TEORIA DELLO STATO DI TRANSIZIONE

(Henry Eyring – anni 30)

A + B-C → A-B + C (A····B····C)

Complesso attivato

Stato di transizione

Coordinata di reazione
H A − H B + HC → H A + H B − HC
 K  k'
A + B ←→ X 
→ P + Q

d [P ] − ΔG  / RT
= k'e [A][B]
dt

Energia di attivazione
 ΔΔG

Aumento della velocità ≈ e RT

10 volte ≈ 5,7 KJ mole-1

1 milione di volte ≈ 34 KJ mole-1
Dipendenza dalla temperatura
Q10 ≈ 2
Dipendenza dal pH
 CINETICA

ENZIMATICA
 invertasi
saccarosio + H 2O → glu cos io + fruttosio
1902 – Adrian Brown dimostrò che quando la
concentrazione del saccarosio è molto più alta
di quella dell enzima, la velocità della reazione
diventa indipendente da quella del substrato:
la velocità è di ORDINE ZERO rispetto al saccarosio

k1 k2
E + S←
→ ES → P + E
 k −1
Non può essere integrata a meno di
d [P ]
v= = k2 [ES ] assunzioni semplificatrici
dt
d [ES ]
= k1 [E ][S ]− k−1 [ES ]− k2 [ES ]
dt
 ASSUNZIONE DI EQUILIBRIO

1913 – Leonor Michaelis e Maude Menten, lavorando

su una precedente ipotesi di Victor Henri, assunsero che
k-1>>k2, cioè che la prima tappa della reazione potesse
raggiungere l equilibrio.
k −1 [E ][S ]
KS = =
k1 [ES ]
 ASSUNZIONE DI STATO STAZIONARIO
(G.E Briggs e James B.S. Haldane)

FASI DI UNA REAZIONE

CATALIZZATA DA UN ENZIMA
(nelle condizioni fisiologiche,
per cui [S] >> [E]):

k1 k2
E+S←
→
 ES → P+E
k−1

1) Fase pre-stazionaria

2) Fase stazionaria
(quando la reazione ha
raggiunto un equilibrio
dinamico)
 d [ES ] k1 k2
=0 E + S←
→ ES → P + E

dt k −1

k1[E][S ] = (k−1 + k2 )[ES ] [E]T = [E]+ [ES ]

k 1 ([E ]T − [ES ])[S ] = (k−1 + k2 )[ES ]

k −1 + k 2 [E ]T [S ]
KM = [ES ] =
k1 K M + [S ]
 [ES ] = [E ]T [S ]
v=
d [P ]
= k2 [ES ]
K M + [S ] dt
S
v0 = k 2
[E ]T [S ] v0 = Vmax
S + Km
K M + [S ]
Equazione di Michaelis - Menten

[S ] = K M
S 1
=
S + Km 2

1
v0 = Vmax
2
 GRAFICO DEI DOPPI RECIPROCI

L equazione di Michaelis – Menten può essere trasformata in una equazione

lineare rispetto a 1/v0

1 1 Km 1
= +
v0 Vmax Vmax [ S ]
La costante catalitica di un enzima (kcat) è il numero di cicli catalitici completati
nell unità di tempo. Viene anche chiamata numero di turnover di un enzima ed
è di fatto una frequenza.
Vmax
kcat =
ETOT
Il rapporto kcat/Km (costante di specificità) è una misura dell efficienza catalitica
di un enzima:
S S k cat
S << K m v0 ≈ Vmax v0 ≈ ETOT kcat v 0 ≈ ETOT S
Km Km Km
 LO STUDIO DELLA CINETICA ALLO STATO STAZIONARIO
NON DA MOLTE INFORMAZIONI SUL MECCANISMO DI REAZIONE

Allo stato stazionario possiamo solo misurare il flusso in uscita o in entrata,

i quali sono uguali tra loro. Possiamo comunque ottenere alcune informazioni
sul meccanismo di reazione variando le condizioni sperimentali (dipendenza dal pH)
INIBIZIONE

ENZIMATICA
INIBIZIONE COMPETITIVA
v0 = Vmax
[S ]
[S ]+ αK m
1 αK M 1 1
= +
v0 vmax [S ] vmax
INIBIZIONE INCOMPETITIVA
v0 = Vmax
[S]
α ' [S ]+ K m

1 KM 1 α'
= +
v0 vmax [S ] vmax
INIBIZIONE MISTA
v0 = Vmax
[S]
α ' [S ]+ αK m

1 αK M 1 α'
= +
v0 vmax [S ] vmax
Vmax/α
αKM/α
 INATTIVAZIONE DEGLI ENZIMI

{
•  COMPETITIVA
REVERSIBILE •  INCOMPETITIVA
•  MISTA

IRREVERSIBILE { •  ASPECIFICA PER IL TIPO DI ENZIMA

•  BASATA SUL MECCANISMO DI REAZIONE
DELL ENZIMA (inibitori suicidi)

E+I EI ↔ E + P
→

X
 La VIGABATRINA: un farmaco contro l epilessia.

