UNIVERSIDADE DA REGIÃO DE JOINVILLE – UNIVILLE

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIAS

CULTURA E CRESCIMENTO MICROBIANO

ANA PAULA COELHO DE SOUSA, ANA PAULA CORDOVA,

MÉLANIE PSCHEIDT, THIAGO SEBASTIANA

PROFESSORA MICHELE CRISTINA FORMOLO GARCIA

Microbiologia Industrial

Joinville - SC
2016
 INTRODUÇÃO

O crescimento microbiano é considerado versátil pois sua exigência

nutricional varia de pequenas porções de substâncias inorgânicas à ingestão de
compostos mais complexos. Entretanto todos eles compartilham a necessidade de
três nutrientes básicos, o carbono, nitrogênio e a água. As células microbianas são
cultivadas em laboratório a fim de analisar suas propriedades fisiológicas,
morfológicas e bioquímicas. Tais cultivos exigem meios de cultura específicos para
cada microrganismo.
O crescimento microbiano é definido como o aumento numérico de células e é
representado por uma curva de crescimento, construída por meio de dados de
contagem populacional em determinadas fases de seu desenvolvimento após a
inoculação do microrganismo. Esta curva de crescimento é dividida em quatro fases,
a fase lag, log, estacionária e fase de declínio. A fase lag é o período de adaptação
microbiana, onde há pouco divisão celular. A fase log, ou fase exponencial, é onde
ocorre o aumento do número de células, sendo o período em que se encontram
mais ativas e em melhores condições. Na fase estacionária ocorre uma diminuição
na taxa de divisão celular e por fim a fase de morte ou declínio, onde os nutrientes
passam a se tornar escassos e há alteração no pH do meio, causando a morte
celular.
 1. DESENVOLVIMENTO

1.1. Meios de Cultura

Os meios de cultura elaborados em laboratórios devem ser adequados às

exigências nutricionais e a capacidade Biosintética de cada microrganismo, sendo
assim, há uma grande variedade deles, podendo ser classificados de diversas
maneiras.
De acordo com Spolidorio (2013, p. 32) os meios de cultura são classificados
em duas grandes classes: os quimicamente definidos e os complexos. Sendo a
primeira classe preparada com a composição exata de tais meios, e os meios de
cultura complexos são compostos a partir de produtos naturais, geralmente por
caseína, carne, soja ou levedura, que fornecem elevadas quantidades de nutrientes.
Segundo Pelczar Jr. (1996, p.150) tais “substratos são substâncias químicas
complexas contendo açúcares, aminoácidos, vitaminas e sais. ”
Spolidoria (2013, p.32) explica que os meios de cultura ainda são subdivididos
em diferentes estados físicos, os líquidos, semissólidos e os sólidos. Os meios de
cultivo líquidos são utilizados para culturas microbianas puras, enquanto que os
semissólidos são utilizados para identificação microbiana e os sólidos para
isolamento, identificação e visualização de colônias microbianas.
Pelczar Jr. (1996, p.151) afirma que em meios de cultivo solidificados é
necessário a aplicação de um agente solidificante, para que haja crescimento
microbiano. O agente comumente adicionado é o ágar, um polissacarídeo complexo,
que não serve de nutriente para o microrganismo e não é metabolizado durante o
crescimento.
Os meios de cultura ainda podem ser classificados em outro grupo, de acordo
com Spolidoria (2013, p.33), os meios seletivos e os diferenciais. Os meios de
cultura seletivos são aqueles onde há um componente que inibe o desenvolvimento
de determinado microrganismo, mas não interfere em outro. Já os diferenciais são
aqueles meios onde são acrescentados componentes químicos que diferenciam as
espécies microbianas na cultura.
 Pelczar Jr. (1996, p. 154) apresenta outros meios de cultura especiais, além
dos meios seletivos e diferenciais, os meios para anaeróbios e os meios
enriquecidos. O objetivo dos meios para anaeróbios é produzir um meio chamado de
meio reduzido, onde um agente redutor é adicionado ao meio para reduzir o teor de
oxigênio, tendo em vista que os organismos anaeróbios são aqueles que toleram
baixas concentrações ou até nenhum teor de oxigênio.
O meio de cultura enriquecido é aquele que favorece o desenvolvimento de
uma determinada espécie, mas não os demais organismos da colônia.

As técnicas de enriquecimento proporcionam um ambiente tanto químico

quanto físico, que resulta em um aumento do número da espécie que
inicialmente era minoria. Ao contrário do meio seletivo, nenhum agente
inibidor é utilizado para prevenir o crescimento de microrganismo
indesejáveis. Após cultivos seriados em meios novos, a espécie desejada
emerge como uma população predominante ou enriquecida. (PELCZAR,
1996, p.156,167)

1.2. Curva de crescimento

O crescimento microbiano é representado por meio de uma curva de

crescimento, que obtida por meio da contagem numérica de microrganismos ao
longo de um intervalo de tempo, após a inoculação. A curva de crescimento é
composta por quatro fases, a fase lag, log, estacionária e de declínio, conforme a
figura a seguir.
Figura 1 – Curva de crescimento microbiano

Fonte: SPOLIDORIA, 2013, p.34

A fase de lag de crescimento microbiano, é de acordo com Pelczar (1996,

p.180), o período onde as células estão metabolicamente ativas, apensar de não
estarem de multiplicando, é a fase onde reparam danos celulares e sintetizam
enzimas. Segundo Madigan (2004, p.134) a fase lag é onde o crescimento não se
inicia de imediato, podendo ser uma fase curta ou longa, dependendo das condições
de cultivo. A fase lag pode não ocorrer em alguns casos, como quando uma cultura
em crescimento exponencial for inoculada. Pelczar (1996, p.180) também discute a
fase de crescimento exponencial, ou fase log, que é caracterizada pelo aumento
numérico de células, é a etapa em que se encontram mais ativas e em melhores
condições. Madigan (2004, p.134) apresenta a fase log como sendo a mais
“saudável”. Por essa razão células que se encontram na metade da fase
exponencial de crescimento são frequentemente utilizadas para estudos enzimáticos
ou de outros componentes celulares. Essa fase é influenciada pelas condições
ambientais como temperatura, e composição do meio e pelas características
genéticas do próprio organismo. A maioria dos microrganismos unicelulares
apresentam crescimento log embora com taxas de crescimento bastante variável,
assim como os procarióticos crescem mais rapidamente que os eucarióticos, sendo
que os organismos eucarióticos menores crescem mais rápido que os maiores. A
fase seguinte é a estacionária, nela Pelczar (1996, p.180) afirma que não há mais
crescimento significante, ou seja, ocorre uma diminuição na taxa de divisão celular,
e inicia-se um declínio na população.

Há também um decréscimo na atividade metabólica decorrente de

alterações nutricionais e químicas do ambiente, geralmente redução
de nutrientes e aumento de produtos de excreção microbiana, que
interrompem o crescimento. (SPOLODORIO, 2013, p. 34)

Apesar de não ocorrer mais crescimento nessa fase muitas funções celulares
podem estar ainda ativas, inclusive o metabolismo energético e alguns processos
biossintéticos, afirma Madigan (2004, p.134). A última fase presente é a de declínio
ou de morte que é quando determinados fatores como escassez de nutrientes,
alteração de pH e acumulo de metabólicos tóxicos impedem o desenvolvimento
microbiano, acarretando na morte celular.

