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CURSO: Biotecnologia.
Enzimas en disolución
Excelentes métodos (selectivos y sensibles) para la determinación
de sustratos, activadores, inhibidores.
Costes elevados
Inmovilización de enzimas
Proceso por el que se confina la enzima en un soporte adecuado para
obtener una forma insoluble de la misma que retiene su actividad catalítica
Aplicaciones Analíticas:
Diseño de biosensores
Reactores enzimáticos
Enzimas inmovilizados
Atrapamiento o
Adsorción Unión covalente Entrecruzamiento
inclusión
Métodos de Inmovilización
Uniones
Reversibles Estabilidad limitada, se requiere un control
No covalentes
riguroso de las condiciones de trabajo para
evitar pérdidas de enzima por desorción.
Atrapamiento o
Adsorción Unión covalente Entrecruzamiento
inclusión
Métodos de Inmovilización
Se requieren elevadas
concentraciones de proteína
en disolución acuosa (10 mg/L)
Atrapamiento o
Adsorción Unión covalente Entrecruzamiento
inclusión
Métodos de Inmovilización
Soporte Enzima
Activación para obtener grupos funcionales reactivos
Grupo funcional Soporte Unión a través de las cadenas laterales
-CONH2 Poliacrilamida de los aminoácidos de la secuencia
polipeptidica de la proteína
-COOH Carboxymetilcelulosa
-NH2 Lisina -SH Cisteina
-NH2 Poliestireno, nylon
-OH-Ph Tirosina -OH Serina
-OH Celulosa, agarosa, sephadex -COOH Aspartato -Nimidazol Histidina
-Si(OH)3 Vidrio poroso Glutamato
CH3OH NH2NH2
OCH2COOH OCH2COOCH3 OCH2CONHNH2
HCl
NaNO2
OCH2CONHNH2 OCH2CON3
HCl
Atrapamiento o
Adsorción Unión covalente Entrecruzamiento
inclusión
Métodos de Inmovilización
Entrecruzamiento
Formación de enlaces covalentes intermoleculares
(entre moléculas de enzima) y entre estas y el soporte
Cantidades altas de proteína inmovilizada resistentes a condiciones
extremas de pH y temperatura
CHO O O
H H
(CH2)3 N2 N2 ICH2 C N (CH2)6 N C CH2I
CHO
Glutaraldehido Diazobenzidina Hexametileno-bis(iodoacetamida)
O O O
O
N O C (CH2)2 S S (CH2)2 C O N
O O
Bis(N-hidroxysuccinimidyl)ditiopropionato
Métodos de Inmovilización- Entrecruzamiento
N- Enzima
NH2-ENZIMA CHO CH
+ (CH2)3 (CH2)3
NH2-ENZIMA
CHO CH
N-Enzima
1. Efectos en la Estabilidad
Estabilización conformacional de la enzima
por uniones multipuntuales enzima-soporte
Mayor resistencia a
desactivación térmica o química
Quimotripsina/
portador catiónico Quimotripsina en disolución
100
% Quimotripsina/
Actividad portador aniónico
relativa
4 6 8 10
pH
SENSORES QUÍMICOS
ELEMENTO DE
TRANSDUCTOR ELECTRÓNICA
RECONOCIMIENTO
Componentes de
reconocimiento molecular
Bióticos Abióticos
Bioafinidad Biocatalíticos
analito
Transducción Energía
Piezoeléctricos
Electroquímicos Ópticos Térmicos
(de masa)
Respuesta-Procesamiento de datos
Ureasa
(NH2)2CO 2 NH3 + CO2
Capa de enzima
inmovilizada
Métodos de inmovilización Estabilidad
del enzima del sensor
Encapsulación en membranas
10 d.
de diálisis
Inclusión en gel de poliacrilamida 21 d.
Inclusión + enlace covalente
>30 d.
en ácido poliacrílico
Entrecruzamiento con albúmina
>60 d.
(glutaraldehido)
SENSORES ENZIMÁTICOS AMPEROMÉTRICOS.
Proceso catódico:
-600 3.25 O2 + 2 H+ + 2 e- H2O2
Eap./ mV i./ µA
Proceso anódico:
Electrolito interno (KCl)
2 Ag(s) + 2 Cl-(aq) 2AgCl(s) + 2 e-
Ánodo de Ag/AgCl
Tiempo de respuesta:
δ2 test ≈ 20 – 50 s
test. =2
(D/q)
SENSORES AMPEROMÉTRICOS ENZIMÁTICOS
1. Basados en el empleo de enzimas oxidasas
E(FADH2)
Medox Ered S S
E DIFICULTADES
SH2 + NAD
+
S + NADH + H+
Mecanismo Estabilidad
electrodo
NADH NAD+ + 2e- + H+ complejo
Reproducibilidad
Medox NADH S S
Electrodo Disolución