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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOLOGIA- XALAPA

EXPERIENCIA EDUCATIVA:
VIRUS Y BACTERIAS

MATERIAL: MANUAL DE PRÁCTICAS

PERIODO DE APLICACIÓN: AGOSTO 2016-ENERO 2017

Elaborado por:
Dra. Celia Cecilia Acosta Hernández
Dr. Mauricio Luna Rodríguez
M. C. Paloma Violeta Susan Tepetlan
Dra. Albertina Cortés Sol
M. en C. Lizbeth Estrada Vargas

PERIODO DE ELABORACIÓN: AGOSTO 2014


PERIODO DE MODIFICACIÓN: AGOSTO-2016
1
INDICE

PRESENTACIÓN. __________________________________________________ 3
NORMAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA ________________ 4
MATERIAL DE TRABAJO POR EQUIPO____________________ ____________ 5
MANEJO DE MATERIAL_____________________________________________ 6

TÉCNICAS PARA LA ELABORACIÓN Y OBSERVACIÓN DE UNA


PREPARACIÓN FRESCA____________________________________ 8
PRÁCTICA No. 1: __________________________________________________ 10
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS EN MEDIOS SÓLIDOS Y LÍQUIDOS
PRÁCTICA No. 2: ______________________________________________ 20
OBSERVACIÓN DE LA MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS POR
PRÁCTICA No. 3: __________________________________________________ 22
TRANSFERENCIA DE UNA COLONIA PARA DESARROLLO DE CULTIVOS PUROS
PRÁCTICA No. 4: ________________________________________________ 26
TINCIÓN SIMPLE
PRÁCTICA No. 5: _____________________________________________________ 28
TINCIÓN DE GRAM (Modificado por Hucker)
PRÁCTICA No. 6: __________________________________________________ 31
MICROFLORA DE PLANTAS Y SUELO

PRÁCTICA No. 7: __________________________________________________ 33


COLORACIÓN DE ESTRUCTURA
PRÁCTICA No. 8: _________________________________________________ 39
PRUEBAS BÁSICAS PARA DETERMINAR LA INFLUENCIA DE FACTORES
AMBIENTALES SOBRE EL DESARROLLO BACTERIANO
PRÁCTICA No. 9: _____________________________________________ 41
PRUEBAS DE REACCIÓN BIOQUÍMICA PARA EL ESTUDIO DE BACTERIAS

PRÁCTICA No. 10:_____________________________________________ 56

CONTEO BACTERIANO POR EL MÉTODO DE PLACA VACIADA


PRÁCTICA No. 11:_____________________________________________ 59
ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO: MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP).
PRÁCTICA No. 12:_____________________________________________ 63
INTERACCIONES ECOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS
PRÁCTICA No. 13:_____________________________________________ 62

2
AISLAMIENTO DE Rhizobium
PRÁCTICA No. 14:_____________________________________________ 64
RESISTENCIA BACTERIANA
PRÁCTICA No. 15:_____________________________________________ 70
ACCIÓN DE AGENTES QUÍMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO

PRÁCTICA No. 16:_____________________________________________ 72


PRUEBA DE SENSI-DISCOS PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD A
ANTIBIÓTICOS
PRÁCTICA No. 17:_____________________________________________ 74
ACCIÓN INHIBITORIA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
PRÁCTICA No. 18:_____________________________________________
76
FERMENTACIÓN ANAERÓBICA (PRODUCCIÓN DE METANO)

PRÁCTICA No. 19_____________________________________________


79
PRUEBA DE INMUNOADSORCIÓN CON ENZIMAS LIGADAS – DOBLE
ANTICUERPO EN SÁNDWICH (ELISA-DAS) APLICADO AL DIAGNÓSTICO DE
VIRUS Y BACTERIAS FITOPATÓGENOS

PRÁCTICA No. 20_____________________________________________


87
MÉTODO DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PARA EL
DIAGNÓSTICO DE VIRUS

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO. _____________________________ 91


PREPARACIÓN DE REACTIVOS_______________________________ 92

BIBLIOGRAFÍA. ___________________________________________________ 95

3
PRESENTACIÓN

El Laboratorio Experimental de Microbiología es complemento y parte fundamental de la


teoría, es el espacio donde el estudiante aplica los conceptos revisados durante las horas
de clase teórica.

El objetivo principal del Laboratorio Experimental es desarrollar en los estudiantes las


habilidades y aptitudes necesarias para el manejo, mantenimiento y reconocimiento de
cultivos bacterianos.

Para hacer más efectivo el logro de este objetivo, y evitar en lo posible errores, es
recomendable tener una guía de trabajo que permita a los estudiantes anticiparse a las
actividades programadas para cada sesión.

El presente manual, pretende ser esta guía de trabajo, las prácticas aquí presentadas
guardan un orden de acuerdo con el programa teórico y son una recopilación selecta de
técnicas básicas para el sembrado, purificación, tinción, reconocimiento de cultivos
bacterianos y conteo bacteriano, así como, algunas de las técnicas más comunes
utilizadas en la determinación de resistencia de las bacterias a metales pesados y
sustancias tóxicas como insecticidas.

4
NORMAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

1. Cada equipo deberá presentarse al laboratorio con su material de trabajo y manual de


prácticas, de lo contrario no tendrá derecho a participar en la sesión de laboratorio.

2. Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente el guión para adquirir una
idea clara de su objetivo, fundamento y técnica.

3. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente en su bitácora de


laboratorio.

4. El uso de la bata es obligatorio para todo trabajo en el laboratorio experimental.

5. Fumar, comer o tomar cualquier alimento NO está permitido dentro del laboratorio

6. Mantenga sus lápices, dedos y papeles fuera de la boca.

7. No deben aplicarse cosméticos dentro del laboratorio.

8. Las mesas de trabajo deben limpiarse con desinfectante antes y después de cada
sesión.

9. Todos los cultivos y materiales de desecho que hayan entrado en contacto con
microorganismos (pipetas usadas, placas petri o tubos), deben colocarse en bolsas de
autoclave y proceder posteriormente a su esterilización.

10. No se debe limpiar ni desechar material sin antes preguntar al maestro.

11. Es indispensable lavarse las manos antes de salir del laboratorio.

12. Todos los cultivos deben marcarse con NOMBRE, NUMERO DE EQUIPO, GRUPO Y
FECHA DE SIEMBRA.

13. Los accidentes de laboratorio como son quemaduras, cortadas o derrames de un


medio de cultivo inoculado deben reportarse inmediatamente al maestro.

14. Las pipetas se cogerán de forma que sea el dedo índice el que tape su extremo
superior para regular la caída de líquido.

DE TODOS LOS ERRORES POSIBLES, LA FALTA DE REPORTAR CUALQUIER

ACCIDENTE AL MAESTRO, ES EL MAS SERIO.


5
MATERIAL DE TRABAJO POR EQUIPO

GASA
ALCOHOL
1 litro AGUA DESTILADA.
PLUMÓN INDELEBLE PUNTO FINO
MASKING TAPE ANCHO (1 cm APROX.)
PLIEGOS DE PAPEL REVOLUCIÓN
ALGODÓN PLISADO (1 PAQUETE CHICO)
JABON DE TOCADOR
ESCOBILLON
ESPONJA PARA LAVAR
JABÓN PARA TRASTES
TELA PARA SECAR MATERIAL
CUBRE BOCAS
GUANTES
CERILLOS
ASA BACTERIOLOGICA (2)
1 CAJA DE PORTA OBJETOS
1 CAJA DE CUBRE OBJETOS
TRES FRASCOS PEQUEÑOS (1 para muestra, 1 para guardar cubreobjetos y otro para
portaobjetos)
TIJERAS
EXACTO
PINZAS PUNTA DELGADA
JERINGA 10 ml

MATERIAL POR GRUPO

1 ROLLO DE PAPEL CELOPACK


1 ROLLO DE BOLSAS PLÁSTICAS DE TAMAÑO MEDIANO
1l BENZAL

ESTE MATERIAL ES INDISPENSABLE PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO,


EN CASO DE NO TRAERLO, NO PODRÁ ENTRAR A LA SESIÓN
CORRESPONDIENTE.

6
MANEJO DE MATERIAL

1. Las cubetas para el espectrofotómetro, y los cubreobjetos y portaobjetos deben


cogerse por los bordes para evitar que se engrasen.

2. Los tubos de ensayo que contengan medios de cultivos o cultivos de


microorganismos, nunca deben abrirse en posición vertical, sino lo más
horizontalmente posible (inclinados) y para quitar el tapón se mantendrán inclinados
con una mano y se abrirán con la otra, que sostendrá a su vez el asa. Una vez abierto,
se flamea por algunos segundos el orificio, repitiendo dicha operación una vez
realizada la siembra (el tapón nunca debe dejarse sobre la mesa).

3. Antes de utilizar las asas con hilos de platino que sirven para las siembras, éstas
deben flamearse al rojo en posición vertical bajo la acción de la llama; también debe
flamearse el mango. Antes de efectuar la siembra debe esperarse algunos segundos a
que se enfríen, pudiendo enfriarse también en el borde de la placa de Petri que
contiene el medio de cultivo. Inmediatamente después de haberlas utilizado, deben
flamearse nuevamente (vea figura).

4. Las varillas de vidrio también deben flamearse, para ello primero moje la varilla en
alcohol pásela por la flama, retírela en cuanto se incendia y espere a que se apague la
flama y se enfríe la varilla (vea figura)

5. Las cajas Petri que han sido sembradas deben colocarse en las cámaras de
incubación de manera invertida

6. LOS CULTIVOS QUE SE ESTEN INCUBANDO DEBERAN SER REVISADOS A LAS


24 HRS. DE HABER SIDO SEMBRADOS PARA EVITAR SU ENVEJECIMIENTO O
MUERTE.

7
TIPOS DE ASA Y SU USO.

Las asas se utilizan para inoculación o transferencia de cultivos, pueden ser un alambre de
platino, recto en forma de asa, un extremo de ese alambre se interna en un mando cilíndrico
que permite su manejo. Actualmente se utilizan mayoritariamente las asas de siembra de
plástico que además de estar calibradas pueden tener una aguja incorporada cuando se
quiere hacer siembras en profundidad, y que son desechables. Las asas de plástico tienen
una ventaja frente a las de metal, flameadas después de cada uso, con las cual se evita que
se produzcan aerosoles que provocan contaminación.

A continuación se indican algunos modelos de asas que se usan en el trabajo microbiológico.

A. Asa en argolla o anillo, no calibrada. Generalmente son de alambre de nicromo. Sirve para
siembra por estrías e inoculaciones en general

B. Asa recta o en hilo.
 Sirve para trasladar una sola colonia o medios de identificación o
subcultivo.

C. Asa de platino amarillo.
 Calibrada para tomar 0.001 ml de uso frecuente para urocultivos.

D. Asa espatulada.
 Para manipular colonias duras.

E. Asa de alambre grueso en L.
 Sirve para purificar colonias de hongos y procedimientos
especiales.

F. Aguja de disección con punta aguda.
 Sirve para purificar colonias pequeñas y distribuir
las preparaciones de hongos en fresco.5
8
TÉCNICAS PARA LA ELABORACIÓN Y OBSERVACIÓN DE UNA PREPARACIÓN
FRESCA

La preparación fresca es una técnica útil en los estudios de bacterias para observar
aspectos de las células bacterianas como movilidad y forma. A continuación se indican
dos procedimientos para su elaboración.

Procedimiento.

A) Método de la gota pendiente.

a) A partir de un cultivo bacteriano de 24 a 48 h prepare una dilución en agua


destilada estéril.

b) Coloque una gota de muestra en el centro de un cubreobjetos limpio. Use


condiciones asépticas.

c) Invierta el cubreobjetos cuidadosamente y colóquelo sobre la depresión de un


portaobjeto excavado (lámina excavada), de manera que no deslice la gota por
el cubreobjeto. La gota no debe tocar el fondo de la depresión.

d) Aplique unas gotas de agua destilada estéril a los bordes del cubreobjetos para
sellarlo y mantenerlo en su lugar.

e) Observe con el lente seco de mayor aumento, este puede ser el de 40x.

B) Método de lámina-laminilla.

a) A partir de un cultivo bacteriano de 24 a 48 h prepare una dilución en agua


destilada estéril.

b) Coloque una gota de la muestra usando técnica aséptica (con asa o con pipeta
estéril) sobre un portaobjetos limpio y coloque un cubreobjetos sobre esta. Para
prevenir las corrientes de convección y el secado de la preparación, sellar los
bordes del cubreobjetos con petrolato, sellador o esmalte de uñas incoloro.

c) Observe con el lente seco de mayor aumento.

Nota: La visión es mucho mejor si se dispone de un microscopio de contraste de


fases.

9
C) Preparación fija (frotis) de una muestra microbiana.

El propósito de la fijación es matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la


célula y adherir la preparación al portaobjetos. Sin el proceso previo de fijación se lavaría
la capa de células durante el proceso de tinción.

El agente fijador ideal preserva las estructuras de la célula con su forma y posición sin
que aparezcan estructuras que no existían en la célula original.

El calor es el método de fijación utilizado para la observación de la morfología de células


microbianas.

Procedimiento.

a) Si la muestra a analizar se encuentra en suspensión, colocar una gota sobre un


portaobjetos limpio con un asa o pipeta estéril. Si la muestra proviene de un
cultivo en medio sólido, colocar primero una gota de agua destilada estéril sobre
el portaobjetos, tomar la muestra con el asa, tocar la gota, quemar el asa y luego
de haberse enfriado, mezclar bien con el agua.

b) Secar al aire para fijar las células. Puede acelerar el secado, pasando el
portaobjetos tres veces por la llama del mechero a 15 cm o más de distancia. El
calor hace que las células se deformen y se tiñan defectuosamente, por lo que
es conveniente sostener el portaobjetos con la mano la cual funcionará como
sensor de que no se esté aplicando calor excesivo.

c) Una vez fijada una preparación, sobre el frotis seco pueden emplearse
colorantes básicos para teñir las células, varias de las cuales están referidas en
la Práctica 4.

10
PRÁCTICA No. 1

SIEMBRA DE MICROORGANISMOS EN MEDIOS SÓLIDOS Y LÍQUIDOS

OBJETIVO: El estudiante aprenderá las técnicas de dilución, inoculación por picadura


cultivo en placa y tubo de ensayo en medio líquido y sólido.

INTRODUCCION

En la naturaleza los microorganismos se presentan como poblaciones mixtas que


conviven en un hábitat determinado. A partir de la toma de muestras de estas poblaciones
es factible obtener cultivos mixtos. Si se quiere estudiar solo una especie, es necesario
realizar aislamientos, que aseguren el obtener una cepa pura, es decir, un cultivo que
contiene una sola especie.

Para poder lograr esto, es necesario cumplir con ciertos requerimientos como son los
nutrientes necesarios, tales como, fuente de carbono, nitrógeno, minerales y factores de
crecimiento, condiciones ambientales apropiadas con son pH, temperatura, presión
osmótica y oxígeno atmosférico, además, de condiciones asépticas estrictas.

Para prácticas posteriores se requiere un cultivo puro, por lo que debemos manejar todo
de tal manera que no introduzcamos organismos no deseados.

MATERIAL

Material estéril de la práctica anterior.


Muestra seleccionada para sembrar.
Asas bacteriológicas
2 mecheros bunsen
1 gradilla
Estufa de incubación.

PROCEDIMIENTO

1.- Preparar las diluciones de acuerdo a las instrucciones, para mayor comprensión vea la
figura 2

a) Añadir 1 ml. de la muestra a un tubo de ensayo que contenga 9 ml. de agua


destilada estéril (dilución 10-1). Mezclar.

b) Pasar 1ml. de la dilución 10-1 al siguiente tubo con 9 ml. de agua estéril (dilución 10-
2
). Mezclar. UTILICE OTRA PIPETA.

c) Pasar 1ml. de la dilución 10-2 al tercer tubo que contiene 9 ml. de agua estéril
(dilución 10-3). Mezclar. COLOQUE LA TERCERA PIPETA DENTRO DEL TUBO
11
0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml

MUESTRA 10 -1 10-2 10-310-4 10-5

Figura 2. Método de dilución de una muestra

2.- Siembra por extensión en placa de agar tome una pipeta estéril y pase 1 ml. de las
dilución deseada a dos cajas petri con medio sólido, distribuya homogéneamente con
la varilla en forma de “L”. (ver Fig. 3a)

4.- Siembra por vaciado de placa: primero inocule 1 ml. de la dilución deseada en una caja
vacía y estéril posteriormente vacié medio fundido a temperatura media, para
homogenizar mezcle con movimientos suaves. Deje solidificar en una superficie plana
(ver Fig. 3b).

Figura 3. Siembra en caja Petri a) siembra por extensión; b) siembra por vaciado de placa

1. Siembra por estriado de placa: se toma una sola asada del material a inocular y se
disemina sobre la superficie del medio sólido, de una manera suave sin escarbar en el
medio.

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a) Estrías escocesas: Primero dibuje estrías en la mitad de la caja, gire su caja de
manera que el estriado quede de su lado derecho. Queme su asa, enfríela y
tocando el extremo superior del estriado, vuelva a estriar hasta cubrir un cuarto de
la caja, gire de nuevo su caja. Queme el asa, enfríela y vuelva a estriar hasta cubrir

el otro cuarto de la caja. SOLO TOME MUESTRA EN EL PRIMER ESTRIADO.


(Figuras 4a y b)

b) Estriado por agotamiento: tome una asada de muestra y estríe toda la caja (Figura
4a).

Siembra por estriado en medio sólido.

Figura 4. Siembra por estriado en medio sólido: a) Estrías escocesas: b) estriado por
agotamiento

13
2. Para siembra en medio líquido transfiera con una pipeta estéril 1 ml. de la dilución
deseada al tubo con medio líquido. Antes y después de inocular se flamea la boca del
tubo.

3. Siembra por picadura en tubo con medio sólido: Flamee el asa, quite el tapón del tubo
con la mano que tiene el asa y flamee la boca del tubo. Tome una asada de la
muestra. Flamee la boca del tubo e introduzca el asa dentro del medio hasta
aproximadamente ¼ de profundidad. Saque el asa, flamee nuevamente la boca del
tubo y el tapón. Coloque el tapón en el tubo (Figura 5).

Figura 5.- Siembra por picadura en tubo con medio sólido

4. Siembra por estría en medio sólido inclinado: se lleva el asa (con muestra) hasta
donde empieza el declive del medio y se sube haciendo un movimiento de zig-zag
sobre la superficie dibujando así una serie de estrías. Inocule sólo una asada, en
caso de necesitar más asadas inicie la siembra a partir de donde termino la anterior
(Figura 6).

Figura 6.- Siembra por estría en medio sólido inclinado

9.- Selle las cajas con celopack, etiquete con número de equipo, grupo y dilución. Incube
los medios a 37ºC por 48 hrs.

14
Manipulación aséptica de cultivos. Métodos de siembra

El método de siembra a emplear dependerá de los objetivos que se pretendan alcanzar


con el cultivo, ya que en ocasiones se requiere que el desarrollo del microorganismo se
produzca de forma masiva, mientras que en otras resulta indispensables que las colonias
queden aisladas o que las manifestaciones del metabolismo tengan lugar con tensiones
reducidas o privadas de oxígeno. Así mismo, en el trabajo con cultivos microbianos
siempre que se vaya a tomar una muestra de un cultivo axénico con cualquier finalidad
debe procederse bajo las mayores condiciones de aséptica posible con el fin de no
introducir contaminación en el cultivo nuevo ni en la muestra.

Los métodos de siembra más empleados son los siguientes:

1. Siembra por estrías.

2. Siembra por punción.

3. Siembra volumétrica.

4. Siembra masiva.

Siempre que se utilicen instrumentos de siembra de platino o nicrón, deben ser calentados
en la llama del mechero hasta el rojo vivo, antes y después de realizar la siembra, con el
objetivo de destruir a los microorganismos contaminantes de la superficie del instrumento.

Con independencia del tipo de medio y el método de siembra a emplear ésta debe
realizarse en las proximidades de la llama del mechero ya que el calor emanado reduce el
número de microorganismos presentes en sus inmediaciones, lo cual es utilizado como un
recurso aséptico.

A). Siembra por estrías

Este método de siembra se realiza sobre la superficie de los medios de cultivo sólidos
distribuidos en placas de "Petri" o en tubos de ensayo solidificados en forma de cuña
(Slam).

Para la siembra por estría se utiliza el asa de platino o el hisopo. En algunas ocasiones, se
utilizan ambos instrumentos en la misma siembra.

Procedimientos

Cuando se utilice exclusivamente el asa de platino o nicrón.

1. Sujete el asa de alambre de platino o nicrón por el cabo, en forma similar, a cuando
tomamos el lápiz para escribir.

2. Introduzca el asa directamente en la zona de color azul de la llama del mechero, hasta
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que se ponga al rojo vivo. A continuación introducir lentamente el resto del alambre
para lograr el mismo efecto.

3. Retire el instrumento de la llama y espere de 4 a 5 segundos con el objetivo de que el


asa se enfríe.

4. Con el asa estéril y fría tome el volumen o fragmento de la muestra que será sembrado y
trasládelo de inmediato para el medio del cultivo seleccionado.

5. Si la siembra se realizará en un medio solidificado en forma de cuña en tubo de


ensayo, proceda del siguiente modo:

a. Para iniciar es recomendable que gire el tapón cuidando de no destapar el tubo.

b. Tome el asa bacteriológica con los dedos pulgar, índice y mayor, dejando libres el
anular y el meñique.

c. Con la mano opuesta a la que sujeta el asa, tome el tubo por la porción inferior,
de modo que el fondo del tubo toque la palma de la mano.

d. Con el dedo meñique de la mano que sostiene el asa, retire del tubo el tapón de
algodón o la tapa de rosca y reténgala (no colocar el tapón o la tapa sobre la mesa
de trabajo)

e. Flamee de inmediato la boca del tubo de ensayo, pasándola una o dos veces por la
llama del mechero, con el objetivo de eliminar por incineración los
microorganismos contaminantes que se encuentran en esa zona por la parte
externa del tubo. Esta acción calórica, provoca además una convección del
movimiento del oxígeno presente en el interior del tubo hacia afuera, debido a la
desigualdad de calor, lo cual favorece que decrezca el riesgo de contaminación.

f. Queme el asa introduciendo la punta en el cono frío de la llama del mechero en


posición vertical y luego vaya levantándola hasta que quede toda al rojo. Pasar el
asa por la flama en un ángulo de 60º con la vertical, manteniéndola siempre en
posición paralela al cuerpo. Flamear el metal adyacente al asa.

g. Para enfriar el asa, introdúzcala al tubo tocando la pared fría y luego introdúzcala en
el cultivo líquido o si es un cultivo sólido deslícela sobre la superficie de abajo
hacia arriba, para tomar las células a transferir (inóculo).

h. Posteriormente introduzca el asa con el volumen o fracción de la muestra en el


tubo, hasta el fondo de la cuña. A partir de este momento, la siembra puede
realizarse de diferentes maneras, en dependencia del tipo de microorganismo que
pretendemos que se desarrolle en ese medio de cultivo:

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• Deslizando el asa, desde el fondo hacia arriba, por toda la superficie de la
cuña, trazando una línea longitudinal.

• Deslizando el asa por la superficie de la cuña desde el fondo hacia arriba,


imprimiéndole un movimiento de zigzag.

• Moteando toda la superficie de la cuña con hisopo.

• Efectuando cualquiera de las tres variantes explicadas pero adicionalmente


roturando el medio con el asa, haciendo un pequeño corte longitudinal.

• Al concluir la siembra se flamea la boca y se taponea nuevamente el tubo


procediendo a esterilizar el asa en las llama del mechero.

i) Saque el asa del tubo, flamee la boca del tubo y tápelo.


Queme nuevamente el asa para eliminar el resto del inóculo.

Figura. Siembra microbiológica en medios de cultivos distribuidos en tubos de ensayo: 1) y


2) Retirar el tapón del tubo; 3) Flamear la boca del tubo; 4) Introducir el instrumento de
siembra con la muestra y realizar la siembra; 5) Retirar el instrumento y flamear
nuevamente la boca del tubo; 6) Taponar el tubo.

6. Si la siembra se fuera a realizar en la superficie de un medio solidificado en placa


de Petri, proceda de la siguiente manera:

a. Con la mano opuesta a la que sujeta el asa de platino, tome la placa de Petri,
de manera que la tapa quede hacia arriba. Con ayuda del dedo pulgar abra
parcialmente la placa. Trabajar siempre en el área del mechero (Figura).

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Figura. Apertura manual de la placa de Petra con medio de cultivo.

b. Introduzca el asa con la muestra y proceda a deslizarla suavemente en forma de


zigzag, desde la pared, hasta cubrir aproximadamente un tercio de toda la
superficie (Figura).

c. Cierre la placa y gírela varios cm, en contra de las manecillas del reloj, procediendo
a abrirla nuevamente por igual procedimiento.

d. Introduzca nuevamente el asa y haga un segmento similar al anterior, de manera


que las bacterias sembradas en el primer segmento sean removidas para el
segundo (Figura).

e. Repita esta operación una o dos veces más.

Nota: Existen diferentes métodos de estriado en placa (Figura)

f. Finalmente cierre la placa y colóquela sobre la mesa de trabajo boca abajo.

g. Esterilice el asa de platino a la llama del mechero, en la forma explicada antes de


dejarla en el puesto de trabajo.

Figura. Método de siembra por estrías en medios de


cultivo sólidos distribuidos n placas de Petri.

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Figura. Diversas técnicas para el aislamiento por estría.

7. Cuando la muestra es tomada exclusivamente con hisopo.

a. Si la siembra se va a producir en una cuña de agar, se procede en forma similar que


la siembra con asa en este tipo de medio de cultivo.

b. Si la siembra se fuera a producir en medios sólidos en placas, el primer segmento


se hace con el mismo hisopo con que se tomó la muestra y los restantes se
realizan con asa estéril, para lograr una diseminación por agotamiento, que
posibilite el desarrollo aislado en los últimos segmentos del microorganismo en
estudio. Otra variante es la diseminación cruzada, en este caso, en lugar de
hacer un primer segmento en zig zig con el hisopo, se procede a trazar en el
centro de la plaza una letra "Z" y a continuación con el asa esteril se procede a
deslizarse con un movimiento ondulatorio sobre la "Z".

Figura. Siembra por diseminación cruzada: a) Trazar con el hisopo que contiene el inóculo
una "Z"en la superficie del medio; b) Completar la siembra con un asa de platino estéril,
imprimiendo movimientos ondulatorios sobre la "Z".

B. Siembra por punción

Como es obvio, el instrumento de siembra a emplear será la aguja de platino y el medio de


cultivo sólido, generalmente, en tubo de ensayo. Las manipulaciones y la observancia de
las precauciones de asepsia, son similares que cuando se utiliza el asa. La particularidad
que tiene este método, es que la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente

19
el medio de cultivo.

Figura. Siembra por punción

C. Siembra volumétrica

Este método de siembra consiste en sembrar una muestra liquida cuyo volumen no puede
ser predeterminado, en medio de cultivo sólidos o líquidos. Por ejemplo: En las muestras
de exudado vaginal tomadas con pipetas de Pasteur, no puede determinarse el volumen,
ya que este tipo de pipeta carece de escala de graduación, sin embargo, la orina
empleadas en el urocultivo o la sangre para el hemocultivo se puede determinar con pipeta
o jeringuilla respectivamente el volumen que será sembrado.

D. Siembra masiva

Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátula de Driglaski.
En este caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la superficie
del medio de cultivo sólido imprimiendo un movimiento en espiral. La siembra masiva
también se puede realizar con un hisopo grueso embebido de un cultivo liquido,
procediendo a su deslizamiento sobre toda la superficie de una placa de agar.

Figura. Siembra masiva con espátula de Drigalski.

NO OLVIDE ETIQUETAR SU MATERIAL

DEBE REVIZAR LOS CULTIVOS CADA 24hrs. EN CASO DE PRESENTAR


CRECIMIENTO DEBE METERLOS AL REFRIGERADOR.

REPORTE

Investigar: 1) ventajas y desventajas de cada técnica de sembrado y en qué casos es más


apropiado utilizar cada una; 2) Los tipos de medio de cultivo: generales, selectivos y diferenciales,
y su uso.

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PRÁCTICA No. 2

OBSERVACIÓN DE LA MORFOLOGIA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS

OBJETIVO: El estudiante reconocerá las principales características de la morfología


colonial utilizada en la identificación de cepas bacterianas.

INTRODUCCION

Una colonia es un grupo de bacterias formado por la reproducción de un solo organismo


sobre un medio sólido y generalmente visible a simple vista. Para la identificación de las
colonias bacterianas se consideran algunas características físicas como:

Tamaño de las colonias: Es constante dentro de las especies y puede ir desde colonias
diminutas hasta varios milímetros.

Forma: Está determinada por su borde y espesor.

Consistencia y textura: La consistencia puede variar desde una colonia seca que puede
moverse sobre el agar con un asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma
filamentos o hilos mucosos cuando se separa del agar. La textura puede parecer granular
o amorfa. La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada
con muescas concéntricas o quebradas.

Pigmentación: En bacterias saprofitas las colonias aparecen rojas, amarillas,


anaranjadas, etc. El pigmento no se aprecia en células individuales ya que se debe a
gránulos intracelulares muy pequeños para verse con luz transmitida.

Turbidez: En cultivo de caldo la opacidad es más o menos densa, signo de crecimiento.

Película: Es un crecimiento casi continuo sobre el líquido.

Sedimento: Es un sedimento de células en el fondo del tubo que se resuspende al agitar.

MATERIAL

Cultivos de la práctica anterior


Microscopios de disección y óptico
2 mecheros
Asas bacteriológicas Portaobjetos
Cubreobjetos
Azul de metileno, Nigrosina

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PROCEDIMIENTO

1.- Observe las colonias bajo el microscopio y anote las características basándose en el
texto y en la figura 7.

2.- Para textura destape cuidadosamente las cajas y con una asa estéril toque las
colonias.

NOTA: Ciertas características de las colonias ocurren de una manera uniforme, por lo que
se toman en cuenta para identificar bacterias en cultivos mixtos, pero para hacer un
estudio completo a nivel de especie es necesario hacer un estudio fisiológico e
inmunológico de estas colonias.

FORMA

SUPERFICIE

BORDE

Figura 7.- Morfología de las colonias bacterianas

OBSERVACIÓN DE BACTERIAS AL MICROSCOPIO

REPORTE:

Elaborar una tabla con las características observadas de las diferentes colonias.

Investigar los caracteres y pruebas que usa la taxonomía clásica bacteriana para la
identificación de las bacterias.

22
PRÁCTICA No. 3

TRANSFERENCIA DE UNA COLONIA PARA DESARROLLO DE CULTIVOS PUROS

OBJETIVO: El estudiante aprenderá la técnica de aislamiento para la obtención de


cepas puras.

INTRODUCCION

El aislamiento y obtención de cultivos puros posiblemente hayan sido las bases más
importantes en el desarrollo de la Microbiología. Los primeros trabajos en Microbiología se
hicieron en unas condiciones experimentales que no permitían tener la certeza de que se
hubieran obtenido cultivos puros.

Las técnicas para obtener cultivos puros fueron inicialmente desarrolladas por De Bary y
Brefeld para el estudio de hongos y consiguieron aislar células y cultivar hongos sobre
medios sólidos. Pero estas técnicas no eran adecuadas para el cultivo de bacterias.

El proceso de aislamiento consiste en disponer de la descendencia de un individuo (célula)


inmovilizada sobre la superficie de un medio sólido y separada del resto de individuos
presentes en el cultivo mixto. Esta célula, en las condiciones de crecimiento adecuadas
dará lugar a una descendencia (clon) que resultará macroscópicamente visible y que se
llama colonia. Cada colonia contiene millones o miles de millones de células idénticas y
con el mismo origen y propiedades. Se puede demostrar que prácticamente cada colonia
procede de una sola célula o de un grupo de células del mismo tipo si el microorganismo
forma agregados. Por ello lo más correcto es hablar de unidades formadoras de colonias
(UFC) al referirnos al origen de una colonia. Cada colonia representa una población de
microorganismos procedentes de una sola célula, a partir de la cual se posee la seguridad
de obtener dicho cultivo puro de un solo tipo de microorganismo.

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO

Técnica de aislamiento por estría escocesa o agotamiento en placa

La siembra por estría escocesa es un método cualitativo de aislamiento de


microorganismos por agotamiento en placa a partir de una muestra natural o de un cultivo
de laboratorio. Este método está basado en arrastrar, mediante un asa de siembra, un
número cada vez más pequeño de individuos.

Es un método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inoculo sobre un


medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo es obtener, a partir de un
elevado número de bacterias, un número reducido de ellas distribuidas individualmente

23
sobre la superficie de la placa. Al incubar la placa, y dejar crecer las bacterias distribuidas
sobre ella, cada una de las bacterias originará una colonia.

Técnica de aislamiento por banco de diluciones y recuento de células viables

El aislamiento de microorganismos mediante banco de diluciones es un método tanto


cualitativo como cuantitativo. Es cualitativo porque permite diferenciar las diferentes
morfologías coloniales y también es cuantitativo porque permite conocer el número de
microorganismos que hay en una suspensión.

Consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de esterilidad, de


manera que se va reduciendo el número de microorganismos de la suspensión inicial, con el
objeto de sembrar después cantidades conocidas de las diluciones en placas de Petri.
Evidentemente, el número de microorganismos en algunas de las diluciones será tal que al
distribuir una parte de ella en una placa originará colonias separadas en un número óptimo
para su recuento. Las diluciones se realizan en tubos que contienen una disolución mineral
isotónica (solución Ringer 1/4) que mantiene la viabilidad de las células pero no permite la
división celular. De los tubos de las diluciones se siembra un volumen conocido, 0.01 ó 0.1
ml (10 ó 100 μl), sobre una placa de Petri.

Conociendo el número de colonias (UFC), la cantidad sembrada y la dilución


correspondiente, esta técnica también permite evaluar el número de microorganismos viables
en la muestra original.

La técnica que se empleará en esta práctica es la de estría escocesa o agotamiento en placa

MATERIAL

Cultivos de la práctica anterior 2


Cajas petri con medio sólido
3 Tubos de ensayo con medio sólido inclinado
2 mecheros
Asas bacteriológicas

PROCEDIMIENTO

1.- Examine las placas y seleccione una colonia aislada, marcando su posición con un círculo
por el lado inferior de la caja de petri.
2.- Flamee el asa. Levante la tapa de la caja de petri y toque con el asa la colonia
seleccionada, verifique que el asa lleve parte de la colonia. Solo transfiera una mínima
parte de la colonia, de preferencia de la parte externa de la misma (Figura 10).
3.- Estríe en otra caja petri con medio, empleando la técnica de estría escocesa o
agotamiento en placa (Figura 10a y b).

24
4.- Después de haber obtenido el inoculo, tome un tubo con medio inclinado y siembre por
estriado.
5.- Selle e incube a 37 ºC por 24 hrs.

Figura 10.- Aislamiento de una colonia a) estría por agotamiento en placa; b) estría escocesa

PURIFICACIÓN

1.- Observe los cultivos incubados, si no están contaminados proceda a su purificación de la


siguiente manera:

a) Prepare tubos de ensayo con medio sólido inclinado.

b) Seleccione una colonia aislada del cultivo, con una asa toque la colonia y proceda
a sembrar por estriado en tubo inclinado. SOLO UNA (Figura 12).

c) Selle e incube a 37 ºC por 24 hrs.

d) Si observa crecimiento guarde el cultivo en refrigeración a 6 ºC aproximadamente


para su uso en prácticas posteriores.

Figura 12. Purificación de una colonia por siembra en tubo inclinado

REPORTE

Investigar la importancia de los cultivos puros.

Investigar otras técnicas para la obtención de cepas bacterianas.


25
PRÁCTICA No.4

TINCIÓN SIMPLE

Una vez que se fija una preparación, éstas pueden emplearse para teñir las células
bacterianas.

La tinción simple se basa en que las células bacterianas difieren desde el punto de vista
químico de su medio externo y por eso se tiñen, contrastando con él. Para la tinción simple
de las células puede emplearse los siguientes colorantes básicos: azul de metileno, cristal
violeta o fucsina fenica. Estos presentan diferente afinidad por las células bacterianas y por
ello, los tiempos de aplicación necesariamente serán distintos.

Los microorganismos también difieren física y químicamente entre si y por eso reaccionan de
una manera diferente frente a un determinado proceso de tinción. Esto constituye el
fundamento de las tinciones diferenciales.

Procedimiento.

A. Tinción simple

a) Preparar un frotis según la técnica antes descrita (Figura 8).

b) Colocar el portaobjetos sobre un soporte para tinciones.

c) Cubrir la preparación con 2 o 3 gotas de solución de azul de metileno y dejar 1 min (o


de cristal violeta o fucsina fénica y dejar 30 s).

d) Lavar con agua.

e) Secar con papel de filtro o encima del mechero.

f) Observar al microscopio con lente de inmersión y determinar forma, disposición y


relación de tamaños de las distintas bacterias.

g) Determine la forma de sus bacterias guiándose con los esquemas de la figura 9.

26
Figura 8.- Preparación de un frotis para observación al microscopio.

Figura 9.- Formas bacterianas

REPORTE

Investigar la importancia de las tinciones en la identificación de las bacterias.

Reporte las formas bacterianas observadas.

27
PRÁCTICA No. 5

TINCION DE GRAM (Modificada por Hucker)

OBJETIVO: Los estudiantes conocerán y aprenderán una de las tinciones diferenciales más
usadas en el laboratorio, distinguiendo las bacterias gram+ y gram-.

INTRODUCCION.

La tinción de Gram utiliza cuatro reactivos: cristal violeta, yodo de gram, etanol al 95% y
safranina. Existen algunas modificaciones de la tinción original, sin embargo el principio
fundamental es el mismo para todas.

La tinción de Gram, la más empleada en bacteriología, es una tinción diferencial. Por este
método se clasifican las bacterias en dos grupos: Gram positivos (Gram +) y Gram negativos
(Gram -), en función de su reacción frente a la coloración.

Según este procedimiento, las células previamente fijadas, se tiñen con solución de cristal
violeta, se lavan y se tratan con lugol. El iodo forma un complejo con el cristal violeta, que
sirve para fijar éste a la célula. Luego se agrega un agente decolorante (alcohol, acetona o
mezclas de ambos) en el cual el complejo iodo-cristal violeta es soluble y por eso algunos
microorganismos son decolorados (Gram -) mientras que otros no (Gram +).

Luego de la decoloración se aplica un colorante de contraste, generalmente safranina, que


hace visibles los microorganismos decolorados (Gram -). Cuando se observa una
preparación teñida mediante este procedimiento, se ven células azul violeta (Gram +) y
rosadas (Gram -).

En los Gram - el complejo es extraído por el alcohol mientras que en los Gram + no. Las
bacterias Gram + poseen paredes gruesas de peptidoglicano, se deshidratan por el alcohol.
Esto provoca que se cierren los poros de la pared, impidiendo que el complejo iodo-cristal
violeta se escape. En las bacterias Gram -, la fina capa de peptidoglicano no evita el pase del
solvente y el escape del complejo yodo-cristal violeta de la célula.

Las levaduras, que poseen una pared celular gruesa pero de una composición química
totalmente diferente, se tiñen como Gram +. No son los constituyentes químicos, sino la
estructura física de la pared lo que le confiere la Gram positividad.

El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las


bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las
bacterias Gram-tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica

28
externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con
etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el
colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán
después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

MATERIAL

Asa, mecheros
Cultivo de bacterias
Microscopio óptico
Pizeta
Portaobjetos y cubreobjetos estériles
Cristal violeta
Yodo de Gram
Etanol al 95%
Safranina

PROCEDIMIENTO

a) 1.- Preparar un frotis según la técnica antes descrita.

b) Colocar el portaobjetos sobre un soporte para tinciones.

c) Cubrir con solución de cristal violeta y dejar actuar 1 min.

d) Lavar suavemente con agua de la llave o con una pizeta.

e) Cubrir con lugol y dejar actuar 1 min.

f) Lavar suavemente con agua de la llave o con una pizeta.

g) Cubrir con etanol 95% y dejar 30 s moviendo suavemente el portaobjetos. Repetir el


lavado con etanol hasta que éste no arrastre más colorante.

h) Lavar con agua.

i) Cubrir con solución de safranina y dejar 1 min.

j) Lavar y secar.

k) Observar al microscopio por inmersión.

29
Las bacterias Gram + se verán de color azul-violeta y las Gram - rosadas. La tinción de Gram
es frecuentmente usada para determinar forma, disposición y tamaño relativo y reacción al
Gram de las distintas bacterias presentes.

Medición de tamaño

La medición del tamaño (longitud y diámetro) de las bacterias, no se puede realizar con la
precisión y exactitud deseables debido a dificultades técnicas inevitables. Los
microorganismos en preparaciones fijadas y coloreadas sufren deformaciones que hacen
que las medidas sean solo aproximadas. Además los preparados secos, fijados (aún con
formol) y coloreados no revelan la pared celular.

No se debe medir el tamaño con coloración negativa en caso de organismos encapsulados;


además, debido a que tanto la bacteria como el colorante tienen carga negativa, este se seca
a una pequeña pero significativa distancia de la bacteria, lo que hace que esta aparezca más
grande, aun cuando no tenga cápsula.

9.- Examine al microscopio con el objetivo de inmersión. Guíese por las fotos de la figura
13.

NOTA: Las bacterias se pueden fijar con calor, alcohol, acetona o formaldehido.

REPORTE

Registre el tipo de bacteria: gram+ y las


gram- en la tabla de características de las
colonias.

Investigar los fundamentos de la tinción


de Gram.

Explicar los problemas que presentó esta


tinción.

Figura 13. Esquema de tinción de gran y fotografías de bacterias Gram+ y Gram-

REPORTE

Investigar por qué se diferencian las bacterias en Gram + y Gram – y su importancia en la


identificación de las bacterias.

Reporte el tipo Gram de bacterianas observadas.

30
PRÁCTICA No. 6
MICROFLORA DE PLANTAS Y SUELO

OBJETIVO: Conocer la microflora normal de las plantas y la del suelo asociada a plantas.

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos normalmente existen en el suelo e interactúan con las plantas, a


estas poblaciones se les conoce como microflora nativa del suelo, pero su simple
presencia no debe interpretarse como indicación de patogenicidad. La interacción
planta/bacteria puede ser benéfica, perjudicial o neutral desde el punto de vista del
desarrollo y crecimiento vegetal. La interacción bacterias/plantas se inicia desde la
germinación y continúa durante todo el desarrollo de la planta. Las bacterias pueden
establecerse en cualquier parte de la planta, raíces, hojas, tallos, flores, etc. Algunos
microorganismos son solo superficiales y otros son endófitos. Pueden contribuir en varias
funciones útiles, por ejemplo, la microflora del suelo asociada a la raíz de las plantas,
denominadas bacterias rizosféricas, son capaces de impactar positivamente sobre el
crecimiento de cualquier especie vegetal, además de controlar a otros microorganismos
del suelo capaces de enfermar a las plantas. Estas bacterias son comúnmente conocidas
como PGPR (por sus siglas en inglés, que significan plant growth promoting rhizobacteria,
o rizobacteria promotora del crecimiento vegetal). No obstante, la aplicación de
rizobacterias representa sólo 1.4% (380 millones de dólares) del mercado global para el
control de plagas y enfermedades.

MATERIAL
1 Planta de jardín o bosque
Hisopos estériles
Asas bacteriológicas
Colorantes para tinción de Gram
Medio de cultivo con Agar nutritivo
Medio cultivo Agar-tripticasa de soya
Microscopios
Aceite de inmersión
Porta y cubreobjetos
Estufa de incubación

PROCEDIMIENTO

I. Estudio de la microflora asociada a plantas

1. Frote suavemente un hisopo estéril sobre la superficie de una hoja, deposítelo con
cuidado en el extremo de una placa de tripticasa-agar-soya o de agar nutritivo y extiéndalo
en la superficie con un asa bacteriológica, por estría cruzada.

2. Con otro hisopo frote suavemente una parte del tallo y haga un frotis en un
portaobjetos. Deje secar y fije con calor. Tiña con Gram. Observe a 100 X.
31
Estudio de la microflora del suelo asociada a las raíces.
1. Tome la planta y elimine el suelo sacudiendo la raíz en un recipiente lo suficientemente
grande.
2. El suelo adherido a la raíz de la planta arrástrelo a una cápsula estéril, aplicando 10 ml
de agua estéril con una pizeta directamente. Ésta solución es su muestra.
3. Haga diluciones de 110, 1100, 11000, 110000 de la muestra y siembre cada una en dos
placas de Agar TSA (Agar Tripticaseína de Soya).
4. Incube a 28°C durante 72 hrs.

REPORTE

Describa la morfología de las colonias de bacterias asociadas a hoja, tallo y raíz/suelo.

Investigue los beneficios de la interacción de bacterias PGPR/plantas.

Investigue las ventajas y desventajas de aplicar bacterias PGPR en cultivos de


importancia agrícola.

32
PRÁCTICA No. 7

COLORACIÓN DE ESTRUCTURAS

A) Tinción de Esporas

Ciertas especies bacterianas, en particular de los géneros Bacillus y Clostridium, producen


elementos de resistencia denominados esporas o endoesporas debido a que se forman
dentro de la célula, a razón de una por célula.

A diferencia de la célula vegetativa que la produce, la espora es muy resistente a


condiciones adversas tales como alta temperatura, baja humedad, radiaciones y agentes
químicos. Es una forma de vida latente que puede permanecer largos períodos como tal y
cuando desaparecen las condiciones adversas pueden germinar. También puede
inducirse esa germinación mediante, por ejemplo, un shock térmico por calentamiento a
80ºC.

Las esporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las
técnicas de coloración comunes aparecerán como regiones sin teñir dentro de las células
coloreadas. Por lo tanto, para teñir las esporas específicamente, deben usarse métodos
de coloración especiales; por otra parte, una vez coloreada, la espora resiste fuertemente
la decoloración y el contraste.

Procedimiento

a) Preparar un frotis pasando 10 veces por la flama para fijar.

b) Colocar la lámina sobre un soporte para tinciones.

c) Cubrir con pequeños trozos de papel de filtro e impregnarlos con solución de


verde de malaquita y calentar durante 5 min con el mechero. Mantener el papel de
filtro siempre saturado con verde de malaquita, no dejar que se seque.

d) Quitar el papel de filtro y lavar suave, pero abundantemente, con agua.

e) Dar contraste con solución de safranina durante 30 s.

f) Lavar con agua y secar.

g) Observar al microscopio por inmersión. Se verán las esporas verdes y los cuerpos
celulares rosados. Si se dispone de un microscopio con contraste de fases, se
puede observar la endospora sin teñir como una estructura densa, blanca dentro
de la célula.
33
Observe y registre los datos siguientes:

- presencia o ausencia de esporas

- deformación o no del cuerpo celular

- posición de la espora dentro del cuerpo celular según lo siguiente:

o terminales (espora en el extremo del cuerpo celular)

o centrales (espora en el centro del cuerpo celular)

o centrales a terminales o subterminales (posición intermedia).

B) Tinción de Cápsula

Ciertas bacterias segregan en su superficie materiales gomosos compuestos por


polisacáridos, polipéptidos o complejos glucoproteicos. Cuando este material se dispone
de una manera compacta alrededor de la superficie celular se denomina cápsula.

La mejor forma de observarla es con tinción negativa (Procedimiento 1) aunque también


existen técnicas especiales para la coloración específica de la cápsula (Procedimiento 2).

Procedimiento 1

a) Colocar una gota de tinta china en un portaobjetos limpio y mezclarla con una
muestra de crecimiento colonial.

b) Cubrir con un cubreobjetos.

c) Observar al microscopio por inmersión. Las cápsulas aparecen como zonas claras
alrededor del organismo refractil sobre fondo oscuro.

Procedimiento 2

a) En un portaobjetos limpio hacer un frotis de la solución bacteriana.

b) Secar y fijar al aire.

c) Cubrir la lámina con fuccina fénica fuerte y calentar ligeramente durante 1 minuto.

d) Lavar rápidamente con etanol y posteriormente con agua.

e) Cubrir con la solución mordente de Muir durante 30 segundos.

f) Lavar con agua y posteriormente con etanol durante 30 segundos o bien, hasta que
el frotis tome un color rojo pálido.

g) Lavar con agua.


34
h) Teñir con azul de metileno de Loeffler dejando actuar por 30 segundos.

i) Lavar con agua y dejar secar.

j) Observar al microscopio con el objetivo 40x o el de inmersión. Las bacterias se


tiñen de rojo y las cápsulas de azul.

C) Tinción de Flagelos

Muchas bacterias son móviles y su capacidad para moverse en forma independiente se


debe generalmente a la presencia de estructuras especiales, los flagelos. Son apéndices
largos, delgados, de forma helicoidal, libres en un extremo y unidos a la célula por otro.

Son tan delgados que solo se pueden ver al microscopio común luego de una coloración
especial que hace uso de un mordiente. Este promueve la fijación de las moléculas de
colorante al flagelo dando lugar a la formación de un precipitado a lo largo del flagelo,
haciéndolo visible.

Procedimiento

a) Colocar una gota de agua esterilizada en el extremo de un portaobjetos

b) Con el asa bacteriológica tome crecimiento bacteriano desarrollado en el medio y


deposítelo en la gota de agua para que se forme una suspensión. También puede
partir del crecimiento bacteriano en medio líquido.

c) Inclinar el portaobjetos de tal manera que la gota se deslice suavemente a lo largo


del portaobjetos.

d) Secar al aire.

e) Cubrir durante 5 minutos con el mordiente.

f) Escurrir y enjuagar con agua de la llave evitando que el agua caiga de golpe sobre
la preparación.

g) Adicionar solución de cristal violeta y dejar actuar por 2 minutos.

h) Escurrir y enjuagar con agua de la llave.

i) Dejar secar.

j) Observar al microscopio con el objeto de inmersión.

