INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CELAYA

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

INGENIERÍA GENETICA
GRUPO “A”

DR. GERARDO ACOSTA GARCÍA

“EVALUACIÓN DE Bacillus thuringiensis EN Musca domestica”

EQUIPO NO.2:
HERNÁNDEZ ACEVEDO LESLIE BEATRIZ
MOTA CAMACHO FERNANDA ISABEL

FECHA DE ENTREGA:
22/11/2018
INTRODUCCIÓN
Dentro de las plagas más comunes que atacan a explotaciones pecuarias se encuentran las moscas. La
especie Musca domestica (Linnaeus), genera pérdidas económicas y daños que pueden llegar a causar incluso,
la muerte en el ganado. Por una parte la M. domestica o mosca común, tiene la capacidad de posarse sobre el
ganado y chupar superficies, con ello adquirir y transmitir patógenos como las bacterias: Salmonella typhi (Le
minor y Popoff), Shigella, Escherichia coli (Migula), entre otras (Bejar et al., 2006).

La solución más eficaz para estas plagas es la aplicación de productos químicos. Nava-Pérez et al.
(2012) señalan que el uso de productos químicos ha generado problemas en explotaciones agrícolas así como en
la salud humana, resultando como alternativa el uso de bioplaguicidas como virus, nematodos, bacterias u
hongos entomopatógenos; mencionado dentro de los más efectivos el uso de bacterias como Bacillus
thuringiensis (Linnaeus) con un 74% de uso en el mercado.

En otro estudio realizado por Mwamburi et al. (2009) demostraron que la interacción de diferentes
microorganismos resultó mayormente eficaz para reducir la población de mosca domestica; donde evaluaron un
tratamiento de B. thuringiensis disminuyendo en un 42% la población. Además, se evaluó la interacción de este
tratamiento demostrando que la reducción de la población en estado larvario varió de 45 a 52%. Debido a lo
anterior, es necesario las evaluaciones in vitro en laboratorio, para evaluar el efecto de los organismos
biocontroladores solos y combinados en las plagas para considerar si se potencializa la mortalidad en mosca
doméstica (Gao et al., 2012) e incluso que puedan observarse efectos sub letales.

Estas evaluaciones podrían aumentar el control de la plaga con la combinación de formas de acción de
entomopatógenos que permitan interrumpir el ciclo biológico en fases tempranas del ciclo de vida de las plagas
o en adultos donde la plaga ya está causando daños (Potrich et al., 2017; Wraight y Ramos, 2017). Por lo
anterior, el presente estudio tiene como objetivo evaluar la interacción de B. thuringiensis, solo y combinado, en
larvas y adultos de M. domestica.
ANTECEDENTES

Musca domestica

La mosca doméstica es una especie diurna, es decir, tiene actividad durante el día y en especial
durante las horas más calurosas a diferencia de las noches que se encuentra casi inmóvil, se considera una
especie sinantrópica porque se relaciona y comparte hábitat con el ser humano, también se considera
cosmopolita, debido a su facilidad de adaptación a diferentes sustratos como alimentos, desechos, secreciones,
excretas para alimentarse y reproducirse, esto le permite persistir desde los trópicos hasta las regiones de los
polos por ello se considera una plaga universal que afecta principalmente a la ganadería.

Taxonomía

Musca domestica o mosca común es un insecto de orden Díptera descrita por Linnaeus en 1758, se
agrupa en la familia Muscidae donde esta especie se relacionan con problemas de parasitosis animal
principalmente, por ser transmisora de parásitos (Mancebo et al., 2001; Schlapbach, 2007).

Orden Díptera

Familia Muscidae

Subfamilia Muscinae

Género Musca

Especie domestica
Ciclo de vida

El ciclo de vida de huevo a adulto dura aproximadamente una semana durante el verano y en
temperaturas bajas requiere de tres semanas aproximadamente; en etapa adulta viven dos semanas y media
durante el verano, a temperaturas bajas pueden sobrevivir poco más de tres meses. Para desarrollarse requieren
de un ciclo holometábolo, es decir, tiene metamorfosis completa en la que se presentan fases de huevo (8-12
horas) que es depositado preferentemente en materia putrefacta como basura, hierbas o excretas de origen
humano y animal, de estos huevos que varían desde 100 a 600 por hembra, se desarrollan larvas (5 días) que
carecen de cabeza, ojos, antenas o patas definidas; simplemente poseen un cuerpo puntiagudo en el extremo
frontal, se alimentan donde se encuentran y existen tres cambios de tamaño durante esta etapa que conservan la
misma morfología denominados 1er, 2do y 3er estadio, aumentando su tamaño; cuando una larva ya es madura
detienen su alimentación y se transforman en pupas (4-5 días) de coloración marrón castaño, dentro de esta
etapa emergerá una mosca adulta (macho o hembra), que volverá a repetir su ciclo dentro del primer y segundo
día que comience a reproducirse sexualmente, su capacidad adaptativa de reproducción le permite desarrollarse
en 450 g de sustrato fresco donde pueden habitar 1,500 larvas (Makkar et al., 2014; Jacobs, 2013).

