TECNICAS Y METODOS DE AISLAMIENTO Y SELECCIÓN

DE MICROORGANISMOS
SEPTIEMBRE 26, 2012 CONALEPFELIXTOVAR DEJA UN COMENTARIO

TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS: SIEMBRA Y ESTUDIO DE BACTERIAS

INTRODUCCIÓN
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajocondicione
artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo demicroorganismo. Una de las
técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir unamuestra microbiológica de un ambiente determinado a
un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivosmicrobianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el
área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos
penetren ycontaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también
lascondiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH yconcentración de sales y
durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación, la luminosidad. La aplicación de estos procedimientos ha
permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así comosu aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de
este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de
microorganismo y propósitoespecífico del estudio.

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo ycondiciones de
laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denominacultivo. Cuando éste contiene una
sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axénico, cuandocontiene más de una especie de microorganismos se
denomina cultivo mixto.

.Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos
y estudios.Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicosson muy
raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-existen cultivos mixtos. En un
cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta.
Un cultivoaxénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones
especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio yen los instrumentos y recipientes
usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados ocontaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste
pueda ser axénico. El segundo paso paraobtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en
un medio sólido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrámultiplicar
en condiciones favorables. Un clon está constituido por una población de células descendientes de unsolo microorganismo. Una
colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficiede un medio sólido.Un cultivo microbiano que
ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferidoa un medio de cultivo nuevo, de otra manera el
crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En estatransferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no
introducir microorganismos indeseables(contaminantes) y concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas:
Los utensilios utilizados para la transferencia de muestras son los siguientes:

Hisopo, pipeta (para uso microbiológico sonterminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta
pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho.

En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación, hisopos, pipetas o pipetaspasteur que deberán
esterilizarse previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones
específicas. Por ejemplo:

Los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido
puede ser transferido mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o
medio líquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a
través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a laposibilidad de agitarlos acelerando la
velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil
homogenizarlas, lo que permite estandarizar laconcentración del inóculo. La desventaja que presentan, es que en ellos e difícil detectar
contaminación a simple vista.
Los medios semisólidos se preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta pasteur; en este último caso es
necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado líquido y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el
inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y par a
favorecer la separación de microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno.
Los medios sólidos se preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, despuésde esterilizarlos, estos se
inclinan o vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando lasuperficie del agar con mucha suavidad; en estos
medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les
denominan colonias, las que presentancaracterísticas que varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo
empleado. En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aún cuando la mayoría de
losmicroorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado
se favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo propósito durante la incubación
se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismoen estudio. El crecimiento óptimo de los microorganismos se
presenta a temperaturas que la mayoría de las veces están relacionadas con la de su hábitat natural. Algunos microorganismos crecen
por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas
temperaturas se puede usar una incubadora microbiológica o un baño de agua a temperatura constante, en tanto que para lo
microorganismos que presentan su crecimientoóptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del
laboratorio, a temperaturaambiente. En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de
temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco, lo que
determina la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en
incubadora no debe prolongare por más de nueve días.
Con relación a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de oxígeno atmosférico; los que sólo crecen
en presencia de aíre se llaman aerobios obligados; los que sólo crecen en ausencia de oxígeno sedenominan anaerobios obligados o
estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conocecomo facultativos. Existe una cuarta categoría que comprende
bacterias que requieren oxígeno, pero sólo loutilizan cuando éste existe en concentraciones reducidas; a estos se les
llama microaerofílicos.
El desarrollo de estos diferentes grupos se favorece mediante la agitación de los cultivos o mediante la exclusión de oxígeno para lo
que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales.Lasbacterias son organismos procarióticos, se encuentran ampliamente
distribuidas en la naturaleza, habitan enel agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre.
Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parásitos, comensales o mutualistas.Fisiológicamente
este grupo presenta características muy variables, hay bacterias móviles e inmóvilesfotosintéticas y quimiotróficas, autótrofas y
heterótrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos
algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celular, forma de agrupación, reacción a la
tinción de Gram, formación de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características culturales en medios líquidos
y sólidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.
Técnicas de siembra
Método de siembra por estría en placa
Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se tomauna muestra de la
población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólidopreparado en una placa Petri (a las placas Petri
también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en
la superficie del medio menosmicroorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las
últimasestrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo esteproceso varias
veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células
aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa
un clon derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado
una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a
partir deuna colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con todaseguridad,
cultivos axénicos.