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Observar y registrar la flagelación característica de la célula bacteriana, la cual
puede tener uno o más flagelos dispuestos en distinta manera y en base a eso se
clasifican en:

- Polar .......... un flagelo en un extremo del cuerpo celular

- Anfítrica ..... flagelos en ambos extremos

- Lofótrica ..... penacho de flagelos en un extremo

- Perítrica ..... flagelos alrededor de toda la célula sin distribución

- Célula sin flagelos

En las fotos se observan flagelos teñidos con ácido tánico (mordiente) y fucsina básica, en
disposición perítrica.

Tinción de Gránulos metacromáticos.

Procedimiento

 En un portaobjetos limpio hacer un frotis del cultivo bacteriano.

 Fijar al aire.

 Teñir con el colorante de Albert durante 3 -5 minutos.

 Lavar con agua y secar con papel secante.

 Teñir con solución de Lugol durante 1 minuto.

 Lavar con agua, escurrir y secar.

 Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.


36
El citoplasma aparece verde claro y los gránulos azul obscuro.

Tinción de Inclusiones de poli ß-hidroxibutirato.

Procedimiento

 En un portaobjetos limpio hacer un frotis del cultivo bacteriano de 12-24 horas de


edad, sembrado en medio de agar nutritivo o medio mineral.

 Dejar secar al aire y fijar al calor.

 Cubrir la preparación con la solución de sudán negro (Schaad, p. 72) dejándola


actuar durante 15 minutos.

 Decantar la solución y secar.

 Lavar la preparación con Xilol y dejar secar al aire.

 Adicionar solución acuosa de safranina al 0.5 % y mantenerla durante 10


minutos.

 Lavar con agua y dejar secar.

 Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

Si la bacteria acumula o no intracelularmente el Poli B-hidroxibutirato, propio del


grupo de bacterias Pseudomonas no fluorescentes.

Tinción de bacterias ácido resistentes

La tinción de ácido-resistentes es una tinción diferencial que demuestra la resistencia de la


célula a ser decolorada por los álcalis, ácidos y alcohol.
En algunos microorganismos de los géneros Mycobacterium y Actinomyces la propiedad
ácido resistente está relacionada con su alto contenido en lípidos.
La tinción de estas bacterias debe hacerse con colorantes que tengan alta afinidad por
tales células y en caliente. El método general consiste en teñir el frotis en caliente,
decolorar con alcohol ácido (no se decoloran los ácido resistentes) y luego teñir con un
colorante de contraste. De esta forma quedan las bacterias ácido resistentes con el color
inicial y las demás con el color de contraste.

Procedimiento (Técnica de Ziehl-Neelsen)

37
a) Colocar el portaobjetos sobre un soporte para tinciones.
Cubrir con solución de fucsina básica y calentar, por debajo, con el mechero hasta
que se desprendan vapores (sin hervir). Mantener así durante 5 min con
calentamiento intermitente según sea necesario. No recalentar.

b) Lavar con agua de la llave hasta que no aparezca colorante en el agua de


enjuague.

c) Cubrir con solución decolorante (alcohol-HCl), lavar inmediatamente con agua de


la llave y repetir la operación hasta que el preparado quede rosa pálido.

d) Cubrir con solución de contraste (azul de metileno) y dejar durante 20-30 seg.
Lavar con agua de la llave, secar con papel de filtro.

e) Observar por inmersión. Las bacterias ácido resistente se verán rojo-rosadas y las
demás azules.

38
PRÁCTICA No. 8

PRUEBAS BÁSICAS PARA DETERMINAR LA INFLUENCIA DE FACTORES


AMBIENTALES SOBRE EL DESARROLLO BACTERIANO

Requerimiento de oxígeno. Capacidad anaeróbica (Hugh & Leifson).

Procedimiento.

1. Pesar y disolver en agua destilada...

g/L

Peptona 2.0 g

NaCl 5.0 g

K2HPO4 0.3 g

Agar 3.0 g

Azul de bromotimol 3.0 ml

-1% de azul de bromotimol en solución acuosa

De manera separada, preparar una Solución acuosa de Glucosa 10% y esterilizar a


10 psi durante 1 h.

2. Ajustar el pH a 7.0 ± 0.1.

3. Vaciar a tubos de ensayo con tapa.

4. Esterilizar a 121° C, 15 psi, 20 min, y dejar enfriar a 45-50° C.

5. Adicionar por cada 5 ml de medio, 0.5 ml de solución de glucosa estéril. El medio


se puede esterilizar 10 psi/ 1 h, agregando todos los componentes, o bien utilizar
medio elaborador por alguna marca comercial siguiendo las instrucciones para su
preparación.

6. Inocular una asada del cultivo microbiano en dos tubos.

7. Adicionar a uno de los tubos inoculados, 0.5 a 0.8 ml de aceite mineral, vaselina o
parafina estéril (alcanzar un nivel de 5 mm de altura).

8. Incubar 25-28° C durante24 h.


39
9. Observar un cambio de color del medio a amarillo en ambos tubos, el cual será
registrado como positivo para crecimiento anaerobio (fermentación).

Rango de Temperatura de Crecimiento

(Recomendado para Enterobacterias...)

1. Preparar Caldo YS.

NH4H2PO4 0.5 g

K2HPO4 0.5 g

MgSO4.7H2O 0.2 g

NaCl 5.0 g

Extracto de levadura 1.0 g

Agua destilada 1.0 L

Ajustar el pH a 6.8 y esterilizar.

NOTAS:

Esterilizar por autoclaveado y posteriormente adicionar por filtración la fuente de carbono


a una concentración final de 0.5% (w/v).

O bien, adicionar la solución del carbohidrato al medio y esterilizar a 116-118° C durante


10 min.

Para las sustancias difíciles de disolver, como la salicina, disolverla en un volumen mayor
de agua y adicionarla al Medio C, y esterilizar tres días sucesivos.

Preparar medio sin carbohidrato para utilizarlo como control negativo.

2. Vaciar a cajas petri o tubos de ensayo y dejar solidificar de manera inclinada.

3. Tomar con un asa, una muestra del cultivo bacteriano y estriarlo sobre el medio.

4. Incubar en el rango de temperaturas que se disponga y observar el crecimiento


durante 2, 4, 6, 21 y 28 días.

5. Comparar el crecimiento con las cajas o tubos control.

40
PRÁCTICA No. 9

PRUEBAS DE REACCIÓN BIOQUÍMICA PARA EL ESTUDIO DE BACTERIAS

Las pruebas de reacción bioquímica o pruebas bioquímicas determinan la actividad


metabólica de una cepa microbiana pura. Son empleadas principalmente en la
identificación y clasificación de bacterias y hongos.

Se pueden resumir en los siguientes puntos:

•Sustrato (contenido en el medio de cultivo)

•Enzima o vía metabólica (secretada o en el interior del microorganismo)

•Producto

•Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean)

Algunas pruebas bioquímicas básicas se describen a continuación.

A) Producción de la enzima Citocromo Oxidasa.

Permite diferenciar especies de la Familia Pseudomonales de otros bacilos gram


negativos mediante la detección del sistema enzimático citocromo oxidasa de la cadena
respiratoria del complejo enzimático IV. Se dice que una bacteria es oxidasa +, cuando el
cultivo es capaz de oxidar la forma reducida de derivados de N-metil-para-fenilendiamina
en semi-quinona. Vibrio, Pseudomonas, Neisseria y Brucella, son ejemplo de ello. Las
Enterobacterias y Acinetobacter, son oxidasa negativo.

PROCEDIMIENTO

1. Preparar la solución del reactivo:

100.0 ml 3.0 ml
N,N dimetil-para-fenilen-diamina 1.0 g 0.03 g
(Puede usarse Hidrocloruro de tetrametil-p-fenilen-diamina)
Disolver el reactivo en agua destilada y guardarlo en frasco gotero ámbar. Nota: Es
conveniente utilizar reactivo recién preparado.

2. Colocar 1 o 2 gotas de solución sobre papel filtro.

3. Obtener con palillos de madera o asa de platino, una muestra del cultivo bacteriano y
depositarlo sobre el papel filtro impregnado con la solución de N,N dimetil-para-
fenilen-diamina.
41
Nota: Se recomienda que el cultivo sea no mayor a 48 h y preferentemente crecidos
en medios NA o KB.

4. Observar: Positivo: Si al cabo de 10 seg. la muestra de cultivo bacteriano adquiere


una coloración rosa o roja o púrpura.

B) Producción de enzimas Catalasas.

Utilizada en sistemática bacteriológica para la identificación de bacterias. La catalasa es


una enzima (EC 1.11.1.6) que cataliza la destrucción de H2O2 (peróxido de hidrógeno) a ½
O2 + H2O. La mayoría de las bacterias gram negativo, son catalasa positivo.

PROCEDIMIENTO

1. Preparar la solución del reactivo:

100.0 ml 10.0 ml
Peróxido de hidrógeno 3.0 ml 0.3 ml
Agua destilada 97.0 ml 9.7 ml
Mezclar el reactivo en agua destilada y guardarlo en frasco gotero. Es conveniente
utilizar reactivo recién preparado.

2. Colocar 1 gota de solución sobre portaobjeto o caja petri.

3. Obtener con el asa una muestra del cultivo bacteriano, depositarlo y mezclarlo
con la solución de peróxido de hidrógeno.

Nota: Se recomienda que el cultivo sea no mayor a 48 h y preferentemente crecidos


en medios NA.

4. Observar.: Positivo: Formación de burbujas de gas (efervescencia).

C) Producción de la enzima Arginina dihidrolasa.

Permite separar las especies de la Familia Pseudomonales mediante la detección del


sistema enzimático dihidrolasa arginina, haciendo que las bacterias puedan crecer bajo
condiciones anaeróbicas. El sistema está constituido por las enzimas arginina desaminasa
y citrulina ureidasa, que actúan en el metabolismo de la arginina a citrulina y amoniaco y
en la transformación de la citrulina en ornitina, bióxido de carbono y amoniaco.

42
PROCEDIMIENTO

1. Preparar medio de arginina (Thornley, 1969):

1L 100.0 ml
Peptona 1.0 g 0.1 g
NaCl 5.0 g 0.5 g
K2HPO4 0.3 g 0.03 g
Rojo de fenol 3.0 g 0.3 g
L(+) Hidrocloruro de arginina 10.0 g 1.0 g
Agar 3.0 g 1.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Disolver los componentes en agua destilada y ajustar a pH 7.2, distribuir en tubos y
esterilizar a 121°C durante 15 min.

2. Inocular 2 tubos por picadura con asa bacteriológica.

3. Adicionar 0.8 a 1.0 ml de aceite mineral estéril para generar anaerobiosis.

4. Incubar a 27°C ± 1, durante 72 h.

5. Observar: Positivo: Si el indicador rojo de fenol vira a rosa-violeta, debido a la


alcalinidad del medio por la acumulación del amoniaco.

D) Licuefacción de gelatina o producción de la enzima gelatinasa.

Permite observar la síntesis de la enzima gelatinasa, enzima que depolimeriza la proteína


simple o gelatina, obtenida de la hidrólisis del colágeno. La fermentación de carbohidratos
inhibe la síntesis de la gelatinasa.

PROCEDIMIENTO

1. Preparar medio para licuefacción de gelatina:

PROCEDIMIENTO 1.

1L 100.0 ml
Extracto de carne 3.0 g 0.3 g
Peptona 5.0 g 0.5 g
Gelatina 120.0 g 12.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml

43
Agregar la gelatina al agua destilada y dejar reposando durante 15-30 min. Calentar y
disolver la gelatina, agregar los componentes y ajustar el pH a 7.0, distribuir en tubos
y esterilizar a 115°C durante 20 min.

PROCEDIMIENTO 2.

1L 100.0 ml
Gelatina (grado bacteriológico) 120.0 g 12.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Agregar la gelatina al agua destilada. Calentar y disolver la gelatina y ajustar el pH a
7.0, distribuir en tubos y esterilizar a 121°C durante 15 min.

2. Inocular 2 tubos por picadura con asa bacteriológica.

3. Incubar a temperatura ambiente o hasta 28° C± 1.

4. Observar que el medio presente apariencia líquida (licuefacción), el tiempo


transcurrido (hasta 4 días) y además, la forma que presenta la excavación producida.

E) Capacidad para hidrolizar el Almidón.

Permite separar a las bacterias por su capacidad de hidrolizar el almidón (polímero de


glucosa usado como sustancia de reserva en los vegetales) a maltosa. El sistema está
constituido por las enzimas α y β amilasas.

PROCEDIMIENTO

1. Preparar medio de almidón:

PROCEDIMIENTO 1.

1L 100.0 ml
Agar nutritivo 23.0 g 2.3 g
Almidón soluble de papa 15.0 g 1.5 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Agregar los componentes y esterilizar a 121°C durante 15 min. Vaciar a cajas petri.

44
PROCEDIMIENTO 2.

1L 100.0 ml
Agar 16.0 g 1.6 g
Almidón soluble de papa 10.0 g 1.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Agregar los componentes y esterilizar a 121°C durante 15 min. Vaciar a cajas petri.

PROCEDIMIENTO 3.
1L 100.0 ml
Agar PDA (Bioxon) 39.0 g 3.9 g
Almidón soluble de papa 10.0 g 1.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Agregar los componentes y esterilizar a 121°C durante 15 min. Vaciar a cajas petri.

2. Inocular cultivo bacteriano por estría.

3. Incubar a 28°C ± 1, durante al menos 4 días.

4. Vierta solución de lugol hasta cubrir la superficie del crecimiento bacteriano.

5. Observar: Positivo: Formación de un halo transparente por abajo o


alrededor del crecimiento bacteriano. En PDA el halo puede
observarse sin lugol.

F) Capacidad de síntesis de Indol.

Las peptonas son producto de la degradación de las proteínas por la pepsina, y son el
sustrato para la acción de diversas enzimas proteolíticas, por lo que aporta a un medio de
cultivo, principalmente, aminoácidos y péptidos. El indol es un compuesto orgánico
aromático heterociclico cuyo nombre es derivado del índigo. El indole está presente en
numerosos compuestos organicos como el triptofano (aminoácido) como en las proteínas
que contienen triptofano, y en los alcaloides y pigmentos.

PROCEDIMIENTO

A. PROCEDIMIENTO 1. (Indol)

1. Preparar el medio (para medios líquidos):

1L 100.0 ml
Peptona (libre de indol) 10.0 g 1.0 g

45
NaCl 5.0 g 0.5 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Agregar los componentes, ajustar el pH a 7.2, vaciar a tubos de ensayo y esterilizar a
121°C durante 15 min.

Otras opciones de medio son:

a. Caldo nutritivo

- Hay presentaciones comerciales. Corroborar que sea libre de indol.

b. Caldo caldo triptofano o tripticasa.

1L 100.0 ml
Bacto-Triptona 10.0 g 1.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
2. Inocular cultivo bacteriano a los tubos.

3. Incubar a 25 °C ± 2, durante 24-48 h.

4. Adicionar de 0.2 a 0.3 ml de reactivo de Kovac.

5. Agitar moderadamente.

6. Observar: Positivo: Presencia de un anillo rojo en la superficie.

El alcohol isoamílico extrae el indol que reacciona con el p-dimetil-aminobenzaldehido,


dando una coloración roja.

PROCEDIMIENTO 2. (Indol)

1. Preparar el medio:
1L 100.0 ml
Medio SIM (Bioxon) 30.0 g 3.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml

Agregar los componentes y disolver por ebullición, ajustar el pH a 7.3 ± 0.2, vaciar 3 ml a
tubos de ensayo y esterilizar a 121°C durante 15 min. Dejar enfriar en posición
vertical.

2. Inocular cultivo bacteriano a los tubos.

3. Incubar a 25 °C ± 2, durante 48 h.

4. Concluido el tiempo, adicionar sin agitar reactivo de Kovac.

46
5. Observar: Positivo: Presencia de una anillo rojo en la superficie.

NOM-114-SSA1-1994.

PROCEDIMIENTO 3. (Indol)

1. Preparar el medio:

1L 100.0 ml
Triptona 10.0 g 1.0 g
Triptofano 1.0 g 0.1 g
Agar 15.0 g 1.5 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Agregar los componentes y esterilizar a 121°C durante 15 min. Vaciar a cajas petri ydejar
enfriar.

2. Inocular cultivo bacteriano por estría.

3. Incubar a 25 °C ± 2, durante 48 h.

4. Concluido el tiempo, colocar sobre papel filtro en caja petri, 2 o 3 gotas de una solución
p-dimetilamino-cinamaldehido (1 g en 100 ml de ácido hidroclorico 10%).

5. Inmediatamente colocar con un asa, muestra del crecimiento bacteriano sobre el


papel filtro impregnado con la solución de p-dimetilamino-cinamaldehido.

6. Observar: Positivo: Cambio de coloración azul-verde en el área impregnada con la


muestra bacteriana, a los 10 seg.

Negativo: Presencia de decoloración a ligeramente rosa.

Schaad, et al. (2001) p.61.

G) Capacidad de reducción de Nitratos.

Es una prueba útil en la identificación de bacterias fitopatógenas basada en la presencia


de la enzima nitrato reductasa. Generalmente las Pseudomonas no pueden reducir
nitratos, pero algunas especies no patogénicas como P. fluorescens, P. chlororaphis y P.
aeruginosa, pueden usar nitrato como aceptor final de electrones y crecer en ausencia de
oxígeno. Por otro lado, la mayoría de las enterobacterias del grupo amylovora no reducen
nitratos, excepto E. persicinus, contrariamente a Pectobacterium y Pantoea (excepto P.
stewartii) que si reducen nitratos.

47
PROCEDIMIENTO 1. (recomendado por Schaad et al. para Pseudomonas)

1. Preparar el medio:

1L 100.0 ml
Extracto de levadura 5.0 g 0.5 g
KNO3 3.0 g 0.3 g
NH4H2PO4 1.0 g 0.1 g
KCl 0.2 g 0.02 g
MgSO4.7H2O 0.2 g 0.02 g
Agar Noble 1.0 g 0.1 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Disolver los componentes, vaciar a tubos de ensayo y esterilizar a 121°C durante 15 min.
Dejar enfriar.

2. Inocular cultivo bacteriano por punción y sellar la superficie del tubo, adicionando 1
ml de solución de agar noble 3% o aceite mineral estéril.

3. Incubar a 27° C durante 5 días.

4. Observar...

Positivo: Si se observa crecimiento bacteriano.

PROCEDIMIENTO 2. (recomendado por Schaad et al. para Enterobacterias)

1. Preparar el medio:

Caldo Nitrato, con...


1L 100.0 ml
KNO3 3.0 g 0.3 g
Bacto peptona 5.0 g 0.5 g
Extracto de levadura 5.0 g 0.5 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Calentar el agua y disolver los componentes, ajustar el pH a 7.1 ± 0.1, vaciar 4 ml a tubos
de ensayo e introducir, de manera invertida, un tubo Durham lleno de medio. Esterilizar a
121°C durante 15 min. Dejar enfriar.

Otras opciones de medio son:

1L 100.0 ml
KNO3 3.0 g 0.3 g
48
Peptona 5.0 g
Extracto de levadura 5.0 g 0.5 g
Agar Ion Oxoid No.2 1.0 g 0.1 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Calentar el agua y disolver los componentes, ajustar el pH a 7.1 ± 0.1, vaciar 4 ml a tubos
de ensayo. Esterilizar a 121°C durante 15 min. Dejar enfriar.

2. Inocular 4 tubos con cultivo bacteriano, por punción en el segundo caso.

3. Incubar 2 tubos a 28°C ± 2 durante 24 h y 2 tubos durante 5 días. Coloque a


incubación 2 tubos sin inóculo.

4. Una vez concluido cada periodo de incubación (24 h y 5 días). Tomar el tubo
inoculado y el control, a los cuales se agrega 1 ml de solución A y 1 ml de solución
B (Sol. A y B, para reducción de nitratos).

Sol. A ...... (0.6% v/v de N,N-dimetil-1 naftilamina o 0.5% de alfa naftilamina).


Precaución por ser carcinogénicos.

Sol. B ...... (0.8% v/v de Ácido Sulfanílico).

Nota: Ambas soluciones se preparan en Ácido Acético 5 N (1 parte de Ácido


Acético Glacial por cada 2.5 partes de agua).

5. Observar: Positivo: Si se presenta una coloración rosa a roja debido a la presencia


de nitritos en un periodo hasta de 1 h.

Si no aparece el color rosa, adicionar polvo de zinc al tubo, el cual reaccionará con los
nitratos produciendo un color rosa, confirmando así que la prueba es negativa. Sin
embargo, si el color rosa no aparece, indica que la denitrificación ha sido completa y
la prueba se considera positiva.

Los tubos control verificarán cada paso de la prueba para evitar un error debido a la
absorción del ácido nitroso del aire.

Rodríguez (1994) p. 67,107, 113 y 114; Schaad, et al. (2001) p.46.

H) Fermentación de Lactosa.

La realización de esta prueba permite observar si la bacteria tiene capacidad de


fermentar lactosa, característica propia de organismos facultativamente anaerobios.

49
PROCEDIMIENTO 1. Producción de ácido a partir de carbohidratos (medio C de
Dye).

1. Ir a la prueba Producción de ácido a partir de carbohidratos (medio C de Dye)


de este Manual.

2. Los organismos que utilizan lactosa, cambiarán el color del medio a amarillo como
resultado de la presencia de ácido.

PROCEDIMIENTO 2. Cultivo en Levine EMB Agar (Difco)

1. Preparar medio Levine EMB Agar (Difco: 37g/litro) ajustando el pH 7.1 ± 0.2 a 25°
C; esterilizar a 121-124° C/15 min./15 psi; y vaciar en placas.

2. Estriar cultivo bacteriano.

3. Incubar por 24 a 48 h / 28 –30º C.

4. Observar y registrar:

Las colonias fermentadoras de Lactosa se apreciarán de color verde


metálico, azul obscuro a café.

Las colonias no fermentadoras se apreciarán incoloras a ligeramente


púrpuras translucidas.

PROCEDIMIENTO 3. Cultivo en medio TSI (Medio triple azúcar hierro) (Bioxon).

La realización de este PROCEDIMIENTO permite observar si la bacteria tiene


capacidad de fermentar glucosa, lactosa o sacarosa y, producir ácido sulfhídrico.

1. Preparar medio TSI (Bioxon) inclinado en tubos grandes, procurando que la


inclinación inicie a partir de la parte media del tubo.

2. Seleccionar colonias que se encuentren bien aisladas y tocar el centro de la


colonia con el asa microbiológica.

3. Inocular por estría en la superficie inclinada y por punción hacia el fondo del tubo
con TSI.

4. Incubar por 24 a 48 h / 28-30º C.

50
5. Observar y registrar:

Evento Resultado

Vire del indicador a amarillo positivo a fermentación de la

en el fondo del tubo glucosa.

Si en la superficie del medio se observa negativo para fermentación de la


un color rojo más intenso que el medio lactosa ni de la sacarosa.
original.

Presencia de coloración negra positivo para producción de


ácido a lo largo de la punción. sulfhídrico.

Nota: tiene el inconveniente de que no se puede distinguir la fermentación de la


lactosa de la glucosa. Es adecuado para diferenciar bacterias entéricas de
importancia en salud humana utilizando la tabla anexa.

I) Descarboxilación de la Lisina (empleando medio LIA).

La realización de esta prueba permite observar si la bacteria tiene capacidad de


descarboxilar la Lisina.

PROCEDIMIENTO

1. Preparar medio LIA en tubos preferentemente grandes y esterilizar por autoclave.

2. Inclinar los tubos, procurando que la inclinación inicie a partir de la parte media del
tubo.

3. Seleccionar colonias que se encuentren bien aisladas y tocar el centro de la


colonia con el asa microbiológica.

51
4. Inocular por estría en la superficie inclinada y por punción hacia el fondo del tubo
con TSI.

5. Incubar por 24 a 28-35ºC.

6. Observar y registrar:

Evento Resultado

Si el medio intensifica el color Positivo. Debido a la descarboxilación de


púrpura en todo el tubo la lisina.

Si el fondo del agar se torna Negativo a la descarboxilación de la


un color claramente amarillo lisina.

Presencia de coloración negra Positivo a la producción de ácido


a lo largo de la punción. sulfhídrico.

J) Producción de enzimas Ureasas

Procedimiento

1. Con una asa estéril, tomar crecimiento del cultivo.

2. Inocular tubos de caldo urea.

3. Utilizar un control de medio para comparación.

4. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC o bien 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño de agua.

5. Observar el viré púrpura de las reacciones positivas contra el control.

K) Utilización de Fuentes de Carbono

(Para Enterobacterias y Pseudomonas...)

PROCEDIMIENTO

1. Preparar Medio de sales minerales de Ayers et al.

1L
NH4H2PO4 1.0 g
KCl 0.2 g
52
MgSO4.7H2O 0.2 g
Azul de bromotimol 1.0 ml
(1.6% w/v en etanol de 50 a 95%)
o bien, ...... 3.0 ml
(1.0% w/v en etanol de 50 %)
Agar 12.0 g
Agua destilada 1.0 L
Ajustar el pH a 7.2 ± 0.1 y esterilizar.
NOTAS:

Esterilizar por autoclaveado y posteriormente adicionar por filtración la fuente de


carbono a una concentración final de 0.1% (w/v).

O bien, adicionar la solución de la fuente de carbono al medio y esterilizar el medio


a 116-118° C durante 10 min.

Preparar medio sin fuente de carbono para utilizarlo como control negativo.

2. Vaciar a cajas petri y dejar solidificar.

3. Tomar con un asa, una muestra del cultivo bacteriano y estriarlo sobre el medio.

4. Incubar a 27° C y observar crecimiento durante 3, 7 y 14 días.

5. Comparar el crecimiento con las cajas control y registrar resultados.

L) Producción de ácido a partir de carbohidratos

(Para Enterobacterias...)

PROCEDIMIENTO.

1. Preparar Medio C de Dye.

1 L
NH4H2PO4 0.5 g
K2HPO4 0.5 g
MgSO4.7H2O 0.2 g
NaCl 5.0 g
Extracto de levadura 1.0 g
Púrpura de bromocresol 0.7 ml
(1.5% w/v en etanol 95%)
Agar 12.0 g
Agua destilada 1.0 L
53
Ajustar el pH a 6.8 y esterilizar.

NOTAS:

Esterilizar por autoclaveado y posteriormente adicionar por filtración la fuente de


carbono a una concentración final de 0.5% (w/v).

O bien, adicionar la solución del carbohidrato al medio y esterilizar a 116-118° C


durante 10 min.

Para las sustancias difíciles de disolver, como la salicina, disolverla en un volumen


mayor de agua y adicionarla al Medio C, y esterilizar tres días sucesivos.

Preparar medio sin carbohidrato para utilizarlo como control negativo.

2. Vaciar a cajas petri o tubos de ensayo y dejar solidificar de manera inclinada.

3. Tomar con un asa, una muestra del cultivo bacteriano y estriarlo sobre el medio.

4. Incubar a 27° C ± 2, y observar vire del indicador a color amarillo, durante 2, 4, 6,


21 y 28 días.

5. Comparar el vire del indicador con el de las cajas o tubos control y registrar
resultados.

M) Producción de ácido a partir de fuentes de carbono

(Para Agrobacterium...)

PROCEDIMIENTO.

1. Preparar Medio de sales minerales de Ayers et al. + YS

1 L
NH4H2PO4 1.0 g
KCl 0.2 g
MgSO4.7H2O 0.2 g
Extracto de levadura 1.0 g
Azul de bromotimol 1.0 ml
(1.6% w/v en etanol de 50 a 95%)
o bien .... 3.0 ml
(1.0% w/v en etanol de 50 %)
Agar 12.0 g
Agua destilada 1.0 L
54
Ajustar el pH a 7.1 ± 0.1 antes de adicionar el Agar.

NOTAS:

Esterilizar por autoclaveado y posteriormente adicionar por filtración la solución 10% (w/v)
de la fuente de carbono (eritritol, melezitosa o sacarosa) en una proporción de 1: 9 (fuente
de carbono : medio basal).

O bien, adicionar la solución de la fuente de carbono al medio y esterilizar a 116-118° C


durante 10 min.

2. Vaciar a tubos de ensayo, inclinarlos y dejar solidificar.

3. Tomar con el asa, una muestra del cultivo bacteriano y estriarlo sobre el medio.

4. Incubar a 27° C ± 1 y observar vire del indicador a color amarillo, durante 2, 4, 6,


21 y 28 días.

5. Comparar el vire con tubos control y registrar los resultados.

55
PRÁCTICA No. 10

CONTEO BACTERIANO POR EL MÉTODO DE PLACA VACIADA

OBJETIVO: El estudiante será capaz de cuantificar el número de organismos presentes


en un cultivo.

INTRODUCCION

Existen varios métodos para llevar a cabo el recuento de bacterias vivas en un


cultivo, sin embargo en la mayoría de los métodos lo que se busca es diluir el número de
microorganismos, de tal manera que no interactúen entre sí y se puedan contar
individualmente.

Los métodos conocidos son: determinación de peso seco, conteo directo al


microscopio, método de placa vaciada, NMP, filtración con membrana, turbidimetría,
conteo electrónico y asa calibrada.

METODO DE PLACA VACIADA.

Este método se lleva a cabo inoculando en una caja de petri estéril un volumen
dado de muestra, se mezcla con medio de cultivo fundido y frío y se deja solidificar. Cada
célula viva en el medio dará origen a una colonia visible. Se cuentan las colonias y se
estima el número de bacterias por milímetro o gramo de muestra. Este es uno de los
métodos más comúnmente usados y de los más exactos. Sin embargo se debe ser
cuidadoso para evitar errores por manipulación durante la dilución.

MATERIAL

10 ml de Muestra
2 Mecheros
4 Cajas petri estériles
3 Pipetas estériles de 1 ml
3 Tubos de ensayo estériles con 9 ml. de agua
Gradilla

PROCEDIMIENTO.

1.- Agite varias veces la muestra.

2.- Bajo condiciones asépticas realice las diluciones de la muestra 10 -1, 10-2, 10-3 (Figura
56
14).

3.- En una caja de Petri vierta 1ml. de la muestra concentrada y adicione de 10 a 15 ml. de
medio fundido frío, mezcle con movimientos circulares suaves. EL MEDIO NO DEBE
TOCAR LA TAPA DE LA CAJA. Etiquete.

4.- En las otras tres cajas vierta 1ml. de cada dilución (una dilución para cada caja) y
adicione de 10 a 15 ml. de medio fundido frío, mezcle con movimientos circulares
suaves. EL MEDIO NO DEBE TOCAR LA TAPA DE LA CAJA. Etiquete.

5.- Deje solidificar en una superficie plana, selle e incube a 37 ºC observando a las 24 y 48
hrs.

7.- Cuando observe crecimiento bacteriano (máximo a las 48 hrs) cuente el número de
colonias en un contador de bacterias.

Figura 14. Dilución de una muestra para conteo bacteriano, por


el método de placa vaciada

CUENTA

Seleccione las placas en las que el número de colonias sea entre 30 y 300 (a veces se
realiza el conteo en placas de menos de 30 colonias). La cuenta se debe hacer por lo
menos en dos placas.

Multiplique el número de colonias contadas, llevando a cifras redondas, por la dilución de


la muestra.

57
Ci = N x D x 10

Ci = Concentración inicial (unidades: número de células / ml)


N = nº de colonias

D = dilución

Obtenga el promedio y este será el resultado del número de bacterias por mililitro de agua
sin diluir por la temperatura de incubación.

EJEMPLO:

Si cuenta 159 colonias en la placa con dilución 10-1, el número de colonias por
mililitro de agua sin diluir será: 1.59 x 10-3

INTERPRETACION

El número máximo de bacterias permitidas para una agua inocua no debe ser mayor a 100
x ml. a 37 ºC. Los microorganismos que normalmente se encuentran en el agua se
desarrollan mejor a 20ºC, los organismos coliformes a 37ºC. Si la cuenta total de las dos
temperaturas es aproximada, es muy probable que haya bacterias de los desagües. En las
cuentas habituales repetidas de una misma fuente tiene un valor definitivo la elevación
brusca del número total de bacterias, lo cual indica una contaminación súbita.

REPORTE

Numero de bacterias en cada dilución

Numero de bacterias total en su muestra

Interprete sus datos

58
PRÁCTICA No. 11

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO: MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

OBJETIVO: El estudiante aplicará la prueba del NMP a un cuerpo de agua, para


determinar su estado sanitario, desde el punto de vista bacteriológico.

INTRODUCCIÓN

Para determinar si una masa de agua puede ser utilizada o no con seguridad para
consumo humano (beber, preparar alimentos o aseo personal) es necesario hacer un
reconocimiento sanitario de la misma. Este reconocimiento incluye pruebas de laboratorio
tales como 1) examen microscópico; 2) análisis físico-químico y 3) análisis microbiológico.

Este último es indicador de la presencia de bacterias patógenas que se desarrollan


normalmente en el intestino del hombre y animales y su presencia en cuerpos de agua
representa un problema de contaminación fecal y de salud.

Una de las principales tareas de la microbiología es el desarrollo de métodos de


laboratorio que puedan utilizarse para detectar los contaminantes microbiológicos
presentes en el agua para consumo humano. En la práctica se emplean organismos
indicadores, el más usual es el grupo de organismos coliformes. Dicho grupo está
definido en la bacteriología del agua como toda bacteria aeróbica y anaeróbica facultativa,
gram negativa, no formadora de esporas, en forma de bastón, que fermentan lactosa con
formación de gas en 48 horas a 35ºC.

De las bacterias formadoras de gas más prolíficas y fáciles de cultivar es la Escherichia


coli (bacteria coliforme normalmente no patógena) cuya presencia constituye una prueba
segura para detectar contaminación fecal potencialmente peligrosa originada por
microorganismos enteropatógenos tales como Shigella, Salmonella y algunas especies de
Klebsiella y Enterobacter (coliformes no fecales)

La prueba convencional es la del Número Más Probable (NMP) la cual incluye una
reacción en tres etapas; la primera es la Prueba presuntiva, en donde la formación de gas
en caldo lactosa es indicadora de contaminación por bacterias coliformes fecales y no
fecales; la segunda es la prueba confirmativa, para realizarla es necesario transferir los
cultivos positivos resultantes en lactosa al medio verde brillante bilis que inhibe el
crecimiento de todas las especies formadoras de gas a excepción de los bacilos
coliformes y la tercera la prueba completa en la cual se demuestra que cultivos puros
aislados de colonias de tipo coliforme en las placas contienen bastones gram negativos no
formadoras de esporas que forman gas en caldo de lactosa
59
Para el recuento de coliformes se consultan las tablas donde se indica el número estima
de bacterias coliformes en 100 ml de agua, que corresponden a varias combinaciones de
resultados positivos y negativos en las cantidades utilizadas para los ensayos. Estas
tablas son básicamente las calculadas originalmente por McCrady con ciertas
correcciones debidas a cálculos más precisos de Swaroop.

El método que se utilizará en esta práctica es el Método Estándar de los EE:UU:, para el
cual se usan 15 tubos de fermentación, conteniendo cada uno de ellos 20 ml de caldo
lactosado al 0.5%. Se siembran con 5 x 10 ml, 5 x 1 ml y 5 x 0.1 ml de la muestra de agua.
Se incuban a 35ºC y se examinan comprobando la formación de gas tras 24 y 48 horas.
La presencia de gas en 48 horas es presunta evidencia de bacilos coliformes (Collins and
Lyne 1989)

MATERIAL

100 ml. de una muestra de agua


1 Pipeta estéril de 10 ml.
2 Pipetas estériles de 1 ml.
18 Tubos de ensayo de 50 ml.
18 tubos Durham Caldo
Medio lactosado (Merk)
Medio Verde brillante bilis (Merk)
Gradilla, mecheros, asa bacteriológica

MÉTODO DE TRABAJO

1.- Toma de muestra

Se tomará en un frasco de 100 ml previamente esterilizado en autoclave a 15 libras de


presión y 120ºC. El frasco se abrirá solo en el momento de la toma de muestra. Todas las
muestras se transportaran en hielera al laboratorio para su siembra inmediata.

PRUEBA PRESUNTIVA

1.- Prepare el caldo lactosado y agregue 20 ml. a cada tubo.

2.- Coloque los tubos Durham invertidos dentro de los tubos con medio. NO DEBEN
FORMARSE BURBUJAS.

3.- Coloque los tapones a los tubos y esterilice a 15 libras durante 15 min.

60
4.- Cuando estén fríos agregue la muestra de la siguiente forma.

Número de tubos Muestra ml.

3 10

3 1

3 0.1

En cada inoculación debe utilizar una pipeta estéril.

5.- Mezcle el contenido de los tubos agitando suavemente.

6.- Incube a 35ºC por 24 hrs. y observe si hubo formación de gas dentro de los tubos
Durham. En caso de que los resultados sean negativos incube por otras 24 hrs, revise
y anote la lectura.

7.- Para la lectura de los tubos elabore una tabla con la posición del tubo y la cantidad de
muestra inoculada, registrando positivo si se presenta formación de gas o negativos si
no se presenta formación de gas.

PRUEBA CONFIRMATIVA

1 Prepare tubos de fermentación con 10 ml. de caldo verde bilis brillante (de la misma
forma que los tubos con lactosa) por cada tubo positivo de la prueba anterior.

2.- Aquellos tubos que resulten positivos deberá resembrarlos en Verde Brillante bilis
transfiriendo 1 ml. a cada tubo.

3.- Incube a 35ºC durante 24 ºC y observe la formación de gas, aquellos que resulten
positivos regístrelos de la misma forma que la prueba anterior.

REPORTE

Consulte la tabla 1 y reporte el NMP.

Consulte los límites permitidos por el Código sanitario.

Clasifique su muestra de acuerdo al Código Sanitario

61
Tabla 1. Número más probable de bacterias

62
PRÁCTICA No. 12

INTERACCIONES ECOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS

OBJETIVO: Demostrar la presencia de las bacterias en la naturaleza y algunas de sus


actividades.

INTRODUCCIÓN
Los hábitats de las bacterias, al igual que los de cualquier microorganismo, son
extremadamente diversos. Cualquier hábitat adecuado para los seres superiores, también
lo es para los microorganismos. En muchos lugares donde las condiciones ambientales
son extremas, no se encuentran organismos superiores, pero pueden existir
microorganismos variados. Algunas bacterias de las encontradas naturalmente en el
medio ambiente, son utilizadas en la industria o en proyectos ecológicos contra la
contaminación. En la naturaleza todos los microorganismos conviven en poblaciones
mixtas que interactúan entre sí, estableciendo relaciones de diferente grado de
complejidad. Estas relaciones pueden ser benéficas, perjudiciales o indiferentes,
repercutiendo sobre uno o sobre ambos microorganismos involucrados. Simbiosis
(mutualismo): hay beneficio para ambos organismos, ya sea entre dos microorganismos,
entre un microorganismo y un organismo superior, por ejemplo mamíferos rumiantes y
protozoarios, o como las bacterias fijadoras de nitrógeno asociadas con raíces de plantas
leguminosas. Comensalismo: en esta relación sólo uno de los organismos resulta
beneficiado y el otro no es afectado. Un ejemplo común lo constituyen los organismos
aerobios, que al consumir el oxígeno permiten el desarrollo de los anaerobios. Otro
ejemplo es en las cadenas de degradación orgánica, donde cada etapa es desarrollada
por un grupo diferente de organismos. Antagonismo: Una de las especies inhibe a la otra o
causa su muerte, por ejemplo en el caso de las bacterias productoras de antibióticos.
Sinergismo: Aquí la actividad cooperadora de dos organismos es mayor a la suma de las
dos actividades realizadas por separado.

MATERIAL
Suspensiones de dos aislado bacterianos de prácticas anteriores
Medio agar nutritivo
Medio ELMA
Medio agar tripticasa de soya
Asas bacteriológicas
Microscopio de disección
Azul de lactofenol
Hipoclorito de sodio
Agua estéril
Colorantes para la tinción de Gram

PROCEDIMIENTO

I. Comensalismo.
Entre dos bacterias:
1. Con un marcador divida a la mitad externamente, dos cajas con agar nutritivo.
63
2. Siembre la mitad de cada placa con un primer aislado y la otra mitad con el segundo
aislado.
3. Selle los bordes de la placa con celopack e incube a 32°C durante 24 horas y compare
el crecimiento en ambas cajas, sin quitar la cinta adhesiva. Vuelva a incubar hasta
completar 48 y 72 horas.

II Simbiosis entre una bacteria y una planta (aislamiento de Rhizobium de nódulos de


leguminosas):

1. Elija raíces de buen tamaño de plantas leguminosas (frijol, trébol, alfalfa, otros),
eliminando el tallo y lávelas con agua. Separe en un vasito los nódulos más grandes,
cortando con un bisturí.

2. Cubra los nódulos con un poco de alcohol y agite con unas pinzas por 10 segundos.
Escurra y lleve el vaso al área de esterilidad del mechero y enseguida agregue agua
estéril agitando para enjuagar y escurra.

3. Cubra los nódulos con hipoclorito de sodio comercial (cloralex) al 5%, agitando con las
pinzas por 1 -3 min. Escurra y enjuague con agua estéril agitando. Repita el lavado tres
veces.

4. Transfiera los nódulos a un mortero estéril y agregue 5 gotas de agua estéril y triture
para favorecer la salida de las bacterias, de los nódulos.

5. Siembre una asada del material por estría cruzada, en placas de medio ELMA (extracto
de levadura-manitol-agar-rojo congo), e incube a 28°C de 3 a 7 días.

6. Seleccione una colonia blanca y mucosa y tiña con Gram. El Rhizobium es un bacilo
corto Gram negativo

7. Resiembre una colonia bien aislada en tubos del mismo medio para purificar la bacteria.

REPORTE
I.- Comensalismo: Mida el crecimiento de los aislados bacterianos. Distinga cuál es el
organismo beneficiado y cuál es el afectado.

64
PRÁCTICA No. 13

AISLAMIENTO DE RHIZOBIUM

OBJETIVO: El estudiante aprenderá a aislar una cepa de Rhizobium a partir de una


planta nodulada.

INTRODUCCION

Las bacterias desempeñan un papel esencial en el ciclo biogeoquímico del nitrógeno,


puesto que en él intervienen algunas bacterias quimioautotróficas. El nitrógeno al
descomponerse se convierte principalmente en NH3 (nitrito). Este compuesto volátil es
estabilizado en el suelo mediante oxidación a través de la acción bacteriana nitrificante a
nitrato no volátil, el cual puede reducirse a compuestos orgánicos aminos por medio de las
plantas.

La fijación biológica de nitrógeno se efectúa solo por las bacterias, de las cuales el grupo
más importante es el género Rhizobium que infectan la raíz de las plantas leguminosas y
conducen a las formaciones de nódulos simbióticos que fijan el nitrógeno.

MATERIAL

2 Tubos de ensayo chicos 1 Macerador


3 Cajas de petri potenciómetro
2 pipetas de 1 ml. Nódulos de leguminosa
Etanol al 70 % Cloro al 10.2 %
Hidróxido de sodio Caldo nutritivo
Rojo congo al 1% Extracto de levadura
Fosfato de potasio (K2HPO4) Manitol
Sulfato de Magnesio (MgSO4) Agar bacteriológico
Cloruro de Sodio (NaCl) Agua estéril
Cloruro Férrico (FeCl3)

PROCEDIMIENTO

1.- Se preparan 1000 ml. de medio YEM de la siguiente manera:

a) Disuelva en 1000 ml. de caldo nutritivo los siguientes reactivos

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REACTIVOS CANTIDAD gr.
K2HPO4 0.5
MgSO4 0.3
NaCL 0.2
FeCl3 0.01
Extracto de levadura 0.5
Manitol 10
Agar 20
Colorante Rojo Congo al 0.25 %

b) Regule el pH del Hidróxido de Sodio a 7, agregue el agar bacteriológico (7.5 gr.).


Esterilice a 15 libras de presión por 15 min.

c) Diluya 0.7 gr de rojo congo en 30 ml. de agua destilada tibia, filtre con papel
filtro fino y esterilice a 10 libras de presión.

2.- Esterilice dos tubos con agua a 15 libras por 10 min.

3.- Esterilice el medio YEM y cuando esté frío (no permita que solidifique) añádale el rojo
congo y agitando suavemente.

4.- Vacié el medio a las cajas petri previamente esterilizadas y deje que solidifique.
5.- Corte los nódulos y lávelos quitando el exceso de tierra.

6.- Enjuáguelos con etanol al 70% por 3 min.


7.- Sumérjalos por 5 min. en Cloro al 10.2%.

8.- Enjuáguelos tres veces con agua estéril, desechando el agua.

9.- Coloque los nódulos dentro de los tubos con agua y macháquelos con macerador.

10.- Tome una muestra con el asa, capturando una película, estrié la caja de petri con el
medio YEM.

11.- Incube a 30 ºC por 24 hrs. y observe la formación de colonias.

REPORTE

Investigue el ciclo biogeoquímico del nitrógeno y esquematizarlo.

Investigue la importancia de las bacterias nitrificadoras y relaciónelo con el ciclo del


nitrógeno.

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PRÁCTICA No. 14

RESISTENCIA BACTERIANA

OBJETIVO: Los estudiantes aplicarán la técnica de Concentración mínima inhibitoria para


determinar la resistencia bacteria a la sustancia que elijan.

INTRODUCCIÓN

La acumulación de desechos, sobre todo en áreas urbanas, genera la dispersión de gran


diversidad de compuestos en suelos, aguas superficiales y aire, con la consecuente
filtración de los mismos hacia las aguas subterráneas: los acuíferos que constituyen la
reserva de agua potable.

Podemos solucionar este problema con lo que llamamos remediación. Para definir este
término podemos decir que es el uso intencional de procesos de degradación químicos o
biológicos para eliminar sustancias contaminantes ambientales que han sido vertidas con
conocimiento o accidentalmente en el ambiente. Los procesos de remediación pueden
efectuarse in situ, o sea en el mismo lugar en el que ha ocurrido el derrame, o bien ex situ,
separando la porción contaminada y trasladándola a un reactor. Tal es el caso de
efluentes industriales o domiciliarios que se tratan previamente al vertido al medio
ambiente.

Las actividades industriales generan una contaminación a gran escala en el medio


ambiente. En el caso de los suelos, pueden afectar a la fertilidad y/o el uso posterior de
los mismos, mientras que en el caso de los acuíferos y aguas superficiales, pueden
comprometer seriamente el uso de este recurso como fuente de agua para consumo
humano. La remediación de estos ambientes contaminados mediante el uso de métodos
químicos involucra procesos de costos excesivamente altos debido a la especificidad
requerida.

La aplicación de métodos de remediación efectivos depende del conocimiento de los


factores hidrológicos y geológicos del sitio, la solubilidad y especiación de las sustancias
contaminantes, los procesos de atenuación e inmovilización y la medida en que puedan
dispersarse. La utilización de métodos biológicos para remediar un ambiente contaminado
(bioremediación) ofrece una alta especificidad en la remoción, con flexibilidad operacional,
tanto en sistemas in situ como ex situ.

MATERIAL

3 tubos de ensaye con tapón estéril, con 5 ml. De agua (p/ muestras de
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aceite). 1 tubo de ensaye con tapón (p/ caldo nutritivo).
8 cajas petri estériles, 4 pipetas estériles de 5ml, 1 pipeta estéril de
1ml. Muestra de aceite o solución de algún contaminante (10ml.)
Caldo y medio nutritivo
Mecheros, Gradilla, Asa bacteriológica, 4 matraces erlenmeyer de 250ml.

MÉTODO DE TRABAJO:

1. Se envuelven pipetas y cajas petri y se dejan listas para la esterilización.

2. Se prepara el medio y caldo de cultivo.

3. Se vacían exactamente 20ml. de medio en cada matraz.

4. Se añaden 4ml de medio a 8 de los tubos de ensayo, al noveno se le agregan 5ml de


caldo nutritivo al décimo 15 ml de agua y el último se queda vacío.

5. Los matraces y tubos se taponan y cubren con capuchones de papel.

6. Todo el material se esteriliza como en prácticas anteriores.

7. Una vez estéril el material, se esteriliza la mesa de trabajo y se prenden los mecheros,
mientras el material se enfría.

8. Dentro de la zona estéril se abre el tubo que tiene el caldo nutritivo.

9. Se toma una asada de una colonia aislada con anterioridad en un tubo con medio de
cultivo inclinado (la colonia debe estar en la estufa a 37º para evitar un choque debido
a la diferencia de temperatura entre el caldo y el medio inclinado).

10. Inocular el caldo nutritivo e incubar por 24 hrs. A 37º.

11. El resto del material se guarda en el refrigerador.

12. Al cabo de las 24 hrs. Sacar el material del refrigerador y poner a baño maría los
matraces y tubos con el medio.

13. Hacer los cálculos necesarios para obtener las concentraciones a trabajar de los
elementos a estudiar, considerando el uso de la sal más soluble disponible del metal
pesado. Considerar que la primera solución se hará en 10 ml de agua.

14. Dentro de la zona estéril, abrir el tubo de ensaye vacío y poner la sal ya pesada, abrir
el tubo que contiene agua y pipetear 10 ml, agitar y preparar las concentraciones a
usar en los matraces según los cálculos hechos anteriormente.

15. Disuelto el medio de los tubos, sembrar en cada uno 0.1 ml del caldo nutritivo
68
inoculado.

16. Poner en las cajas 10ml. de medio de cultivo, 2 con la concentración y el blanco,
pasando a cada caja aproximadamente la mitad del contenido de cada matraz.
Esperar a que solidifique.

17. Agregar el contenido de los tubos de ensaye, esperar a que solidifique, empaquetar e
incubar de 24 a 48 hrs. a 37ºC en espera de ver crecimiento de colonias.

