Cristalización continua de proteínas en un tanque de eliminación de producto clasificado

agitado con un reactor tubular en derivación

Resumen:
Se aplicó un tanque agitado a escala de laboratorio con un reactor tubular refrigerado en
derivación para la cristalización continua de lisozima y un anticuerpo monoclonal
terapéutico de longitud completa. El tanque agitado se hizo funcionar como un
cristalizador de eliminación de producto clasificado de suspensión mixta. La lisozima se
cristalizó mediante una combinación de cristalización de enfriamiento y salificación. El
anticuerpo se cristalizó mediante una combinación de cristalización de enfriamiento y
cristalización isoeléctrica. Se dedujo que las velocidades de nucleación se mejoraron
cuando las soluciones de proteínas pasaron a través del bypass tubular refrigerado. Se
dedujo además que las velocidades de crecimiento cristalino se mejoraron en el tanque
agitado que se hizo funcionar a una temperatura más alta en comparación con el reactor
tubular. La eliminación de productos clasificados fue posible mediante la sedimentación
controlada de cristales de proteínas. El sistema de cristalización continuo permitió un
control específico de la morfología y el tamaño de los cristales. No se produjo
sedimentación en el reactor tubular y se evitó la precipitación en todo momento. Se
obtuvieron altos rendimientos de cristalización de más del 90%. Los cristales del
anticuerpo monoclonal se produjeron continuamente por primera vez con un rendimiento
de espacio-tiempo de hasta 12 g L-1 h-1.

