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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIANECIAS

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BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO

Departamento De Bioquímica

Laboratorio De Métodos De Análisis

“Separación de una mezcla de azul de metileno y fluoresceina


usando cromatografía por adsorción”

Cordero Venegas Eduardo

5QM1
PROFESOR QUE EVALUA:
Gabriela Olguín Ruiz
SECCIÓN 3

Fecha de realización: 23 de octubre del 2018


FECHA DE ENTREGA: 30 de octubre del 2018
OBJETIVOS

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 Aplicar la técnica de cromatografía por adsorción para la separación de azul de metileno
y de fluoresceina.
 Comprobar la separación con base en el perfil de elución.

FUNDAMENTO DEL METODO:


La cromatografía líquida de adsorción se caracteriza por utilizar una fase estacionaria sólida
(Adsorbente) de carácter polar y una fase móvil líquida (Eluyente) apolar, y se utiliza tanto con
fines analíticos (identificación de sustancias) como con fines preparativos (aislamiento), siendo
su limitación más importante la dificultad de separar sustancias de polaridad parecida.

En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria la constituye un sólido poroso finamente


granulado, siendo el proceso de adsorción debido a las atracciones intermoleculares dipolo-
dipolo o puentes de hidrógeno entre los componentes de la muestra y el adsorbente. El
adsorbente más utilizado es el gel de sílice, aunque también se utiliza alúmina activada: debe
tenerse en cuenta que la capacidad de retención de un adsorbente varía en función de su
grado de activación que a su vez depende del contenido en agua: La activación requiere
eliminar de su superficie el agua adsorbida, operación que se lleva a cabo por secado
prolongado a vacío y alta temperatura; aunque un exceso de activación puede producir
adsorciones irreversibles e incluso reacciones catalíticas indeseadas. Por otra parte, la fase
estacionaria debe ser químicamente inerte con las sustancias que se pretenden separar, por
lo que hay que tener en cuenta que el gel de sílice tiene carácter ácido, mientras que la alúmina
puede adquirirse con carácter ácido, básico o neutro.

La fase móvil está constituida por una mezcla de disolventes que deben ser, al menos,
parcialmente solubles. Para una fase móvil determinada, cuanto más polar sea la sustancia
de la muestra, más va a ser retenida por la fase estacionaria (o menos arrastrada por la fase
móvil), mientras que por lo que respecta a la velocidad de elución de una sustancia
determinada, depende de la naturaleza de la fase móvil: cuanto más polar sea la fase móvil
más se desactivará la fase estacionaria y, por lo tanto, menos retenida quedará la sustancia
en cuestión, recogiéndose en el cuadro adjunto una relación de los disolventes más utilizados
en esta tipo de cromatografía.
RESULTADOS

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Tabla 1. VALORES DE ABSORBANCIA OBTENIDAS PARA LA SEPARACION DE
FLUORESCEÍNA Y AZUL DE METILENO.
Volumen (Fluoresceína) (Azul de
de A493 metileno)
elución A668
(mL)
3 0.003 0
6 0.004 0.028
9 0.068 1.224
12 0.031 0.402
15 0.014 0.072
18 0.016 0.032
21 0.011 0.02
24 0.003 0.008
27 0.003 0.006
30 0.012 0.006
33 0 0
36 0.024 0.001
39 0.744 0.001
42 0.606 0.005
45 0.23 0.005
48 0.128 0.007
51 0.053 0.009
54 0.075 0.043
57 0.054 0.031
60 0.009 0
1.4
Pico de absorbancia de azul
1.2 de metileno.

1 Pico de absorbancia de
fluoresceína.
0.8
A

A493
0.6
A668
0.4 Segundo pico de
absorbancia de
0.2 azul de metileno
a 493 nm.
0
0 10 20 30 40 50 60
Volumen de elucion (mL)

Figura 1.- Perfil de elución del azul de metileno (A668) t de la fluoresceína (A493)
PREGUNTAS ADICIONALES:

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1. Especifique y defina los elementos del sistema cromatógrafo para esta separación.

Soporte: Columna de vidrio, con el objetivo de mantener fija a la fase estacionaria y de


materiales inertes que no interactúen con el soluto.

Fase estacionaria: Alúmina acida, puede ser sólido o líquido que tiene como objetivo sele mm
medio por el cual pasa el soluto y la fase movil.

Fase móvil: Agua destilada pH 5 y regulador de fosfatos pH 2, que transporta la muestra a


través de la fase estacionaria, puede ser liquido o gas.

Soluto: Mezcla de azul de metileno y fluoresceína, el análito que se desea separar.

2. Defina el termino adsorción y empleando formulas, esquematice que fuerzas


intermoleculares participan en el proceso de separación de los solutos.

Fenómeno por el cual moléculas de un gas o de un líquido se fijan dentro de una fina capa
superficial de determinadas sustancias sólidas (llamadas por esto absorbentes), como el
carbón animal, las arcillas activadas, la alúmina, la bauxita activada, etc. La adsorción puede
ser de naturaleza física o química. Es una operación en la que una determinada sustancia
(adsorbato) se transfiere desde un fluido hasta la superficie de un sólido (adsorbente), cuyas
paredes están en contacto con dicho fluido.
Esquema en el anexo.

