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1º de Qu ímica, gr. D

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Cuestiones de Bioqu í mica

Tema 4

1) Una reacci ó n enzim ática puede escribirse como dos reacciones sucesivas, donde el complejo ES es el intermediario en la conversió n del sustrato en producto. En determinadas condiciones, la primera de las reacciones anteriores alcanza virtualmente el equilibrio, mientras que la segunda puede considerarse como el paso limitante de la reacció n.

a) Teniendo en cuenta las premisas anteriores, escribe un esquema general para la

conversi ó n de un sustrato S en producto P. Señ ala sobre ese esquema cu áles son las constantes de velocidad que habr ían de considerarse, e indica cu á l es la constante ciné tica que define la velocidad global de la reacció n.

b) ¿En qué consiste el estado estacionario? ¿Cu á les son las condiciones que deben de cumplirse para que é ste se alcance?

c) Deduce la expresió n de V en funció n de [S] propuesta por MICHAELIS­MENTEN. Escribe cada paso hasta llegar a la ecuació n final. Si necesitas establecer asunciones especiales, indica claramente cu áles son éstas.

d) ¿A qu é tipo de funci ó n corresponde la ecuaci ó n anterior? Repres é ntala, indicando sobre la gráfica los par á metros principales.

2) En una determinada enzima, un residuo de Ala se encuentra localizado en la hendidura dó nde se

Figura 1

k cat K M 6 7 8 9 10
k cat
K M
6
7
8
9
10

pH

11

k cat

Figura 2 6 7 8 9 10 11
Figura 2
6
7
8
9
10
11

pH

K M

une el sustrato. Una mutaci ó n, que consiste en la sustituci ón de este residuo por uno de Gly, no

afecta a la actividad de la enzima. Sin embargo, el cambio de la Ala por Glu conduce a la pé rdida completa de la actividad. Sugiere una explicació n para estas observaciones.

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3) La eficiencia catalítica ( k cat / K M ) de muchas enzimas depende del pH. La quimotripsina

muestra un valor m áximo de k cat / K M a pH 8,0 (Figura 1).

a) ¿Cu á l es el significado de esta observació n?

b) Un an álisis detallado muestra que k cat aumenta rá pidamente entre pH 6 y 7,

permaneciendo constante para valores de pH superiores a éste ú ltimo. Sin embargo, K M

permanece constante hasta pH 8 y aumenta rá pidamente entre pH 8 y 10 (Figura 2). Explica estas observaciones y extrae conclusiones sobre la naturaleza de los residuos de amino ácido que son importantes para la actividad de la quimotripsina.

4) La figura siguiente muestra esquem á ticamente algunos residuos del centro activo de la papaina.

El sustrato N­etilmaleimida (NEM) reacciona rá pidamente con el grupo anió nico tiolato de la Cys 25 del centro activo.

a) ¿En cu á l de las siguientes condiciones crees que reaccionará mejor la Cys con el sustrato

NEM: a pH 5,0 o a pH 7,5?

b) ¿Cabrí a esperar que la Cys 25 de la papaina fuese má s reactiva frente al NEM que otras

Cys de la prote í na? Razona tu respuesta.

Asp

Asp H His N N : H S Cys 2 5

H

His

N N :
N
N :

H

Asp H His N N : H S Cys 2 5

S

Cys 25

5) ¿De qué manera afecta a una enzima que se comporta segú n la cin ética de MICHAELIS un inhibidor reversible competitivo y uno irreversible? Utiliza representaciones grá ficas para comparar la actividad de la enzima en ausencia y en presencia de cada tipo de inhibidor ¿Podrí as utilizar una diá lisis para distinguir ambos tipos de inhibidores?

6) En las enzimas alostéricas, los inhibidores competitivos, cuando se encuentran a bajas concentraciones, act ú an a menudo como activadores ¿Có mo puede explicarse este hecho?

7) Si el n úmero de recambio de una enzima es 100 s ­1 ¿cuá nto tiempo necesita esta enzima para transformar 1 mol de sustrato en producto?

8) Para una enzima que responde al modelo ciné tico de MICHAELIS­MENTEN

a) Deduce el valor de la [S] para la cual se obtiene ½ V max

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b) ¿Cu á l es la proporci ó n entre las concentraciones de sustrato necesarias para conseguir un 80 % y un 10 % de la V max , respectivamente?

c) Sup ón que para la enzima anterior K M = 1 . Si V 0 = 0,1 mM/min cuando [S] = 10 mM ¿se

duplicar í a V 0 si la [S] fuese 20 mM?

9) La hidró lisis de pirofosfato a ortofosfato es importante para impulsar las reacciones

biosint é ticas, tales como la s í ntesis de DNA. Esta reacci ón hidrolí tica es catalizada en E. coli por una pirofosfatasa que tiene una masa molecular de 120 kDa y est á constituida por 6 subunidades id é nticas. La enzima purificada tiene una velocidad m áxima de 2800 unidades por mgr de enzima. Para esta enzima, una unidad viene definida como la cantidad de enzima que hidroliza 10 moles de pirofosfato en 15 minutos a 37 ºC bajo condiciones de ensayo est á ndar.

a) ¿Cu á ntas molé culas de sustrato son hidrolidadas por segundo y por mgr de enzima?

b) Suponiendo que en cada subunidad existe un solo centro activo ¿Cu á ntos moles de centro activo existen en un mgr de enzima?

c) ¿Cu á l es el n úmero de recambio de la enzima?

10) La hexoquinasa del cerebro de rata cataliza la siguiente reacció n general:

azucar ATP Azucar fosfato ADP

Esta enzima puede emplear diversos sustratos, entre ellos glucosa, para la cual K M = 2 mM , y

fructosa, cuya K M = 6 mM . Si el n úmero de recambio es el mismo para ambos sustratos ¿por

cu á l de ellos mostrará la enzima m ás especificidad?

11) En la figura adjunta se representa una ciné tica t í pica de MICHAELIS­MENTEN. Indica cuá l es la regió n, de las representadas en la figura (A, B o C) que se aplica mejor a cada uno de los siguientes casos:

V 0

a) El centro activo est á ocupado por sustrato la mayor parte del tiempo.

b) El centro activo se encuentra libre la mayor parte del tiempo.

c) Es el rango de [S] en el que funcionan la mayor parte de las enzimas in vivo.

d) Incluye el valor de K M .

e) La velocidad est á limitada principalmente por el nú mero de centros catal íticos.

V max C B A [ S ]
V max
C
B
A
[ S ]

f) La velocidad est á limitada principalmente por el nú mero de molé culas de sustrato.

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12) La aspartato transcarbamoilasa (ATCasa) es una enzima formada por seis subunidades catal í ticas y seis reguladoras que cataliza el primer paso de la ruta de la s íntesis de pirimidinas, seg ú n la siguiente reacci ó n:

Carbamoilfosfato Asp P i N carbamoilaspartato

a) Se supone que un residuo de His del sitio activo es importante para la estabilidad del estado de transició n de los sustratos unidos. Predecid la dependencia de la velocidad

catalí tica con el pH, aceptando que la interacci ó n en la que participa la His es esencial, y domina el perfil de variaci ó n de la actividad enzimá tica de la ATCasa con el pH.

b) La velocidad de reacció n de la ATCasa con respecto a la concentraci ó n de Asp , a concentraci ó n saturante de carbamoilfosfato varí a con arreglo a una curva sigmoidal, y se ve

V 0

Figura 1 ­ CTP + CTP
Figura 1
­ CTP
+ CTP

[ Asp ]

V 0

Figura 2 ± CTP
Figura 2
± CTP

[ Asp ]

Figura 3

1 2 3 4 5 6 % Actividad
1
2
3
4
5
6
% Actividad

[ PALA ] / [ ATCasa ]

afectada por la presencia de citidintrifosfato (CTP) (Figura 1). Sin embargo, si calentamos suavemente la ATCasa, (4 min a 60 ºC) la curva se convierte en hiperb ó lica y la enzima se muestra insensible a la presencia de CTP (Fugura 2).

¿Có mo podemos calificar los efectos del Asp y del CTP sobre la actividad de la

ACTasa?

¿Cu á l es el significado fisioló gico del efecto del CTP?

¿Có mo explicar í as el efecto del calentamiento suave sobre las propiedades catalí ticas

de la ATCasa?

c) La N(fosfonacetil)-L-Asp (PALA) es un potente inhibidor de la ATCasa. Se observa que concentraciones bajas de PALA aumentan la velocidad de reacci ó n. Por ejemplo, cuando existe hasta un promedio de 3 molé culas de PALA unidas por cada mol é cula de ATCasa, la velocidad de reacci ó n es unas 17 veces mayor que en ausencia de inhibidor. Sin embargo, al añ adir má s mol éculas de PALA a la enzima, hasta una relaci ó n molar de 6, la velocidad disminuye hasta llegar prá cticamente a cero (Figura 3) ¿Porqué PALA act ú a como inhibidor de la ATCasa, y sin embargo a bajas concentraciones es capaz de activar a la enzima?

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13) En la figura se muestra la variaci ó n de la velocidad de reacci ón de la enzima piruvato quinasa en funció n de la concentració n de sustrato y en ausencia (curva A) o presencia

(curva B) de fructusa 1,6-difosfato (F-1,6-P 2 ).

a) ¿A qu é se puede deber la forma sigmoidal de la curva

b) ¿Có mo influye la F-1,6-P 2 sobre la actividad de la enzima?

c) ¿Qué mecanismo puede explicar el efecto de la F-1,6-

P 2 ?

V

B A
B
A

[S]

14) El producto de una reacció n (A

B) tiene color y presenta un má ximo de absorbancia a 600 nm.

Como la absorbancia es proporcional a la concentració n de producto, las medidas obtenidas con un color í metro permiten realizar un estudio de la ciné tica de la enzima que cataliza esta reacci ó n.

En la tabla se muestran los resultados de un estudio en el que la velocidad inicial de la reacció n (V o ) se expresa como la variaci ó n de la absorbancia producida por minuto ( A/min) para cada una de las concentraciones de sustrato utilizadas.

a) Determinar los par ámetros cin é ticos del enzima V max y

K M.

b) Sabiendo que en estos experimentos se ha utilizado 1 nmol de enzima ¿Se puede calcular el nú mero de recambio? En caso de que no sea posible ¿Qu é dato o experimento adicional harí a falta?

5

[A] (mM)

Vo ( A/min)

2.5

0.13

5.0

0.21

10.0

0.30

20.0

0.37

40.0

0.43