INTRODUCCION
Muchas proteínas, en particular proteínas terapéuticas como anticuerpos monoclonales,
necesitan estar disponibles en una forma altamente purificada en grandes cantidades y a
un costo reducido en comparación con el estado actual de la técnica. Para alcanzar el
elevado nivel de pureza requerido, generalmente se aplican varias etapas de
cromatografía por lotes preparativa. Sin embargo, se sabe que los procedimientos de
cromatografía discontinua tienen baja capacidad de purificación, requieren mucho tiempo
y requieren consumibles costosos. Como resultado, la cromatografía puede representar
un cuello de botella de procesamiento descendente desfavorable, especialmente a gran
escala. Para implementar la intensificación general del proceso, se ha propuesto la
conversión de lote a operación continua. La cromatografía continua se puede llevar a cabo
usando sistemas de columnas múltiples tales como lecho móvil simulado (SMB) o
cromatografía periódica a contracorriente (PCC). Sin embargo, tales sistemas requieren
equipo sofisticado y costoso como tecnología analítica de proceso precisa y estable, en
particular para monitorear las concentraciones de proteínas a través de detectores UV, así
como también tecnología compleja de control en tiempo real. Por lo tanto, las alternativas
no cromatográficas se han abordado en el pasado como precipitación o cristalización.
En la literatura se han descrito procesos de precipitación de lotes de proteína exitosos de
proteínas terapéuticas en tanques agitados. Recientemente, se ha informado de la
precipitación continua de anticuerpos monoclonales recombinantes en reactores
tubulares. Se demostró que después de resolubilizar los anticuerpos precipitados, la
estructura secundaria y la distribución de la isoforma no cambiaban en comparación con
el material purificado por cromatografía de proteína A. Las aplicaciones exitosas de
cristalización discontinua de proteínas, que incluyen proteínas recombinantes, en
reactores de tanque agitados también se han descrito en la literatura. Sin embargo, la
cristalización de anticuerpos monoclonales de longitud completa se ha notificado
principalmente solo en la escala de FL no agitada (es decir, experimentos de difusión de
vapor y / o microbatch). La cristalización por lotes a gran escala de un anticuerpo
monoclonal terapéutico de longitud completa mAb01 se logró por primera vez por
Smejkal et al. en 2013. En este trabajo, se realizó la cristalización discontinua de mAb01 a
partir de soluciones puras, así como de la cosecha de cultivo de células CHO clarificada
previamente tratada. Se demostró que los cristales de anticuerpos tenían una alta
bioactividad y podían resolubilizarse fácilmente para recristalización y formulación. La
eficacia de purificación de la cristalización fue similar a la cromatografía de proteína A
como se informó anteriormente para otro anticuerpo monoclonal. Los cristales de
anticuerpos tenían una mayor estabilidad mecánica y una cinética de resolubilización
mejorada en comparación con los anticuerpos precipitados. La cristalización en lote del
anticuerpo se amplió satisfactoriamente desde la escala de FL no agitada hasta la escala L
en tanques agitados. Se demostró además que la cristalización de lotes de proteínas a
gran escala en un tanque agitado (por ejemplo, 1.000 L) es concebible aplicando la
máxima disipación de energía local como un criterio de escalamiento adecuado.
Hasta donde saben los autores, la cristalización continua de proteínas hasta ahora solo se
ha publicado once. En este trabajo, la lisozima se cristalizó en un reactor tubular. El
reactor tubular se alimentó con una solución de proteína tamponada que contiene 100 g
de lisozima L-1 y 16 g L-1 del agente de cristalización cloruro de sodio y una solución que
contiene 64 g de cloruro de sodio L-1 que se mezclan antes de la entrada en una
proporción de 1 : 1 (v / v). La cristalización se llevó a cabo mediante un flujo de paso único
a través de un reactor tubular de 13 m de longitud con un diámetro interno de 2 mm a
una velocidad de flujo lineal baja de 1,9 mm s-1, dando como resultado un tiempo de
residencia de 113 minutos. Se logró una distribución de tiempo de residencia estrecha
(cerca del flujo de tapón) segmentando el líquido que fluye en babosas bien mezcladas
mediante la adición de burbujas de aire en forma pulsante en la entrada. El reactor
tubular se dividió en tres secciones, cada una de las cuales se sumergió en baños de agua
con temperaturas ligeramente variables ajustando por lo tanto tres niveles de
sobresaturación diferentes. Por lo tanto, las velocidades de nucleación y las tasas de
crecimiento cristalino variaron a lo largo del cristalizador tubular. Se obtuvieron cristales
de lisozima tetragonal con una distribución de tamaño estrecho y un tamaño de cristal
máximo de 20-25 Fm. La velocidad de cristalización continua fue 0,72 g h-1 con un
rendimiento relativamente bajo de 68%. Para aumentar el rendimiento, se habrían
requerido tiempos de residencia más largos, sin embargo, conduciría a reactores tubulares
excesivamente largos. Por otro lado, se pueden lograr tiempos de residencia más largos
en tanques con agitación continua.
Los cristalizadores de tanque agitado continuo se han utilizado en el pasado para la
cristalización de moléculas pequeñas. Frecuentemente, la cristalización de enfriamiento se
ha aplicado donde un enfriamiento externo es proporcionado por un bypass externo. Este
bypass puede ser un intercambiador de calor de haces tubulares o tubos. Dicha
configuración puede ampliarse sin dificultad ya que la derivación externa proporciona
flexibilidad con respecto a la extensión del área superficial de transferencia de calor
requerida, así como velocidades de flujo de calor mejoradas en comparación con un
tanque agitado sin derivación. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue aplicar
una combinación de un tanque agitado con un reactor tubular enfriado en derivación para
una cristalización continua de proteínas eficiente y fácilmente escalable.
El tanque agitado se alimentará continuamente con una solución de proteína tamponada
y el agente de cristalización. Se alcanzarán altas velocidades de nucleación
constantemente cuando la solución de proteína pasa a través del bypass tubular
refrigerado debido a una sobresaturación incrementada. El tanque agitado se operará
como un cristalizador de eliminación de producto clasificado de suspensión mixta. La
suspensión de proteína con los cristales de proteína más grandes sedimentados se retirará
en el fondo del tanque agitado de una manera casi continua. En una configuración de este
tipo, se pueden conseguir tiempos de permanencia medios deseables en el tanque
agitado con el fin de obtener un alto rendimiento. La cristalización continua de la lisozima
se estudiará y se comparará con los datos publicados hasta el momento. La cristalización
continua del anticuerpo monoclonal terapéutico de longitud completa mencionado
anteriormente mAb01 se estudiará por primera vez. Ambas proteínas muestran una
solubilidad decreciente a medida que desciende la temperatura (como muchas proteínas).
Los experimentos continuos que se realizarán requieren grandes cantidades de proteína,
lo que es particularmente desafiante en el caso del anticuerpo. Además, el
acondicionamiento de las soluciones de alimentación de proteínas y los propios
experimentos de cristalización continua son bastante laboriosos y requieren mucho
tiempo. Por lo tanto, no era el objetivo del presente trabajo realizar un estudio
sistemático. En su lugar, se realizarán tres ejecuciones continuas ejemplares con
enfriamiento del bypass tubular, una para la lisozima y dos para el anticuerpo y se
analizarán cuantitativamente. Los procesos de cristalización continua se evaluarán en
términos de velocidad de cristalización alcanzable, rendimiento y rendimiento de espacio-
tiempo, así como la calidad de la morfología y reproducibilidad del cristal obtenido.

sección experimental
Proteínas y productos químicos
La lisozima purificada a partir de clara de huevo de gallina se obtuvo de Sigma-Aldrich
Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania (Nº 62971). La cosecha clarificada del cultivo de
células CHO que contiene aproximadamente 2,3 g de L-1 del anticuerpo monoclonal
terapéutico IgG1 humanizado de longitud completa mAb01 fue proporcionada por
Novartis Pharma AG, Basilea, Suiza. La cosecha contenía aproximadamente 267,000 ppm
de proteínas de la célula huésped (HCP) (igual a ~ 21% p / v de proteína total) y
aproximadamente 77,700 ppb de ADN. Todos los productos químicos se compraron con
calidad analítica de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania, Carl Roth GmbH
& Co. KG, Karlsruhe, Alemania, y VWR International GmbH, Bruchsal, Alemania.
Pretratamiento de la cosecha de mAb01.
El pretratamiento de la cosecha clarificada de mAb01 fue necesario para aumentar la
concentración de proteína mediante ultrafiltración (UF) y disminuir la fuerza iónica de la
solución mediante diafiltración (DF). Al principio, se llevó a cabo un cambio de pH de 7,2 a
5,0 de 9 l de cosecha clarificada en un tanque agitado usando 10% de ácido acético. El HCP
precipitado se eliminó mediante microfiltración usando un cartucho de filtro plisado
multicapa de 0,5 μM tipo WFMLP0.5 (Wolftechnik Filtersysteme GmbH & Co. KG, Weil der
Stadt, Alemania). A continuación, se aplicó una ultrafiltración de flujo cruzado utilizando
un equipo de mesa UF / DF tipo Sartorius Slice (Sartorius Stedim Biotech GmbH,
Göttingen, Alemania) equipado con una membrana de polietersulfona (0,1 m2, MWCO de
10 kDa) en un soporte Sartocon Slice. La caída de presión transmembrana fue de 2 bar con
una bomba de membrana SartoJet. La cosecha se concentró alrededor de 4 veces. Una
etapa de diafiltración usando tampón de histidina / acetato 10 mM a pH 5,0 siguió con
una duración de siete volúmenes de diafiltración. El precipitado se eliminó nuevamente
usando el cartucho de filtro de 0,5 Fm. Posteriormente, se aplicó una segunda etapa de
ultrafiltración para concentrar nuevamente la solución aproximadamente 4 veces.
Finalmente, se realizó una microfiltración sin salida utilizando un filtro en tándem tipo
Opticap XL 300 SHC 0.5 / 0.2 Fm (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania).
Ensayos de proteínas
Las concentraciones de soluciones de proteína se midieron por absorción UV estándar a
280 nm usando una cubeta de cuarzo con una longitud de trayectoria de 10 mm en un
espectrofotómetro UV / VIS tipo Genesis 10S (Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich,
Alemania). Los coeficientes de extinción fueron 2.50 l g-1 cm-1 para lisozima y 1.62 l g-1
cm-1 para mAb01. Se obtuvo una correlación lineal con la concentración de proteína a
valores de absorción dentro del rango de 0.2-0.9. La electroforesis en gel de poliacrilamida
con dodecilsulfato de sodio estándar (SDS-PAGE) y los ensayos de IgG de
microaglutinación estándar se realizaron para analizar la cosecha de mAb01, la cosecha de
mAb01 después del pretratamiento y el sobrenadante de la suspensión cristalina mAb01
obtenida de la fase estacionaria de las cristalizaciones continuas. Los ensayos para
contenido de HCP y contenido de ADN se describen en otra parte. La cantidad de agua
cristalina de cristales de mAb01 se midió mediante análisis termogravimétrico usando una
termobalanza tipo STA 449 C Jupiter (Netzsch-Gerätebau GmbH, Selb, Alemania). Se aplicó
un perfil de temperatura dinámico de 30-120 ° C con una velocidad de calentamiento de
0.2 K min-1.
Esto correspondió a un tiempo de secado de 7.5 h. Una condición inerte en la cámara de
muestra se mantuvo mediante un caudal de nitrógeno constante de 30 ml min-1.
Experimentos de cristalización de proteínas
Los experimentos se realizaron usando un tanque agitado continuamente operado con un
reactor tubular enfriado en derivación. Un diagrama esquemático de la configuración
experimental se da en la Figura 1.

Figura 1. Diagrama esquemático del sistema de cristalización continua que consiste en un

tanque agitado de eliminación de producto clasificado con un reactor tubular en
derivación. El tanque agitado no tenía control de temperatura y estaba expuesto a
temperatura ambiente. El reactor tubular se sumergió en un termostato discontinuo
refrigerado de modo que T1 <T2.
Se han descrito combinaciones similares en la literatura para la cristalización de moléculas
pequeñas. El tanque agitado estaba hecho de un tubo de vidrio sin deflector con fondo
redondo y una salida en la parte inferior (Figura 2). El diámetro interno del tanque agitado
fue D = 49 mm. El volumen de trabajo fue de aproximadamente 150 ml (incluido el
volumen del sedimento de cristal). Se utilizó un impulsor de segmentos de tres palas con
un diámetro de 24,8 mm y una altura de 18 mm. El material del impulsor y el eje del
impulsor era de acero inoxidable. La relación del diámetro d y D del impulsor era
aproximadamente 0,5. El agitador se posicionó casi equidistante entre el nivel de llenado
de fluido y el nivel de sedimento. La relación de altura a diámetro de la columna de
suspensión de cristales mixtos por encima del sedimento cristalino fue de
aproximadamente 1,5. Las palas planas grandes tenían un ángulo de inclinación de 45 °
que producía un flujo axial y radial simultáneo bajo con bajas fuerzas de cizallamiento a
baja velocidad del agitador. Este propulsor se derivó de biorreactores de cultivo de células
de mamíferos para asegurar una mezcla suave de la suspensión cristalina. La velocidad de
agitación era controlable. Esta configuración del cristalizador de tanque agitado aseguró
condiciones hidrodinámicas bien ajustables con bajas fuerzas de cizallamiento como se
describió anteriormente.