3. Considerando las propiedades de solubilidad de los colorantes, indique que


modificaciones haría para invertir el orden de la elución.

Existe la alúmina básica por cual repulsara a la fluoresceina con la fase movil de regulador de
fosfatos pH 12, el azul de metileno va a interaccionar con la fase estacionaria y dado que no
es soluble en el regulador se quedará adherido a la alúmina y por consiguiente cambiar fase
movil por agua destilada pH 5 para protonar a la alúmina y disuelva siendo así eluído el azul
de metileno.

DISCUSIÓN
Se obtuvieron 20 fracciones de la separación de la mezcla de azul de metileno y de
fluoresceína. Como se puede ver en el perfil de elución se observa a un volumen de 9mL se
obtuvo dos picos de absorbancia, el primero y muy evidente a 668 nm y otro pico no muy
notorio, muy chico a 493 nm, que corresponden al azul de metileno, a otro volumen de 39 mL
se obtuvo otro pico de absorbancia a 493 nm que corresponde a la fluoresceína. De acuerdo
a la bibliografía el azul de metileno tiene lentitudes de onda de absorbancia a 668 y 609 nm
respectivamente por lo que se puede asegurar que se separó de la muestra el azul de metileno
en primer lugar, la fluoresceina marca la bibliografía que tiene absorbancias 493.3 y 460 nm
por lo que el perfil de elución a 493 nm corresponde a la fluoresceina.
Observando el perfil de elución las dos curvas no presentan picos de abosorbancias en los

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tubos posteriores a los 12 mL hasta los 39 mL donde se presenta el pico de la fluoresceina
por lo cual se puede corroborar que la separación de la mezcla fue eficiente y correcta.

Para poder entender cómo se llevó acabo la cromatografía por adsorción debemos tener en
cuenta las características de los solutos, las fases móviles y la fase estacionaria:

La fase estacionaria es la alúmina acida, que está compuesta por óxido de aluminio (Reactivo
de Brockmann), con un pH 4.5 +/- 0.5 en agua, se encuentra protonada por H+ por lo que las
fuerzas de repulsivo serán el fundamento para la separación. Siendo de naturaleza polar
retiene de mejor manera a los componentes polares.

El azul de
metileno
tambien
conocido como
cloruro de
metiltionina,
que es un
colorante que
es usado para
tratar una
enfermedad
llamada

metahemoglobinemia, siendo un compuesto sólido como polvo, es soluble en agua,


cloroformo y alcohol. Como se observa la estructura tiene carga positiva por lo cual al estar en
contacto con la alúmina acida se van a repeler y es debido a esto que es el primero en eluir
en las primeras fracciones. Esta interacción impide la fijación del colorante en la alúmina.

La fluoresceina se preparó de fluoresceína sódica, es un polvo amarillo que se disuelve en


soluciones alcalinas por lo que
intensifica la fluorescencia verde, es
polar y tiene cargas negativas como se
muestra en la figura de la izquierda, por
lo que interactúa con la alúmina siendo
fijada a ella mediante puentes de
hidrogeno, por ello es que se mantiene
de forma uniforme en la parte superior
de la fase estacionaria

Ya estando seguros de que se hubiera


eluído por completo el azul de metileno
se procede a cambiar la fase movil por
el regulador de fosfatos de pH 12 por lo cual se desprotonan la alúmina haciéndola de carga
negativa y así tanto se va a repeler por las mismas cargas negativas y dado que el medio va
a ser alcalino se disolverá favoreciendo la elución de la fluoresceina.
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CONCLUSIONES
 Se llevó a cabo una eficiente evidenciado en el perfil de elución.
 Se usan las fuerzas de repulsión y la solubilidad para la cromatografía por adsorción.
 El azul de metileno absorbe a 493 y 668 nm,
 La fluoresceina absorbe a 493 nm.
REFERENCIAS
 ENRIQUE CASTAÑOS. (2015). CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN. 27/10/2018, de
LIDIA CON LA QUÍMICA Sitio web:
https://lidiaconlaquimica.wordpress.com/2015/08/14/cromatografia-de-adsorcion/
 Cromatografía Líquida de Adsorción. 27/10/2018, de RODAS Sitio web:
https://rodas5.us.es/file/23a16560-123f-bec5-ec5b-
44a3042a281d/2/laboratotio_quimica_organica_SCORM.zip/pagina_24.htm
 Conceptos fundamentales de cromatografía. 27/10/2018, Sitio web:
http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/principios
_de_cromatografia.pdf
 (2007). Técnicas Cromatografías. 27/10/2018, de Universidad Nacional Autónoma de
México Sitio web:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf
 Técnicas cromatograficas. 27/10/2018, Sitio web:
http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/Quimica%20analitica%20ambiental
/Tema6.pdf

ANEXO: