ANÁLISIS ENZIMATICO PARA LA MEDIDA DE GLUCOSA

MEDIANTE LAS REACCIONES DE GLUCSA OXIDASA Y

PEROOXIDASA.

INTRODUCCIÓN

El análisis enzimático se trata de la determinación cuantitativa de concentraciones de sustancias, los

analitos, usando enzimas como reactivos analíticos y es cada vez más usado hoy en día. Se usa para la
media de la actividad catalítica de las enzimas, así como la determinación cuantitativa de concentraciones
de sustancias con ayuda de reactivos marcados con enzimas.

Los métodos empleados en el análisis enzimático cada vez se extienden más, ya que presentan muchas
ventajas frente a otros métodos de análisis, como es que su procedimiento es muy sencillo, el costo de la
realización es muy bajo, así como la fácil interpretación de los datos que se obtienen. Aun así, también
presenta alguna que otra desventaja, como la baja sensibilidad, ya que no se detectan diferencias sutiles
entre muestras (menores del 5% relativo) y su falta de exactitud.

En este caso, se va a realizar la medida de la glucosa mediante dos métodos de análisis enzimático, el
cinético y a punto final, basados en el empleo de dos reacciones enzimáticas acopladas, catalizadas por la
glucosa oxidasa y la peroxidasa. Se emplea la o-dianisidina como sustrato de esta última enzima, ya que nos
permitirá tener un producto coloreado al cual se le podrá medir la absorbancia en el espectrofotómetro.

La medición de la glucosa se puede llevar a cabo gracias a las enzimas mencionadas anteriormente, debido
a que la glucosa oxidasa cataliza la oxidación de la β-D glucosa, por la vía del D-glucano- δ-lactona, hacia
ácido glucónico y peróxido de hidrógeno (comúnmente conocido como agua oxigenada), usando el oxígeno
molecular como aceptor final de electrones. En medio líquido, la glucosa se encuentra en α-D-glucosa y β-D-
glucosa, pero se puede determinar la cantidad total de glucosa ya que la α-D-glucosa pasa a β-D-glucosa por
mutarrotación espontánea.
Luego, ese peróxido de hidrogeno se utiliza para oxidar a otro sustrato, en nuestro caso la o-dianisidina, la
cual en su estado oxidado presenta un color marrón, y por tanto se puede medir la absorbancia a 440 nm
con un espectrofotómetro.

Sabiendo esto, se concreta que la glucosa oxidasa se trata de la enzima auxiliadora, ya que es la que tiene
como sustrato la molécula a la cual se quiere medir su concentración, la glucosa. Por otro lado, la
peroxidasa se trata de la enzima indicadora, ya que da un producto coloreado el cual se puede medir,
acoplando un producto de la reacción anterior y así poder realizar la medición.

Así, terminada las dos reacciones y obteniendo la o-dianisidina oxidada total, se podrá determinar la
concentración de glucosa de la muestra problema por la interpolación de la absorbancia que se obtiene en
una recta de calibrado que se ha calculado previamente utilizando diferentes muestras de glucosa en agua a
diferentes concentraciones conocidas (las muestras de disoluciones patrón) y sus correspondientes
absorbancias.

Este método de análisis enzimático se llama método del punto final, en el que las reacciones tienen que
estar completamente desplazadas hacia la formación de productos, para así poder determinar la formación
de productos de reacción, en este caso la o-dianisidina oxidada, o la desaparición de alguno de los
reactivos, tanto para reacciones simples o por acoplamiento con reacciones indicadoras, como en este
experimento. Este método es el más simple y más ampliamente utilizado.

Hay que tener en cuenta que todos los sustratos de las reacciones indicadoras y auxiliadoras, menos el que
se va a determinar, tienen que estar en concentraciones saturantes para que ninguno de ellos sea limitante
en la velocidad de reacción, al igual que todos los efectores y todas las enzimas tanto auxiliadoras como
indicadoras.

Se puede considerar que la reacción ha llegado al punto final cuando el sustrato que se analiza haya
desaparecido en un 99’9%. El tiempo necesario se calcula con la ecuación integrada de Michaelis-Menten,
de la que se puede despejar el tiempo de reacción, en el cual la reacción se haya completado, es decir, que
concentración de sustrato sea un 0.01% de la inicial.