Figura 2. Fotografía del cristalizador de tanque agitado continuo equipado con un

impulsor de segmento de tres paletas. La línea discontinua superior indica el nivel de
llenado de fluido (V ≈ 150 ml). La línea discontinua inferior indica el nivel del sedimento de
cristal de proteína (h ≈ 20 mm).
La temperatura del tanque agitado se determinó por la temperatura preestablecida del
bypass tubular refrigerado y se mantuvo constante a un nivel que resultó de la diferencia
de la temperatura ambiente y la temperatura del bypass tubular. El cristalizador de
tanque agitado se alimentó con solución de proteína y una solución de agente de
cristalización usando una bomba peristáltica multicanal tipo Ismatec Reglo ICC4 (diámetro
interno del tubo 0,25 mm) (Cole Palmer GmbH, Wertheim, Alemania). La rápida mezcla de
las soluciones se logró ubicando las salidas de ambos tubos de alimentación junto al
diámetro externo del impulsor del tanque agitado. La suspensión de sedimento cristalino
de proteínas se descargó del cristalizador de tanque agitado utilizando una bomba
peristáltica de bajo corte (impulsión Masterflex Nº 7521-35 con cabeza de bomba
estándar tipo L / S 14 (diámetro interno del tubo 1,6 mm) (Cole Palmer GmbH, Wertheim,
Alemania Debido a la falta de un sensor adecuado para monitorear el nivel superior del
sedimento de cristal de proteína, la bomba de descarga fue operada intermitentemente
usando un temporizador de reloj y supervisión manual para evitar mayores desviaciones
del nivel. El reactor tubular consistió en un tubo de silicona con una longitud de 10 m, un
diámetro interior de 2 mm y un volumen de trabajo de aproximadamente 30 ml. La
recirculación de la suspensión de cristal de proteína se mantuvo mediante una bomba
peristáltica de bajo cizallamiento con un cabezal de bomba más grande que funcionaba a
menor velocidad para minimizar la atrición cristalina (Unidad Masterflex n. ° 7521-35 con
cabeza de bomba estándar tipo L / S 16 (diámetro interno del tubo 3,1 mm) (Cole Palmer
GmbH, Wertheim, Alemania). La velocidad de flujo lineal en el reactor tubular se ajustó
dentro de el rango de 8.5-17 cm s-1. Esto dio como resultado un régimen de flujo laminar
(número Reynolds Re = 170-340 suponiendo una viscosidad de 1 mPa s para la suspensión
espesa cristalina). El coeficiente de dispersión axial no se midió. El reactor tubular se
sumergió en un termostato de baño refrigerado programable tipo 1157P (PolyScience,
Niles, EE. UU.) Para el enfriamiento eficiente de la suspensión de cristal de proteína
recirculada. La caída de presión del reactor tubular se midió mediante un manómetro
digital tipo Greisinger GMH3181 (GHM Messtechnik GmbH, Regenstauf, Alemania).
Resolubilización de cristales de mAb01.
La suspensión cristalina de mAb01 se centrifugó a 3260 g durante 5 min usando una
centrífuga de pie Rotixa 50 RS (Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Alemania). El
sobrenadante se descartó y los gránulos de cristal se resolubilizaron en tampón de
histidina / acetato 10 mM a pH 5,0 mientras se agitaba.
Microscopía óptica y análisis de imágenes.
Se obtuvieron microfotografías de los cristales de proteína usando un microscopio óptico
tipo Axioplan equipado con dos objetivos (Plan-Neofluar 40x / 1.30, Plan-Neofluar 100x /
1.30) y una cámara digital tipo AxioCam ICc3 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania). El
software de procesamiento de imágenes fue AxioVision SE64, versión 4.9 (Carl Zeiss AG,
Oberkochen, Alemania).
Resultados y discusión
Cristalización continua de lisozima purificada.
Cada ciclo continuo de cristalización en el sistema de cristalización combinado fue
precedido por una fase discontinua. El proceso por lotes se inició mezclando una solución
que contenía 96 g de lisozima L-1 y una solución de agente de cristalización que contenía
80 g L-1 de cloruro de sodio con un volumen de 90 ml cada uno en una proporción de 1: 1
v / v una velocidad de agitación de 200 min-1. Ambas soluciones contenían un tampón de
acetato sódico 50 mM a pH 4,6. El volumen de reacción total fue de 180 ml. La bomba de
recirculación del reactor tubular se ajustó a una velocidad de flujo lineal de 17 cm s-1. La
concentración de lisozima en solución se controló mediante ensayo UV. El proceso se
cambió a operación continua después de observarse una turbidez intensa de la solución
que indicaba el inicio del crecimiento del cristal y la concentración de lisozima en la
solución había mostrado una fuerte disminución. En este punto, comenzó la alimentación
continua del tanque agitado de una solución que contiene 192 g de lisozima L-1 y una
solución que contiene 80 g de cloruro de sodio L-1 en una proporción de 1: 1 v / v. Ambas
soluciones contenían tampón de acetato sódico 50 mM a pH 4,6. Al mismo tiempo, la
velocidad del agitador se redujo a 50 min-1. La altura del sedimento de cristal de proteína
se controló dentro de un rango de 15-25 mm mediante el funcionamiento intermitente de
la bomba de descarga a través de un temporizador de reloj para lograr la eliminación cuasi
continua del producto.
La primera ejecución de cristalización se realizó a temperatura ambiente con el fin de
identificar parámetros clave experimentales. Se estableció una velocidad de flujo
apropiada del reactor tubular para evitar la sedimentación de cristales en el reactor
tubular. Se estableció una velocidad de agitación adecuada con el fin de lograr la
sedimentación de cristales más grandes y mantener una columna de suspensión de finos
de cristales finamente mezclados, pero bien mezclados en el tanque agitado. La velocidad
de flujo de alimentación de proteína se ajustó a un valor máximo para lograr una
operación estacionaria con una tasa de cristalización maximizada. Se logró un nivel
adecuado de cristales sedimentados en el tanque agitado ajustando el tiempo de
operación de la bomba de descarga. Estos ajustes se adaptaron a las condiciones de los
experimentos posteriores con enfriamiento utilizando lisozima y el anticuerpo. El tiempo
de inducción de la primera etapa de cristalización a temperatura ambiente tomó
aproximadamente 4 h. La operación continua se inició después de aproximadamente 6 h.
Se observó sedimentación de cristales de lisozima en el tanque agitado unos minutos
después del inicio de la operación continua. La suspensión de finos de cristal sobre el
sedimento tenía una turbidez uniforme durante el funcionamiento continuo. Por lo tanto,
el lodo estaba bien mezclado en todo momento. En la figura 3 se da una fotografía del
cristalizador de tanque agitado continuo durante la operación estacionaria.
Figura 3. Izquierda: fotografía del cristalizador del tanque agitado durante la operación
estacionaria continua a temperatura ambiente usando lisozima. Arriba a la derecha:
cristales de lisozima de suspensión de finos cristales recirculados. Abajo a la derecha:
cristales de lisozima de la suspensión de sedimentos vertidos.

