
2007; RODRIGUEZ et al., 2013).
2
As leveduras do gênero Saccharomyces são resistentes a altas concentrações de

etanol e por isso dominam a fermentação alcoólica de mosto de uva para produção de vinho.
Já as leveduras do gênero Kloeckera, Candida, Hanseniospora, Hansenula, Pichia e
Kluyveromyces, comuns a microflora da uva, são menos resistentes ao etanol e morrem no
terceiro ou quarto dia de fermentação (FLEET; HEARD, 1994). Embora estas leveduras
participem apenas do início da fermentação, elas produzem compostos de aroma que têm
grande contribuição para a qualidade sensorial do vinho. Por isso, o estudo das propriedades
metabólicas e fisiológicas das leveduras não-Saccharomyces cerevisiae pode ser importante
para a indústria de vinhos.
As co-culturas são definidas como a incubação anaeróbica ou aeróbica de diferentes
cepas microbianas especificadas em condições assépticas. Já as culturas mistas podem ser
definidas como a incubação anaeróbica ou aeróbica de diferentes microrganismos, por vezes
não especificados e podem ser conduzidas em condições sépticas. Onde, a degradação e
metabolização dos substratos se dão devido a atividade metabólica combinada, ou não, das
cepas microbianas (JUNIOR,2018). O desenvolvimento de qualquer produto envolvendo mais
de um ingrediente requer algumas formas particulares de experimentos para a mistura
(THONSON, 1981).
Delineamentos para mistura são empregados em vários experimentos para o
desenvolvimento de produtos. Onde os componentes são misturados em várias proporções e
as respostas dependem, somente, das proporções dos componentes presentes na mistura e não
da quantidade absoluta na mistura (CORNELL, 2002). A partir de um delineamento de
misturas, pode-se verificar como as propriedades de interesse são afetadas pela variação das
proporções dos componentes da mistura (ALEXANDRE et al., 2001; SCHABBACH et al.,
2003).
3
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o processo fermentativo em mosto sintético de uva utilizando culturas puras

e mistas com as leveduras Saccharomyces cerevisiae (MONASTRELL e T73),
Saccharomyces kudriavzevii (CR85) e Saccharomyces uvarum (BMV58).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Avaliar o comportamento cinético de culturas puras e mistas quanto à produção de

etanol, biomassa, glicerol, ácido acético e consumo de glicose e frutose;
 Avaliar a interação das leveduras a partir do delineamento de misturas;
 Sugerir a partir dos resultados das fermentações a melhor combinação de acordo com
os teores de ácido acético, glicerol e etanol, visando a produção de vinhos de excelente
qualidade para o consumidor final;
 Determinar parâmetros fermentativos (Fator de conversão de Substrato em Produto,
Velocidade Específica, Produtividade e Eficiência Fermentativa), para culturas puras e
mistas.
4
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A formação de vinho a partir de mosto de uva é um processo realizado por leveduras,

principalmente pela espécie Sacharomyces cerevisiae. Existe uma fermentação alcoólica
transformando os açúcares simples presentes na uva, principalmente glicose e frutose, em
concentrações semelhantes, em etanol, CO2, glicerol, álcoois e ésteres superiores. S.
cerevisiae, além de ser a espécie majoritária responsável pela realização da fermentação do
vinho, é a espécie mais estudada (PRETORIUS, 2000).
No entanto, outras espécies do gênero Saccharomyces, como S. cerevisiae, S. uvarum
e S. kudriavzevii, também foram descritos como capazes de fermentar o mosto no vinho
(RUIZ, 2016).
3.1 VINHO
A produção de fermentados alcoólicos a partir de frutas é uma alternativa atrativa

para indústria de alimentos, esse tipo de bebida tem recebido forte aceitação por parte dos
consumidores (DIAS et al., 2003; SANDHU; JOSHI, 1995;). Além disso, a utilização de
sucos de frutas para elaboração de bebidas alcoólicas é uma forma de aproveitamento com o
intuito de evitar o desperdício, contribuindo para a redução de perdas pós-colheita de frutos
perecíveis e agregando valor às bebidas regionais (ASQUIERI et al., 2009).
Tradicionalmente, são empregados uvas e maçãs na obtenção de bebidas fermentadas
(MUNIZ et al., 2002).
O vinho é um produto natural, fruto de reações bioquímicas, que se iniciam durante a
maturação da uva e se estendem até ao engarrafamento (ROMANO et al., 2003). É uma
bebida de composição complexa, devido às transformações biológicas, químicas, físicas e
enzimáticas que ocorrem em seu processamento (ZOECKLEIN et al., 1994). Entre os fatores
naturais, a safra vitícola exerce influência preponderante na qualidade da uva e,
consequentemente, do vinho. Cada safra apresenta peculiaridades específicas. Assim, para
uma mesma cultivar, as condições climáticas do período de maturação da uva podem
antecipar ou retardar a colheita, influir nas concentrações de açúcar e de ácidos orgânicos, no
teor de compostos voláteis e de compostos fenólicos da uva (CHAMPAGNOL, 1984).
Processo tradicional de obtenção do vinho, a fermentação natural (espontânea) do
mosto de uva é realizada por uma sequência de diferentes espécies de leveduras (HEARD;
FLEET 1986), que fazem parte da microflora da uva e podem iniciar a fermentação. O
5
crescimento destas leveduras durante a fermentação é influenciado por diferentes fatores

como pH, concentração de nitrogênio e açúcar, concentração de SO2, conteúdo de álcool e
ainda pela temperatura de fermentação (HEARD; FLEET 1988).
3.2 PROCESSO FERMENTATIVO
O processo fermentativo é uma das reações bioquímicas conhecidas pelo homem

desde a antiguidade. No Egito antigo, em torno de 5.000 a.C., já se usava a fermentação,
porém, sem conhecimento científico sobre o processo. Os primeiros produtos eram feitos a
partir da fermentação natural de sucos de frutas, que deram origem aos primeiros tipos de
vinhos, desde então as bebidas alcoólicas podem ser obtidas de fontes naturais de açúcares e
amiláceos, como frutas, cana-de-açúcar, dentre outros (AQUARONE et al., 2001; GAVA et
al., 2008).
Apesar do processo fermentativo ser utilizado desde a antiguidade, foi em 1860 que
o químico francês Louis Pasteur demonstrou cientificamente que a fermentação alcoólica
ocorria devido as células de levedura (BARNETT, 2003). Com o advento dos estudos a
fermentação alcoólica, ao final do século XIX, a produção de etanol já era um processo
amplamente utilizado, inclusive para fins combustíveis; tanto que Henry Ford, pioneiro da
indústria automobilística, projetou automóveis para rodar com etanol (SONGSTAD et al.,
2009). A fermentação alcoólica é um processo catabólico e anaeróbico que não envolve
cadeia respiratória ou citocromos. Nesse processo ocorre a degradação de moléculas de açúcar
(glicose ou frutose), no interior da célula de um microrganismo (leveduras ou bactéria) até a
formação de etanol e dióxido de carbono, havendo liberação de energia química e térmica.
Além de diversas outras reações e transformações que ocorrem no mosto, acabando por
produzir um caldo alcoólico muito aromatizado (NELSON; COX, 2014; RODRÍGUEZ-
BENCOMO, 2012).
3.3 PARÂMETROS DE CONTROLE DA FERMENTAÇÃO ALCÓOLICA
Para a avaliação e o controle do processo fermentativo, é necessário o

acompanhamento por meio dos parâmetros cinéticos. Através deste estudo é possível
comparar os cultivos, conhecer as condições favoráveis e, ainda, determinar as velocidades de
transformações que ocorrem durante os processos fermentativos, como o consumo de
substratos, acúmulo de produtos e de biomassa (VIEIRA; FERNANDES, 2012)
6
Velocidade específica de transformação é o grande incentivo em que se baseiam

várias investigações cinéticas fermentativas, as quais buscam entender e prever a velocidade
de transformação do substrato em produto e biomassa ao decorrer da fermentação.
Normalmente, esses estudos focam em determinada fase do crescimento, sempre observando
o comportamento do crescimento do microrganismo e geração de produto desejado
(SANTOS, 2017).
Produtividade é a velocidade com que o etanol é produzido, relacionando sua
concentração no vinho pela unidade de tempo.
Eficiência de fermentação ou rendimento (%), relaciona o álcool produzido com o
teórico, isto é, com o que deveria ser produzido, em função do teor de açúcares totais
existentes no mosto. Em anaerobiose as leveduras fermentam o açúcar redutor em etanol e
CO2 (NELSON; COX, 2011). A estequiometria da fermentação alcoólica e dos açúcares
redutores segundo pesquisadores como Gay-Lussac (1815), Louis Pasteur (1863) e Harrison
(1970) é representada pela Equação 01:
C6H12O6 (açucares redutores)  2CH3CH2OH + 2CO2 Equação 01
A equação estequiométrica serve de base ao cálculo de rendimento. Para Gay-Lussac

(1815) 100 g de açúcar redutor deve produzir 51,1 g de etanol e 48,9 de CO2.
O fator de conversão do substrato em células (YX/S), definido por Monod (1949),
permite calcular a quantidade celular produzida por grama de substrato consumido. Quando
conhecido o valor de (YX/S), é possível calcular o valor de biomassa (X), a partir de um valor
conhecido de substrato (S) e vice-versa. Enquanto que, o fator de conversão do substrato em
produto (YP/S) é definido como quantidade de substrato consumido por grama de produto
produzido (SANTOS, 2017).
3.4 LEVEDURAS
Leveduras são fungos conhecidos como fermentos e apresentam forma unicelular

(GAVA; SILVA; FRIAS, 2008). Conhecidos como agentes biologicamente ativos,
responsáveis pela fermentação alcoólica, são definidas como fungos, heterotróficos,
unicelular, aclorofilados, organismos facultativos por apresentarem metabolismos anaeróbico
e aeróbico (MENEZES, 1980; DIJKEN, 1986; SANTOS et al., 2012). Em anaerobiose,
7
fermentam, com a formação de pouca biomassa e muito etanol, enquanto que, em aerobiose
seu metabolismo é destinado ao crescimento celular.
Dependendo do meio de cultivo, as leveduras apresentam dimensões e formas
variáveis, como ovoides, esféricas ou elipsoidais (PELCZAR JUNIOR et al., 1996). Podem
ser visualizadas isoladas, em pares, cadeia ou cachos. Reproduzem-se vegetativamente por
gemulação, formam esporos ovoides ou esféricos e fermentam vigorosamente (TORTORA et
al., 2012).
A escolha da linhagem apropriada para o processo é de importância fundamental
para o êxito da fermentação. É de grande valia as linhagens que apresentam características
fermentativas, tais como: boa eficiência fermentativa, elevada velocidade de fermentação,
resistência a etanol, eficiência de conversão, resistência a pH baixo, resistência a antissépticos
e estabilidade genética para que as qualidades das leveduras sejam mantidas durante
sucessivos reusos (MENEZES, 1980; SANTOS et al., 2012).
A abordagem do estudo de delineamento de mistura com mosto sintético de uva,
utilizará leveduras do gênero Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum e
Saccharomyces kudriavzevii, analisando os parâmetros cinéticos e fisiológicos das leveduras.
3.4.1 Saccharomyces cerevisiae
A Saccharomyces cerevisiae e a espécie de leveduras mais pesquisada e usada para a