Métodos de vertido en placa y extensión en placa

En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. Se siguenestas técnicas cuando la
muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil
millones de células por mililitro debe ser diluida 10

veces paraobtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (envarias etapas),
normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien.

Para realizar diluciones de diez endiez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (de medio estéril o solución salina,
igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación,
sepuede proceder de dos maneras diferentes.

En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán
embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes.
En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembrandirectamente en la superficie de la placa de agar,
extendiéndolas con avuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas
sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por
estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado
sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. Las dos técnicas de siembra por
dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número decolonias aisladas que el método de siembra por estría, por
tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos. Para obtener un
cultivo axénico mediante este método:
(a) Hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener una muestra con sólo unos pocoscientos de bacterias-

(b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter el contenido en una placa Petri.

(c) Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y en su superficie (más grandes).

Método de aislamiento por siembra por estría en placa: Para obtener un cultivo axénico:
(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero.

(b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra.

(c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y

(d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estrías enuna región nueva de la
placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células
aisladas.

(e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero;
para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa.

3.2.4 El crecimiento de los cultivos axénicos

Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de nuevo). Seguramente, el investigador
deseará obtener más células para poder trabajar con ellas. Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio
de cultivo, líquido o sólido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios sólidos se hacen generalmente,
añadiendo agar a los líquidos (

LA IMPORTANCIA DE SER CULTIVO PURO

Todos los microbiólogos saben que han de trabajar con cultivos axénicos (puros) para que sus experimentos sean significativos. Pero
incluso los microbiólogos más experimentados han cometido errores alguna vez. Esto le sucedió a Ralph Wolfe, uno de los
microbiólogos americanos más distinguidos.

En 1960 Wolfe obtuvo un cultivo puro de la bacteria Methanobacillus omelianskii. Este microorganismo es anaerobio estricto, capaz
de producir metano (gas natural). Wolfe quería conocer de qué manera M. omelianskií producía gas metano a partir de etanol y
anhídrido carbónico. El procedimiento estaba claro; tenía que lisar la bacteria y aislar las enzimas que catalizan la reacción, en un tubo
de ensayo. Esto, aunque suena bastante simple, había sido intentado previamente por otros investigadores y todos habían fracasado.
Wolfe lo intentó durante todo un año y tampoco tuvo éxito. De repente lo consiguió: una solución de enzima. sintetizaba metano en un
tubo de ensayo! Se trataba de un descubrimiento espectacular, hasta que un colega se preguntó si el cultivo era axénico.
Wolfe decidió volver a aislar el culfivo, pero en vez de añadir etanol yanhídrido carbónico al mismo, añadió hidrógeno y anhídrido
carbónico. En el nuevo medio se desarrollaron colonias, pero cuando se transfirieron al medio con etanol y anhídrido carbónico no
crecieron. ¿Qué había sucedido? Un colega, M.J. Wolin, se dio cuenta de lo que estaba sucediendo. Aunque M.
omelianskii originaba colonias uniformes y aisladas en el medio original, se trataba de una mezcla de dos bacterias. Una, designada
cepa S, convertía el etanol en hidrógeno gas. La otra, designada cepa M, convertía el hidrógeno gas y el anhídrido carbónico en
metano. Ninguna de las dos podía crecer sola con etanol y anhídrido carbónico. Todos los experimentos de Wolfe se habían realizado
con un cultivo mixto y tuvieron que repetirse para averiguar qué enzimas pertenecían a la cepa S y cuáles a la cepa M.
¿Qué lección puede aprenderse de la historia de Wolfe? Primero, que los problemas técnicos (tales como obtener un cultivo axénico),
aunque son tan básicos que se explican en los textos introductorios, son reales e importunan a los más prestigiosos investigadores.
Segundo, que incluso un buen microbiólogo puede equivocarse. Algunas especies pueden crecer juntas (para formar un consorcio) y
parecer un cultivo axénico cuando realmente no lo son.

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