1.3. Fatores que influenciam no crescimento microbiano

Existem diversos fatores que podem influenciar do desenvolvimento

microbiano. Tais fatores podem ser divididos em químicos e físicos. As quatro
condições físicas básicas mais influentes no crescimento microbiano, são elas:
temperatura, pH, atmosfera gasosa e pressão osmótica.
A temperatura possui grande influência no crescimento microbiano. Segundo
Spolidorio (2013, p. 35) a maioria do microrganismo cresce na temperatura ideal
para os seres humanos, aproximadamente 35ºC. Entretanto existem algumas
bactérias capazes de se desenvolverem em temperaturas superiores e inferiores.
Tal características possibilita a classificação dos microrganismos em três grupos, de
acordo com a temperatura do meio onde vivem. Existem os microrganismos
psicrófilos, que se desenvolvem em baixas temperaturas; os mesófilos, que crescem
em temperaturas medianas; e os termófilos, que suportam temperaturas mais
elevadas.
Quanto ao pH, grande parte dos microrganismos se desenvolve em pH
neutro, onde seu crescimento ótimo é entre 6,5 e 7,5. Mas também existem
exceções, microrganismo que crescem em pH ácido, aproximadamente 4,0, são
chamados de acidúricos.
De acordo com Spolidorio (2013, p. 37) a atmosfera gasosa também é um
fator relevante no crescimento microbiano. Gases como carbono, oxigênio, dióxido
de carbono, nitrogênio e metano são de elevada importância. O carbono é aplicado
na síntese de compostos orgânicos. O dióxido de carbono é utilizado em diferentes
reações químicas celulares. Já o oxigênio pode ser benéfico ou não para o
desenvolvimento microbiano, dependendo da necessidade do microrganismo quanto
a este composto, podendo ser classificados em aeróbicos, facultativos, anaeróbicos
e microaerófilos.
Os microrganismos aeróbicos são aqueles que necessitam de oxigênio para
se desenvolver. Os facultativos crescem na presença de oxigênio, entretanto podem
também se desenvolver em anaerobiose. Os microrganismos anaeróbicos não
crescem em um ambiente onde há oxigênio. Por fim os microaerófilos são aqueles
que crescem na presença de oxigênio, mas ao contrário dos organismos aeróbicos,
estes não se desenvolvem em altos teores de oxigênio, como na atmosfera, onde há
cerca de 21% de oxigênio.

1.4. Medidas de crescimento populacional microbiano

De acordo com Spolidorio (2013, p.37), o crescimento microbiano pode ser

medido direta ou indiretamente. O método direto é realizado por meio da contagem
das células totais ou viáveis. A contagem total das células é realizada por meio de
uma câmara denominada Neubauer, entretanto tal método não diferencia as células
mortas das vivas.

Para realizar a contagem das células viáveis, deve-se diluir a cultura

microbiana e plaquear em meio sólido adequado. O número de colônias
crescidas no meio deve ser multiplicado pelo fator de diluição [...] para se
obter o número de unidades formadoras de colônias por mL – UFC/mL.
Para reduzir os erros nas contagens, amostras devem ser diluídas a ponto
de se contar entre 30 e 300 colônias. (SPOLIDORIO, 2013, p.38)

A contagem indireta é realizada por um fotômetro ou espectrofotômetro, e

mede a turbidez do meio, segundo Spolidorio (2013, p.38). O controle microbiano
também pode ser realizado por meio de um quimiostato, que ajusta “a concentração
de nutrientes e a taxa de diluição da cultura, mantendo-a viável e com conhecida
densidade celular. ” (SPOLIDORIO, 2013, p.38)

1.4. Reprodução e crescimento microbiano

A fissão binária é um processo onde ocorre a reprodução dos microrganismos.

Nela uma única célula se divide dando origem a duas novas células, como mostrado
na figura 2 (Madigan, 2004, p.128).