Se obtuvieron cristales de tipo tetragonal. Las distribuciones de tamaño de la suspensión

de finos de cristales recirculados y la suspensión de sedimentos de cristales descargados
se presentan en la Figura 4.
El tamaño medio del cristal del sedimento fue de aproximadamente 17 Fm y fue
aproximadamente un factor de 2-3 veces mayor que los cristales recirculados.

Se realizó una segunda operación de cristalización continua usando lisozima con

temperaturas operativas reducidas. El reactor tubular se enfrió a T1 = 10 ° C, dando como
resultado una temperatura del cristalizador de tanque agitado T2 = 13 ° C. El curso de
tiempo de la concentración de lisozima en solución se presenta en la Figura 5.
Como se puede ver, el crecimiento del cristal comenzó casi al instante. Por lo tanto, el
tiempo de inducción se redujo significativamente en comparación con la etapa de
cristalización a temperatura ambiente. La solubilidad de la lisozima disminuye con la
disminución de la temperatura. Además, la solubilidad de la lisozima disminuye al
aumentar la concentración de sal. Para bajas concentraciones de sal, la solubilidad de la
lisozima tiene una pronunciada dependencia de la temperatura. Para concentraciones de
sal más elevadas, la dependencia de la solubilidad de la lisozima con la temperatura es
menor40 (ver Información de apoyo, figura S1). La sobresaturación se define como c / c *
donde c es la concentración de proteína real y c * es la concentración de proteína en
equilibrio. La sobresaturación de la lisozima durante la cristalización continua a
temperatura ambiente fue 2,0. La sobresaturación de la lisozima durante el proceso de
cristalización continua en el tanque agitado a 13 ° C fue 4,27. La sobresaturación se
aumentó a 5,26 en el reactor tubular a 10 ° C. La supersaturación global más alta de la
operación de cristalización continua con enfriamiento del reactor tubular en comparación
con la etapa de cristalización continua a temperatura ambiente condujo a un aumento de
la nucleación dando como resultado una reducción pronunciada del tiempo de inducción.
Se describió una observación similar en la literatura donde el ajuste fino del nivel de
sobresaturación permitió el control de la nucleación.
Como resultado de un tiempo de inducción reducido, la operación continua ya se inició
después de 2 h. La operación estacionaria se alcanzó rápidamente a una velocidad de
alimentación de 6 ml h-1. La relación de recirculación (definida como Vreactor tubular / V
alimentación) fue 320. La concentración estacionaria de lisozima fue de 7 g L-1 y la velocidad
de cristalización fue de 0,58 g h-1. Este valor estaba en el mismo orden de magnitud que
el reportado en la literatura.34 El rendimiento del sistema de cristalización combinada fue
del 93%. Como se esperaba, el rendimiento fue mayor en comparación con la literatura.
Se obtuvo un rendimiento de espacio-tiempo de 3.2 g L-1 h-1. De nuevo, se obtuvieron
cristales de lisozima de tipo tetragonal. Sin embargo, el tamaño medio de los cristales
descargados fue ligeramente inferior a 13 Fm en comparación con la etapa de
cristalización a temperatura ambiente. No se produjo sedimentación cristalina en el
reactor tubular. La caída de presión en el reactor tubular durante la fase estacionaria fue
constante a aproximadamente 200 mbar. La precipitación de lisozima se evitó en todo
momento.
Cristalización continua del anticuerpo mAb01 de la cosecha pretratada.
Los experimentos de cristalización por lotes previos de mAb01 revelaron que esta
proteína cristaliza mejor en soluciones con baja fuerza iónica. Contrariamente a la
lisozima, la cristalización de mAb01 mediante la adición de un agente de cristalización
como NaCl no produjo resultados satisfactorios. Sin embargo, la solubilidad de mAb01
exhibe una dependencia típica en forma de U del pH de la solución (ver Información de
apoyo, figura S2). Además, la solubilidad de mAb01 disminuye con la disminución de la
temperatura como la lisozima. Por lo tanto, la cristalización de mAb01 se realizó a
temperaturas operativas reducidas cerca del punto isoeléctrico (pI = 6,8) mediante la
adición de base TRIS como agente de cristalización. De nuevo, la ejecución de
cristalización continua fue precedida por una fase discontinua. El proceso por lotes sin
operación de la derivación se inició con 180 ml de cosecha pretratada que se tituló a un
pH de 6,8 por base 1 M TRIS a una velocidad de agitación de 200 min-1. La solución de
inicio contenía aproximadamente 16 g de proteína L-1. La temperatura de cristalización
del tanque agitado se controló a 10 ° C por inmersión en un baño de refrigeración. Los
cristales de mAb01 obtenidos eran ortorrómbicos (ver Información de apoyo, figura S3).
Durante la fase inicial de crecimiento del cristal (después de 30 minutos), se formaron
largas varillas de cristal con forma de aguja con una longitud media de aproximadamente
32 Fm y un ancho medio de aproximadamente 2,3 Fm. Por lo tanto, la relación de longitud
promedio a anchura fue aproximadamente 14. Estos cristales crecieron
predominantemente en anchura y después de 1 h, se formaron barras de cristal robustas
con una longitud media de aproximadamente 32 Fm y una anchura media de
aproximadamente 5,3 Fm. Por lo tanto, la relación promedio longitud-anchura era ahora
de aproximadamente 6. El proceso se cambió a operación continua al alimentar una
solución con aproximadamente 16 g de proteína L-1 en tampón de histidina 10 mM y una
solución base TRIS 80 mM en una proporción de 10: 1. Esta relación dio como resultado
un pH de 6.8 - 6.9. Al mismo tiempo, la velocidad del agitador se redujo a 50 min-1. La
altura del sedimento cristalino durante el funcionamiento continuo se controló
nuevamente mediante el funcionamiento intermitente de la bomba de descarga como se
menciona anteriormente.
Se llevaron a cabo dos experimentos de cristalización continua utilizando la cosecha de
mAb01 pretratada. El reactor tubular se enfrió a T1 = 0 ° C dando como resultado una
temperatura del cristalizador de tanque agitado T2 = 10 ° C. Los cursos de tiempo de la
concentración de proteína total en solución para las operaciones de cristalización se
presentan en la Figura 6.