produção de etanol, seguida pela bactéria Zymomonas mobilis (MENEZES, 1980; BAI et al.,
2008; SANTOS et al., 2012). Frequentemente associada à obtenção de bebidas alcoólicas,
etanol combustível e, também, na produção de leveduras destinada à panificação (SANTOS et
al., 2012).
Numerosos levantamentos de habitats de levedura por muitos investigadores
mostraram que as espécies de levedura não são distribuídas aleatoriamente na natureza, mas,
geralmente, têm habitats altamente específicos e, frequentemente, associados com sua fonte
de energia. S. cerevisiae é encontrada em bebidas fermentadas como vinho e cervejas, em
pães, em vegetais, e em tantos outros (PHAFF, 2001; PÉTER; ROSA, 2005). Além de etanol
e CO2, vários subprodutos também são produzidos durante a fermentação alcoólica. O
glicerol, produzido a um nível de cerca de 1,0% (p/v) para a maioria das fermentações com
etanol, é o principal destes subprodutos (LIU et al., 2008).
A produção do glicerol na fermentação é uma forma de satisfazer o balanço redox
durante o crescimento sob condições anaeróbicas, uma vez que oxidam enzimaticamente o
8
NADH intracelular a NAD+. Assim, além dessa biomolécula servir como osmorregulador
para as leveduras (VAN DIJKEN e SCHEIRS, 1986), a biossíntese de glicerol em condições
anaeróbias, está principalmente ligada ao metabolismo redox (VAN GULIK e HEIJNEN,
1995).
S. cerevisiae, são bem conhecidas pela sua capacidade de produzir ácido acético sob
condições aeróbias e anaeróbias (PÉTER; ROSA, 2005). Em S. cerevisiae, o metabolismo
adicional do ácido acético é de extrema importância, uma vez que através da acetil-CoA
sintetase, sendo ela a única fonte de acetil-CoA citosólica, produz esse ácido como
componente essencial da biossíntese de ácidos graxos para a levedura (BERG, VAN DEN;
STEENSMA, 1995). Quando o acetaldeído é convertido em ácido acético, produz-se um
excedente redutor. A formação de tal produto levanta um problema adicional no balanço
redox, mais uma vez solucionado pela produção de glicerol (PÉTER; ROSA, 2005).
3.4.2 Saccharomyces kudriavzevii
A levedura S. kudriavzevii tem sido principalmente isolada em ambientes naturais e

matéria orgânica, como folhas em decomposição e em amostragens ambientais recentes, S.
kudriavzevii foi associada a árvores de carvalho em simpatizantes associações com S.
cerevisiae em todo território do Mediterrâneo. Contudo, é importante observar que S.
kudriavzevii nunca foi descrita em vinícolas e só foi isolado de habitats naturais no Japão. Se
esses híbridos são originários de eventos ocorridos no ambiente de produção ou na natureza,
se desconhece (SAMPAIO; GONÇALVES 2008; GONZÁLEZ et al., 2007; NAUMOV et al.,
2000).
O maior problema que enfrentam as espécies S. kudriavzevii e S. uvarum, é a
dificuldade em realizar a fermentação com cepas puras por elas mesmas, contando que no fato
de esta fermentação ocorrer, apresente uma microbiota natural que contenha estirpes de S.
cerevisiae que se sobressaiam perante as demais, graças à sua alta capacidade de fermentação
e tolerância ao etanol. A S. kudriavzevii pode respirar mais tempo e também a sua
fermentação não é tão eficaz, por isso requer a via de glicerol para compensar o potencial
redox que ocorre com a glicólise (GONZALÉZ et al., 2007).
Portanto, S. Kudriavzevii aumenta o teor de glicerol e produz uma maior quantidade
de biomassa. Este fato demonstra uma diferença importante na regulação do metabolismo
respiro-fermentativo entre S. cerevisiae e S. kudriavzevii (OLIVEIRA, 2016).
9
3.4.3 Saccharomyces uvarum
A levedura S. bayanus, sinônimo da S. uvarum, é extremamente utilizada na

produção de bebidas pela indústria alimentícia. Podendo ser também utilizada na produção de
biocombustível, devido a sua alta capacidade de fermentação de açúcares (MORAIS,2015)
Segundo Gava, Silva; Frias (2008), algumas variedades, tais como S. cerevisiae, S.
bayanus e S. uvarum, por serem boas produtoras de álcool, são usadas na fabricação de
vinhos. S. uvarum, conhecido no passado como S. carlsbergensis, é usado na fabricação de
cerveja de baixa fermentação (tipo lager).
S. uvarum é capaz de assimilar uma grande variedade de açúcares (glucose, frutose,
maltose, maltotriose, sacarose), e também consegue fermentar o dissacarídeo celobiose
(glicose-galactose) (STEWART e RUSSEL, 1998).
3.5 CO-CULTURAS E CULTURAS MISTAS EM PROCESSOS
Grande parte produtos derivados da biotecnologia industrial são produzidos através

da utilização de uma única espécie microbiana. Porém, existem inúmeros casos em que a
utilização de co-culturas se mostra vantajosa quando comparada a utilização de uma única
cultura (JUNIOR,2018). Isto se dá devido ao potencial sinergético das vias metabólicas de
todas as cepas que são envolvidas no processo utilizando co-culturas (BADER et al., 2010).
A sobrevivência e persistência dessas espécies irão depender de sua co-interação, e
também das condições fermentativas empregadas a elas (JUNIOR,2018).
3.6 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
No intuito de encontrar a combinação ideal, o delineamento experimental se torna

uma ferramenta indispensável. O desenvolvimento da melhor combinação das leveduras
requer de forma particular experimentos de misturas. Delineamento experimental para
misturas sugere proporções de componentes, dos quais, são avaliadas as respostas geradas
frentes as diferentes composições de misturas, permitindo classificar os parâmetros que mais
influenciam nas respostas (CORNELL, 2002).
O planejamento experimental é uma ferramenta poderosa para se chegar às condições
otimizadas de um processo, ao desenvolvimento de formulações dentro das especificações
10
desejadas, ou simplesmente para avaliar os efeitos ou impactos que os fatores têm nas
respostas desejadas (RODRIGUES & IEMMA, 2005).
Diferentemente dos planejamentos tradicionais, nos experimentais para o estudo de
misturas, a variável resposta é função somente das proporções relativas dos ingredientes
presentes na mistura e não da quantidade total da mistura. Além disso, as proporções dos
diversos componentes de uma mistura não são independentes e a soma de todos deve totalizar
sempre 100% (BARROS NETO et al., 1995; ZAUBERAS et al., 2004; CAMPOS et al.,
2007). Pode-se, ainda, estabelecer limites inferiores e superiores das proporções dos
componentes nas misturas (BARROS NETO et al., 1995; ZAUBERAS et al., 2004).
Levando em consideração todas essas informações, a abordagem do estudo de
delineamento de mistura com mosto sintético de uva, utilizará leveduras do gênero
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum e Saccharomyces kudriavzevii, analisando
os parâmetros cinéticos e fisiológicos das leveduras.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
A presente pesquisa foi realizada no Laboratório de Engenharia Bioquímica e

Laboratório LabMulti da Regional Goiânia – Campus Samambaia, localizados na
Universidade Federal de Goiás, Campus Samambaia, em Goiânia.
4.1 MICRORGANISMO
Foram utilizadas espécies isoladas e puras de Saccharomyces, sendo S. cerevisiae

(T73 e MONASTRELL), S. kudriavzevii (CR85) e Saccharomyces uvarum (BMV58),
pertencente ao banco de cepas do LEB – UFG (Laboratório de Engenharia Bioquímica da
Universidade Federal de Goiás) cedidas pelo IATA - Instituto Agroquímica y Tecnología de
Alimentos (Valência, Espanha), e mantidas sob congelamento a 0°C com solução glicerinada
a 15%.
4.2 REPIQUE E MANUTENÇÃO DAS CEPAS
Para o repique das cepas, foi preparado meio GPY sólido, conforme mostra o Quadro
1.
11
Quadro 1 – Composição do Meio GPY sólido para manutenção das cepas.
Componente do meio de manutenção Concentração (g.L-1)
Peptona (HIMEDIA®-RM001) 5
Extrato de Levedura (HIMEDIA®-RM027) 5
D-(+)-Glicose anidra P.A 20
Ágar Tipo 1 (HIMEDIA®-RM666) 20
Foram pesados todos os componentes do Quadro 1, e diluídos em 1L de água

destilada. O meio foi transferido para frascos de 250 mL e esterilizados em autoclave
(QUIMIS®, modelo Q190M23 50L, Diadema, São Paulo). Em seguida, em ambiente estéril
o meio foi vertido em placas de Petri também estéreis e, após a solidificação do meio, se
iniciou o repique das cepas. As leveduras MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 foram
repicadas com o auxílio de uma alça de platina e bico de Bunsen e estriadas em placas
preparadas, como descrito anteriormente. Posteriormente, as placas foram mantidas em estufa
incubadora refrigerada tipo BOD à 30º C por 48 h.
4.3 MOSTO SINTÉTICO
Para o mosto sintético, utilizou-se os componentes descritos no Quadro 2, os quais

foram pesados e diluídos em 1,200 L de água. Ajustou-se o pH da solução com NaOH para
3,3, logo após, adicionou-se 12 mL de solução de soluções vitaminas (Quadro 4), 1,2 mL de
solução de elementos traços (Quadro 5) e 15,708 mL de solução de aminoácidos (Quadro 3),
com base na metodologia de Santos (2017).
Por fim, esterilizou-se o meio por filtração a vácuo com filtro em membrana de 0,2
µm de diâmetros dos poros.
12
Quadro 2- Composição química do mosto sintético de uva.
Componente Concentração (g.L-1 )
Glucose 120
Frutose 120
Acido Málico 6
Acido Citrico 0,6
Acido Tartarico 3,6
Fosfato monopotássico 0,9
Sulfato de potássio 0,6
Sulfato de magnésio 0,3
Cloreto de cálcio 0,186
Cloreto de sódio 0,24
Quadro 3- Composição química da solução de aminoácidos.
Concentração
Componente
(g.L-1 )
D-Biotina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 0,0000375
Cálcio-D-Pantotenato P.A (SIGMA-ALDRICH®) 0,00075
Ácido Nicotínico P.A (SIGMA-ALDRICH®) 0,00075
Myo-Inositol P.A (SIGMA-ALDRICH®) 0,01875
Cloridrato de Tiamina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 0,00075
Cloridrato de Piridoxal P.A (SIGMA-ALDRICH®) 0,00075
Ácido p-Aminobenzóico P.A (SIGMA-ALDRICH®) 0,00015

13
Quadro 4- Composição química da solução de vitaminas.
Concentração
Componente
(g.L-1 )
Tirosina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 0,7433
Isoleucina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 1,7267
.A (SIGMA-ALDRICH®) 4,1133
.A (SIGMA-ALDRICH® 4,400
Arginina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 1,7967
Leucina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 3,3667
L-Treonina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 0,1633
Glicina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 3,1833
Alanina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 2,9300
Valina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 2,8433
Metionina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 0,3633
Fenilalanina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 1,7333
Serina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 2,2000
Histidina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 0,6600
Lisina P.A (SIGMA-ALDRICH®) 1,1833

14
Quadro 5- Composição química da solução de elementos traço.
Concentração
Componente
(g.L-1 )
EDTA Sal Dissódico P.A (VETEC®) 0,00505
Sulfato de Zinco Heptahidratado P.A (NEON®) 0,001515
Cloreto de Maganêns (II) P.A (NEON®) 0,000336667
Cloreto de Cobalto Hexahidratado P.A (VETEC®) 0,000101
Sulfato de Cobre II P.A (NEON®) 0,000101
Molibidato de Sódio Dihidratado P.A (NEON®) 0 0,000134667
Cloreto de Cálcio Dihidratado P.A (VETEC®) 0,001515
Sulfato de Ferro II P.A (VETEC®) 0,00101
Ácido bórico P.A (VETEC®) 0,000336667
Iodeto de Potássio P.A (VETEC®) 3,36667E-05

15
4.4 PREPARO DO INÓCULO
Após a manutenção e crescimento das colônias, as placas foram retiradas da BOD e

levadas à capela de fluxo laminar, onde, com o auxílio de uma alça de platina, foi feita a
raspagem superficial das colônias, obtendo a maior quantidade possível de biomassa para o
preparo do inóculo em tubos de Falcon contendo 5 mL de meio de cultivo líquido GPY
(Quadro 6), identificados com o código de cada cepa.
Quadro 6- Composição do Meio GPY líquido para manutenção das cepas.
Componente do meio de manutenção Concentração (g.L-1)
Peptona (HIMEDIA®-RM001) 5
Extrato de Levedura (HIMEDIA®-RM027) 5
D-(+)-Glicose anidra P.A 20
Em seguida, os tubos foram incubados a 30ºC por 24 h. Após a agitação, os tubos

foram retirados e centrifugados (FANEN, modelo, EXCELSA® II 206 BL, São Paulo, São
Paulo) a 8000 rpm por 2 min, o sobrenadante foi descartado e a biomassa, acumulada no
fundo do tubo, foi ressuspendida com 1mL de água estéril. Em seguida, procedeu-se, em
espectrofotômetro, o ajuste da densidade ótica da biomassa de cada cepa, para assim se
determinar os valores a serem inoculados na fermentação.
4.5 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Desenvolveu-se um delineamento de misturas simplex-centróide das leveduras do

tipo MONASTRELL (X1), T73 (X2), BMV58 (X3) e CR85 (X4), com o número de
combinações igual a 2n-1, n e “n” e n e nú e e v ve n
central.
Em resposta a este delineamento, obteve-se a produção de etanol, glicerol, ácido
acético e biomassa, bem como, resposta para sacarose e frutose residual. A Tabela 1
apresenta os níveis codificados e reais das variáveis estudadas. O delineamento, para os
quatros componentes, foi composto de 15 ensaios feitos em triplicata.
16
Tabela 1 - Planejamento experimental de misturas simplex-centróide para quatro componentes 2n -1 mais um

ponto central.
Níveis das variáveis independentes codificadas e reais
MONASTRELL
N° do Ensaio (g.L-1 ) T73 (g.L-1 ) BMV58 (g.L-1 ) CR85 (g.L-1 )
1 1 (0,075) 0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0,00)
2 0 (0,00) 1 (0,084) 0 (0,00) 0 (0,00)
3 0 (0,00) 0 (0,00) 1 (0,19) 0 (0,00)
4 0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0,00) 1 (0,198)
5 0,5 (0,0375) 0,5 (0,042) 0 (0,00) 0 (0,00)
6 0,5 (0,0375) 0 (0,00) 0,5 (0,0545) 0 (0,00)
7 0,5 (0,0375) 0 (0,00) 0 (0,00) 0,5 (0,099)
8 0 (0,00) 0,5 (0,042) 0,5 (0,0545) 0 (0,00)
9 0 (0,00) 0,5 (0,042) 0 (0,00) 0,5 (0,099)
10 0 (0,00) 0 (0,00) 0,5 (0,0545) 0,5 (0,099)
11 0,33 (0,025) 0,33 ( 0,028) 0,33 (0,03633) 0 (0,00)
12 0,33 (0,025) 0,33 ( 0,028) 0 (0,00) 0,33 (0,066)
13 0,33 (0,025) 0 (0,00) 0,33 (0,03633) 0,33 (0,066)
14 0 (0,00) 0,33 ( 0,028) 0,33 (0,03633) 0,33 (0,066)
15 0,25 ( 0,01875) 0,25 (0,021) 0,25 (0,02725) 0,25 (0,0495)
4.6 FERMENTAÇÃO
A concentração de inóculo foi fixada de acordo com o planejamento experimental

apresentado na Tabela 1. As fermentações com a quantidade de inóculo determinada pelo
delineamento experimental foram realizadas em tubos de Falcon de 50 mL e volume útil de
20 mL. O meio de cultivo está descrito no item 4.4.
Realizou-se a fermentação a 30°C e 150 rpm, com os tubos inclinados a 45°,
periodicamente foram feitas coletas para o acompanhamento da fermentação.
17
4.7 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR
A determinação da concentração celular foi realizada por espectrofotometria, através

da leitura da absorbância do meio de cultura a 600 nm, utilizando espectrofotômetro
(BIOSPECTRO®, modelo SP – 220 – UV, Curitiba, Paraná). Todas as amostras foram
diluídas e homogeneizadas em vórtex por 15 segundos e colocadas em cubetas de vidro para
leitura da absorbância.
4.8 DETERMINAÇÃO DE ETANOL, FRUTOSE, GLICOSE, GLICEROL E

ÁCIDO ACÉTICO
A partir das coletas realizadas no decorrer da fermentação, retirou-se alíquotas de

500 μ , centrifugando-a a 8.000 rpm por 2 min, sendo que, a biomassa era descartada e o
sobrenadante analisado por CLAE, em um cromatógrafo Thermo (Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA) equipado com um detector de índice de refração e ultravioleta. A coluna usada
foi a HyperREZTM XP Carboidratos H+8µm (Thermo Fisher Scientific), protegido por
HyperREZTM XP Carboidratos (Thermo Fisher Scientific).
As condições usadas nas análises foram: eluente 1,5 mM de H2SO4, fluxo de 0,6 mL
min-1 e temperatura de 50ºC. Diluiu-se as amostras cinco vezes, sendo, posteriormente,
filtradas em filtro de nylon de 0,22 mícrons (Symta, Madrid, Espanha) e analisadas em
triplicata. As análises de etanol, sacarose, glicerol e ácido acético ocorreram nos tempos 0, 36,
60, 89, 109, 159 e 236 horas.
4.9 CÁLCULOS DOS PARÂMETROS CINÉTICOS DA FERMENTAÇÃO
4.9.1 Velocidades específicas de transformação (h-1)
Para o cálculo da velocidade específica de crescimento celular (µXmáx) foram

consideradas as concentrações celulares obtidas durante as 236 horas de fermentação. Para as
velocidades específicas de formação de produto (µPmáx), foi considerado, a concentração de
etanol, o produto principal. Para isso,utilizou-se a Equação 02 e Equação 03, a seguir:
18
Equação 02
Equação 03
Na qual:
: Concentração celular no início do intervalo analisado (g.L-1);
: Concentração celular no final do intervalo analisado (g.L-1);
: Concentração de etanol no início do intervalo analisado (g.L-1);
: Concentração de etanol no final do intervalo analisado (g.L-1);
: Instante inicial do intervalo analisado (h);
: Instante final do intervalo analisado (h);
Com o intuito de calcular e produzir gráficos, foram utilizados os softwares Statistica

7.0 e Microsoft Excel 2013.
4.9.2 Fator de conversão de substrato a células (YX/S)
O fator de conversão do substrato em células (YX/S) foi calculado pela diferença entre
concentrações iniciais de biomassa e substrato, utilizou-se a Equação 04:
Equação 04
Na qual:
: Concentração celular inicial (g.L-1);
: Concentração celular final (g.L-1);
: Concentração inicial do substrato (g.L-1);
: Concentração residual do substrato (g.L-1);
19
4.9.3 Fator de conversão do substrato em produto (YP/S)
O fator de conversão do substrato em produto (YP/S) foi calculado pela diferença

entre concentrações inicias de produto e substrato (Equação 05):
Equação 05
Na qual:
: Concentração final de etanol (g.L-1 );
: Concentração inicial de etanol (g.L-1 );
: Concentração de açúcar final (g.L-1 );
: Concentração inicial de açúcar (g.L-1 );
4.9.4 Produtividade do produto (g.L-1.h-1 )
A produtividade do produto principal, etanol, foi calculada a partir das

concentrações, inicial e final, de etanol dividido pelo tempo total da fermentação (Equação
06):
Produtividade do produto= Equação 06
Na qual:
: Concentração de etanol inicial (g.L-1.h-1 );
: Concentração de etanol final (g.L-1.h-1 );
: Tempo total de fermentação (h);
P: Produtividade (g.L-1.h-1 )
4.9.5 Rendimento da fermentação (%)
O rendimento da fermentação foi calculado a partir do rendimento teórico de Gay-

Lussac (1815) e rendimento prático obtido. A partir da massa de etanol obtida no final da
20
fermentação, dividida pela quantidade de açúcares redutores totais, obtendo o rendimento

prático a partir da Equação 07.
Rendimento prático (Yp)= x 100 Equação 07
O rendimento teórico, baseado na estequiometria de Gay-Lussac (1815), em que a

cada 100 g de glicose e frutose, 51,11 g de etanol é formado, assim tem-se a Equação 09 :
Rendimento teórico (Yt)= x 100 = 51,11% Equação 08
Sendo assim, a eficiência fermentativa foi calculada pela Equação 09:
x100 Equação 09
A unidade de medida de etanol %(V/V) , corresponde ao volume de etanol em mL

para 100 mL de solução.
O rendimento é calculado pela massa de etanol, conhecendo a densidade do etanol a
20ºC que é de 0,789 g.mL-1, multiplicou-se o volume correspondente ao %(V/V) pela
densidade e foi encontrada a quantidade de massa de etanol em 100 mL de mosto.
21
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Conforme reportado, este trabalho buscou a estratégia de co-cultura para fermentação

do mosto sintético de uva com diferentes espécies de Saccharomyces, visando determinar a
melhor combinação de leveduras para produção de vinhos que atendam as exigências do
consumidor. Foram realizados, ainda, testes utilizando combinação entre leveduras a fim de
verificar, a partir da caracterização do mosto, qual produziria melhor associação de
parâmetros cinéticos de acordo com os teores de biomassa, ácido acético, glicerol e etanol.
5.1 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS DO PLANEJAMENTO

EXPERIMENTAL DE MISTURA
Buscando facilitar a compreensão dos resultados sobre os 15 ensaios do

planejamento experimental de mistura e suas respectivas discussões, agrupou-se e avaliou-se
tais ensaios em três diferentes grupos. O primeiro agrupamento de dados foi constituído pelos
ensaios que continham apenas uma cepa, correspondendo aos ensaios 1 ao 4. O segundo
agrupamento de resultados foi integrado pelos ensaios com a combinação de duas cepas,
correspondendo aos ensaios 5 ao 10. O terceiro agrupamento de resultados foram
experimentos com 3 e 4 cepas, correspondendo os ensaios 11 ao 15. E, por fim, realizou-se
uma avaliação e discussão geral incluindo os 15 ensaios.
5.1.1 Avaliação dos Parâmetros Cinéticos dos ensaios com uma cepa.
Com o intuito de compreender o comportamento cinético e fisiológico de cada levedura

separadamente, avaliou-se, nesta parcela do estudo, ensaios constituídos por apenas uma
levedura em cada experimento (Ensaios 1 ao 4) das linhagens MONASTRELL, T73, BMV58
e CR85 quanto a resposta produção de biomassa, etanol, ácido acético, glicerol e consumo de
frutose e glicose.
As curvas de fermentação obtidas das culturas individuais das leveduras
MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 são ilustradas na Figura 1, a seguir, em que mostra a
cinética de crescimento das leveduras durante 236 horas de fermentação.
22
Figura 01 - Resultados de Crescimento Celular (A), Glicose Residual (B), Frutose Residual (C), Formação de
Etanol (D), Glicerol (E) e Ácido Acético (F) nos Ensaios 1 ao 4 em culturas puras com as leveduras
MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 durante 236h h de fermentação.
Média Concentração Celular(g/L) 2,5 A

2
1,5
100% Monastrell
1 100% T73
100% BMV58
0,5 100% CR85
0
0 40 80 120 160 200 240
Tempo (h)
100
B
80
Média Glicose (g/L)
60
100% Monastrell
40 100% T73
100% BMV58
100% CR85
20
0
0 36 60 89 109 159 236
Tempo de fermentação (horas)
23
140
C
120 100% Monastrell
Média Frutose (g/L)
100
100% T73
80
100% BMV58
60
40 100% CR85
20
0
0 36 60 89 109 159 236
10 D
Média Etanol Produzido(%V.V)
6
100% Monastrell
4 100% T73
100% BMV58
2
100% CR85
0
0 36 60 89 109 159 236
24
10 E
Média Glicerol Produzido(mg/L) 9
8
7
6
5 100% Monastrell
4 100% T73
3 100% BMV58
2 100% CR85
1
0
0 36 60 89 109 159 236
F
1200
Média Ácido Acético Produzido(mg/L)
900
600 100% Monastrell

100% T73
100% BMV58
300 100% CR85
0
0 36 60 89 109 159 236
Na Figura 1-A, observa-se o perfil de crescimento das leveduras separadamente,

sendo possível verificar que a MONASTRELL foi a levedura que obteve maior crescimento
enquanto que a CR85 obteve o pior resultado referente à concentração celular e formação de
biomassa. Na fase Lag ou fase de latência o crescimento celular é nulo devido à adaptação das
células. Esta fase praticamente não foi observada neste trabalho, devido ao meio de cultivo ser
idêntico ao utilizado no preparo do pré-inóculo. A segunda fase, a fase logarítmica, foi
observada nas primeiras 36 horas. Nesta fase, a curva apresenta inclinação acentuada
atribuída a fatores e condições favoráveis ao metabolismo, onde a formação de unidades
25
funcionais celulares é máxima. Após esta etapa, nota-se a desaceleração do crescimento, até o
fim do processo fermentativo.
O consumo do substrato é destinado à produção de biomassa, etanol e outros
bioprodutos secundários, e decai durante a fermentação (MENEZES, 1980; LIMA et al.,
2001). As Figuras 1-B e 1-C apresentam as concentrações de glicose e frutose residuais,
respectivamente, ao longo do período de fermentação (236h), sendo possível observar o
consumo destes açúcares que agiram como substrato durante o processo fermentativo. A
levedura MONASTRELL foi a maior consumidora de açúcares (glicose e frutose), enquanto
que a CR85 obteve menor consumo. Observa-se claramente como o consumo de glicose na
fermentação é prioritário diante do consumo de frutose. Para todas as cepas o declínio do
substrato foi significativo, no entanto, em 236h de fermentação não houve completo consumo
dos açúcares por parte de nenhuma cepa. Apesar da variação do consumo de substrato entre as
leveduras, os resultados se mostraram melhores do que os reportados na literatura (SANTOS,
2017).
Quanto à produção de etanol, a Figura 1-D mostra a média da porcentagem de
concentração de etanol em 236h de fermentação. Observa-se, claramente, para as leveduras
BMV58 e CR85, que a porcentagem de etanol aumenta mais rapidamente até as primeiras
159h de fermentação e logo desacelera, enquanto que para as leveduras MONASTRELL e
T73 a velocidade de produção se mantém durante as 236 h de fermentação.
No trabalho de SANTOS (2017), usando concentração inicial de 230g/L foram
encontrados resultados de produção de etanol parecidos com a linhagem MONASTRELL do
presente trabalho. Já em relação à cepa CR85 observou-se valores de etanol levemente
inferiores, em torno de 7%(V/V), aos encontrados por CONTRERAS (2016).
De acordo com LIMA et al., (2001) e PÉTER; ROSA, (2005), na sequência de
reações intracelulares para formação de etanol surgem rotas metabólicas alternativas que
propiciam uma maior adaptação da levedura no meio de fermentação, resultando em formação
de glicerol e demais compostos orgânicos secundários.
Estima-se que 5% do açúcar metabolizado pela levedura seja desviado para gerar
produtos secundários da fermentação, resultando num rendimento de 95% em etanol,
conforme já observado por Pasteur em condições adequadas de fermentação (com mostos
sintéticos). Entretanto, em condições industriais, nas quais fatores químicos, físicos e
microbiológicos afetam a levedura, rendimentos de 90% normalmente são obtidos, os que
implicam em desvios de 10% do açúcar processado para a formação de outros produtos que
não o etanol (LIMA et al., 2001).
26
Observa-se, no presente estudo (Figura 1-E) que, ao longo do período de

fermentação, houve produção crescente de glicerol, sobretudo por parte das leveduras BMV58
e CR85. Considerado o mais abundante dos componentes orgânicos secundários da
fermentação, a formação de glicerol, está acoplada à manutenção do equilíbrio redox celular,
o qual é alterado quando da formação de ácidos orgânicos, biomassa e da presença de sulfito
no mosto, sendo assim, atribui-se sua crescente produção, à intensa formação de biomassa
(BORZANI et al., 2001; PÉTER; ROSA, 2005).
Outro produto secundário da fermentação alcoólica é o ácido acético (PÉTER;
ROSA, 2005). Considerado o componente essencial da biosíntese de ácidos graxos,
especialmente para a S. cerevisiae, o metabolismo adicional do ácido acético é de extrema
importância para a levedura (BERG, VAN DEN; STEENSMA, 1995).
Observa-se, na Tabela 2, a seguir, a relação direta e significativa entre a formação de
biomassa e síntese de ácido acético, sendo que no ensaio com CR85 onde a quantidade de
biomassa produzida foi relativamente menor, também houve pouca produção de ácido acético,
de igual forma, nota-se que no ensaio com a levedura MONASTRELL, esta cepa produziu
maior quantidade de levedura bem como de ácido acético.
A levedura MONASTRELL apresentou, ainda, maior fator de conversão de substrato
em biomassa, enquanto que a BMV58, por sua vez, obteve menor fator de conversão substrato
em biomassa. Com relação à velocidade específica de crescimento, não houve diferença
significativa entre os 4 ensaios apresentados.
Além de apresentar a maior quantidade de biomassa, esse ensaio obteve a maior
concentração de etanol final, em torno de 9 % (v/v), porém, esperava-se um maior teor
alcoólico. Tal fato pode ser explicado pelo alto teor de ácido acético produzido,
provavelmente, por parte do substrato em um desvio de sua rota metabólica, visto que, esse
ácido é precursor da síntese de biomassa.
A fim de verificar o desvio da rota metabólica para a síntese de etanol, considera-se
fatores como eficiência fermentativa, YP/S e produtividade com relação a etanol (MORAIS,
2013).
Sendo assim, pôde-se confirmar um moderado desvio da rota etanólica ao constatar
que a eficiência fermentativa e fator de conversão de substrato em produto, isto é, a
produtividade de etanol atingiram 70,61 % e 0,456 gEtanol.g-1, respectivamente, com taxa de
transformação máxima de 0,332 h-1 e produtividade de 0,306 g.L-1.h-1. de etanol. Tal desvio
também foi confirmado por SANTOS o qual obteve, para a levedura MONASTRELL,
eficiência fermentativa e produtividade de etanol em 76,13±1,86% e 0,409 gEtanol.g-1,
27
respectivamente, com taxa de transformação máxima de 0,175±0,008 h-1 e produtividade de

0,629±0,012 g.L-1 h-1 de etanol (SANTOS, 2017)
Ao observar a quantidade de glicerol produzida pela levedura MONASTRELL, uma
das menores entre os ensaios avaliados, é possível constatar sua alta capacidade de adaptação
ao meio fermentativo, interessante ao processo de fermentação, visto que essa biomolécula
está vinculada à adaptação do microrganismo ao meio (PÉTER; ROSA, 2005).
Tabela 2 - Parâmetros cinéticos encontrados em 236 horas para os Ensaios de 1 a 4, culturas puras das cepas:
MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85).
Variáveis da Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3 Ensaio 4
fermentação MONASTRELL T73 BMV58 CR85
Biomassa
Final (g.L-1) 1,4 ± 0,12 1,11 ± 0,13 0,98 ± 0,15 0,83 ± 0,11
µXmáx (h-1) 0,055556 0,055556 0,055556 0,055556
YX/S (g.g-1) 0,008846 0,007833 0,006763 0,007073
Glicose
Final (g.L-1) 6,58 ± 3,55 11,92 ± 1,79 10,20±6,86 21,36±1,10
Frutose
Final (g.L-1) 35,16 ± 6,049 46,36± 4,48 44,90±1,91 61,29±4,36
Etanol
Final (% v/v)) 9,044 ± 0,939 7,47 ± 1,15 6,792±3,02 5,301±0,402
µPmáx (h-1) 0,332 1,197 1,303 1,282
YP/S (g.g-1) 0,456 0,421 0,374 0,361
Produtividade
(g. L-1.h-1) 0,306 0,826 0,909 0,781
Eficiência
Fermentativa(%) 70,618 58,327 53,03 41,392
Glicerol
Final (mg.L-1) 5,947 ± 0,288 5,694 ± 0,354 6,82 ± 2,26 7,412 ± 0,71
Ácido Acético
Final (mg.L-1) 987,515 ± 28,96 904,78±36,18 461,66±1,9 458,32±13,9
Quanto ao catabolismo associado ao substrato (glicose e frutose), observou-se que a

cepa MONASTRELL apresentou os melhores resultados quanto ao consumo e concentração
28
final tanto de glicose como de frutose no final da fermentação (Tabela 2), confirmando, assim,
a máxima utilização destes açúcares na formação de etanol e demais compostos orgânicos.
O ensaio que continha apenas a cepa CR85 apresentou a menor concentração de
biomassa e uma das piores taxas de conversão de substrato em biomassa (YX/S).
Contrariamente ao esperado, também foi o experimento de menor concentração de etanol,
YP/S e eficiência fermentativa, porém, com taxas intermediárias de µXMÁX e produtividade de
etanol. Apesar de ser a menor produtora de etanol e ácido acético, tal cepa foi a maior
produtora de glicerol e a que menos consumiu substrato (Tabela 3), confirmando ser potencial
produtora de glicerol. A S. kudriavzevii (CR85) pode respirar mais tempo e também a sua
fermentação não é tão eficaz, por isso requer a via de glicerol para compensar o potencial
redox que ocorre com a glicólise. (GONZÁLEZ et al, 2007).
Comparando os ensaios entre a T73 e a BMV58 é possível supor alguns
comportamentos metabólicos. A cepa T73 obteve maior concentração celular do que a
BMV58, e ainda assim obteve maior concentração de etanol final, YX/S, YP/S e eficiência
fermentativa, enquanto que, a cepa BMV58 além da menor produção de etanol, obteve
velocidade específica de produção de etanol superior, maior consumo de glicose e frutose e
menor produção de glicerol (Tabela 2). A junção dos resultados, permite afirmar que a
levedura T73 possui melhor capacidade fermentativa do que a levedura BMV58, visto que
conseguiu destinar melhor a glicose e frutose para a produção de etanol com menor consumo
destes substratos, desviando-o das rotas de produção de biomassa e glicerol. Essa
característica mencionada pode ser confirmada pelo fato de que a T73 alcançou a maior
eficiência fermentativa (58,327%), maior fator de transformação de substrato em etanol
(0,421gEtanol.g-1) com uma taxa de transformação máxima de 1,197 h-1 e produtividade de
0,826g.L-1 de etanol por hora. Enquanto que a BMV58 produziu menor concentração de
biomassa e etanol, e ainda apresentou a maior produção de glicerol e consumo de sacarose
superior.
Contrariamente ao esperado da levedura T73, houve maior produção de ácido
acético, com relação aos ensaios mencionados. Tal fato pode ser explicado com base na
utilização desse ácido como precursor dos lipídios constituintes da biomassa (PÉTER; ROSA,
2005), visto que T73 apresentou maior produção de biomassa se comparada à cepa BMV58
que apresentou menor concentração de ácido acético.
29
5.1.2 Avaliação dos Parâmetros Cinéticos dos ensaios mistos com duas cepas
No intuito de determinar o ensaio que obtivesse melhor combinação de parâmetros

cinéticos para a produção de vinhos com características sensoriais que atendam as exigências
do consumidor, foram feitos testes com fermentações em co-cultura de duas leveduras
avaliando a produção de biomassa, etanol, ácido acético, glicerol e consumo de sacarose.
Na Figura 2, a seguir, estão ilustradas gráficos com as variáveis da fermentação
obtidas das combinações de leveduras na proporção de 1:1 das misturas de
MONASTRELL+T73, MONASTRELL+BMV58, MONASTRELL+CR85, T73+BMV58,
T73+CR85, BMV58+CR85.
Etanol (D), Glicerol (E) e Ácido Acético (F) nos ensaios 5 ao 10 com duas cepas na proporção de 1:1 das
leveduras MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 durante 236h h de fermentação.
2,5 A
Média Concentração Celular(g/L)
2
50% Monastrell/50%T73
1,5
50%Monastrell/50%BMV58
1 50%Monastrell/50%CR85
0,5 50% T73/50% BMV58
50%BMV58/50%CR85
0
0 40 80 120 160 200 240
Tempo (h)
30
100 B
80
60 50% Monastrell/50%T73
40 50% Monastrell/50%CR85
50% T73 / 50% BMV58
20 50% T73 / 50% CR85