Figura 2 - Fissão binária em um bacilo

Fonte: Madingan (2004, p. 129)

 Quando bactérias em forma de bacilos (como Escherichia coli) encontra-se
crescendo em uma cultura, as células se alongam até atingirem
aproximadamente o dobro de seu tamanho quando então se forma uma
partição, dano origem as duas células filhas. Essa partição referida com
septo é resultante do crescimento da membrana citoplasmática e da parede
celular para o interior da célula, em direções opostas, até a individualização
das células filhas. (Madigan, 2004, p.129)

O tempo necessário para ocorrer o ciclo completo varia pois depende de

fatores tanto nutricionais quanto genéticos.
 2. OBJETIVOS

i) Objetivo geral: analisar o crescimento celular microbiano.

ii) Objetivo específico: construir e compreender os gráficos de curva de

crescimento celular de Saccharomyces cerevisiae e o consumo de substrato;
entender os cálculos referentes a determinação dos dados; aprimorar as habilidades
laboratoriais.
 3. METODOLOGIA

Para a execução do experimento, foram necessários 6 cadinhos devidamente

tarados( massa do cadinho) e numerados. Em cada um dos cadinhos foram
adicionados 10 mL, respectivamente de cada balão volumétrico, com o auxílio de
uma pipeta volumétrica de 10 mL. Posteriormente, os cadinhos foram levados para a
estufa a 90 ºC por 24 horas. Após as 24 horas, os cadinhos foram retirados da
estufa e levados para um dessecador. Retirando os cadinhos do dessecador após o
resfriamento dos mesmos, foram pesados e feito a diferença das massas dos
cadinhos para saber o peso seco do substrato adicionado em cada um, os valores
foram anotados.
De cada balão volumétrico, foram retirados com o auxílio de uma micropipeta,
1 mL e adicionados em cubetas. As cubetas foram levadas para o
espectrofotômetro, regulado à 600 nm e adicionadas no equipamento. O
espectrofotômetro foi zerado e em seguida foram feitas as leituras de absorbância
de cada amostra. Com os valores de absorbância e peso seco, foi feita uma curva
de concentração conforme Gráfico 1.
Na segunda parte do experimento, foi realizada uma diluição seriada. Á partir
da solução mãe foi retirado 1 mL com o auxílio de uma micropipeta e transferido
para um tudo de ensaio devidamente numerado, completado com 9 mL de uma
solução, homogeneizado em um shacker de agitação orbital e retirado 1 mL desse
tudo de ensaio e adicionado em um outro tubo de ensaio devidamente numerado,
repetindo a mesma diluição mensionada anteriormente por mais cindo vezes,
totalizando 6 tubos de ensaios. De cada tubo, foram retirados 100 uL com o auxílio
de uma micropipeta e adicionados em placas de Petry, cada uma com a mesma
numeração do tubo de ensaio respectivo. Sendo espalhado por toda a placa,
fechados e levados até uma estufa a 30 ºC por 24 horas.
Na terceira parte do experimento, o frasco com o cultivo foi agitado e retirado
uma amostra de 2 mL, colondo em um tubo de ensaio separado chamado de t0.
Incubando o cultivo em agitador rotatório a 150 rpm a 25 ºC. O tubo foi agitado e
transferido 1 mL de amostra para a cubeta, procedendo à leitura da absorbância da
suspensão celular, tomando como tempo zero (t0) e utilizando comprimento de onda
de 600 nm e água destilada como branco. O valor da absorbância, quando excedido
o limite de linearidade, foi necessária a diluição com água destilada. Procedido à
leitura de pH da amostra presente no tubo de ensaio. Foi transferido 1 mL para um
tubo de eppendorf e centrifugado a 8000 rpm e assim sendo repetidas a cada hora,
marcando os valores de absorbância e pH. Posteriormente, o sobrenadante foi
congelado para as análises de substrato (Técnica de DNS) e concentração de
produto (CG).
Para a análise de substrato foi utilizada a técnica de DNS. O sobrenadante
que foi separado anteriormente, teve que ser descongelado e diluído dez vezes, de
acordo com a equação: Fd = Vt/Va; Sendo: Fd= Fator de diluição; Vt= volume total;
Va= volume da amostra. Foram transferidos para os tubos de ensaio 0,5 mL da
amostra diluída e adicionado 0,5 mL do reagente DNS, respectivamente para cada
aliquota diluída. Foram fervidos por 5 minutos, após, colocados em um banho de
gelo e adicionado 5 mL de água. Sendo realizada, posteriormente, a leitura em
espectrofotômetro em 540 nm. Para o cálculo da concentração de glicose, utilizou-se
uma curva de correlação, conforme Gráfico 4.
 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após o término das práticas iniciou-se a construção dos gráficos para