•  L acido γ-aminobutirrico (GABA) è uno dei principali neurotrasmettitori inibitori del

sistema nervoso centrale

COO - COO -
CH2 CO2 CH2
CH2 CH2
+HN C H +HN C H
3 3
H+
COO - H
glutammato
L-glutammato decarbossilasi GABA

COO - COO- COO- COO -

CH2 CH2 CH2 CH2

CH2 + CH2 CH2 + CH2

+HN
GABA O C +HN C H
3 C H O C 3
aminotrasferasi
H COO- H COO -

GABA α-chetoglutarato Succinico semialdeide L-glutammato

L epilessia può essere trattata aumentando la concentrazione di GABA
nel sistema nervoso centrale. Un metodo per ottenere questo risultato è
quello di inibire in modo specifico la GABA aminotrasferasi

COO - COO-
CH2 CH2
CH2 CH2 H
+HN H +
3 C 3HN C C
CH2
H H

GABA 4-amino-5-esanoato
VIGABATRINA

La VIGABATRINA, un analogo del GABA, è un efficiente inibitore

della GABA aminotrasferasi ed è attualmente utilizzata con successo
nel trattamento dell epilessia
MECCANISMO DI INIBIZIONE DELLA VIGABATRINA

Lys329
NH
75% R
H NH
H
Py

ENZIMA
INATTIVATO

25%
 REAZIONI A DUE SUBSTRATI

Le reazioni a due substrati sono quasi sempre reazioni di trasferimento

A+BP+Q

A-X + B  A + B-X

Il trasferimento può avvenire:

•  tramite un singolo spostamento : REAZIONI SEQUENZIALI O

A SINGOLO SPOSTAMENTO

•  tramite un doppio spostamento: REAZIONI PING - PONG O

A DOPPIO SPOSTAMENTO
 REAZIONI A SINGOLO SPOSTAMENTO (o sequenziali)

In questo tipo di reazioni entrambi i substrati devono legarsi

all enzima affinché possa avvenire la reazione

1) Meccanismo casuale

2) Meccanismo ordinato
 REAZIONI A DOPPIO SPOSTAMENTO (o ping-pong)

In questo tipo di reazioni un prodotto viene rilasciato prima che

entrambi i substrati si siano legati
 Esempio:
Esperimenti di scambio isotopico o di cinetica
1) Saccarosio fosforilasi

glucosio-fruttosio + fosfato ⇔ glucosio-1-fosfato + fruttosio

Il meccanismo è a ping pong

2) Maltosio fosforilasi

glucosio-glucosio + fosfato ⇔ glucosio-1-fosfato + glucosio

Il meccanismo è sequenziale
REGOLAZIONE

ENZIMATICA
REGOLAZIONE DELL ATTIVITA
ENZIMATICA

•  Coordinare i processi metabolici

•  Rispondere a variazioni dell ambiente

•  Crescere e differenziarsi
 REGOLAZIONE DELL ATTIVITA
ENZIMATICA

•  Controllo della disponibilità dell enzima

1.  Controllo genetico sulla produzione di enzimi (da

minuti a ore). Attivazione o terminazione di una
determinata via metabolica

2.  Degradazione proteica

 REGOLAZIONE DELL ATTIVITA
ENZIMATICA

•  Controllo dell attività enzimatica

•  L attività enzimatica è regolata dalla concentrazione dei substrati

presenti e disponibili.

•  La velocità della reazione enzimatica diminuisce quando diventa

cospicua la reazione contraria P  S (una volta raggiunto l equilibrio
la velocità apparente della reazione diventa uguale a zero).

•  Inibizione da prodotto, ma anche inibizione da substrato

 REGOLAZIONE DELL ATTIVITA
ENZIMATICA

•  Modificazioni dell enzima

•  Modificazione covalente (molto rapida, secondi)

 REGOLAZIONE DELL ATTIVITA
ENZIMATICA
1.  Regolazione allosterica. Diversi effettori.
Prontamente reversibile.

2.  Zimogeni. Accensione di un processo metabolico nel

luogo e nel momento giusto. Irreversibile.
Emofilia classica
REGOLAZIONE DELL ATTIVITA
ENZIMATICA
•  Isozimi

•  Proteine modulatrici
 REGOLAZIONE DELL ATTIVITA
ENZIMATICA

•  ALLOSTERIA
Modello di Monod-Wyman-Changeux (modello concertato)

Equilibrio tra due forme T0  R0

T0
L=
R0
KR
Costanti di dissociazione KT >> KR, ossia ≈ 0
KT
 T0 KR
L= c=
R0 KT
Effetti eterotropici POSITIVI e NEGATIVI
REGOLAZIONE DELL ATTIVITA
ENZIMATICA
ESEMPIO : l aspartato transcarbamilasi
REGOLAZIONE DELL ATTIVITA
ENZIMATICA
ESEMPIO : l aspartato transcarbamilasi
L INIBIZIONE RETROATTIVA
(a FEEDBACK )
 c6 r6
(2c3 + 3r2)
Stato T Stato R
DETERMINAZIONE DELLE STRUTTURE T e R

•  PALA si lega alla forma R

•  CTP si lega alla forma T

 MODELLO SEQUENZIALE DI
KOSHLAND
•  Il legame del substrato e il cambiamento conformazionale
sono due fenomeni
distinti e sequenziali

•  Trasmissione del segnale

allosterico attraverso
la comunicazione
all interfaccia delle subunità