En el caso de la glucosa oxidasa y peroxidasa, basta con unos 15-30 minutos.

La glucosa oxidasa presenta una Km para la glucosa muy elevada, entre 30-100 mM, hecho que permite que
se pueda emplear también el método cinético para determinarla concentración de glucosa de una muestra,
basándonos en la correlación existente entre velocidades de reacción y concentración de sustrato.

Esto se demuestra gracias a la ecuación de Michaelis-Menten:

Cuando la Km de una enzima es mucho más grande que la concentración de sustrato, es decir, [S] <<<Km, la
concentración de sustrato puede despreciarse como sumando en el denominador de la ecuación por lo que
se deduce que la velocidad de reacción es proporcional a la concentración de sustrato:

Donde Km es la constante de afinidad, Vo la velocidad de reacción y [S] la concentración de sustrato y Vmax

la velocidad máxima.

La técnica permite construir curvas patrones de concentraciones de sustrato conocidas, y manteniendo las
mismas condiciones de experimentación, interpolar las velocidades obtenidas a concentraciones de
sustrato desconocidas, pudiéndose determinar las correspondientes concentraciones de sustrato problema,
gracias a los incrementos de absorbancia que se obtienen en el espectrofotómetro.

Esté método es muy utilizado en bioquímica, tanto en investigación como en análisis clínico, como por
ejemplo en la determinación de glucosa en sangre, líquor y líquidos ascítico, pleural y sinovial, pero
mediante un diagnostico in vitro, y la muestra debe ser obtenida después de ayunos de como mínimo 8
horas. También se utilizan en ensayos rápidos como los de las tiras reactivas de orina. La aplicación más
frecuente de la determinación de glucosa es para detectar y monitorizar desordenes de la regulación de la
concentración de glucosa en sangre, como por ejemplo la diabetes mellitus. También se realiza en pacientes
que presentan un cambio en el comportamiento, episodios de desmayo o convulsiones por primera vez.
Además, las máquinas que tienen los diabéticos para poder determinar su índice de glucemia antes de cada
comida, realizan esta sucesión de reacciones para poder determinarla e indicarla.

Ensayos similares permiten monitorear los niveles de glucosa en procesos de fermentación, biorreactores, y
el control de niveles de glucosa en materia prima vegetal y productos alimentarios.

El objetivo de la práctica es aprender los fundamentos del análisis enzimático, estudiando los métodos
cinéticos y e punto final, para poder saber cuáles son las ventajas y desventajas de cada uno de ellos.
Además, se va a aprender a medir la velocidad inicial catalizada por enzimas, así como a establecer cuál es
el rango de aplicación, es decir el intervalo dinámico.

Se identificarán los tipos de error y como se calculan, y la determinación de la exactitud y precisión de

ambos métodos analíticos.
 Por último, se analizarán los datos para poder decidir que método es más adecuada a cada análisis, según el
tipo de muestra que se estudie.

Para todo esto, se realizará la determinación de glucosa en diferentes muestras.

RESULTADOS

Figura 1. Recta patrón obtenido por el método cinético, donde se representa incremento de absorbancia frente a
concentración de glucosa (mM). Se realizo mediante el ajuste lineal por el método de mínimos cuadrados. Se obtiene
la recta Y=0.3059X+0.00165 con un coeficiente de regresión de 0.99.
Figura 2. Recta patrón obtenido por el método del punto final, donde se representa absorbancias finales frente a
concentración de glucosa (mM). Se realiza el ajuste lineal por el método de mínimos cuadrados obteniendo la
recta Y=1.176X+0.02648 con un coeficiente de regresión de 0.8073.

Tabla 1. Tratamiento de las rectas de

calibrado. Se presentan los volúmenes
de agua destilada y de una disolución de glucosa 1mM necesarios para obtener las disoluciones de
concentración indicada para realizar la recta patrón. Se muestra las absorbancias de cada concentración
para los dos métodos enzimáticos.