avaliação do crescimento microbiano. O grupo ficou responsável pelo Frasco 3A:
meio YED contendo 140 ml.
Para montar o primeiro gráfico construiu-se a seguinte tabela:

M cadinhos (g) M cadinhos + cél(g) Massa cél(g) V (ml) [X] Biomassa Absorbância
1 32,875 32,836 -0,039 10 -3,9 0
2 28,329 28,34 0,011 10 1,1 0,022
3 32,731 32,736 0,005 10 0,5 0,068
4 33,968 33,938 -0,03 10 -3 0,212
5 39,345 39,395 0,05 10 5 0,282
6 27,503 27,55 0,047 10 4,7 0,63

A concentração de biomassa foi calculada com os valores das massas das

células que restaram nos cadinhos secos e o volume colocado nos cadinhos, assim:

𝑚𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎 × 1000
[𝑋] =
10

Pode-se observar alguns equívocos em relação as massas dos cadinhos com

as células, onde alguns valores apresentaram-se menores que a massa dos
cadinhos vazios 1 e 4. Isso pode ser justificado pela diferença de manuseio entre as
pessoas que pesaram os cadinhos vazios e os cadinhos com célula e também a
diferença da umidade do ar no laboratório.
Utilizando os valores de concentração de biomassa e os valores de
absorbância medidos no espectrofotômetro construiu-se o gráfico abaixo (1) para se
obter uma curva de correlação. Para melhor observação do gráfico preferiu-se
ignorar os valores negativos.
Gráfico 1 – Absorbância X Concentração de Biomassa

0,7

0,6

0,5
Absorbância

0,4
y = 0,0961x - 0,0211
0,3 R² = 0,6666

0,2

0,1

0
0 1 2 3 4 5 6
Concentração

Fonte: Os autores (2016)

A partir da equação gerada no gráfico acima calculou-se os valores das

concentrações baseadas nas absorbâncias medidas na aula prática de cinética do
crescimento microbiano realizada no sábado.

𝑦 + 0,0211
𝑥=
0,0961

Onde y é a absorbância e x a concentração de biomassa. A tabela abaixo

mostra os valores de concentração, as absorbâncias medidas no espectrofotômetro
e o tempo referente a cada concentração.

Concentração de Biomassa Absorbância Tempo (h)

22,27991675 2,12 1
23,42455775 2,23 2
62,13423517 5,95 3
88,66909469 8,5 4
60,57336108 5,8 5
50,16753382 4,8 6
67,85744017 6,5 7
 Com os valores desta tabela construiu-se o gráfico de concentração de
biomassa por tempo de inóculo. A absorbância foi medida a cada uma hora de
agitação. Excluiu-se o último valor de concentração para melhor apresentação do
gráfico.

Gráfico 2 – Concentração de biomassa X tempo

100
90
80
Concentração de Biomassa

70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Tempo (hora)

Fonte: Os autores (2016)

Na curva pode-se observar que os microrganismos tiveram uma fase lag curta
e logo entraram em fase log, de crescimento exponencial. Esse crescimento foi
muito rápido, porém a curva não apresenta fase estacionária, apresentando
diretamente a fase de morte, como apresentado no gráfico teórico citado por
Spolidoria (2013, p. 34), apresentado no desenvolvimento deste trabalho.
O resultado da curva apresentada pelo gráfico não foi o esperado, visto que
este não demonstrou fase lag, fase log e fase estacionária bem definidas. Isso pode
ser justificado pela troca de turno da aula, manuseio incorreto da pipeta e do
espectrofotômetro.
Para uma melhor comparação, encontra-se abaixo o gráfico referente ao
grupo responsável pelo frasco 1 A, em que a curva apresentou as fases bem
definidas.
Gráfico 3 – Curva de crescimento microbiano equipe 1 A