50% BMV58 / 50% CR85
0
0 36 60 89 109 159 236
140 C
120
100
Média Frutose(g/L)
50%Monastrell/50%T73
80
50% T73 / 50% BMV58
40
50% T73 / 50% CR85
20 50% BMV58 / 50% CR85
0
0 36 60 89 109 159 236
31
Média Etanol Produzido(%V.V) 10 D
6 50%Monastrell/50%T73
50% T73 / 50% BMV58
2 50% T73 / 50% CR85
50% BMV58 / 50% CR85
0
0 36 60 89 109 159 236
10
E
9
Média Glicerol Produzido(mg/L)
8
50%Monastrell/50%T73
7
6 50% Monastrell/50%BMV58
4
50% T73 / 50% BMV58
3
2 50% T73 / 50% CR85
1
50% BMV58 / 50% CR85
0
0 36 60 89 109 159 236
32
1200 F
Média Acido Acético Produzido(mg/L) 900
50% Monastrell/ 50% T73
600 50% Monastrell/ 50% BMV58

50% Monastrell/50% CR85
50% T73 / 50% BMV58
300
50% T73 / 50% CR85
50% BMV58 / 50% CR85
0
0 36 60 89 109 159 236
A Figura 2-A mostra a cinética de crescimento das leveduras durante 236 horas de
fermentação. A partir do perfil da cinética de crescimento definido por Schmidell et al. (2001)
os seis ensaios mostrados, apresentaram comportamento semelhantes. Assim como nos
experimentos com culturas puras, não foi possível observar a fase lag, devido à rápida
adaptação das leveduras ao meio de cultivo. Já a fase logarítmica ou exponencial, observou-se
nas primeiras 89 horas de fermentação, seguida da desaceleração do crescimento que
permaneceu até o fim do período da fermentação. A fim de visualizar claramente as fases lag
e estacionária, recomenda-se observar o crescimento em um intervalo de tempo mais curto,
como a cada 15h, por exemplo.
Diferentemente do relatado da literatura, verificou-se que após 159 h de fermentação,
a combinação MONASTRELL+T73 apresentou considerado aumento na concentração de
biomassa, atingindo a maior concentração celular dentre todos os ensaios. De acordo com a
literatura, considera-se tal aumento após a desaceleração como resultado o uso do etanol
como fonte de carbono pela levedura Saccharomyces cerevisiae (CRUZ, 2016).
As interações entre a população da biomassa durante o processo fermentativo produz
diversos efeitos comportamentais nas leveduras, sendo que o sinergismo e o antagonismo são
considerados os principais. O primeiro, denominado sinergismo, caracteriza-se pelo aumento
de biomassa da cultura mista quando comparada aos cultivos puros, enquanto que o segundo,
denominado antagonismo, caracteriza-se pelo decaimento da biomassa quando comparada a
cada levedura que o compõe (AMORIM et al., 2011). Sendo assim, constata-se a partir da
comparação da concentração de biomassa das co-culturas com relação aos cultivos puros, que
33
nas misturas de MONASTRELL+T73, MONASTRELL+BMV58, BMV58+CR85 e

MONASTRELL+CR85, houve sinergismos, enquanto que nas combinações T73+BMV58 e
T73+CR85 ocorreu antagonismo.
As Figuras 2-B e 2-C mostram as concentrações de glicose e frutose,
respectivamente, durante todo o processo fermentativo. Houve um declínio evidente do
consumo dos açúcares que agiram como substrato durante a fermentação, não sendo possível
realizar o consumo total de glicose e sacarose. As co-culturas T73+BMV58, T73+CR85 e
BMV58+CR85 foram as que consumiram menor quantidade de glicose e frutose se
comparadas aos cultivos puros. Tal característica permite a elaboração de ensaios visando
maior eficiência fermentativa.
Com relação à produção de etanol das combinações de duas cepas pesquisadas
(Figura 2-D), no período de 236h de fermentação, os valores estiveram entre 6,77 % (V/V) e
8,48 % (V/V) (Tabela 3). Nota-se, em tais co-culturas, interações positivas em que há o
aumento da concentração de etanol para ambas as leveduras se comparadas aos seus cultivos
puros, como na T73+BMV58 e BMV58+CR85, além de interações negativas, nas quais não
ocorrem aumento da concentração de etanol se comparadas aos cultivos puros para ambas,
como nas co-culturas MONASTRELL+T73, MONTASTRELL+BMV58,
MONASTRELL+CR85 e T73+CR85.
No presente estudo, observou-se, ainda, o comportamento das co-culturas com
relação à produção de glicerol, sendo constatada concentração progressiva ao longo do
processo fermentativo. O único ensaio que apresentou aumento na concentração de glicerol
foi MONASTRELL+T73 quando comparado aos cultivos puros. A hipótese de que as
leveduras em condições estressantes de meio de cultivo tenham consumido o etanol em
excesso, produzindo biomassa, é válida e relevante na tentativa de explicar tal fato que pode
ser confirmado pela alta formação de biomassa neste ensaio. Considera-se que essa biomassa
produzida tenha gerado um desequilíbrio da balança redox sendo corrigida pela produção de
glicerol a fim de retomar o equilíbrio. Já as combinações entre as leveduras
MONASTRELL+CR85, T73+CR85 e BMV58+CR85 foram os ensaios que induziram a
diminuição da concentração de glicerol, quando comparado com os cultivos puros.
A Figura 2-F, apresenta a produção de ácido acético, produto secundário de grande
importância na fermentação alcoólica. As misturas, quando comparadas aos seus respectivos
cultivos puros resultaram em um aumento da produção de ácido acético para os ensaios com
BMV58+CR85 e T73+BMV58, enquanto que para a combinação MONASTRELL+CR85,
houve a diminuição da concentração do ácido em questão. As co-culturas mistas estudadas,
34
não apresentaram relação proporcional entre a formação de biomassa e produção de ácido

acético, diferentemente do ocorrido no estudo de culturas puras.
Sendo assim, acredita-se na existência de interações desconhecidas entre as rotas
catabólicas de ácido acético em co-culturas de leveduras, as quais desviam esse ácido da rota
de produção de biomassa. Buscando justificar e explicar tal comportamento destoante do
esperado, observou-se uma leve e direta relação entre produção de etanol e ácido acético, em
que as co-culturas com maior produção desse composto secundário apresentaram tendência a
uma maior produção alcoólica, considerando o consumo de ácido acético pelas leveduras.
SANTOS (2017) em seu estudo sobre a competência de co-culturas de leveduras
Saccharomyces cerevisiae para produção de etanol, determinou essa mesma relação direta
entre a produção de etanol e ácido acético, confirmando os resultados deste presente estudo.
Entre os ensaios estudados, destaca-se a co-cultura MONASTRELL+T73 sendo que
a mesma obteve maior produção de etanol, formação de biomassa, bem como o maior fator de
conversão YX/S, maior produtividade e eficiência fermentativa, sendo ainda a maior
consumidora de substrato (glicose e frutose). Já com relação ao fator de transformação de
substrato em produto (YP/S), obteve valor intermediário, não havendo diferença significativa
se comparado aos demais ensaios. Considerando tal comportamento aliado à baixa produção
de glicerol, constata-se que houve ideal destinação do substrato para a formação de biomassa
e produção de etanol.
35
Tabela 3 - Parâmetros cinéticos encontrados para as fermentações com combinações de duas cepas na proporção
1:1, durante 236 horas.
Variáveis da Ensaio 5 Ensaio 6 Ensaio 7 Ensaio 8 Ensaio 9 Ensaio 10

fermentação MONASTRELL MONASTRELL MONASTREL T73+ T73+ BMV58+
+T73 +BMV58 +CR85 BMV58 CR85 CR85
Biomassa
Final (g.L-1) 1,33 ± 0,17 1,06 ± 0,24 0,87 ± 0,06 0,95±0,18 0,76 ± 0,19 0,84±0,09
-1
µXmáx (h ) 0,055556 0,055556 0,055556 0,055556 0,055556 0,055556
YX/S (g.g-1) 0,0087 0,007 0,006 0,007 0,006 0,006
Glicose
Final (g.L-1) 7,374 ± 5,43 8,098 ± 2,024 10,68±0,96 13,25±1,334 18,382±2,4 13,62±1,58
Frutose
Final (g.L-1) 39,804 ± 5,764 40,592 ± 6,958 45,68±3,15 52,462±6,19 56,998±4,7 50,484± 4,6
Etanol
Final (% v/v) 8,492 ± 0,193 7,951 ± 0,009 7,635±0,015 7,597±0,126 6,774±0,03 7,774 ±0,09
-1
µPmáx (h ) 1,540 0,833 1,322 0,989 1,114 0,901
YP/S (g.g-1) 0,443 0,419 0,424 0,451 0,434 0,456
Produtividade
(g. L-1.h-1) 1,602 0,936 0,960 0,995 0,892 1,148
Eficiência
Ferment.(%) 66,304 62,086 59,616 59,321 52,893 60,702
Glicerol
Final 6,006 ± 0,167 6,051 ± 0,303 6,38 ± 0,99 6,323± 0,88 6,393±0,27 6,721± 0,643
-1
(mg.L )
Ácido Acético
Final 948,482 ± 19,459 743,554 ± 17,22 802,1±67,3 775,92±41,2 722,9±71,0 567,15± 80,542
1
(mg.L )
A qualidade de produção alcoólica desta combinação deve-se às características e alta

capacidade fermentativa das Saccharomyces cerevisiaes, sendo destaque nas destilarias
brasileiras. Segundo BASSO (2008) e BATISTOTE (2010), tais cepas apresentam, ainda, alta
competitividade com demais leveduras, além de metabolismo rápido, proporcionando melhor
adaptação ao meio com elevada concentração de etanol e metabólitos secundários.
Em contrapartida, verificou-se para a mistura entre as leveduras T73 e CR85, os
piores resultados no que concerne aos fatores de conversão (YX/S e YP/S), produção de etanol,
formação de biomassa, produtividade de etanol por hora e eficiência fermentativa. Na
36
tentativa de justificar tal comportamento, observa-se a dificuldade desta co-cultura em

consumir substrato, além de serem desviados por rotas metabólicas que levam à produção de
metabólitos secundários, como glicerol e ácido acético.
5.1.3 Avaliação dos Parâmetros Cinéticos dos ensaios mistos com três e quatro
cepas.
No intuito de avaliar os parâmetros cinéticos das leveduras em co-culturas, foram

analisadas, nesta etapa do estudo, as fermentações com misturas de três e quatro cepas no
intervalo de 236 horas e na proporção de 1:1:1 (33,3%:33,3%:33,3%) de cada levedura nas
co-culturas de três cepas e 1:1:1:1 (25%:25%:25%:25%) de cada levedura quando foram
utilizadas quatro linhagens diferentes.
Visando melhor visualização dos resultados, apresenta-se, na Figura 3, a seguir, as
curvas das variáveis da fermentação obtidas das co-culturas de leveduras na proporção de
1:1:1 das cepas MONASTRELL+T73+BMV58, MONASTRELL+T73+CR85,
MONASTRELL+BMV58+CR85 e T73+BMV58+CR85 e na proporção de 1:1:1:1 de cada uma
das leveduras.
Etanol (D), Glicerol (E) e Ácido Acético (F) nos ensaios 11 ao 15 com três e quatro cepas na proporção de 1:1:1
e 1:1:1:1, respectivamente, das leveduras MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85 durante 236h h de
fermentação.
2,5 A
Média Concentração Celular(g/L)
33% Monastrell/
33%T73/ 33%BMV58
2
33%Monastrell/
1,5 33%T73/ 33%CR85
1 33%Monastrell/
33%BMV58/ 33%CR85
0,5
33%T73/ 33% BMV58/
33%CR85
0
0 40 80 120 160 200 240
25%Monastrell/
Tempo (h)
25%T73/ 25%BMV58/
25%CR85
37
100
B
80 33% Monastrel/33%
T73/33%BMV58
T73/33%CR85
BMV58/33%CR85
33% T73/33%
20
BMV58/33%CR85
25% Monastrel/25% T73/
0 25% BMV58/25%CR85
0 36 60 89 109 159 236
140
C
120
33% Monastrel/33%
Média Frutose(g/L)
100
T73/33%BMV58
T73/33%CR85
BMV58/33%CR85
40
33% T73/33%
BMV58/33%CR85
20
0 25% BMV58/25%CR85
0 36 60 89 109 159 236
38
10 D
Média Etanol Produzido(%V.V)
33% Monastrel/33%
6 T73/33%BMV58
33% Monastrel/33%
4 T73/33%CR85
33% Monastrel/33%
BMV58/33%CR85
2 33% T73/33%
BMV58/33%CR85
0 25% Monastrel/25% T73/

