La cromatografía de adsorción, o líquido-sólido

En general, la cromatografía líquido-sólido es más adecuada para muestras que son solubles
en disolventes no polares, y que por tanto tienen una solubilidad limitada en los disolventes
acuosos que son los que se utilizan en los procedimientos de reparto en fase inversa. Como en
cromatografía de reparto, los compuestos que tienen distintos grupos funcionales por lo
general se pueden separar, Una característica particular de la cromatografía de adsorción, que
no es compartida por otros métodos, es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros.

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN EN COLUMNA (CC)

En la figura 1 se muestra esquemáticamente una columna cromatográfica. La fase estacionaria

consiste en un sólido adsorbente empaquetado en una columna de vidrio. La mezcla a separar
(muestra) se deposita sobre la superficie superior de la fase estacionaria quedando adsorbida
en ella. A continuación, se vierte la fase móvil (eluyente) en la parte superior de la columna y
se permite su paso a través de la fase estacionaria. Durante el proceso cromatográfico los
componentes de la muestra son arrastrados por la fase móvil a distintas velocidades
efectuándose la separación. La velocidad de arrastre de cada componente depende de su
grado de adsorción en la fase estacionaria y de su afinidad por la fase móvil.

Para que la separación de los componentes de la mezcla sea efectiva, su velocidad de

migración a lo largo de la columna debe ser suficientemente diferente y la longitud de la
columna adecuada. Algunos adsorbentes comúnmente utilizados son: gel de sílice, alúmina,
sacarosa y almidón. La fase móvil consiste en un disolvente o mezcla de disolventes,
seleccionado en base a su polaridad con el fin de optimizar la separación de los componentes
de la muestra en la columna. De forma orientativa se puede establecer el siguiente orden de
polaridades para los disolventes usados con mayor asiduidad: Éter de petróleo < tetracloruro
de carbono < ciclohexano < éter etílico < acetona < benceno < acetato de etilo < cloroformo <
etanol < metanol < agua < piridina < ácido acético.

La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un
soporte sólido adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados son gel de sílice (SiO 2) y
alúmina (Al2O3)). La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este
soporte. El resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase
móvil) que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna. Se
establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente
eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una
mezcla establecerá interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil, serán
transportados a diferentes velocidades y se conseguirá su separación. Así, de manera similar
a otros tipos de cromatografía, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a través
del medio sólido se corresponden con diferencias en los tiempos de elución por la parte
inferior de la columna para cada uno de los componentes de la muestra original, que se
recogerán en fracciones diferentes.

La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes
componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes polares compiten más
eficientemente con las moléculas polares de una mezcla por los lugares polares del
adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazará las moléculas, incluyendo las más
polares, rápidamente a través de la columna. Si el disolvente es muy polar la elución será
muy rápida y generalmente habrá poca separación de los componentes de la mezcla. Si por
el contrario el disolvente es muy apolar, no eluirán los compuestos de la columna. Por lo
tanto, la elección del eluyente es crucial para el éxito de la cromatografía en columna. A
menudo se utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elución. La CCF se utiliza para
determinar y elegir el sistema solvente adecuado para cada separación.

En 1978 se introdujo una versión modificada denominada cromatografía en columna

rápida. La diferencia con la cromatografía en columna tradicional es que en la técnica rápida
el disolvente se hace atravesar la fase estacionaria aplicando una presión positiva. Esto hace
que las separaciones mejoren en resolución y se pueda disminuir el tiempo de elución, por lo
cual constituye un método de elección.

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN EN PLACA FINA (TLC) En la cromatografía en capa fina la

fase estacionaria se deposita, formando una capa delgada, sobre un material de soporte tal
como placas de vidrio o aluminio. La fase móvil asciende a lo largo de la fase estacionaria por
capilaridad, produciéndose la separación de los componentes de la muestra en base a su
diferente distribución entre la fase móvil y la fase estacionaria. En lo que se refiere a la
composición de la fase móvil y la fase estacionaria, las consideraciones que se han hecho para
la cromatografía en columna son también aplicables a la cromatografía en placa fina. Así
mismo, el campo de aplicación de ambas técnicas es muy similar, de hecho, una de las
principales aplicaciones de la TLC es seleccionar las condiciones óptimas para llevar a cabo una
CC. Algunas de las ventajas que presenta esta técnica son su bajo coste, su rapidez y su
sensibilidad. En la Fig. 2 se muestra de forma esquemática un proceso cromatográfico en placa
fina. La altura máxima que alcanza el disolvente en la placa recibe el nombre de frente de
disolvente, y se utiliza como referencia para calcular las distancias relativas recorridas por los
componentes de la mezcla en el cromatograma.