35
Concentração de biomassa 30
25
20
15
10
5
0
0 2 4 6 8 10
Tempo

Fonte: Equipe 1 A (2016)

A fase lag se encontra entre os tempos 0h e 4h, onde se inicia a fase log de
crescimento exponencial que termina no tempo 8h, que se observa a fase
estacionária.
Para a construção do gráfico de concentração x substrato primeiramente se
construiu a curva de correlação da glicose.

Gráfico 4 – Curva de correlação da glicose

1,6

1,4

1,2

1
Aborbância

0,8
y = 0,664x + 0,0696
0,6
R² = 0,9922
0,4

0,2

0
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Concentração de glicose (g/L)

Fonte: Os autores (2016)

 A partir da equação gerada na curva de correlação, calculou-se a
concentração do substrato utilizando os valores de absorbância apresentados na
curva de correlação.

𝑦 + 0,0696
𝑥=
0,664

Onde y é a absorbância medida e x a concentração do substrato, que os

valores estão representados no gráfico abaixo.

Gráfico 5 – Concentração de biomassa X Concentração de substrato

100 2,5
90

Concentração de substrato
Concentração de biomassa

80 2
70
60 1,5
50
40 1
30
20 0,5
10
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7
Tempo (h)

Fonte: Os autores (2016)

A tabela apresenta os dados apresentados no gráfico.

Tempo [X] Biomassa [S] Substrato Absorbância

0 22,27991675 1,56686747 1,11
1 23,42455775 2,286746988 1,588
2 62,13423517 1,642168675 1,16
3 88,66909469 1,413253012 1,008
4 60,57336108 0,398192771 0,334
5 50,16753382 0,059337349 0,109
6 67,85744017 0,089457831 0,129
 Como novamente as curvas não apresentaram o resultado esperado,
comparou-se com o gráfico da equipe 1 A, encontrado abaixo.

Gráfico 6 – Concentração de biomassa x concentração de substrato equipe 1 A

Substrato x Crescimento
0,9 35
0,8 30
0,7
25
0,6
[S] g/L

0,5 20
0,4 15
0,3
10
0,2
0,1 5

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tempo (h)

Fonte: Equipe 1 A (2016)

Observou-se diversas alterações nos resultados práticos quando comparados

a literatura. Pelczar (1996) descreve que a fase estacionária é onde ocorre
diminuição na taxa de divisão celular e o início do declínio na população dos
microrganismos. Nossa curva de crescimento não apresentou uma fase estacionária
bem definida, o que pode significar que logo após a fase log já teve o início do
declínio da população, seguido da fase de morte celular.
Estas alterações nos resultados podem ser explicadas considerando o
manuseio dos materiais que foi feito por alunos diferentes, o armazenamento das
amostras, fatores físicos como ph e temperatura, entre outros fatores que podem
alterar os resultados práticos. Entretanto, essas alterações não impediram a análise
do crescimento microbiano e a compreensão dos gráficos pela equipe. Por isso,
pode-se dizer que os objetivos foram alcançados.
 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

MADIGAN, Michael. Microbiologia de Brock. São Paulo: Prentice hall, 2004, Ed.
10.

PELCZAR Jr., Joseph Michael et al. Microbiologia: conceitos e aplicações. v.1,

ed.2. São Paulo: Makron books, 1996.

SPOLIDORIO, Denise M. Palomari, DUQUE, Cristiane. Microbiologia e imunologia

geral odontológica. São Paulo: Artes Médicas, 2013.