V glucosa ΔA/min A (final)

estándar 1 mM
Tubo V H2O (μL) [Glucosa] (mM) Método cinético Método del
(μL) punto final

Blanco 400 0 0 0,0000 -

1 380 20 0,05 0,0164 0,111

2 360 40 0,10 0,0294 0,246

3 340 60 0,15 0,0481 0,365

4 320 80 0,20 0,0689 0,507

5 300 100 0,25 0,0803 0,592

 6 280 120 0,30 0,0939 0,729

7 240 160 0,40 0,1185 0,885

8 200 200 0,50 0,1573 1,089

9 160 240 0,60 0,1833 1,119

10 120 280 0,70 0,2161 1,131

11 0 400 1,00 0,3076 1,135

Tabla 2. Tratamiento de las muestras problema. Se muestra las absorbancias de las cinco replicas realizadas
de la muestra problema en ambos métodos y la concentración de glucosa a la que corresponde. Se muestra
la media y desviación estándar de las concentraciones de glucosa y los errores absoluto y relativo frente a la
concentración real de la muestra.

ΔA/min A (final) Método [Glucosa] (mM) [Glucosa] (mM)

Réplica nº Dilución Método cinético del punto final Método cinético Método punto
final

1 1/50 0,0381 0,246 5,95 4,76

2 1/50 0,0391 0,257 6,12 5,02

3 1/50 0,0374 0,258 5,84 5,04

4 1/50 0,0379 0,263 5,92 5,16

5 1/50 0,0364 0,249 5,68 4,83

Media 5.902 4.960

[Glucosa] (mM) real: 4 Desviación estándar 0.144 0.146

Exactitud Error absoluto 1.902 0.96

Exactitud Error relativo 47.6% 24%

Tabla 3. Tratamiento de las muestras de refrescos. Se determina las absorbancias por ambos métodos de
los refrescos de tónica normal, cola normal, tónica cero y cola cero. Los refrescos normales se midieron en
una dilución 1/1000. Se muestran las concentraciones de glucosa que se obtienen para cada método.
Valores que no concuerdan se marcan con un *.

ΔA/min A (final)
Método del
Refresco Réplica nº Dilución Método [Glucosa] [Glucosa]
punto final
cinético (mM)
 (mM)

Tónica 1 1/1000 0,0886 284,21 0,556 239,38

normal
2 1/1000 0,1072 345,01 0,665 290,08

1 - 0,0104 0,029 0,112 0,033

Tónica “cero” 2 - 0,0116 0,032 0,122 0,038

1 1/1000 0,0511 161,62 0,316 127,75

Cola normal 2 1/1000 0,0504 159,33 0,302 121,24

1 - 0,0126 0,035 0,950* 0,423

Cola “cero” 2 - 0,0140 0,040 0,940* 0,418

Tabla 4. Resumen de los resultados obtenidos.

Parámetros Método cinético Método a punto final

Rango lineal dinámico (LOQ/LOL) 0,05/1 0,05/0.5

Ecuaciones de las rectas de calibrado (y=mx+b) Y=0,3059X+0,0017 Y=2,150X+0,0413

Valor de R2 (regresión lineal simple) 0,9990 0,9923

Sensibilidad del método (m) 0,3059 2,150

Media de las concentraciones problema de 5,902 4,96

glucosa (mM)

Repetibilidad como desviación estándar 0,144 0,146

Exactitud como error absoluto frente al valor 1,902 0,96

real

Exactitud como error relativo frente al valor 47,6% 24%

real

Concentración de glucosa en Tónica normal 314,61 264,73

(mM)

Concentración de glucosa en Tónica cero (mM) 0,031 0,036

Concentración de glucosa en Cola normal 160,475 124,495

 (mM)

Concentración de glucosa en Cola cero (mM) 0,038 0,421

Selectividad frente a interferencias por color + -

(+/-)

Tabla 5. Cálculo de la probabilidad asociada a la prueba de t de Student. Se muestra la media y desviación

estándar de los valores de glucosa (mM) obtenidos por 4 grupos de alumnos, así como la probabilidad de
que las medias de las muestras de los grupos B, C y D sean diferentes a la del grupo A. Se marca con un * los
grupos que presentan diferencias significativas. El cálculo se realiza mediante la prueba de t de Student y se
consideran significativas aquellas con un p valor menor de 0.05. (P<0.05)

