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P2 – biomol

Sequenciamento de DNA: processo de determinação da sequência de


nucleotídeos (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de DNA.

Método de Sanger (1977): método de sequenciamento de DNA baseado


em terminação de cadeia por incorporação de ddNTPs(Método Enzimático)
1. Reação de sequenciamento (amplificação linear com DNA
polimerase - reação em cadeia, por ligações fosfodiéster)
2. Eletroforese em gel de acrilamida (em placa ou capilar)
3. Leitura da sequência (manual ou automática)

Ingredientes:

 Uma enzima DNA polimerase

 Um primer, que é um pequeno fragmento de DNA


de fita simples que se liga ao DNA molde e atua
como um "iniciador" para a polimerase

 Os quatro nucleotídeos do DNA (dATP, dTTP, dCTP,


dGTP)

 O DNA molde a ser sequenciado

 Versões Dideoxi, ou terminadores de cadeia, para os quatro nucleotídeos


(ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uma marcada com um corante de uma
cor diferente
 Para o nucleotídeo se ligar durante a ação da DNA polimerase, ele
precisa da OH no final, quando ddNTP se liga (que tem o hidrogênio)
aleatoriamente, o alongamento da cadeia para, pois a base seguinte
não consegue se ligar.

No Projeto Genoma Humano, o método Sanger foi usado para determinar as


sequencias de muitos fragmentos relativamente pequenos de DNA humano.

Sequenciamento de nova geração (NGS)

Antigamente, era necessário a construção de uma biblioteca de DNA a partir


de clonagem e propagação (amplificação) em células hospedeiras (E.coli).

O sequenciamento de nova geração permite a amplificação de moléculas


de DNA sem o viés de clonagens em organismos hospedeiros (perda de
regiões do genoma, dificultando a montagem) e amplificação em organismos
hospedeiros, e a um custo muito menor por base de DNA sequenciada.

Aplicações: genomas completos, metagenomas, RNA-seq, exomas, RNAs não


codificantes, pequenos RNAs, amplicons, regiões marcadas,
imunoprecipitadas, bibliotecas enriquecidas com fragmentos-alvo,
entre diversas outras aplicações.

Illumina

O princípio desta metodologia é similar ao método proposto por Sanger, pois


temos em ambas a síntese de uma fita complementar ao DNA alvo utilizando
DNA polimerase e nucleotídeos terminadores marcados com diferentes
fluoróforos. A fluorescência emitida após a incorporação de cada nucleotídeo
é registrada como imagem e no final, através de uma decodificação destas
imagens, tem se a sequencia de interesse.

A inovação dessa plataforma consiste na clonagem in vitro dos fragmentos


em uma plataforma sólida de vidro, processo também conhecido como PCR
de fase sólida.

Aplicações: Genomas complexos (humano, rato, plantas), RNA-seq, PCR


multiplex, detecção de mutações somáticas, forense, teste prénatal não
invasive

biblioteca genômica a biblioteca que inclui fragmentos significativos da totalidade do genoma de


uma célula ou organismo. Estão presentes nessa biblioteca as regiões codificantes (Éxons), e
também as regiões não codificantes (Íntrons). Portanto, quando se almeja estudar um ponto não
codificante, porém importante para a regulação da transcrição, utiliza-se este tipo de biblioteca.
As etapas necessárias para a construção de uma biblioteca genômica são, o isolamento de DNA,
deixar o DNA isolado através de enzimas de restrição produzindo fragmentos de tamanho
compatível com o vector de clonagem, a ligação desses fragmentos ao vector, usando o
bacteriófago λ que se comporta como um vírus da E. coli e a introdução do DNA recombinante nas
células hospedeiras de E. coli.
Quando se pretende obter um certo fragmento da biblioteca é necessário fazer o screening
(rastreamento), utilizando sondas de DNA, identifica-se e seleciona-se os clones que contém o
fragmento de interesse.

Biblioteca de DNAc[editar | editar código-fonte]


Contêm sequencias de DNA que aparecem com RNAm. A DNA polimerase é capaz de sintetizar o
DNA a partir de mRNA. Desta forma, surge o cDNA (DNA complementar) que é constituído apenas
pela parte codificante, uma vez que o mRNA só contém os exons.
A construção de bibliotecas de cDNA passa pelas seguintes etapas, a extração do RNAm total da
célula de interesse, a síntese in vitro de cDNA a partir do RNAm pela transcriptase reversa e
conversão das moléculas de cadeia simples de cDNA em cadeia dupla pela polimerase, a
introdução dos cDNA recombinantes nos vectores e estes nas células hospedeiras e a identificação
dos clones de interesse através de um processo de triagem dos clones recombinantes.
Assim como nas bibliotecas de DNA genômico, quando se pretende obter um certo trecho da
biblioteca é necessário fazer o screening. Neste caso, se a sequência for conhecida utiliza-se
sondas de DNA, se não utiliza-se anticorpos (se cDNA estiver num vector de expressão). Depois
identifica-se e seleciona-se os clones que contém o fragmento de interesse.
Desse modo, a sua utilização na área da biotecnologia trouxe muitas vantagens como a
possibilidade de cDNAs de células eucarióticas superiores serem diretamente transcritos e
traduzidos em microrganismos, permitindo assim a produção em grande escala de polipeptídios ou a
determinação direta da sequência de RNA e subsequente dedução da sequência de aminoácidos da
proteína por ele codificada,importante para a sequenciação.[2]

Princípio da técnica Illumina. Em (A) tem-se a fragmentação do DNA a ser


sequenciado (através de um processo de nebulização), com posterior seleção
dos fragmentos de tamanho apropriado e ligação de adaptadores em ambas
as extremidades. Em (B), estes fragmentos são colocados em uma placa de
vidro (flowcell) densamente povoada por adaptadores complementares aos
adaptadores contidos nas extremidades dos fragmentos, de maneira que os
fragmentos possam então se ligarem à placa. Em (C), ocorre a incorporação
de nucleotídeos não marcados com fluorescência até que toda a extensão
do fragmento seja amplificada. Em (D) tem-se a formação da estrutura em
ponte, que dá nome ao processo de amplificação (amplificação em ponte)
evidenciando dois adaptadores presos a placa e outros dois livres. Em (E)
ocorre a desnaturação do duplex. Em (F) os adaptadores livres se ligam a
adaptadores complementares na placa, iniciando um novo ciclo. Em (G),
temos o cluster sendo formado, o qual provavelmente conterá mais de um
milhão de cópias do mesmo fragmento. Em (H) adiciona-se os quatro tipos de
didesoxinucleotídeos terminadores reversíveis contendo fluoróforos, junto com
a enzima DNA polimerase, que fará a incorporação do didesoxinucleotídeo
apropriado. A incidência de um feixe de raios laser excita os fluoróforos
proporcionando emissão de luz que difere em função da base incorporada.
Em seguida, efetua-se uma etapa de lavagem para remoção do grupo
bloqueador presente na extremidade 3’ junto com o fluoróforo; fato este que
permitirá a incorporação do segundo nucleotídeo. Estes ciclos se repetem até
que toda a extensão do DNA seja polimerizada. Em “I” ocorre o registro da
imagem correspondendo a incorporação do primeiro didesoxinucleotídeo. “J”
e “K” representam sucessivos ciclos de incorporação de didesoxinucleotídeos
marcados, incidência de raios laser, emissão de luz e registro da imagem. Por
fim, em “L”, as imagens registradas em cada ciclo são decodificação para
determinar a sequencia de bases de cada cluster na placa.

IonTorrent

As plataformas de sequenciamento IonTorrent adotam uma abordagem


baseada em pH para identificar a incorporação das bases.

Diferente do 454, SOLiD e Illumina, não são utilizados sinais luminosos, mas sim
micropHmetros que detectam a liberação de ions H+ para milhões de
fragmentos ao mesmo tempo.

Em comparação às plataformas da Illumina, a taxa de erro é muito maior,


apesar do custo por reação ser menor. Além disso, sequencias
homopoliméricas tendem a gerar sinais mais intensos, mas em alguns casos é
difícil determinar o tamanho correto, o que leva ao surgimento de inserções e
deleções (INDELs).

Aplicações: Ion Torrent PCR multiplex, microbiologia e agentes infecciosos,


detecção de mutações somáticas

PacBio

O método da PacBio permite a detecção da amplificação de fragmentos


individualmente, sem a necessidade de amplificação. Isso reduz os erros
causados pela amplificação, e permite a detecção de bases modificadas.
Biblioteca genômica
a biblioteca que inclui fragmentos significativos da totalidade do genoma de uma célula ou
organismo. Estão presentes nessa biblioteca as regiões codificantes (Éxons), e também as regiões
não codificantes (Íntrons). Portanto, quando se almeja estudar um ponto não codificante, porém
importante para a regulação da transcrição, utiliza-se este tipo de biblioteca.
As etapas necessárias para a construção de uma biblioteca genômica são, o isolamento de DNA,
deixar o DNA isolado através de enzimas de restrição produzindo fragmentos de tamanho
compatível com o vector de clonagem, a ligação desses fragmentos ao vector, usando o
bacteriófago λ que se comporta como um vírus da E. coli e a introdução do DNA recombinante nas
células hospedeiras de E. coli.
Quando se pretende obter um certo fragmento da biblioteca é necessário fazer o screening
(rastreamento), utilizando sondas de DNA, identifica-se e seleciona-se os clones que contém o
fragmento de interesse.

Biblioteca de DNAc
cDNA – DNA sintetizado à partir de mRNA maduro sem introns (só exons)

Contêm sequencias de DNA que aparecem com RNAm. A DNA polimerase é capaz de sintetizar o
DNA a partir de mRNA. Desta forma, surge o cDNA (DNA complementar) que é constituído apenas
pela parte codificante, uma vez que o mRNA só contém os exons.
A construção de bibliotecas de cDNA passa pelas seguintes etapas, a extração do RNAm total da
célula de interesse, a síntese in vitro de cDNA a partir do RNAm pela transcriptase reversa e
conversão das moléculas de cadeia simples de cDNA em cadeia dupla pela polimerase, a
introdução dos cDNA recombinantes nos vectores e estes nas células hospedeiras e a identificação
dos clones de interesse através de um processo de triagem dos clones recombinantes.
Assim como nas bibliotecas de DNA genômico, quando se pretende obter um certo trecho da
biblioteca é necessário fazer o screening. Neste caso, se a sequência for conhecida utiliza-se
sondas de DNA, se não utiliza-se anticorpos (se cDNA estiver num vector de expressão). Depois
identifica-se e seleciona-se os clones que contém o fragmento de interesse.
Desse modo, a sua utilização na área da biotecnologia trouxe muitas vantagens como a
possibilidade de cDNAs de células eucarióticas superiores serem diretamente transcritos e
traduzidos em microrganismos, permitindo assim a produção em grande escala de polipeptídios ou a
determinação direta da sequência de RNA e subsequente dedução da sequência de aminoácidos da
proteína por ele codificada,importante para a sequenciação.[2]

Quando construir uma biblioteca?

• Biblioteca Genômica

– Clonar um gene específico

– Interesse na complexidade do organismo (éxons, íntrons, promotores, regiões


intergênicas) - localização dos genes nos cromossomos, a identificação e
descrição das sequências codificadoras e não-codificadoras e suas interações

• Biblioteca de cDNA

– Interesse nos transcritos (RNAm) (Presença, Nível de expressão)

- Expressar proteína recombinante de interesse (ex. Insulina)


CRISPR/CAS 9

Bacterias são capazes de reconehcer e remover sequencias de material


genético de vírus que as infectaram

Quando o vírus penetra na célula e junta o material genético dele ao da


célula hospedeira, descobriu-se que algumas bactérias tem o poder de
reconhecer onde está esse material do vírus da bactéria e remover.

Esse sistema de remoção é feito pela enzima Cas 9.

Através do RNA guia, a enzima Cas9 é guiada até o ponto correto do DNA
que ela precisa remover.

1) Dupla fita de DNA com uma mutação (sequencia a ser removida), que
gera doença, proteína doente
2) O RNA guia é complementar a sequencia de DNA que deve ser
removida. Esse RNA guia vai guiar a enzima CAS9 para ela achar a
sequencia que deve ser removida.
A CAS9 quebra a dupla fita do DNA e remove a sequencia informada
pelo RNA guia.

A Cas9 cliva na região desejada e a DNA polimerase tenta reparar


aleatoriamente, só que isso pode gerar uma nova mutação. Então eles
colocam junto um fragmento do DNA normal, sem mutação, aí a DNA
polimerase consegue complementar a fita de boas e esse sistema
elimina a mutação

3) Após a remoção, a célula vai reparar a fita através da DNA polimerase


com sequencias aleatórias. É nesse momento que a engenharia
genética entra, pois o homem pode inserir uma sequencia de interesse
no lugar da sequencia removida. Por isso, é de interesse da terapia
gênica.
Exemplo: diabetes tipo 1
Defeito no gene que produz a insulina. Através da CRISPR, sequencia
que produz a insulina poderia ser inserida, permitindo que a pessoa
passasse a produzir a insulina.

Sistema imune das bactérias: quando a bactéria é infectada por um


tipo de vírus pela primeira vez, ela pega um pedaço dele e coloca no
CRISPR, nas regiões espaçadas, aí quando o mesmo tipo de vírus ataca
novamente ela usa aquele pedaço de DNA que ela já tinha pra fazer o
RNA guia e para atacar o DNA do vírus com a Cas9