Bacillus thuringiensis

B. thuringiensis es una bacteria gram positiva aerobia, que presenta dos fases durante su vida:
crecimiento vegetativo (reproducción de bacterias por bipartición) y esporulación (proceso de diferenciación de
bacteria a espora). Es considerada cosmopolita ya que se ha aislado de todas partes del mundo y de todos los
sistemas: suelo, agua, plantas, insectos entre otros, se ha utilizado durante más de 40 años como bioinsecticida y
se ha estudiado que su principal característica es la producción de cuerpos paraesporales o cristales proteicos
generados en su fase de esporulación, que son el ingrediente activo de sus productos comerciales.
 Estos cristales están formados por proteínas toxicas llamadas Cry, entre ellas a la δ-endotoxina,
resultante altamente tóxica para una variedad de insectos de importancia agronómica, de salud pública y contra
organismos patógenos incluso protozoos (Cinar et al., 2007; Soberón y Bravo, 2007; Ibarra et al., 2003; Zarate,
1997; Wall, 2007).

Mecanismo de acción

En esta bacteria existen dos tipos de endotoxinas: las proteínas Cry y las proteínas Cyt. De estas, las
proteínas Cry se definen como cualquier proteína de B. thuringiensis que demuestre un efecto tóxico sobre
algún insecto, algunos signos característicos de su presencia se producen al ser ingerido provocando: parálisis
del intestino, diarrea, parálisis total y finalmente muerte. Estos efectos surgen cuando las toxinas Cry forman un
poro que ejercen una actividad tóxica, provocando un desequilibrio osmótico en las células epiteliales donde se
insertan en la membrana y requieren ser procesadas por proteasas y por unidades receptoras presentes en la
microvellosidad de células intestinales de insectos que son susceptibles, algunos de ellos son los órdenes
Hymenoptera, Coleóptera, lepidópteros y dípteros (Soberón y Bravo, 2007; Leivi Portugal et al., 2014).
JUSTIFICACIÓN

M. domestica es una especie capaz de volar y recorrer grandes distancias y con ello transportar
diferentes patógenos, depositándolos hasta la superficie del ganado, donde éstas se posan y dependiendo la
especie, lamen, succionan o pican. Algunos de los patógenos que transporta M. domestica mediante su
regurgitación o de manera directa son bacterias como: E. coli, S. typhi entre otros, los cuales generan
principalmente problemas gastrointestinales (Bejar et al., 2006).

Ante esta problemática los dípteros son controlados con productos químicos a diferentes
concentraciones, sin embargo, el uso inmoderado de dichos productos ha provocado que las diferentes
poblaciones de plagas generen resistencia, lo que ha ocasionado que se vuelvan ineficientes además de
contaminar al medio ambiente e incluso generar problemas de salud pública (Badii y Garza, 2007). También se
ha evidenciado que el uso de productos químicos contamina a suelos, aire y agua incluso se han encontrado
residuos tóxicos sobre alimentos provenientes de animales, generando daños en la salud pública al ingerir
alimentos de origen animal contaminados (Püssa, 2013).

Ante ello, existen diversos estudios que demuestran el uso de control biológico es una alternativa
positiva, sin embargo, también se sabe que productos generados por organismos (proteínas insecticidas) como
bacterias aplicados como control de plagas, han generado el fenómeno de resistencia en las plagas (Etebari et
al., 2015). En el estado de Guanajuato se encuentran presentes organismos entomopatógenos tales como hongos
y bacterias de manera natural, a su vez se tiene el conocimiento de su potencial bioinsecticida y también se
conoce la problemática en animales productivos por la presencia de dípteros.

Dado que existe evidencia de que B. thuringiensis es capaz de reducir diferentes poblaciones
consideradas como plaga vinculadas a la ganadería (Wraight y Ramos, 2005), se consideran alternativas de
control “natural” o biológico para reducir el incremento de poblaciones plaga, tales como el díptero antes
mencionado, es importante mencionar que el efecto evaluado de estos organismos naturales únicamente se ha
realizado de manera individual y no en combinación.
OBJETIVOS

Objetivo general

Evaluar la interacción del complejo espora/cristal de Bacillus thuringiensis, en larvas y adultos de

Musca domestica.