18. Realizar el conteo bacteriano y aplicar la fórmula de CMI para reportar los valores de
resistencia bacteriana a la sustancia probada.

% de res. O CMI= # de CSU/ml de conc. considerada + conc. de sust. Cont.

---------------------------------------------------------------------- X 100

# de CSU/ ml del blanco

REPORTE

CMI

Investigar el daño que causan el contamínate probado en el ambiente o la salud del


hombre.

Investigar si existen límites permisibles de esta sustancia en el ambiente

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PRÁCTICA No. 15

ACCIÓN DE AGENTES QUÍMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO

OBJETIVO: Comprender la diferencia entre esterilización y desinfección y adquirir el


criterio para probar la sensibilidad bacteriana a diferentes agentes químicos. En los
métodos de esterilización queda implícita la destrucción total de todas las formas de vida.
En la desinfección no se logra la destrucción total.

INTRODUCCIÓN

Es necesario disponer de procedimientos para controlar la contaminación y el crecimiento


microbianos. La palabra control, aquí se refiere a la inhibición, muerte o eliminación de los
microorganismos, éstos pueden ser controlados por agentes o procesos físicos o por
agentes químicos.

Un agente químico es una sustancia (sólido, líquido o gas) que se caracteriza por una
composición molecular definida y que causa una reacción. Por ejemplo, los compuestos
fenólicos, los alcoholes, los halógenos y sus derivados como el cloro, el bromo y el yodo:
los metales pesados y sus compuestos, los detergentes, los aldehídos y los quimio-
esterilizantes gaseosos como el óxido de etileno.

MATERIAL
Hisopos estériles
Antisépticos, limpiadores, comerciales y domésticos, colorantes, desinfectantes, jabones
Medio de cultivo (Agar nutritivo)
Cultivos de bacterias aisladas en prácticas anteriores
1 gr de suelo
Agua estéril
Solución salina fisiológica
Detergente o jabón antiséptico
Estufa de incubación

PROCEDIMIENTO
I. Actividad bacteriostática o bactericida de algunos compuestos químicos (incluyendo
antibióticos)
1. Siembre la superficie de una placa totalmente, por medio de un hisopo estéril
impregnado de una suspensión bacteriana. Cuide que no quede un espacio sin sembrar.
2. Distribuya varios círculos de papel impregnados con antisépticos, limpiadores
comerciales y domésticos, colorantes, desinfectantes, jabones, etc. Aproximadamente
cuatro círculos cerca de la orilla de la placa y uno en el centro. Deben ser los mismos para
las dos bacterias. En el caso de antibióticos, los círculos impregnados se obtienen
comercialmente.

70
3. Incube a 37°C por 24 horas, mida el radio de inhibición alrededor de cada círculo de
papel para cada compuesto y compare entre las dos bacterias probadas. Determine si hay
diferencias en el efecto de cada compuesto para las dos bacterias.
II. Efectividad del lavado de manos con detergente
1. Un primer estudiante se vacía unas gotas de suspensión de suelo (1gr de tierra fresca
obtenida por debajo de la superficie del suelo, en 9 ml de agua estéril) en la palma de la
mano derecha y la extiende en toda la superficie de la palma.

2. Un segundo estudiante saluda de mano al primer estudiante. Un tercer estudiante


saluda al segundo y un cuarto al tercero (todos la mano derecha).

3. Con un hisopo estéril humedecido en solución salina fisiológica (s.s.f.) estéril se frota la
mitad de la palma de la mano usada en el saludo y se descarga el inóculo en la mitad de
una placa de agar nutritivo. Se repite la operación con el segundo estudiante y se siembra
en la mitad de otra placa nueva de agar nutritivo, y así sucesivamente con los otros
estudiantes.

4. Todos los estudiantes deberán lavarse la mano inoculada, con detergente y se


enjuaguen con agua estéril. Enseguida se repite el muestreo de la misma mano con un
hisopo estéril (no requiere humedecerse), y se siembra la mitad de la placa que quedó sin
sembrar, sin tocar para nada la parte previamente sembrada.

5. Incube todas las placas a temperatura ambiente por 48 horas.

REPORTE
Compare los resultados de las siembras de manos sin lavar y manos lavadas:
a).- cuantifique el número de colonias desarrolladas
b).- Describa la morfología colonial de las colonias diferentes
c).- Explique las diferencias en cada caso.

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PRÁCTICA 16

PRUEBA DE SENSI-DISCOS PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD A


ANTIBIÓTICOS

PROCEDIMIENTO

1. Preparación de Sensi-discos con antibiótico. Se dará como ejemplo la preparación de


sensidiscos con eritromicina en relación de 15 µg/disco.

A. Preparación de 1 ml de solución de eritromicina.

a. Si la eritromicina está en presentación de tabletas medicinales, primero estimar la


relación de eritromicina por peso de la tableta (una tableta con 500 mg de
eritromicina pesa alrededor de 1 g, por lo tanto por cada 2 mg de tableta tenemos 1
mg de eritromicina).

b. Pesar la cantidad de tableta que contenga 3 mg de eritromicina.

c. Adicionar la eritomicina en 0.5 ml de etanol en un recipiente previamente esterilizado.

d. Agitar hasta disolver el polvo.

e. Adicionar 0.5 ml de agua destilada estéril.

B. Preparación de los sensi-discos de eritromicina (15 µg/disco).

a. Cortar discos de papel filtro de 7 mm de diámetro.

b. Marcar con lápiz un lado del disco.

c. Envolver en papel aluminio y esterilizar en autoclave.

d. Adicionar en flujo laminar, 5 µl de la solución de eritromicina (3 mg/ml) por disco.


Depositados en el lado no marcado del disco.

Nota: Esterilizar discos sin eritromicina para control.

2. Preparación del cultivo.

2. Preparación de Agar. El Agar Muller Hinton es el más usado para este fin aunque
también puede realizarse en Agar Nutritivo (AN).

2. Esterilizar por autoclave y mantenerlo en baño de agua a 45-50° C.

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2. Preparar una suspensión acuosa densa de células bacterianas a partir de cultivos
jóvenes (24-48 h). Se recomienda que el cultivo se realice en el mismo medio de
cultivo en que se probará la sensibilidad al antibiótico.

2. Vaciar 6 ml de medio a cajas Petri y dejar solidificar. Mantener el resto a 45-50° C.

2. Adicionar 100 µl de la suspensión acuosa de bacterias.

2. Adicionar 10-12 ml de Agar Nutritivo y agitar a favor y en contra de las manecillas


del reloj.

2. Después de que el medio haya solidificado, colocar 2 o 3 discos impregnados con


eritromicina sobre el medio y además un disco control (sin antibiótico).

2. Incubar entre 23-27°C durante 48 h.

2. Observar una zona de inhibición circundante al disco con antibiótico.

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PRÁCTICA No. 17

ACCION INHIBITORIA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

OBJETIVO: El estudiante propondrá una sustancia y observará su efecto como inhibidor


del crecimiento bacteriano.

INTRODUCCION

La influencia de los herbicidas sobre las actividades microbianas en el suelo ha sido


evaluada en años reciente, utilizándose frecuentemente a los microorganismos
involucrados en el ciclo del nitrógeno, por su sensibilidad a los distintos contaminantes
ambientales.

Una de las razones por las cuales las bacterias del suelo pueden ser afectadas por los
herbicidas se debe a su carácter de organismos autotróficos y también porque ellas se
desarrollan principalmente sobre la superficie del suelo, donde la exposición a los
herbicidas es más probable.

El crecimiento de algunas bacterias es retardado por la aplicación de los herbicidas ya que


tiene mayor inhibición del crecimiento porque afecta la división celular; además de un
marcado descenso en el crecimiento y la actividad metabólica.

MATERIAL

2 discos de papel filtro del No. 4 Mecheros, asa


10 frascos viales Papel aluminio
1 pipeta de 1ml Caldo nutritivo
2 Cajas de petri Medio nutritivo
1 Tubo de ensayo Plomo a diferentes concentraciones
Alfileres, perforadora Alcohol
Pinzas de disección
PROCEDIMIENTO

1.- Prepare los medios de cultivo.


2.- Haga 20 discos de papel filtro con una perforadora. Cada disco medirá
aproximadamente 6 mm.
3.- Inserte los alfileres en el centro de los tapones de los frascos viales.
4.- Inserte los discos en los alfileres, procurando que queden centrados. Tape los frascos
viales, (los discos deben quedar dentro de los frascos viales) envuelva los viales con
papel aluminio y selle perfectamente.
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5.- Envuelva las cajas y póngale tapones a los tubos.
6.- Esterilice todo el material. También las pinzas.
7.- Cuando enfríe el medio nutritivo vacíelo en las cajas Petri, póngalas en una superficie
plana y espere a que solidifique. Etiquételas y guárdelas invertidas en el refrigerador.
8.- A los tubos de ensayo vacíeles caldo base (aproximadamente 10 ml.) e inocúlelos con
la cepa bacteriana. Incúbelos por 24 hrs. a 37 ºC.
9.- Realice las siguientes diluciones con el herbicida elegido.
1:50, 1:25, 1:10, 1: 5
10.- Humedezca los discos con las diluciones del herbicida, cinco discos con cada
dilución.
11.-. Inocule el cultivo en las cajas Petri con medio sólido (Figura 15)
12.- Coloque los discos con herbicida en la superficie de las cajas utilizando las pinzas
estériles
14.- Incube a 35 ºC por 24 hrs. y observe el halo de inhibición.
15.- Mida el diámetro de los halos de inhibición incluyendo la medida del disco de papel.

Figura 15. Preparación de la prueba inhibitoria por insecticidas

REPORTE

Investigar la acción de los herbicidas sobre las bacterias.

Reporte los diámetros de los halos de inhibición.

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PRÁCTICA No. 18

FERMENTACIÓN ANAERÓBICA (PRODUCCIÓN DE METANO)

Objetivo: Evaluar la producción de metano por el efecto de la fermentación de bacterias


anaerobias estrictas

Introducción

Existen bacterias anaerobias que solo pueden vivir en ausencia de oxigeno (anaerobias
estrictas), las cuales son especies propias de ambientes con poco oxigeno o que carecen
de él. Estos ambientes pueden ser intestinos de animales, suelos profundos, sedimentos
de cuerpos de agua (mar, lagos, lagunas) y pantanos; lugares donde el oxígeno está casi
ausente.

Dentro de las bacteria anaerobias se encuentran Fibrobacter ruminococcus;


Ruminobacter succinomonas, Lachnospira, Megasphera selenomonas; Streptococcus
bovis; Methanobrevibacter Methanomicrobium; bacterias presentes en los intestinos de
organismos rumeantes, las cuales participan en el proceso de la digestión de estos
organismo herbívoros.

La diversidad bacteriana en el rumen es importante ya que cada especie de bacteria está


encargada de realizar diferentes reacciones bioquímicas para una conversión de
productos alimenticios en la célula y productos de fermentación.

Las bacterias que producen metano forman parte de la población bacteriana que se
encuentran dentro del rumen de los organismos herbívoros. Estas baterías juegan un
papel importante en la regulación de la fermentación al reducir el CO 2 con el H2 gaseoso
y producir CH4. Las bacterias metanógenicas al mantener baja la concentración de H 2 en
el rumen mediante la formación de CH4, promueven el crecimiento de otras especies
bacterianas en el rumen y permiten una fermentación más eficaz. Dentro de las bacterias
metanogénicas se encuentran Methanobrevibacter ruminantium, Methanobacterium
formicicum y Methanomicrobium mobile.

Material:

Cámara de incubación
Matraz erlenmeyer de 1000 mL
Probeta de 500 mL
Mortero de porcelana
Tapón de hule
Manguera de plástico
Recipiente de plástico de boca ancha con tapa de rosca de 700 a 900 mL aprox.
Excretas frescas de vaca o borrego (inóculo- liquido ruminal)

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Pasto, alfalfa o paja fresca (sustrato)
Envase térmico (hielera de unicel)
NaOH (5N)
Solución de NaCl (300 g/L)

Preparación del sustrato:

1. Lavar con agua corriente para retirar material adherido al vegetal

2. Triturar el vegetal en un mortero hasta obtén un mezcla homogénea

3. Pesar 300 g de la mezcla para el experimento (sustrato)

Colecta y preparación del inóculo:

1. Se colectará excretas fresca de vaca o borrego

2. Se transportarán las excretas dentro de un recipiente térmico

3. En laboratorio se agregar agua destilada y se filtrará el líquido a través de una


malla de 1 mm para remover los sólidos de mayor tamaño

4. El líquido filtrado (liquido ruminal) se tapará y se colocara en el recipiente térmico


hasta el momento de realizar las determinaciones

5. Al líquido ruminal se determinará el pH al inicio y al final de experimento

Preparación de unidad de experimental

1. Tomar los 300 g del sustrato previamente preparado y vaciarlo en el matraz de


1000 mL, asegurarse de que toda la biomasa quede dentro del matraz

2. Tomar 200 mL del líquido ruminal previamente preparado, medir el pH y


posteriormente agregarlo al matraz de 1000 mL con el sustrato

3. Aforar el matraz a 1000 mL con agua destilada previamente aclimatada a 30 °C


(para la aclimatación del agua se colocará en la cámara de incubación por 30
minutos aproximadamente). Mezclar vigorosamente

4. A la mezcla medir nuevamente el pH y ajustarlo con solución de NaOH (5N) al


valor obtenido en el inciso 2

5. Tapar el matraz con un tapón de hule el cual tendrá la manguera de plástico.

6. Colocar en el recipiente de plástico 200 mL con la solución de NaCl a una


concentración de 300 g/L para evitar la disolución del CO2

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7. Llenar la probeta de 500 mL con la solución de NaCl (300 g/L)

8. Al recipiente de plástico se le colocará la manguera de plástico que vienen del


matraz. A este mismo se le colocará la probeta con la solución de NaCl invertida
(unidad experimental) (Figura 1).

9. Tapar las unidades experimentales y mantener en obscuridad

10. La unidad experimental se agitará una vez al día por un lapso de 10 segundos

11. El biogás (metano) se cuantificará mediante desplazamiento de líquido de la


probeta

12. Registrar el volumen de biogás diariamente (dos veces al día por una semana)

13. Medir el pH al final del experimento

Figura 1. Diagrama de la unidad experimental

Reporte:

Elabora una tabla con las medidas de generación de gas diario por la fermentación de las
bacterias anaerobias estrictas. Explica el proceso de fermentación metanogénica por
estas bacterias

Día Desplazamiento de líquido pH


0 T1
/Tiempo producción de gas (mL)
0 T2
1 T1
1 T2
N T1
N T2
8 T1

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PRÁCTICA 19

PRUEBA DE INMUNOADSORCIÓN CON ENZIMAS LIGADAS – DOBLE


ANTICUERPO EN SÁNDWICH (ELISA-DAS) APLICADO AL DIAGNÓSTICO DE
VIRUS Y BACTERIAS FITOPATÓGENOS

OBJETIVO: Proporcionar el procedimiento de la técnica de ELISA para detectar agentes


patogénicos, virus y bacterias, en muestras vegetales.

INTRODUCCIÓN

La prueba de inmunoadsorción con enzimas ligadas o ELISA ( Enzyme Linked


Inmunosorbent Assay) y los métodos moleculares basados en la estructura de DNA y/o
RNA, son métodos confiables y rápidos para la detección de agentes fitopatógenos, ya
que hace posible la detección de cantidades muy pequeñas de estos agentes en órganos
de plantas.

Diversos métodos han sido desarrollados sobre la base de las características de la


reacción inmune y las propiedades fisicoquímicas de los antígenos y anticuerpos, con la
finalidad de detectar la presencia de ambos y cuantificarlos.

Entre ellas, las técnicas que emplean enzimas marcadoras, conocidas como ensayos
inmunoenzimáticos. La sensibilidad de ELISA es superior a otras pruebas serológicas,
por lo que ha sido extensamente utilizada para la detección de patógenos en humanos,
animales y plantas.

Particularmente, la técnica de ELISA se emplea para la detección de macromoléculas y


microorganismos y se caracteriza porque requiere la separación de fases mediante un
inmunoadsorbente de fase sólida. En otras palabras, se inmovilizan el antígeno o el
anticuerpo sobre una fase sólida, adicionando de forma secuencial los demás
componentes de la reacción y eliminando los elementos deficientemente fijados y los no
fijados mediante un lavado previo a cada fase.

El ensayo denominado sandwich de doble anticuerpo (DAS), es la variante más


comunmente utilizada del ELISA y consiste en la adsorción de anticuerpos específicos a
una placa de poliestireno seguida de la adición de los antígenos o fitopatógenos los
cuales reaccionan con los anticuerpos adheridos a la placa. Para formar el sandwich se
agregan nuevamente anticuerpos ligados con enzimas que se adhieren a los patógenos
capturados en la placa. Una vez formada la secuencia biológica de
anticuerpo+antígenos+anticuerpo ligado a una enzima, se adiciona el sustrato, el cual es
hidrolizado por la enzima dando lugar a un cambio de color de la solución y esto permite

79
determinar los resultados visualmente y cuantificarlos espectrofotométricamente por
medio de un lector de placas.