N.º Réplica Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D

1 0,22 0,31 0,26 0,41

2 0,21 0,35 0,25 0,27

3 0,19 0,29 0,24 0,36

4 0,18 0,26 0,26 0,21

5 0,21 0,3 0,25 0,23

Media (mM) 0,202 0,302 0,252 0,296

Desviación estándar (mM) 0,0164 0,0327 0,0083 0,0859

P (probabilidad) - 0,0009* 0,0009* 0,0697

DISCUSIÓN

De las absorbancias obtenidas para cada disolución patrón, mostradas en la Tabla 1, para el método
cinético se obtiene la recta patrón Y= 0.3059X + 0.001648 con una R 2 de 0.9990, por lo que es un ajuste es
muy bueno y adecuado. De su representación, Figura 1, se observa que es lineal dentro de todos los
puntos, por lo que, el límite de cuantificación de 0.05 mM de glucosa y el límite de linealidad es 1 mM, de lo
que se deduce que el rango lineal dinámico es [0.5-1] mM.

Por el método del punto final, al representar las absorbancias finales frente a las concentraciones de
glucosa, como en la Figura 2, se ve que al principio presenta linealidad y luego se pierde. Al hacer la
regresión lineal se obtiene la recta Y=1.176X + 0.2648 con un R 2 de 0.8073. El ajuste no es muy bueno, por
lo que se eliminan los puntos que se salen de la linealidad, que son los tres últimos puntos,
correspondientes a las concentraciones de glucosa de 0.6, 0.7 y 1 mM. Se realiza de nuevo una regresión
lineal con estos putos eliminados, obteniendo la Figura 3 y se obtiene la recta Y=2.150X + 0.0413 con un R 2
de 0.9923, por lo que ahora es un mejor ajuste.

Por tanto, el límite de cuantificación es de 0.05 mM y el límite de linealidad es 0.5 mM, así que el rango
lineal dinámico es [0.05-0.5] mM.

La sensibilidad de un método analítico se relaciona con la cantidad mínima de analito requerida para dar un
resultado significativo, cualitativo o cuantitativo. Un método analítico es más sensible cuanto mayor sea la
variación de la señal analítica “y” para una variación de la concentración del analito “x” dada, por lo que la
sensibilidad de un método viene dada por la pendiente de la curva de calibrado.
Así, comparando las pendientes de las rectas de calibrado de cada método, 0.3059 para el método cinético
y 2.150 para el método del punto final, se puede decir que el método del punto final presenta mayor
sensibilidad, ya que su pendiente es mayor, en concreto 7 veces más, por lo que es 7 veces más sensible
que el método cinético.

Con ayuda de estas rectas, se determina la concentración de glucosa de una muestra haciendo cinco
replicas. La muestra presentaba una concentración de glucosa que se salía dentro del rango lineal dinámico,
es decir, se salía de nuestra recta patrón, por lo que fue necesario diluir la muestra, que en nuestro caso se
determinó que se podía hacer una dilución 1/20 o 1/50. Escogimos la dilución 1/50 porque había menos
probabilidad de que alguna replica nos diera un punto fuera del rango de la recta. De las medidas de las
cinco replicas se calcula la media y su desviación estándar. Del método cinético se obtiene una media de
5.902 mM con una desviación estándar de 0.144 y en el método del punto final se obtiene una media de
4.96 mM y una desviación estándar de 0.146. Los resultados se muestran en la Tabla 2. La desviación
estándar sirve para expresar la repetibilidad, y viendo estos resultados, se puede considerar una buena
repetibilidad, ya que la desviación no es grande para ninguno de los métodos.

Se compara la media obtenida de concentración para cada método con la concentración real, la cual es de 4
mM. Para determinar la exactitud se calcula el error absoluto y relativo frente al valor de real, obteniendo
1.902 y 47.6% respectivamente para el método cinético y 0.96 y 24% para el método del punto final,
deduciendo que este último es el método más exacto, ya que es con el que se obtiene un menor error y por
tanto se acerca más a concentración de glucosa real, 4 mM.