Objetivos específicos

1. Caracterizar e identificar seis cepas de B. thuringiensis.

2. Evaluar el efecto entomopatógeno del complejo espora/cristal de B. thuringiensis en larvas, adultos y en

recipientes donde se posan insectos de M. domestica.

3. Evaluar el efecto entomopatógeno de hongos + complejo espora/cristal de la bacteria en larvas de M.

domestica.

4. Determinar las CL50 de hongos y bacteria en larvas y adultos de M. domestica.

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención y cultivo de cepas de B. thuringiensis

Las cepas de B. thuringiensis, se identificarán morfológica y bioquímicamente; las cepas pertenecen al

LPCB-UG y serán obtenidas de suelos con producción pecuaria.

Tabla 1. Cepas de B. thuringiensis con sus respectivas claves y lugar de procedencia

ESPECIE CLAVE LUGAR DE PROCEDENCIA

Bacillus thuringiensis Bt5 Cuevas, Guanajuato
Bt49 Granja Las palmas, Las huertas,
Irapuato
Bt111 Romita, Irapuato
Bt115 Abasolo
Bt116 Rodolfo Granados, Laguna Larga,
Irapuato
Bt124 Irapuato, Guanajuato

Para la reactivación de las cepas se resembrarán en cajas Petri con un medio de agar nutritivo y agar
bacteriológico. Posteriormente se cultivaran en medio LB (Luria Bertani), en un matraz de 500 mL, donde se
dejaran incubar a 25±°C a 200 rpm durante 7 días para ser utilizadas. Posteriormente se determinará la
concentración (3x108 espora/cristal/mL) con una Cámara de Neubauer y posteriormente se ajustará de acuerdo
con el bioensayo que corresponda.
ESTRATEGIA

Identificación molecular de cepas de B. thuringiensis

Para realizar la identificación molecular de las cepas de B. thuringiensis se realizará la extracción de

DNA por el método modificado reportado por Rosso (1997) el cual permitió la identificación del gen de la
flagelina. Inicialmente se obtendra un cultivo fresco de 30 mL en medio LB con una D.O. 600= 1.0. Durante el
crecimiento de las cepas en medio LB se registrará la morfología de B. thuringiensis, así como su esporangio
por medio de una tinción de Gram a las 24 h de su inoculación.

Después se centrifugará a 3000 xg, 5 minutos a 4C y se lavará la pastilla con 10 mL de amortiguador J
(Tris-HC1 1.0 M, EDTA 0.1 y NaCl 0.15 M, pH 8). Posteriormente se resuspenderá la pastilla en 4 mL de
amortiguador J y se adicionarán 400 L de lisozima (40 mg/mL), se incubará 30 min a 37C. Se adicionarán 50
L de RNAsa (10 mg/mL), se incubará por 15 min a 50C. Después se adicionarán 200 L de SDS al 20% y se
incubará por 20 min a 70C, se dejará enfriar lentamente a 37C y se adicionarán 120 L de Proteinasa K (10
mg/mL), y se dejará incubando toda la noche.

Al otro día se adicionarán 1.15 mL de NaCl 6 M, y se mezclará suavemente 15 min en hielo, se

centrifugará a 3900 xg, 20 min a 4C, se recuperará el sobrenadante y se precipitará con el mismo volumen de
Isopropanol, se centrifugará a 17000 xg 20 min a 4C. Posteriormente se lavará la pastilla con etanol al 70% y
se dejará secar al aire y se resuspenderá con 200 L de TE (pH 8). La cantidad de DNA que se obtendrá se
determinara por espectrofotometría a 260 nm, los DNA extraídos que se almacenarán a -20C hasta su uso
(Sauka et al., 2014).

Amplificación de los genes de la flagelina

Las amplificaciones de los genes de la flagelina FlaA de cada una de las cepas bajo estudio se realizarán
con los iniciadores (BTFlaA3 y BTFlaA4) ya diseñados específicamente para la FlaA de B. thuringiensis.

Tabla 2. Iniciadores del gen de la flagelina inverso y reverso.

Iniciador directo (BTFlaA3): 5‟ ACAAATATTAATAGCATGCG 3‟

Iniciador de reversa (BTFlaA4): 3” TTGTAATAATTTAGAAGCC 5”

(Delgado, 2011)
 Las mezclas de reacción para la obtención de los amplicones de las flagelinas de cada cepa son las
siguientes: DNA 500 ng, oligonucleótidos 600 ng de cada uno, conc. de Mg++ 3 mM, mezcla de dNTP 200 M
y Taq DNA Polimerasa 2.5 U.I (Invitrogen) a un volumen final de 50 L. A las amplificaciones se les efectuará
una desnaturalización inicial de 5 min a 95C, 34 ciclos que consistirán en desnaturalización de 15 s a 96C,
alineamiento de 15 s a 47C y extensión de 1 min a 72C.