Adsorbentes y eluyentes

Los dos adsorbentes (fase estacionaria) más ampliamente utilizados son la gel de sílice (SiO2)
y la alúmina (Al2O3), ambas de carácter polar. La alúmina anhidra es el más activo de los dos,
es decir, es el que retiene con más fuerza a los compuestos; por ello se utiliza para separar
compuestos relativamente apolares (hidrocarburos, haluros de alquilo, éteres, aldehídos y
cetonas). El gel de sílice, por el contrario, se utiliza para separar sustancias más polares
(alcoholes, aminas, ácidos carboxílicos). El proceso de adsorción se debe a interacciones
intermoleculares de tipo dipolo‐dipolo o enlaces de hidrógeno entre el soluto y el adsorbente.
El adsorbente debe ser inerte con las sustancias a analizar y no actuar como catalizador en
reacciones de descomposición. El adsorbente interacciona con las sustancias mediante
interacción dipolo‐dipolo o mediante enlace de hidrógeno si lo presentan.

El orden de elución de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase móvil o

eluyente. Este puede ser un disolvente único o dos miscibles de distinta polaridad. En el
siguiente recuadro se recoge por orden creciente de fuerza eluyente los disolventes más
comúnmente empleados. Hexano < tetraclorometano < cloroformo < diclorometano < acetato
de etilo < acetona < 2‐propanol < metanol < agua En general, estos disolventes se caracterizan
por tener bajos puntos de ebullición y viscosidad, lo que les permite moverse con rapidez.
Raramente se emplea un disolvente más polar que el metanol. Usualmente se emplea una
mezcla de dos disolventes en proporción variable; la polaridad de la mezcla será el valor
promediado en función de la cantidad de cada disolvente empleada. El eluyente idóneo para
cada caso ha de encontrarse por "el método del ensayo y del error".

permite:

‐ Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar así, por ejemplo, la

efectividad de una etapa de purificación.

‐ Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas. Si, por el
contrario, corren distinto entonces no son la misma sustancia.

‐ Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo desaparecen los reactivos y
cómo aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber cuándo la reacción ha
acabado.

La muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de una lámina de plástico o aluminio

que previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente (fase estacionaria).
Entonces, la lámina se coloca en una cubeta cerrada que contiene uno o varios disolventes
mezclados (eluyente o fase móvil). A medida que la mezcla de disolventes asciende por
capilaridad a través del adsorbente, se produce un reparto diferencial de los productos
presentes en la muestra entre el disolvente y el adsorbente.
Revelado de las placas La mayor parte de las placas de cromatografía llevan un indicador
fluorescente que permite la visualización de los compuestos activos a la luz ultravioleta (254
nm). El indicador absorbe la luz UV y emite luz visible. La presencia de un compuesto activo en
el UV evita que el indicador absorba la luz en la zona en la que se encuentra el producto, y el
resultado es la visualización de una mancha en la placa que indica la presencia de un
compuesto. En el caso de compuestos que no absorben luz UV, la visualización (o revelado) del
cromatograma requiere utilizar un agente revelador. Este tiene que reaccionar con los
productos adsorbidos proporcionando compuestos coloreados

El factor de retardo o factor de retención se calcula de la siguiente manera:

Cromatografía Líquida de Adsorción en Columna

A diferencia de la Cromatografía en Capa Fina, que se utiliza tanto con fines analíticos como
preparativos, la Cromatografía en Columna se usa sólo con fines preparativos, siendo el métodos
más general para la separación y purificación de compuestos orgánicos, tanto sólidos como líquidos.

En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria (adsorbente) impregnada con la fase móvil
(eluyente) se deposita en el interior de una columna de vidrio dispuesta verticalmente que termina
en un estrechamiento provisto de una llave. La mezcla que se va a separar se deposita sobre la
parte superior de la fase estacionaria y la fase móvil atraviesa todo el sistema. Los distintos
compuestos son arrastrados por la fase móvil (eluídos) y van saliendo por el otro extremo de la
columna donde se recogen en fracciones. Los más polares son más fuertemente retenidos por la
fase estacionaria polar y salen más tarde que los compuestos poco polares, que son eluídos muy
rápidamente.

El tiempo necesario para eluír un compuesto de la columna recibe el nombre de "tiempo de

retención" y es característico para cada compuesto en unas condiciones cormatográficas dadas
(naturaleza, cantidad y características del adsorbente, fase móvil, diámetro y longitud de la columna,
temperatura, presión, etc.)

El adsorbente más utilizado para la cromatografía en columna es el gel de sílice, mientras que la
alúmina y el florisil (silicato de magnesio) se emplean como sustitutos cuando el gel de sílice es
incompatible con la mezcla que se va a cromatografiar.

El proceso de cromatografía en columna se puede realizar de forma que la fase móvil atraviese la
fase estacionaria por gravedad (tamaño de partícula 0.063-0.200 mm) o aplicando media presión
(flash cromatography, diámetro de partícula entre 0.040-0.063 mm). En este último caso, se conecta
a la cabeza de la columna un compresor de media presión (5-10 psi).
El diámetro de la columna y la cantidad de gel de sílice debe estar de acuerdo tanto con los Rf de
las sustancias a separar como con la cantidad de muestra que se va a someter al proceso.

En la figura se indica un esquema del sistema descrito