La media de concentración sale muy diferente entre ambos métodos, pero además, se encuentran muy
alejados de la concentración real, por lo que pensamos que habíamos cometido algún error a la hora de
diluir la muestra, por lo que volvimos a hacer otra medida de la muestra, pero esta vez con una dilución
1/20, pero aun así nos seguía dando una concentración de glucosa de 5.64 mM y de 5.91 mM para el
método del punto final, que eran resultados similares a los que obtuvimos con las diluciones 1/50, por lo
que pensamos que habíamos cometido algún error a la hora de medir las absorbancias para realizar la recta
patrón o que nuestra muestra problema en realidad no era de 4 mM de glucosa. Lo más probable es que
fuera un fallo experimental nuestro, ya que con en ambos métodos no nos da una concentración de glucosa
similar, sino que hay una diferencia de casi 1 mM, cosa que tampoco concuerda.

Por otro lado, se determinó la concentración de glucosa en 4 tipos de refrescos, cola normal, cola cero,
tónica normal y tónica cero, y para cada uno de ellos se realizó dos replicas. En los refrescos de cola normal
y tónica normal se determinó que había que diluir, ya que se sabe que estos refrescos tienen una alta
concentración de glucosa, por lo que era necesario hacer una dilución 1/1000 para que al medir en el
espectrofotómetro la absorbancia obtenida no se saliera del rango lineal dinámico de las rectas patrones
para los dos métodos. En los refrescos de cola cero y tónica cero no era necesario diluir, ya que no deberían
tener glucosa, porque supuestamente son sin azúcar.
Los resultados de las réplicas para cada refresco se muestran en la Tabla 3. Se calcula la media de ambas
replicas, independientemente para cada método empleado, obteniendo las concentraciones medias, que se
muestran en la Tabla 4. Con estos resultados se puede discutir cuál de los dos métodos es más conveniente
debido a los pros y contras que tiene cada uno, que se deducen al analizar los resultados y ver las
interferencias que han podido ocurrir.

Llama la atención los resultados que se obtienen de la concentración de glucosa de la coca cola cero por el
método del punto final, ya que sale que tiene una alta absorbancia, y, por tanto, una alta concentración de
glucosa, en concreto, 0.421 mM, cuando no debería ser así, ya que es un refresco sin azúcar. Esto es debido
a que en la coca cola cero no hacía falta diluir la muestra, y, por tanto, la muestra era coloreada, e influía en
la medición de absorbancia, se causaba interferencias. En la coca cola normal, como se diluyo 1/1000,
estaba tan diluía la muestra que no presentaba color, y no interfería en la medición de la absorbancia. Sin
embargo, por el método cinético, si se obtienen valores esperables de concentración de glucosa en la cola
cero, ya que se obtiene una concentración de 0.038 mM, una concentración baja, y concuerda con el tipo
de muestra, ya que es sin azúcar.

También se observa, que, en la tónica, al ser un refresco sin color, en la tónica normal y cero se obtienen
valores esperables por el método del punto final y el método cinético, es decir, no se obtienen
interferencias.

Por tanto, se concluye que el método cinético, presenta la ventaja de que mide pendientes, variaciones de
absorbancia en las distintas muestras, por lo que no hay preocupación de que la cubeta esté un poco
teñida. Además, al medir incrementos, es esencial para medir concentraciones de muestras que son
coloreadas, como en nuestro caso, al medir la concentración de glucosa en el refresco de cola, por lo que
este método es más selectivo para muestras que presentan color, es decir, presenta una reducida
sensibilidad para las interferencias. Otra ventaja que presenta es que este método es más rápido La
desventaja de este método es que las medidas no pueden ser muy exactas, ya que, las reacciones para
construir la recta patrón a partir de muestras conocidas de metabolito y las reacciones problema deben
realizarse a un mismo tiempo fijo, ya que se están comparando velocidades iniciales de reacciones de
pseudorden unos, dicho de otra forma, se comparan concentraciones de sustratos transformados en un
tiempo determinado, y este tiempo a la hora de la experimentación puede variar, ya que se pierde tiempo
desde que se dispara la reacción, hasta que la cubeta se mete en el espectrofotómetro, y en ese intervalo
de tiempo se pierden segundos importantes donde se está dando la reacción y aumenta el margen de error,
además de que no se mide directamente la concentración de un sustrato, si no velocidades de reacción, lo
que puede hacer que aumente aún más el error.