Se terminó con un paso final de extensión de 10 min a 72C. Las visualizaciones de los productos de
amplificación se realizarán por electroforesis de las muestras en geles de agarosa al 1%, utilizando TAE 0.5X
como amortiguador de corrida a 40 volts durante 1 h.

Tabla 3. Mezcla para PCR

Componentes para la mezcla de PCR

10x PCR MgCl₂ 2.5 µL

50mM MgCl₂ 2.5 µL

DNTp 0.5 µL

Oligos A3 y A4 1 µL c/uno

DNA 3µL c/uno

H₂O miliq. 11.5 µL

Taq. DNA pol 0.5 µL

Vol. final 25 µL

La secuenciación de los fragmentos amplificados del gen de la flagelina de las diferentes cepas de B.
thuringiensis bajo estudio, se realizarán utilizando como iniciadores de la reacción de amplificación de cadena
sencilla a los iniciadores a partir de los cuales fueron generados (BTFlaA3 y BTFlaA4). Como una estrategia de
verificación por empalme de las secuencias obtenidas, así como para complementar las secuencias incompletas
o que tuvieran problemas durante la lectura de la secuenciación, se podrían utilizar dos oligonucleótidos
adicionales a partir de la región interna del gen (BTFlaA3.2 y BTFlaA4.2).
 La secuenciación se realizará con la química de dNTP de terminación marcado con un floróforo (Big
dye termination kit de Applied Biosystems) en un secuenciador de Applied Biosystems modelo 7700 (Leivi
Portugal et al., 2014).

Análisis de secuencias del gen de la flagelina

Cada una de las secuencias obtenidas en una serie de análisis, iniciando con la eliminación de todas las
bases ambiguas de cada secuencia, por medio del programa EditView (PE Byosistems). El ensamble de las
secuencias obtenidas para cada cepa, se realizará utilizando el programa Autoassambler (PE Byosistems), para
obtener la secuencia consenso final de cada cepa. Con el objeto de corroborar que los fragmentos amplificados
por PCR de cada una de las cepas bajo estudio, corresponde efectivamente a una flagelina, las secuencias se
compararán con el banco de secuencias GenBank.

Cría de M. domestica

Obtención y cultivo

Podemos obtenerla de un insectario, o bien colectar en el municipio de Celaya se hará con un barrido
con ayuda de una red entomológica (tamaño de poro, 1mm). Las moscas se trasladarán al laboratorio y se
criarán en recipientes de plástico cubiertas por una malla mosquitera a una temperatura de 25±1°C con 12 horas
de luz/oscuridad. Para moscas adultos se tendría una cama de sustrato con salvado de trigo fermentado, la
mezcla contendrá: 700 g suspendido en 1500 mL de agua estéril.

El salvado se mezclará hasta quedar húmedo, posteriormente se dejara fermentar por 48 horas. En esta
dieta para larvas se colocorá a las moscas adultas y se les proporcionará una dieta que consistirá en una ración
de leche en polvo, la comida para adultas será sustituida cada 48 horas aproximademente. Las moscas adultas
hembras realizarán la postura sobre el salvado de trigo y días después las larvas que pasarán a ser pupas
permanecerán en la caja de dieta hasta esperar a que emergan los adultos (hembras y machos) para introducirlas
a nueva dieta y continuar con la cría (Inciso y Iannacone, 2008).
CONCLUSIONES

En otros estudios se ha mencionado que los usos de organismos naturales evaluados en el laboratorio
pueden llegar a tener efectos positivos en condiciones de campo dentro de una o varias regiones, dependiendo
las condiciones climáticas y de la plaga en cuestión, e incluso contribuir para inhibir la resistencia, generar
información de nuevas alternativas de insecticidas sustentables para la región (Valero-Jiménez et al., 2016).

Una vez reguladas las plagas podrán ser disminuidas las pérdidas y daños generados, considerando que
dichas alternativas son amigables con el medio ambiente podrían integrarse como estrategias dentro de un
manejo integrado de plagas (Wakil et al., 2013) que permitan reducir el uso de productos químicos comerciales
y permitir a las unidades de producción de diferentes animales tener un manejo sustentable. Si bien, se sabe las
ventajas de hongos y bacterias, poco se conoce del posible efecto sinérgico de estos organismos
entomopatógenos originarios de la región bajío sobre organismos plagas en el área pecuaria.