La concentración de proteína total en solución se controló mediante ensayo UV. Por

razones de simplificación, se supuso que los coeficientes de extinción UV de mAb01 y HCP
eran idénticos. Como puede verse, el tiempo de inducción fue bajo y la operación
continua se inició después de 2 h. Se observó durante la cristalización continua que se
formaron aglomerados de cristales de mAb01 nativos en el sedimento. La mayoría de
estos aglomerados se desintegró mediante la aplicación de vibración controlada a la parte
inferior del tanque agitado durante el funcionamiento de la bomba de descarga utilizando
motores de micro-vibración unidos circunferencialmente (consulte la Figura 1 y la
Información de apoyo). Como resultado, se obtuvieron cristales singulares ortorrómbicos
y algunos fragmentos de cristal como se muestra en la Figura 6. El tamaño medio del
cristal era 39 Fm y la cantidad de cristales <10 Fm era casi despreciable. La relación
longitud-ancho estaba en el rango de 5-10. Se observó que la sedimentación de los
cristales de mAb01 tomó algo más de tiempo y la suspensión de cristal de recirculación
era más densa en comparación con la lisozima. Esto se atribuyó a las diferencias de las
densidades de cristal de lisozima y mAb01 que a su vez se correlacionan con la cantidad de
agua cristalina. La cantidad de agua cristalina de lisozima es aproximadamente 41%. En
contraste con esto, las mediciones termogravimétricas revelaron que los cristales de
mAb01 contenían aproximadamente 73% de agua cristalina. Por lo tanto, la densidad de
los cristales de mAb01 fue menor en comparación con los cristales de lisozima y, por lo
tanto, la sedimentación de mAb01 no fue tan rápida. Sin embargo, una interfaz clara entre
la suspensión de sedimentos de cristal y la suspensión de finos de cristal era visible en
todo momento. Al igual que en el caso de la lisozima, la suspensión de finos de cristal
sobre la suspensión de sedimentos estaba bien mezclada. Se alcanzó una operación
estacionaria para ambas corridas de cristalización después de cierta fluctuación de la
concentración de proteína en solución. La relación de recirculación estaba en el rango de
11.3 - 12.5. Se obtuvo una buena reproducibilidad del proceso de cristalización continua.
La concentración estacionaria de proteína total en solución según las mediciones de UV
fue de alrededor de 4 g L-1. Sin embargo, este valor no reflejaba la concentración de
mAb01 ya que la mayoría del anticuerpo estaba en estado cristalino y principalmente HCP
disuelto había permanecido en el sobrenadante de la suspensión cristalina. Como prueba,
se realizó un análisis SDS-PAGE para examinar la composición del sobrenadante de la
suspensión cristalina obtenida a partir de la cristalización continua estacionaria así como
las composiciones de cosecha clarificada y cosecha pretratada después del cambio de pH y
UF / DF antes de la cristalización. De hecho, SDS-PAGE dio resultados que indicaban un
nivel incrementado de HCP en el sobrenadante de la suspensión cristalina de mAb01
obtenida a partir de la cristalización continua estacionaria (ver Información de soporte,
figura S4). Sin embargo, la medición de extinción UV proporcionó una buena indicación
para determinar si el proceso estaba en estado estacionario o no. Como otra prueba, las
concentraciones reales de mAb01 del sobrenadante de la suspensión de cristales y la
cosecha pretratada se midieron mediante un ensayo de microaglutinación. A partir de
estas mediciones, se obtuvo un rendimiento superior al 90% como se informó
anteriormente en los experimentos de cristalización por lotes.32 La diferencia de los
valores de sobresaturación de mAb01 en el tanque agitado a 10 ° C y en el reactor tubular
a 0 ° C no se evaluó pero se espera que sea considerablemente bajo en el punto
isoeléctrico de mAb01. Sin embargo, como se mencionó anteriormente en el caso de la