El método del punto final, también tiene sus ventajas particulares, ya que, al medir absorbancias finales,
específicas de cada muestra, es más exacta y tiene menos probabilidad de error, ya que la reacción no está
en curso, si no que ya ha finalizado y se mide la concentración exacta que hay del producto que se está
midiendo. Por ello, en general, este método, es mejor que el cinético. Aquí hay que tener mucha precaución
de hacer bien el blanco, para que así no nos interfiera en los datos que la cubeta esté coloreada. Sin
embargo, como se miden absorbancias finales, que la muestra sea coloreada si interfiere en las medidas,
dando resultados erróneos, por lo que este método es más selectivo para muestras, incoloras como la
medida de glucosa en agua o en tónica en nuestro caso, y es menos selectivo para muestras coloreadas,
como la cola.

Para evitar las interferencias que se dan en las muestras de cola, se podrían hacer algunas modificaciones al
método empleado como, por ejemplo:

 Se podría medir de igual manera, pero teniendo de reactivo para la peroxidasa otro que no sea la o-
dianisidina, ya que la peroxidasa puede catalizar la oxidación de muchos sustratos, los cuales pasan
a tener color y se pueden medir de igual forma la absorbancia, y se podría elegir una molécula que
al oxidarse presenta una absorbancia suficientemente diferente a la que presenta la muestra de
cola para que no se de interferencia.
  Cuando la glucosa oxidasa oxida a la glucosa para formar D-gluconolactona,
se consume oxígeno, por lo que podría seguirse manométricamente o mediante un electrodo de
oxígeno la cantidad de glucosa de la muestra.

 Por fluorimetría se podría medir, ya que, si se realiza el método de la hexoquinasa, la glucosa 6-

fosfato se transforma en 6-fosfogluconato produciéndose NADPH, el cual tiene florescencia, y su
forma oxidada no. Por lo que midiendo el aumento de florescencia se podría mediar la cantidad de
glucosa en la muestra.

 Cuando la glucosa se oxidasa por acción de la glucosa oxidasa, se desprenden electrones, los cuales
se pueden medir por electrodos, que generan una corriente eléctrica que se puede medir. Esa
corriente eléctrica es directamente proporcional a la concentración de glucosa de la muestra.

 También se podría diluir la muestra para que no interfiera el color, pero en una muestra de cola
cero, al diluir, se podría llegar a una concentración de glucosa por debajo del límite de
cuantificación.

En los refrescos, la glucosa no es el único azúcar presente, si no que se pueden encontrar bastantes tipos de
azucares, solo hay que mirar las etiquetas de estos, y todo lo que acabe en –osa, se trata de un azúcar.
Podemos encontrar la sacarosa, la fructosa, la dextrosa, incluso hay jarabes de azúcares. La sacarosa,
compuesta por glucosa y fructosa, es el que se encontraría de forma mayoritaria en los refrescos, a parte de
la glucosa.

Para determinar el contenido de sacarosa, primero se tiene que llevar a cabo en primer lugar la hidrólisis
enzimática en las dos hexosas que la constituyen, la glucosa y fructosa, lo cual se lleva a cabo por la acción
de la enzima fructofuranosidasa o invertasa. A continuación, se realiza la determinación de glucosa por el
mismo método que se ha realizado en esta práctica, con la ayuda las enzimas glucosa oxidasa y peroxidasa.
Se debe determinar la glucosa en la muestra antes y después de la hidrólisis enzimática, y el contenido de
sacarosa se obtiene por diferencia entre las concentraciones de glucosa que se obtienen antes y después de
la inversión enzimática.

Para determinar la cantidad de glucosa en otras muestras, como por ejemplo, en la orina, en la sangre ,en el
suero o en tejidos, es muy importante tener en cuenta que es muy probable que se den interferencias, ya
que este método (GOD/POD) presenta como desventaja que muchos compuestos presentes en el suero u
orina, como la bilirrubina, ácido ascórbico, ácido úrico, glutatión o la creatinina pueden ser oxidados por el
H2O2 producido en la reacción catalizada por la enzima GOD y por tanto interfieren en el resultado, ya que
simulan un concentración de glucosa demasiado baja.