25% BMV58/25%CR85
0 36 60 89 109 159 236
E
10
9
Média Glicerol Produzido(mg;/L)
8
33% Monastrel/33%
7 T73/33%BMV58
6 33% Monastrel/33%
5 T73/33%CR85
4 33% Monastrel/33%
BMV58/33%CR85
3
33% T73/33%
2 BMV58/33%CR85
1 25% Monastrel/25% T73/
0 25% BMV58/25%CR85
0 36 60 89 109 159 236
39
Média Acido Acético Produzido(mg/L)

1200
F

T73/33%BMV58
33% Monastrel/33%
600 T73/33%CR85
33% Monastrel/33%
BMV58/33%CR85
300 33% T73/33%
BMV58/33%CR85
0 25% BMV58/25%CR85
0 36 60 89 109 159 236
A Figura 3-A apresenta a cinética de crescimento das leveduras durante 236 horas de
fermentação. Assim como nos demais ensaios, nestes com três e quatro leveduras, não foi
possível identificar a fase lag, isto é, fase de adaptação ao meio, devido ao longo período de
incubação antes da primeira avaliação de concentração celular no espectrofotômetro.
Diferentemente dos ensaios com culturas puras e com duas leveduras em co-cultura, é
possível observar um menor período de fase exponencial, sendo o mesmo ocorrido nas
primeiras 60h, tendo desaceleração do crescimento de biomassa até o fim do período
fermentativo observado. A fase estacionária aparece claramente em dois ensaios,
T73+BMV58+CR85 e MONASTRELL+BMV58+CR85, a partir de 209 horas de
fermentação, enquanto que o ensaio contendo quatro leveduras apresentou comportamento
inesperado ao aumentar significativamente seu crescimento após a fase de desaceleração, no
intervalo de 60h a 159h de fermentação, voltando a diminuir o crescimento após esse período.
Conforme citado anteriormente, tal aumento considerável após a desaceleração é
fruto do uso do etanol como fonte de carbono pela levedura Saccharomyces cerevisiae
(CRUZ, 2016), o que pode ser confirmado ao observar o ensaio contendo
MONASTRELL+T73 que apresentou mesmo comportamento.
As Figuras 3-B e 3-C apresentam as concentrações de substrato, sendo eles, glicose e
frutose, respectivamente, versus o tempo de fermentação. Para todas as combinações de cepas
houve declínio do substrato, no entanto, nenhuma das combinações de leveduras conseguiram
consumir totalmente os açúcares durante as 236 h de fermentação, semelhantemente ao
40
encontrado por SANTOS (2017). Verificou-se um comportamento interessante das leveduras

nestes ensaios, sendo constatado menor consumo de substrato, principalmente nos ensaios
MONASTRELL+BMV58+CR85 e T73+BMV58+CR85, contribuindo positivamente para a
eficiência fermentativa dos ensaios. Na tentativa de justificar tal comportamento atribui-se a
maior concentração de açúcar residual presente na fermentação à baixa atividade enzimática
quando no meio há inibidores (ZECH; GGRISCH, 1995).
No que concerne à produção de etanol ao final das 236 horas de fermentação (Figura
3-D), houve uma variação média entre 6,72 % (V/V) e 9,22 % (V/V) nas combinações de três
e quatro cepas (Tabela 4). Dentre os ensaios estudados nesta etapa, o que apresentou melhor
resultado com relação à produção de etanol foi MONASTRELL+T73+BMV58 enquanto que
a combinação MONASTRELL+BMV58+CR85 obteve o menor teor alcoólico.
A Figura 3-E apresenta a produção de glicerol no decorrer do processo fermentativo,
sendo possível observar uma concentração crescente, nas primeiras 89 horas de fermentação
e, um decaimento na produção após esse período, enquanto que a produção de ácido acético
(Figura 3-F) foi intensa até o fim do processo fermentativo. A combinação que obteve melhor
resultado concernente ao ácido acético foi a MONASTRELL+T73+BMV58, já a co-cultura
MONASTRELL+BMV58+CR85 foi a menor produtora deste metabólito. Com relação à
produção de glicerol houve semelhante perfil de produção entre os ensaios analisados.
Ressalta-se, de acordo com a literatura (Lima et al.,2001; Péter e Rosa, 2005), as
evidências do desvio de rota de produção de biomassa para a produção de etanol na co-cultura
MONASTRELL+T73+BMV58 visto que a mesma foi a maior produtora de etanol, bem como
a que atingiu maiores níveis de produção etanólica, eficiência fermentativa, produtividade de
etanol e consumo de substrato, enquanto que seus níveis de formação de biomassa bem como
de conversão de substrato em biomassa foram intermediários, quando comparado aos demais
ensaios. Nota-se, ainda, uma maior produção de ácido acético e concentração de glicerol
intermediária.
41
Tabela 4 - Parâmetros cinéticos encontrados para as fermentações com combinações de três e quatro cepas nas
proporções 1:1:1 e 1:1:1:1, respectivamente, durante 236 horas.
Variáveis da Ensaio 11 Ensaio 12 Ensaio 13 Ensaio 14 Ensaio 15

fermentação MONASTRELL MONASTRELL MONASTRELL T73+BMV58 MONASTRELL
+T73+BMV58 +T73+CR85 +BMV58+CR85 + CR85 +T73+BMV58
+CR85
Biomassa
Final (g.L-1) 1,32 1,24 1,38 1,02 1,67
µXmáx (h-1) 0,055556 0,055556 0,055556 0,055556 0,055556
-1
YX/S (g.g ) 0,00844 0,008 0,011 0,0086 0,0117
Glicose
Final (g.L-1) 6,474±1,006 7,864±0,347 17,992±1,629 20,152±1,3 11,153±1,384
Frutose
Final (g.L-1) 37,129±3,772 39,953±0,309 56,895±1,864 61,446±3,94 46,647±3,227
Etanol
Final (% v/v)) 9,221±0,056 8,448±0,019 6,718±0,099 6,858±0,057 7,606±0,009
-1
µPmáx (h ) 2,569 0,686 0,705 0,785 1,261
YP/S (g.g-1) 0,47 0,443 0,428 0,462 0,427

Produtivid. 1,186 0,916 0,795 1,021 1,109
-1 -1
(g. L .h )
Eficiência 72 65,961 52,456 53,553 59,387
Ferment. (%)
Glicerol
Final(mg.L-1) 6,213±0,348 6,056±0,187 6,977±0,061 6,891±0,35 5,992±0,447
Ácido Acético
Final(mg.L-1) 1023,053±33,02 918,728±36,88 689,639±17,912 730,81±54,9 967,671±23,464
Outro desvio também foi constatado neste estudo, desta vez, da rota metabólica de
etanol para a síntese de biomassa, observado nas misturas MONASTRELL+BMV58+CR85 e
T73+BMV58+CR85 que obtiveram resultados similares nos parâmetros cinéticos, obtendo os
maiores níveis de formação de biomassa e menor produção etanólica. Ao comparar o
consumo de substrato destas combinações com as demais nota-se que apesar de baixa
produção de etanol, o consumo de substrato também foi baixo, potencializando, assim, a
eficiência fermentativa. Percebe-se, ao relacionar seus parâmetros cinéticos, que apesar da
alta formação de biomassa, não houve desvios de açúcares para produção de metabólitos
secundários (glicerol, ácido acético, etc) e não houve maior concentração de ácido acético
42
visando suprir a busca pela síntese de biomassa (LIMA et al., 2001; PÉTER; ROSA, 2005;
SANTOS, 2017).
Surpreendentemente, os ensaios com três e quatro leveduras apresentaram
comportamento cinético favorável à produção de vinhos nacionais de acordo com a legislação
estabelecida pela União Brasileira de Vitivinicultura que regulamenta os padrões de
identidade e qualidade dos vinhos. Os ensaios MONASTRELL+T73+BMV58 e
MONASTRELL+T73+CR85, poderiam ser empregados na fermentação de vinhos do tipo
“V nh e Me D e S ve”, v q e e ó (9,221% e 8,448%,
respectivamente) e de açúcares totais (43,603 g/L e 47,817 g/L) está dentro dos limites
estabelecidos por legislação, que limita tais valores em 8,6 a 14% para teor alcoólico, e 25,1 a
80g/L de açúcares totais (UVIBRA, 1988). Visto isso, as combinações com três leveduras
mostraram características relevantes que devem ser aprofundadas em estudos futuros.
5.2 AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA DO PROCESSO FERMENTATIVO DAS MISTURAS

DE S. cerevisiae (MONASTRELL, T73), S. uvarum (BMV58) e S. kudriavzevii (CR85)
UTILIZANDO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL DE MISTURAS
A análise estatística de açúcar residual, formação de etanol, biomassa, glicerol e ácido

acético é de fundamental importância para a confirmação dos resultados obtidos, sendo assim,
analisou-se a relação dos valores observados experimentalmente versus valores preditos pelo
modelo. As Figuras 4, 5, 6, 7, 8 e 9 mostram os gráficos obtidos através da análise estatística
dos valores experimentais, sendo apresentadas curvas de nível, resultantes dos modelos
gerados para produção de etanol, biomassa, glicerol, ácido acético e sacarose residual em
função das diferentes proporções MONASTRELL, T73, BMV58 e CR85.
43
Figura 4 - Regiões de contorno da resposta concentração de biomassa para a combinação quaternária utilizada
no planejamento experimental para misturas simplex centroide. (p<0,1)
BIOMASSA BIOMASSA
BMV-58
0,00 1,00 A CR-85
0,00 1,00 B
0,25 0,75 0,25 0,75
0,50 0,50 0,50 0,50
0,75 0,25 0,75 0,25
1,4
1,3
1,4 1,2
1,3 1,1
1,00 0,00 1,2 1,00 0,00 1
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,1 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 0,9
MONASTRELL T-73 MONASTRELL BMV-58
BIOMASSA BIOMASSA
CR-85
0,00 1,00 C CR-85
0,00 1,00 D
0,25 0,75 0,25 0,75
0,50 0,50 0,50 0,50
0,75 0,25 0,75 0,25
1,1 1,4
1,05 1,3
1 1,2
0,95 1,1
1,00 0,00 0,9 1,00 0,00 1
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 0,85 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 0,9
T-73 BMV-58 MONASTRELL T-73
A Figura 4 ilustra as curvas de nível geradas na qual agrupou-se de três em três das
quatro leveduras utilizadas na fermentação quanto a resposta de produção de biomassa. Nota-
se na Figura 4-A, baixa concentração celular, aliada a um menor crescimento das leveduras e,
menor formação de biomassa, entre os eixos T73 e BMV58, caracterizados pela coloração
verde, conforme descrição de legenda. Na Figura 4-C, entretanto, nota-se uma ampla região
de alta concentração celular, caracterizada pela coloração vermelha, nos referidos eixos. As
Figuras 4-A e 4-D mostram que as leveduras MONASTRELL, T73 apresentaram maior
produção de biomassa quando comparadas às demais cepas. No entanto, no ensaio em que
estiveram em igual proporção, apresentaram resultados intermediários concernentes à
formação de biomassa, o que pode ser justificada pelo alto rendimento de etanol (Tabela 3)
uma vez que houve desvio na síntese metabólica de crescimento de biomassa, para a produção
de etanol.
44
A Figura 5 mostra as curvas de nível para produção de etanol. As curvas de

coloração verde estão na região em que a resposta tem menor concentração de etanol, estando
sempre localizada no eixo da cepa CR85, enquanto que as curvas em coloração vermelha
indicam resposta à maior concentração etanólica, nota-se sua localização sempre no eixo das
S. cerevisiae (MONASTRELL e T73).
A combinação das leveduras MONASTRELL, T73 e BMV58 obteve destaque entre
os ensaios, sendo a maior produtora de etanol, importante em processos fermentativos, além
de confirmar a alta capacidade de produção etanólica por parte das S.cerevisiae
(MONASTRELL e T73).
Figura 5 - Regiões de contorno da resposta concentração de etanol para a combinação quaternária utilizada no
planejamento experimental para misturas simplex centroide (p<0,1).
ETANOL ETANOL
BMV-58
0,00 1,00 A CR-85
0,00 1,00 B
0,25 0,75 0,25 0,75
0,50 0,50 0,50 0,50
0,75 0,25 0,75 0,25

72
70
68 70
66 65
64 60
1,00 0,00 62 1,00 0,00 55
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 60 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 50
ETANOL ETANOL
CR-85 CR-85
0,00 1,00 C 0,00 1,00
D
0,25 0,75 0,25 0,75
0,50 0,50 0,50 0,50
0,75 0,25 62 0,75 0,25

60
58
56 70
54 65
52 60
1,00 0,00 50 1,00 0,00 55
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 48 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 50
45
Na tentativa de justificar o comportamento das S. cerevisiae, especialmente a

MONASTRELL, admite-se, entre outras hipóteses, que, além do seu maior crescimento e
desenvolvimento, suas características metabólicas adaptam-se facilmente ao mosto de uva
sintético, por terem apresentado maiores concentrações de biomassa, além de alta capacidade
de produção de etanol. As cepas CR85 e BMV58, por sua vez, apresentam moderada
formação de biomassa, porém, baixa produção de etanol, indicando, entre outras hipóteses,
possíveis desvios de rotas metabólicas para formação de metabólitos secundários ou, então,
simplesmente, indicando não possuírem alta capacidade fermentativa.
Concernente aos açúcares residuais, glicose (Figura 6) e frutose (Figura 7), nota-se,
altas concentrações de açúcares residuais, indicando sua dificuldade no consumo de substrato,
principalmente nos eixos T73 e BMV58 (figura 6-A e figura 7-B), bem como, nos eixos T73 e
CR85 (Figura 6-D) e nos eixos BMV58 e CR85 (Figura 6-B e Figura 7-A). Segundo
SANTOS (2017), essa alta concentração de açúcares, pode refletir em desperdício de fonte de
carbono e, consequentemente, queda na eficiência fermentativa, uma vez que, ao utilizaram
menor quantidade de açúcares para produção de metabólitos secundários ou etanol.
Figura 6 - Regiões de contorno da resposta concentração residual de glicose para a combinação quaternária
utilizada no planejamento experimental para misturas simplex centroide (p<0,1).
GLICOSE
BMV-58
A GLICOSE
B
0,00 1,00 CR-85
0,00 1,00
0,25 0,75
0,25 0,75
0,50 0,50
0,50 0,50
0,75 0,25 0,75 0,25 20

18
16
14
12 12
10 10
1,00 0,00 8 1,00 0,00 8
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 6 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 6
46
Ao contrário do esperado, a combinação MONASTRELL+T73+BMV58 que

apresentou menor quantidade de açúcares residuais nos resultados, foi a que obteve melhor
resposta à concentração de glicose (Figura 6-A) e frutose (Figura 7-B) nas curvas de nível,
porém, observa-se que as curvas em vermelho, em ambos os casos, estão, restritamente,
localizadas entre os eixos T73 e BMV58, indicando que essa combinação obteve a maiores
concentrações de açúcares residuais, confirmando, assim, os resultados anteriormente obtidos
por meio de análise HPLC.
A levedura MONASTRELL, por sua vez, esteve sempre nas curvas de coloração
verde, indicando os menores níveis de açúcares residuais, isto é, maior consumo de substrato
para produção de etanol e demais metabólitos, confirmando assim, ser uma levedura
potencialmente fermentativa.
Figura 7 - Regiões de contorno da resposta concentração residual de frutose para a combinação quaternária
FRUTOSE FRUTOSE
CR-85 BMV-85
0,00 1,00 A 0,00 1,00 B
0,25 0,75 0,25 0,75
0,50 0,50 0,50 0,50
0,75 0,25 0,75 0,25

48
46
60 44
55 42
50 40
45 38
1,00 0,00 1,00 0,00
40 36
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 35 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 34
MONASTRELL BMV-85 MONASTRELL T-73
FRUTOSE FRUTOSE
MONASTRELL CR-85
0,00 1,00
C 0,00 1,00
D
0,25 0,75 0,25 0,75
0,50 0,50 0,50 0,50
0,75 0,25 0,75 0,25

62
60
60 58
55 56
50 54
45 52
1,00 0,00 40 1,00 0,00 50
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 35 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 48
CR-85 T-73 T-73 BMV-85
A Figura 8 mostra as curvas de nível para a resposta de concentração glicerol.

Observa-se, nas Figuras 8-B e 8-C que as leveduras BMV58 e CR85 apresentam sempre as
47
maiores concentrações de glicerol, enquanto que a MONASTRELL e T73 sempre estiveram

na região onde a resposta tem menor concentração deste metabólito, confirmando resultados
anteriormente obtidos, em que mostram as leveduras BMV58 e CR85 como potenciais
produtoras de glicerol, sendo de grande importância para a indústria vitivinícola na produção
de vinhos ricos em glicerol e menor teor alcoólico.
Figura 8 - Regiões de contorno da resposta concentração de glicerol para a combinação quaternária utilizada no
planejamento experimental para misturas simplex centroide (p<0,1).
GLICEROL
GLICEROL CR-85
0,00 1,00
BMV-85
0,00 1,00 A B
0,25 0,75
0,25 0,75
0,50 0,50
0,50 0,50
0,75 0,25 0,75 0,25

7,2
7
6,6 6,8
6,4 6,6
6,2 6,4
1,00 0,00 6 1,00 0,00 6,2
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 5,8 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 6
GLICEROL GLICEROL
CR-85 CR-85
0,00 1,00 C 0,00 1,00 D
0,25 0,75 0,25 0,75
0,50 0,50 0,50 0,50
0,75 0,25 7,2 0,75 0,25

7,2
7 7
6,8 6,8
6,6 6,6
6,4 6,4
6,2 6,2
1,00 0,00 6 1,00 0,00 6
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 5,8 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 5,8
A Figura 9 mostra as curvas de nível para a resposta da concentração de ácido

acético. Nas curvas de nível onde a resposta tem maior concentração de ácido acético estavam
as leveduras MONASTRELL e T73, e as combinações entre MONASTRELL+T73+BMV58
(Figura 9-A) e MONASTRELL+T73+CR85 (Figura 9-D), enquanto que, na região onde a
concentração de ácido acético foi menor, as leveduras BMV58 e CR85 sempre estão
presentes, bem como a mistura das leveduras MONASTRELL+BMV58+CR85 (Figura 9-B).
48
Figura 9 - Regiões de contorno da resposta concentração de ácido acético para a combinação quaternária
ÁCIDO ACÉTICO ÁCIDO ACÉTICO

BMV-58
0,00 1,00 A CR-85
0,00 1,00
B
0,25 0,75 0,25 0,75
0,50 0,50 0,50 0,50
0,75 0,25 0,75 0,25
1000 1000
900 900
800 800
1,00 0,00 700 1,00 0,00 700
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 600 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 600
ÁCIDO ACÉTICO
ÁCIDO ACÉTICO
CR-85 CR-85
0,00 1,00 0,00 1,00
C D
0,25 0,75 0,25 0,75
0,50 0,50 0,50 0,50
0,75 0,25 0,75 0,25
1000
900 900
800 800
1,00 0,00 1,00 0,00
700 700
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 600 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 600
A análise das curvas de nível de biomassa (Figura 4) e ácido acético (Figura 9),
possibilitou relacioná-las, uma vez que o ácido acético é precursor para produção de lipídios
constituinte da biomassa (PÉTER; ROSA, 2005). As mesmas combinações de levedura a
região de maior produção de ácido acético obtiveram, também, maior produção de biomassa,
entretanto, há estudos contrários a esta verdade apresentada, sendo justificados pelo fato de
que as células possuem outros componentes, além de lipídios (BECZE, 1955).
Considera-se de grande importância, esta análise estatística apresentada, pois
confirmam os resultados analíticos.
No intuito de atender as demandas atuais dos consumidores de vinho, cada dia mais
exigentes, as indústrias vinícolas têm desenvolvido vinhos ricos em glicerol, responsável por
porporcionar mais suavidade e consistência aos vinhos, e reduzido teor alcoólico. Sendo
assim, atualmente, tem se empregado diversos métodos, entre eles a utilização de co-culturas
49
de espécies diferentes, principalmente S. cerevisiae e espécies de outros gêneros, objetivando

conseguir uma redução da produção de etanol e, consequente aumento de metabólitos
secundários, neste caso, o glicerol (Morales et al, 2015).
Neste contexto, o presente estudo, adotou como estratégia na tentativa de atender às
exigências do consumidor o desenvolvimento de um delineamento experimental de S.
cerevisiae (MONASTRELL e T73), S. uvarum (BMV58) e S. kudriavzevii (CR85). Utilizou-
se as leveduras S. kudriavzevii e S. Uvarum, capazes de produzir maiores quantidades de
glicerol e menor teor etanólico que a S. cerevisiae, mostrando-se de grande relevância ao
presente estudo (ARROYO-LOPEZ, et al. 2010).
As leveduras S.kudriavzevii (CR85) e S.uvarum (BMV58), se mostraram potenciais
produtoras de glicerol, já que, apesar de consumirem menor quantidade de substrato, utiliza-o
para rotas metabólicas diferentes da rota de fermentação alcoólica, neste caso, para a síntese
de glicerol, confirmando os estudos de ARROYO-LOPEZ (2010). Verificou-se, ainda, a
influência do aumento das proporções de S. kudriavzevii e S.uvarum na produção de glicerol,
bem como, prioridade em produzi-lo, visto a baixa produção de ácido acético.
Torna-se evidente, ao analisar os resultados obtidos, a altíssima capacidade de
produção de etanol por parte da S. cerevisiae (MONASTRELL e T73) sendo que em todos os
ensaios, seja em culturas puras ou mistas, apresentaram maior consumo de substrato destinado
prioritariamente à produção etanólica, produzindo, ainda, alto teor de ácido acético, que
apesar de ser importante no ramo sucroalcooleiro, é um metabólito indesejável na produção
de vinhos devido ao sabor adstringente que proporciona.
A presença de duas ou mais cepas de leveduras se desenvolvendo simultaneamente
no mesmo meio de cultivo, pode ocasionar interações inesperadas, como a ocorrência de
trocas de metabólitos entre as diferentes cepas, provocando modificações sensíveis nas
propriedades cinéticas de cada uma delas e, ocasionando, inclusive, fortes modificações dos
produtos finais da fermentação. Em alguns estudos, com culturas mistas de Saccharomyces
uvarum/Saccharomyces cerevisiae apresentaram troca de acetaldeído entre ambas.
(SALMON, 2006)
Contudo, o desenvolvimento de co-culturas de leveduras tem sido fortemente
estudado como uma estratégia para alcançar objetivos específicos no processo fermentativo,
uma vez que, muitas das cepas industriais comercializadas não satisfazem os enólogos já que
suas propriedades, ao contrário do esperado, nem sempre são garantia de rapidez
fermentativa, resistência ao stress térmico ou ao etanol, produção de aromas ou de enzimas de
interesses, etc.
50
Neste âmbito, as co-culturas têm apresentado resultados satisfatórios, permitindo

combinar interesse tecnológico (boas cinéticas de fermentação e bom rendimento de
transformação açúcar/etanol) e rendimento qualitativo ao nível do produto final (maior
diversidade e complexidade aromática) (SALMON, 2006). O que pode ser confirmado no
presente trabalho, o qual apresentou excelentes resultados na interação entre as diferentes
Saccharomyces utilizadas, sendo que as co-culturas que obtiveram melhores resultados em
nível de parâmetros cinéticos visando a produção de vinhos de melhor qualidade, com maior
teor de glicerol e menor teor alcoólico, bem como menor formação de ácido acético, foram
justamente as combinações compostas pelos três tipos de Saccharomyces (S. cerevisiae, S.
uvarum e S. kudriavzevii), sendo elas MONASTRELL+BMV58+CR85 e
T73+BMV58+CR85.
51
6. CONCLUSÃO
O presente trabalho permitiu analisar as interações entre as leveduras utilizadas na

indústria vitivinícola e leveduras com outras aplicabilidades e pouco experimentadas no ramo
em questão, enfocando nos parâmetros cinéticos quando em co-culturas gerando, assim,
informações com relação às interações dessas microbiotas durante a fermentação do mosto
sintético de uva.
Possibilitou, ainda, melhor compreensão do comportamento cinético e metabólico
das leveduras quando cultivadas em culturas puras e mistas com dois, três e quatro cepas,
comparando-as entre si, por meio dos parâmetros cinéticos apresentados, sendo possível
determinar as combinações de maior relevância ao presente estudo.
As fermentações com as diferentes proporções de leveduras MONASTRELL, T73,
BMV58 e CR85 apresentaram comportamento diferente, diante das respostas encontradas
para síntese de biomassa, etanol, glicerol, ácido acético e consumo de sacarose, sendo
evidenciado, em cada ensaio, a influência das características de cada levedura e a interação
entre as mesmas sobre o seu comportamento cinético.
A partir do planejamento experimental de mistura com a análise das respostas de
concentração de etanol, biomassa, sacarose, glicerol e ácido acético pode-se compreender o
comportamento dos ensaios com uma, duas, três e quatro cepas. A levedura MONASTRELL
destacou-se por apresentar a maior concentração de biomassa final, maior produção etanólica,
maior consumo de substrato (glicose e frutose), bem como maior produção de ácido acético,
mostrando-se potencial produtora alcoólica e sendo de grande relevância em diversos ramos,
como o setor sucroalcooleiro, por exemplo. Seguida da cepa T73 que apresentou níveis pouco
menores que a MONASTRELL, porém, revelando sua alta capacidade fermentativa. As
linhagens BMV58 e CR85 ganharam destaque neste estudo, uma vez que apresentaram os
melhores rendimentos para os parâmetros relacionados ao metabólito secundário desejado, o
glicerol, e maiores quantidades de açúcares residuais, indicando menor consumo de substrato.
No entanto, a BMV58 apesar de obter resultados semelhantes com relação à produção de
glicerol, se comparada à CR85, apresentou maior produção de etanol, revelando capacidade
fermentativa superior à CR85.
Concernente à produção de metabólitos secundários, dentre as combinações, as das
cepas MONASTRELL+BMV58+CR85 foi a co-cultura que apresentou maior quantidade de
glicerol, interessante para a indústria vitivinícola, enquanto que a
MONASTRELL+T73+BMV58 obteve maior produção de ácido acético, indesejável em tal
52
ramo industrial, apesar de possuir outras aplicabilidades. A combinação de

MONASTRELL+T73+BMV58+CR85 respondeu como o ensaio com maior concentração de
biomassa. As cepas MONASTRELL+T73+BMV58 apresentaram menor quantidade de
açúcares residuais, glicose e frutose, indicando maior consumo dos açúcares que agiram como
substrato durante o processo fermentativo, sendo responsável, ainda, pela maior produção
etanólica, sendo, ainda, a combinação que obteve maior eficiência fermentativa, confirmando,
assim, a altíssima capacidade fermentativa da S. cerevisiae, visto que a mesma se encontra em
maior proporção nesta combinação.
Pode-se concluir, através do presente estudo, que a utilização de co-culturas
envolvendo as espécies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kudriavzevii e
Saccharomyces uvarum é uma estratégia válida e efetiva para a produção de vinhos que
atendam às atuais exigências do consumidor, devido à alta produção de glicerol e redução de
etanol ao final da fermentação.
As proporções de cada cepa foram fundamentais para a competência entre as
leveduras utilizadas, neste caso, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kudriavzevii e
Saccharomyces uvarum, visto que permite aumentar o período de fermentação da S.
kudriavzevii e S. uvarum ao competirem com a S.cerevisiae, predominante por excelência nos
processos de vinificação.
Conclui-se, ainda, que nas co-culturas com 33% de S. cerevisiae (tanto T73, como
MONASTRELL), 33% de S. kudriavzevii (CR85) e 33% de S. uvarum (BMV58), foi possível
reduzir a quantidade de etanol produzido e aumentar a concentração de glicerol, sem aumento
significativo de ácido acético a níveis indesejáveis.
Por fim, pode-se afirmar que este trabalho possui grande importância para a indústria
vitivinícola, dado a sua relevante contribuição para o alcance dos objetivos do ramo, que não
são outros senão produzir vinhos com características sensoriais desejadas de acordo com as
exigências do consumidor, tais como vinhos ricos em glicerol e com menor graduação
alcoólica, além de vinhos agradáveis ao paladar do consumidor.
53
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A utilização de co-culturas por meio de um delineamento de misturas tem se

revelado uma alternativa efetiva para a melhoria de processos não apenas na produção de
vinhos, como também em outros processos fermentativos e demais ramos da engenharia
bioquímica e biotecnológica. Com isso, torna-se necessário o desenvolvimento de pesquisas
com delineamento de misturas com outras leveduras utilizadas na indústria vitivinícola, e
estudos mais aprofundados que envolvam outros fatores além dos parâmetros cinéticos.
Alguns pontos positivos podem ser levantados com relação ao que foi estudo no
trabalho. O primeiro deles foi explicitação através da baixa concentração celular de toda a
cínética das leveduras individuais e combinadas. Descrevemos o uso da cepa BMV58,
recentemente descoberta no ramo da vitivinicultura e até hoje não relatada em estudo. Pôde-se
encontrar descrição e explicação para alguns fenômenos e relacionando entre si a produção de
metabólitos, possibilitando a determinação de quais cepas influenciam mais em determinada
metabólito.
Finalmente, o presente estudo apresenta grande relevância científica uma vez que
mostrou detalhadamente a cinética de crescimento, consumo de substrato e obtenção de
produtos a partir da fermentação de algumas misturas de leveduras, que até então não haviam
sido estudadas.
54
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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TCC - Bianca e Ana

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

Ana Cristina Bispo de Moura

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

AVALIAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO EM CO-CULTURA COM

AVALIAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO EM CO-CULTURA COM

Trabalho de Conclusão de Curso

Orientador: Prof.° Dr.° Gabriel Luis Castiglioni

AVALIAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO EM CO-CULTURA COM

Aprovada em _____ de ______________ de ______, pela Banca Examinadora

Agradecemos primeiramente a Deus, pelo dom da vida e por nos proporcionar

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................... i

Tabela 1- Planejamento experimental de misturas simplex-centróide para quatro componentes

Equação 01- Estequiometria da fermentação alcoólica e dos açúcares redutores .................... 6

DE MOURA, A.C.B1; CAETANO, B.M.M1;. AVALIAÇÃO DO PROCESSO

Palavras-chave: Vinho, MONASTRELL, BMV58, T73, CR85, Parâmetros

Key words: Wine, MONASTRELL, BMV58, T73, CR85, Kinetic Parameters,

As leveduras do gênero Saccharomyces são resistentes a altas concentrações de

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o processo fermentativo em mosto sintético de uva utilizando culturas puras

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Avaliar o comportamento cinético de culturas puras e mistas quanto à produção de

A formação de vinho a partir de mosto de uva é um processo realizado por leveduras,

A produção de fermentados alcoólicos a partir de frutas é uma alternativa atrativa

crescimento destas leveduras durante a fermentação é influenciado por diferentes fatores

3.2 PROCESSO FERMENTATIVO

O processo fermentativo é uma das reações bioquímicas conhecidas pelo homem

3.3 PARÂMETROS DE CONTROLE DA FERMENTAÇÃO ALCÓOLICA

Para a avaliação e o controle do processo fermentativo, é necessário o

Velocidade específica de transformação é o grande incentivo em que se baseiam

C6H12O6 (açucares redutores)  2CH3CH2OH + 2CO2 Equação 01

A equação estequiométrica serve de base ao cálculo de rendimento. Para Gay-Lussac

Leveduras são fungos conhecidos como fermentos e apresentam forma unicelular

3.4.1 Saccharomyces cerevisiae

A Saccharomyces cerevisiae e a espécie de leveduras mais pesquisada e usada para a

3.4.2 Saccharomyces kudriavzevii

A levedura S. kudriavzevii tem sido principalmente isolada em ambientes naturais e

3.4.3 Saccharomyces uvarum

A levedura S. bayanus, sinônimo da S. uvarum, é extremamente utilizada na

3.5 CO-CULTURAS E CULTURAS MISTAS EM PROCESSOS

Grande parte produtos derivados da biotecnologia industrial são produzidos através

3.6 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

No intuito de encontrar a combinação ideal, o delineamento experimental se torna

A presente pesquisa foi realizada no Laboratório de Engenharia Bioquímica e

Foram utilizadas espécies isoladas e puras de Saccharomyces, sendo S. cerevisiae

4.2 REPIQUE E MANUTENÇÃO DAS CEPAS

Quadro 1 – Composição do Meio GPY sólido para manutenção das cepas.

Componente do meio de manutenção Concentração (g.L-1)

Extrato de Levedura (HIMEDIA®-RM027) 5

D-(+)-Glicose anidra P.A 20

Ágar Tipo 1 (HIMEDIA®-RM666) 20

Foram pesados todos os componentes do Quadro 1, e diluídos em 1L de água

4.3 MOSTO SINTÉTICO

Para o mosto sintético, utilizou-se os componentes descritos no Quadro 2, os quais

Quadro 2- Composição química do mosto sintético de uva.

Componente Concentração (g.L-1 )

Acido Citrico 0,6

Acido Tartarico 3,6

Fosfato monopotássico 0,9

Sulfato de potássio 0,6

Sulfato de magnésio 0,3

Cloreto de cálcio 0,186

Cloreto de sódio 0,24

Quadro 3- Composição química da solução de aminoácidos.

Aprovada em _ de ____ de , pela Banca Examinadora