lisozima, pequeños cambios en el nivel de supersaturación tuvieron un efecto
pronunciado sobre la nucleación. Se puede suponer que este fue el caso del anticuerpo
también.
Las velocidades de cristalización durante la operación continua fueron de 1,04 g h-1
(carrera n ◦ 1) y de 1,16 (operación n ◦ 2). Se obtuvieron rendimientos espaciotemporales
de 5,7 g L-1 h-1 (carrera n ° 1) y 6,4 g L-1 h-1 (carrera n ° 2). Las mediciones previas de la
cristalización de la cosecha pretratada revelaron que la concentración de HCP se redujo a
aproximadamente 39.100 ppm. Como las condiciones del presente experimento eran
virtualmente idénticas a las de las mediciones previas, se supuso que el anticuerpo se
purificó a aproximadamente ~ 96%. No se produjo sedimentación cristalina en el reactor
tubular. La caída de presión en el bypass durante la fase estacionaria fue constante a
aproximadamente 100 mbar. Al igual que en el caso de la lisozima, se evitó la
precipitación en todo momento.
Recristalización continua del anticuerpo mAb01.
La resolubilización de cristales de mAb01 condujo a una solución que contenía
aproximadamente 24 g de L-1 mAb01. Este valor se obtuvo a partir de mediciones de
extinción UV suponiendo una solución de mAb01 100% pura (en lugar de 96% pura) por
razones de simplificación. De nuevo, la ejecución de cristalización continua fue precedida
por una fase discontinua. El proceso por lotes se inició con 180 ml de solución de mAb01
resolubilizada que se tituló a un pH de 6,8 por base TRIS 1M. La concentración de inicio de
mAb01 resultante fue de aproximadamente 21,6 g l-1. La velocidad del agitador se ajustó
a 50 min-1 y la recirculación a través del reactor tubular tuvo lugar desde el principio. La
temperatura de la derivación tubular se ajustó a 5 ° C, dando como resultado una
temperatura del tanque agitado de 15 ° C. El proceso se cambió a operación continua
como se describió anteriormente alimentando una solución con aproximadamente 19 g de
proteína L-1 en tampón de histidina 10 mM y solución de base TRIS 80 mM en una
relación de 10: 1. El transcurso del tiempo de concentración de mAb01 en solución para el
ciclo de recristalización se presenta en la Figura 7.
Se observó durante esta ejecución de recristalización que la tendencia a formar
aglomerados de cristales en el sedimento no era tan pronunciada. Por lo tanto, la
vibración no se aplicó al tanque agitado. El tamaño medio del cristal era 30 Fm y la
relación longitud-ancho estaba en el rango de 8-10. Como se puede ver, el tiempo de
inducción fue menor en comparación con los ciclos de cristalización de la cosecha
pretratada y la operación continua se inició ya después de 1 h. Se logró un proceso
continuo estable. La relación de recirculación fue 7.9. La velocidad de cristalización fue
2,18 g h-1 y el rendimiento espacio-tiempo fue 12 g L-1 h-1. Por lo tanto, la productividad
de la recristalización fue aproximadamente dos veces mayor en comparación con la
cristalización de la cosecha pretratada. De acuerdo con Smejkal et al., La concentración de
HCP se redujo de aproximadamente 39.100 ppm a aproximadamente 17,400 ppm después
de la recristalización. Nuevamente, las condiciones del presente experimento fueron
virtualmente idénticas a las de las mediciones anteriores. Por lo tanto, se supuso que el
anticuerpo se purificó a aproximadamente ~ 98%. El tiempo de residencia medio más
corto de 1,50 h del ciclo de recristalización en comparación con los tiempos de residencia
medios de 2,12 - 2,35 h de los ciclos de cristalización de la cosecha pretratada condujo a
una reducción del tamaño de los cristales sedimentados de aproximadamente 39 Fm a
aproximadamente 30 Fm. Las distribuciones de tamaños de la suspensión de finos de
cristales recirculados y la suspensión de sedimentos de cristales descargados se presentan
en la Figura 8.

Ya después de 2 h de operación continua, la clasificación del cristal era claramente

observable ya que el tamaño del cristal medio de la suspensión cristalina recirculada se
redujo a aproximadamente 20 Fm. En total, se realizaron cuatro corridas de
recristalización con una buena reproducibilidad de aproximadamente ± 8%. No se produjo
sedimentación cristalina en el bypass tubular y la caída de presión fue constante a
aproximadamente 100 mbar. La precipitación fue nuevamente evitada en todo momento.
Resumen del rendimiento de cristalización.
El rendimiento de cristalización continua de las dos proteínas en estudio se resume en la
Tabla 1.

Tabla 1. Resumen del rendimiento de cristalización continua usando lisozima y el

anticuerpo monoclonal terapéutico mAb01.
Resumen y conclusiones
Los actuales procesos de purificación a gran escala de proteínas terapéuticas se basan
principalmente en etapas secuenciales de cromatografía preparativa que a menudo
representan un cuello de botella de procesamiento posterior debido a capacidades de
producción limitadas. Para superar estas limitaciones, se ha propuesto la cromatografía
preparativa continua en los últimos años. Sin embargo, estos procesos requieren equipos
sofisticados y costosos y una compleja tecnología de control en tiempo real.
En el presente trabajo, se propuso la cristalización proteica continua como una alternativa
de purificación viable. Se investigó una combinación de un tanque agitado con un reactor
tubular enfriado en derivación. En un sistema de este tipo, se puede lograr una
cristalización de enfriamiento eficiente y el proceso puede ampliarse fácilmente. El tanque
agitado se hizo funcionar como un cristalizador de eliminación de producto clasificado de
suspensión mixta. La lisozima se cristalizó mediante una combinación de cristalización de
enfriamiento y salificación. El anticuerpo monoclonal terapéutico de longitud completa se
cristalizó mediante una combinación de cristalización de enfriamiento y cristalización
isoeléctrica. Se dedujo que las velocidades de nucleación se mejoraron cuando las
soluciones de proteína pasaron a través del bypass tubular refrigerado debido a una
sobresaturación incrementada. Se dedujo además que las velocidades de crecimiento del
cristal se potenciaron debido a un nivel de sobresaturación más bajo en el tanque agitado
que se hizo funcionar a una temperatura más alta en comparación con el reactor tubular.
Sin embargo, ambos efectos disminuirán cuando la relación de recirculación sea alta
(como en el caso de la lisozima). Un método similar para controlar la nucleación y el
crecimiento de cristales por variación de temperatura ya se describió en la literatura. Sin
embargo, no se pudo realizar una cuantificación de las diferentes tasas de nucleación y
crecimiento de cristales en el tanque agitado y el reactor tubular debido a la complejidad
de los procesos involucrados, es decir, nucleación secundaria que tiene lugar debido a
nucleación por cizallamiento y nucleación por contacto en el tanque agitado y en el
reactor tubular también. Los experimentos revelaron además que la eliminación del
producto clasificado era posible ajustando la velocidad del agitador del tanque agitado
para permitir la sedimentación controlada de los cristales de ambas proteínas. Se
obtuvieron altos rendimientos de cristalización en el sistema de cristalización combinado
debido a los grandes tiempos de residencia. En el caso de la lisozima, el rendimiento
obtenido fue del 93% en comparación con un valor del 68% informado en la literatura. Un
alto rendimiento es especialmente importante cuando la proteína cristalizada es de gran
valor, como en el caso de los anticuerpos terapéuticos. Se demostró por primera vez la
cristalización continua exitosa del anticuerpo monoclonal terapéutico de longitud
completa. El rendimiento de la cristalización continua de la recolección del 93% fue
idéntico al valor obtenido de un experimento de cristalización por lotes a escala de 100 ml
informado en la bibliografía que se realizó como una etapa de formulación del fármaco.
Sin embargo, la velocidad de cristalización del proceso continuo fue aproximadamente dos
veces mayor. Suponemos que esto se debió a las tasas de nucleación mejoradas en el
reactor tubular refrigerado. El rendimiento espacio-tiempo de la cristalización continua
del anticuerpo de la cosecha resultó ser aproximadamente dos veces mayor en
comparación con la lisozima purificada. La mayor tasa de formación de cristales se debió
muy probablemente a un mayor contenido de agua cristalina del anticuerpo. La
recristalización del anticuerpo tuvo un rendimiento espacio-tiempo aproximadamente dos
veces mayor en comparación con la cristalización de la cosecha. Este fue el caso debido a
menos proteínas de la célula huésped presentes en la solución de cristalización que
interfieren con el proceso de cristalización. Se demostró que el sistema de cristalización
combinado permitía un control dirigido de las propiedades del producto, es decir, se
evitaba la morfología y el tamaño del cristal y la precipitación como se describe en la
literatura. Además, se logró una buena reproducibilidad de manera consistente.
Recientemente, se informó acerca del progreso con respecto a la cristalización por lotes
exitosa de varios otros anticuerpos monoclonales terapéuticos de longitud completa, v.g.
guselkumab y pembrolizumab. Por lo tanto, el número de proteínas terapéuticas
cristalizables está aumentando constantemente. Los procesos de cristalización continua
de estas proteínas podrían desarrollarse en base a los hallazgos del presente trabajo. Esto
permitiría que la cristalización continua se aplique con mayor frecuencia en el futuro
como alternativa a la purificación por cromatografía preparativa.