El ácido perclórico o el ácido tricloroacético interfieren si se usan para la desproteinización de la muestra,

porque estos acidos destruyen a los eritrocitos y dejan salir glutatión y por tanto los valores que se
encuentran son demasiado bajos.

A baja concentración de proteínas, el sobrenadante de muestras desproteinizadas pueden contener un

exceso de iones uranilo. La turbidez causada por la formación de fosfato de uranilo insoluble pueden causar
una lectura falsa de alta glucosa.

También se dan falsas altas concentraciones de glucosa en presencia de fluorido u oxalato, por lo que no se
deben usar como anticoagulantes. Hemoglobina y lípidos interfieren en la medida de glucosa si se
presentan en altas concentraciones (>5g/l).

Mas interferencia se puede dar si la muestra contiene disacáridos y si la preparación de GOD está
contaminada con enzimas como la sacarasa, α-glucosidasa, amilasa... ya que liberan glucosa desde estos
disacáridos. Así, la reacción no termina y la absorbancia continúa creciendo.
El contenido de proteína o la turbidez de la orina pueden causar interferencias, pero se pueden ignorar si se
realiza la medida frente a un blanco.

Para las muestras de sangre, se pueden hemolizar para aumentar la estabilidad de la glucosa en la muestra.

Estas muestras son importantes para realizar análisis y también para detectar alguna anomalía o
enfermedad.

La glucosa, además, puede medirse por otros métodos de determinación, que hacen uso de sus
propiedades de reducción. Pero estos métodos son no específicos, ya que en las muestras suele haber otros
compuestos reductores. También se han desarrollado métodos de determinación de glucosa por HPLC, pero
requieren una derivación del analito y un instrumental caro. Por métodos enzimáticos se puede detectar la
glucosa con alta precisión y exactitud como, por ejemplo:

 Método de la hexoquinasa: es el método de referencia internacional para la determinación de

glucosa. Consiste en dos reacciones acopladas. En la primera reacción (específica), catalizada por la
enzima hexoquinasa, se fosforila la glucosa por el ATP formándose glucosa 6-fosfato.

La glucosa 6-fosfato, en una reacción posterior (reacción indicadora), se transforma en 6-

fosfogluconato produciéndose NADPH (1 mol por cada mol de glucosa).

La producción de NADPH origina un aumento de absorbancia a 340nm. El incremento de

absorbancia a esta longitud de onda será directamente proporcional a la concentración de glucosa.

Las dos enzimas utilizadas requieren de la presencia de iones magnesio para mostrar actividad
catalítica.

 Método de la glucosa deshidrogenasa: la glucosa pasa de su forma alfa a su forma beta por la
acción de una mutarrotasa, la cual es una aldosa 1-epimerasa.

La β-D-glucosa es deshidrogenada en presencia de glucosa deshidrogenasa para formar

gluconolactona y NADH

. La lactona producida se hidroliza espontáneamente a acido glucónico, desplazando la reacción

hacia la formación de productos, y, por tanto, más NADH.
 El aumento de la concentración de NADH es proporcional a la concentración de glucosa de la
muestra. El cambio de concentración se puede medir por el cambio de absorbancia a 339 nm.

Por último, se discute los resultados del supuesto práctico. A la vista de la probabilidad obtenida
comparando el grupo A con los demás grupos, como se recoge en la Tabla 5, se puede concluir que la media
de la concentración del problema analizado por el grupo A es significativamente diferente a la muestra
problema del grupo B y C, ya que la probabilidad que se ha obtenido de que sus medias sean iguales es de
0,009 (0,9%), menor que 0,05. Sin embargo, con el grupo D no se puede decir que haya una diferencia
significativa, ya que la probabilidad de que lo fuera es mayor de 0.05, porque la prueba de t-Student nos da
una probabilidad de 0,0697, por lo que hay cierta probabilidad, aunque sea baja, de que el grupo A y D
presentaran una concentración de muestra similar.