Reactivos

 Kit para ELISA (específico para el agente patógeno a detectar; Gammaglobulina,


Conjugado enzimático)
 p-nitrofenil fosfato (sustrato)
 Solución amortiguadora (SOLAM) de extracción (ver preparación de soluciones)
 Solución amortiguadora de cubrimiento (SOLAM) (ver preparación de soluciones)
 Solución amortiguadora de lavado (PBS-T) (ver preparación de soluciones)
 Solución amortiguadora de extracción (ver preparación de soluciones)
 Solución amortiguadora para el conjugado enzimático (ver preparación de soluciones)
 Solución amortiguadora del sustrato (ver preparación de soluciones)
 Testigo positivo (según el patógeno que se analiza)
 Testigo negativo (según el patógeno que se analiza)

Materiales

 Cristalería (pipetas, probetas, matraces, tubos de ensayo y vasos de precipitado)


 Barras de agitación magnética
 Espátulas
 Bolsas de plástico (aproximadamente 10X15 cm).
 Pistilos de porcelana para mortero
 Placas de microtitulación para ELISA
 Puntas para micropipetas

Equipo

 Balanza analítica
 Parrilla de agitación magnética
 Potenciómetro
 Macerador de rodillos (opcional)
 Macerador u homogeinizador de tejidos de columna vertical (opcional).
 Balanza granataria
 Incubadora
 Lector de placas ELISA e impresora
 Refrigerador (4 a 6 ºC)
 Micropipetas (100 µl) (opcional: multicanal o unicanal)

80
PROCEDIMIENTO

Con la finalidad de dar mayor entendimiento en la aplicación de este procedimiento, los


métodos generales y particulares, serán encontrados de forma separada a partir de la
siguiente página.

Preparación de soluciones de amortiguamiento (SOLAM)

Este, es un método general utilizado para la mayoría de los kits (AGDIA) para el
diagnóstico de virus y bacterias.

a) Preparación de SOLAM de adsorción o cubrimiento

Disolver en 1000 ml de agua destilada:


Carbonato de sodio .......................... 1.59 g
Bicarbonato de sodio .......................... 2.93 g
Azida de sodio .......................... 0.2 g
Ajustar pH a 9.6
Nota: Puede almacenarse por un mes, siempre y cuando se refrigere a 4-6ºC.

En caso de no requerir un litro se deben respetar las proporciones peso/volumen. Esto se


aplica a todas las soluciones que se preparan para el ensayo.

b) Preparación de SOLAM de lavado (PBS-T)

Disolver en 1000 ml de agua destilada:


Cloruro de sodio .................. 8.0 g
Fosfato de sodio dibásico (anhidro) .................. 1.15 g
Fosfato de potasio monobásico (anhidro) ....... 0.2 g
Cloruro de potasio .................. 0.2 g
Tween 20 .................. 0.5 g
Ajustar pH a 7.4
Nota: Almacenar a temperatura ambiente y usarse como máximo una semana después
de su preparación o bien almacenar a 4ºC y usarse como máximo, tres semanas
después de su preparación, cuidando que el pH no varíe.

c) Preparación de SOLAM de extracción

Diluir en 1000 ml de PBS-T (1X):


Sulfito de sodio ................... 1.3 g
*Polivinilpirrolidona (p. m. 24-40,000) ............... 20.0 g (2%)

81
Albúmina de huevo, grado II ................... 2.0 g (0.2%)
Tween-20 ................... 20.0 g
Azida de sodio ................... 0.2 g
Ajustar a pH de 7.4
Nota: Almacenar a 4-6 ºC y usarse como máximo una semana después de su
preparación.

La Azida de Sodio puede ser omitida.

d) Preparación de SOLAM para el conjugado

Diluir en 1000 ml de PBS-T (1X):


Albúmina de suero bovino .................... 2.0 g (0.2%)
Polivinilpirrolidona (p. m. 24-40,000) ................... 20.0 g (2%)
Azida de sodio .................... 0.2 g
Ajustar a pH de 7.4
Nota: Almacenar de 4-6 ºC y usarse como máximo una semana después de su
preparación.

La Azida de Sodio puede ser omitida

e) Preparación de SOLAM del sustrato

Agua destilada ............................................ 800.0 ml


Dietanolamina ............................................ 97.0 ml
Azida de sodio ............................................ 0.2 g
Cloruro de magnesio hexahidratado .............. 0.1 g

Ajustar a pH de 9.8 con ácido clorhídrico concentrado.

Agregar agua destilada ajustando a ............... 1 litro.

Nota: Esta solución amortiguadora debe ser preparada el mismo día en que se realiza la
prueba o usar hasta tres días después, pero debe ser almacenada a 4-6° C.

La Azida de Sodio puede ser omitida.

PROCEDIMIENTO GENERAL.

Los pasos para realizar la técnica serológica de ELISA-DAS, son los siguientes:

82
Nota: Antes de iniciar el ensayo de dicha técnica, es necesario realizar la revisión del
protocolo incluido con el kit adquirido; así como los componentes y las especificaciones
de preparación de los reactivos, enzimas o soluciones en caso de contenerlos, dado que
pudieran ser variables dependiendo del patógeno a diagnosticar.

A) Sensibilización de la placa.

Los anticuerpos (gammaglobulina) específicos para cada agente patogénico son


adsorbidos a la superficie de cada pozo de la placa de microtitulación. Esto se logra
cubriendo los pozos de la placa de microtitulación con un anticuerpo (gammaglobulina
purificada) específico para el agente patogénico que se pretende detectar. Para lograrlo,
es necesario efectuar los siguientes pasos:

a. Diluir la gammaglobulina purificada (anticuerpo) de acuerdo a la recomendación del


fabricante o a resultados de titulación realizados por el usuario. El anticuerpo se
deposita en un recipiente de transferencia que contiene SOLAM suficiente para la
cantidad de muestras a analizar (100 microlitros por muestra).

b. Agregar 100 microlitros de la solución anterior (gammaglobulina purificada -


anticuerpo) en cada pozo de la placa de microtitulación con la ayuda de una
micropipeta.

c. Incubar la placa en cámara húmeda por 12 horas a 4ºC, 4 horas a temperatura


ambiente (20-30ºC) o según las recomendaciones del proveedor (2 h a 35-37° C).

d. Vaciar la placa. Al término del período de incubación se decanta la solución,


invirtiendo la placa sobre el lavadero.

e. Lavar con la ayuda de una pizeta que contiene PBS-T se llenan los pozos de la placa
de microtitulación y se vacían de inmediato, invirtiendo la placa sobre el lavadero.
Este proceso se repite 3-5 veces. El lavado elimina de la placa, la gammaglobulina no
adherida a ella.

f. Secar, golpeando con firmeza la placa de microtitulación sobre el papel secante hasta
eliminar completamente el PBS-T.

B) Colocación de muestras (antígeno).

Antes de este punto, siempre verificar el buffer recomendado por el proveedor.

83
(a) Adsorción del antígeno. Se agregan 100 microlitros de macerado
de tejido a un pozo de la placa. Debe utilizarse una micropuntilla para cada
muestra.

El tejido vegetal se coloca en bolsas de plástico de aproximadamente 10x15


cm y se agrega SOLAM de extracción en una proporción 1:10 (peso: volumen).
Se macera con el pistilo de un mortero, dando golpes suaves sobre el tejido
vegetal y el plástico sobre una tela o servilleta de papel.

Para el caso de semillas y corteza, el tejido puede colocarse en tubos de


ensayo con el SOLAM de extracción (proporción 1:10) y se utiliza un
homogenizador con generador de columna.

Se recomienda no colocar muestra en los pozos cercanos a los bordes de la


placa ya que puede desarrollar reacciones no específicas.

(b) Diagrama de distribución. Cada placa debe incluir:

- Muestra y su duplicado,

- Dos pozos “blanco”, pozos no sensibilizados,

- Cuatro pozos “testigo negativo” (dos con sólo buffer de extracción y


dos con macerado de tejido vegetal negativo al patógeno a diagnosticar),

- Dos pozos con “testigo positivo”.

(c) Incubación. Se incuba la placa en cámara húmeda durante 2 horas


a temperatura ambiente (20-30 ºC) o 12 horas a 4 ºC.

(d) Lavado. Se elimina el contenido de la placa y se lava con PBS-T. Para


lavar adecuadamente y evitar la contaminación entre muestras (pozos), la placa se
coloca en posición inclinada, se agrega PBS-T, iniciando con los pozos de la parte
inferior (columna 12 letra H de la placa), continuando hacia la parte superior
(columna 1 letra A) hasta llenar toda la placa.

Posteriormente se deja reposar la placa con PBS-T durante 3 minutos. Este


proceso se repite al menos 3 veces.

C) Adición del conjugado (anticuerpo-enzima fosfatasa alcalina).

Antes de este punto, siempre verificar el buffer recomendado por el proveedor.

84
(a) Diluir el conjugado enzimático en un recipiente en la proporción conjugado:
SOLAM, señalada por el proveedor. Cuidar que se adicionen todos los
componentes del conjugado que proporciona el kit (en la mayoría de los casos
el conjugado consta de únicamente un bote, pero en algunos otros, viene en
dos recipientes, bote A y bote B.

(b) Agregar a cada pozo de la placa 100 microlitros (0.1 ml) del conjugado
diluido.

(c) Incubar 2 horas a temperatura ambiente (20-30 ºC) en cámara húmeda.

(d) Eliminar el conjugado enzimático y lavar de acuerdo al procedimiento


descrito anteriormente. En este paso se elimina el conjugado enzimático que
no esté adherido a las partículas del agente patogénico.

D) Adición del sustrato.

(a) Preparar el sustrato de la enzima diluyendo el para-nitrofenol fosfato en


SOLAM de sustrato en una relación de 1 mg/ml y agregar 100 µl (0.1 ml) de
ésta solución de sustrato a cada pozo de la placa.

(b) Incubar la placa en cámara húmeda a temperatura ambiente (20-30º C) y


obscuridad por 0.5-1 hr para observar la reacción y tomar las lecturas en el
lector de microplacas en periodos de tiempo: inicial, después de 10 min de
adición del sustrato; intermedia, a la media hora; y final, a los 50-60 min.

E) Identificación del patógeno

Debido a la naturaleza de la prueba, la reacción de la enzima sobre el sustrato se


puede apreciar de manera visual en caso de ser positiva. Sin embargo, se
recomienda después de adicionado el sustrato, leer la absorbancia de la placa a
405 nm en un lector de placas en por lo menos 2 períodos de tiempo. El analista
debe decidir la duración de cada período así como el número de lecturas, con
base en la intensidad de la reacción, no excediendo de 1 hora.

La intensidad del cambio de color es una indicación de la cantidad del antígeno en


la muestra. Cuanto más intenso es el color, mayor es la concentración del
antígeno. Los pozos transparentes, en los que no hay cambio de color,
corresponden a las muestras de plantas en las que no está presente el antígeno,
es decir, plantas sanas; así como los testigos sanos y el blanco con buffer de
sustrato.

Para detener la reacción, cuando se usa fosfatasa alcalina se añaden 50 µl de


hidróxido de sodio al 3 M a los pozos de la placa, y ácido sulfúrico 3 M para el
caso de la enzima peroxidasa.
85
F) Reporte de resultados.

Los resultados deberán interpretarse de acuerdo a los siguientes criterios:

1. Para considerar aceptables los resultados de una prueba ELISA se


recomienda elaborar gráficos considerando los valores mayores, medios y
bajos, reportados para las muestras problema y los datos para los controles
(positivos y negativos).

2. La reacción se considerará como positiva (presencia del fitopatógeno) si la


lectura de densidad óptica es mayor o igual a tres veces la media del testigo
negativo (considerar las lecturas del “negativo de tejido vegetal” y “negativo de
buffer”). De tal forma que si el testigo negativo presenta en promedio valores
de densidad óptica menores de 0.03, sólo se considerarán positivos aquellas
muestras con densidades ópticas mayores a 0.1. Los resultados son
reportados como negativo o positivo al patógeno en cuestión.

Nota: Considerar para el análisis, la incorporación y el análisis de los valores


arrojados por los pozos control: positivos (muestra liofilizada adquirida con la
compañía proveedora del kit ELISA), negativos (adquiridos con la compañía
proveedora del kit ELISA o en su caso, muestras negativas (tejido vegetal
fresco o congelado) analizadas anteriormente) y de buffer (sin muestra).

3. Cuando sólo una de las muestras es positiva y/o si la diferencia con su


repetición es mayor o igual al 50% de su valor, la muestra debe procesarse
nuevamente para determinar la presencia del fitopatógeno.

4. Las pruebas que resulten positivas deberán analizarse una segunda o tercera
vez, según el criterio del analista, para su confirmación.

86
PRÁCTICA No. 20

MÉTODO DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PARA EL


DIAGNÓSTICO DE VIRUS

OBJETIVO: Que el alumno conozca uno de los protocolos de PCR empleados para la
detección de begomovirus, virus de ADN, patógenos comunes en plantas.

INTRODUCCIÓN

Hoy en día las técnicas de biología molecular resultan ser altamente específicas para el
patógeno y también, altamente eficientes en la detección de las variantes virulentas.

La amplificación por medio de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de una


muestra de ADN, aislado a partir de cualquier tipo celular o virus, así como el sintetizado
a partir de un ARN, se basa en la estabilidad térmica de algunas enzimas ADN
polimerasas cuyos “cebadores” son secuencias de ADN específicas. La reacción de
amplificación, es llevada a cabo con ciclos térmicos continuos de desnaturalización,
alineación y síntesis, siendo el resultado final un gran número de moléculas de ADN de
longitud específica, detectables por separación electroforética.

Con fines de diagnóstico, el análisis de las moléculas amplificadas se lleva a cabo


comparando su peso molecular contra marcadores moleculares de ADN. El análisis
puede ir más allá, desde una sencilla cuantificación al inferir la concentración del
ADN hasta la restricción o la secuenciación del producto amplificado.

PROCEDIMIENTO

Reactivos

Ver cada uno de los procedimientos específicos en el apartado: 7.4 Metodología.

MATERIALES

Probetas 10, 50 y 100 ml.


Matraces volumétricos 10, 50, 100, 500 y 1000 ml.
Vasos de precipitado 50, 100, 500 y 1000 ml.
Papel filtro.
Toallas de papel absorbente
Morteros de porcelana con pistilos.

87
Tubos para microcentrifugación de 1.5 – 2.0.
Tubos para PCR de 0.2 o 0.5 ml.
Espátula de acero inoxidable.
Papel aluminio.
Papel kraft.

EQUIPOS

Parrillas de agitación y calentamiento.


Mezclador tipo Vortex.
Autoclave.
Homogenizador de tejidos.
Centrifuga con rotor para tubos 1.5 a 2.0 ml (15 000 rpm).
Refrigerador / congelador que alcance al menos –20º C.
Ciclador de temperatura (termociclador).
Espectrofotómetro UV/Vis.
Potenciómetro con electrodo.
Balanza analítica.
Equipo para electroforesis (cubetas horizontales y fuente de poder)
Transiluminador UV
Pipetas digitales (micropipetas) Vol. 0.5 – 1 µl.
Pipetas digitales (micropipetas) Vol. 1 – 10 µl.
Pipetas digitales (micropipetas) Vol. 10 – 100 µl.
Pipetas digitales (micropipetas) Vol. 100 – 1000 µl.

PROCEDIMIENTO

a). Extracción de ácidos nucleicos.

 Pesar 50 mg de muestra de tejido vegetal fresco, liofilizado u homogenizado.


 Macerar en morteros congelados con 1 ml de solución amortiguadora de lisis
(CTAB).
 Depositar el extracto en tubos estériles de 1.8 ml.
 Incubar la suspensión a 65 °C durante 60 min, agitando continuamente con
suavidad.
 Incubar las mezclas a temperatura ambiente durante 10 min y posteriormente,
agregar 500 μl de cloroformo.
 Mezclar las muestras por inversión y centrifugar a 14000 rpm a temperatura
ambiente durante 10 min.
 Transferir 750 μl del sobrenadante a un tubo nuevo estéril de 1.8 ml.

88
 Adicionar 500 μl de cloroformo y mezclar por inversión.
 Incubar a 37°C durante 30 min.
 Agregar 1 ml de isopropanol (2-propanol) frío y mezclar por inversión para
favorecer la precipitación del DNA.
 Centrifugaron las suspensiones a 14000 rpm a temperatura ambiente durante
10 min y después decantar el sobrenadante.
 Agregar 1 ml de etanol 75% al material precipitado.
 Centrifugar a 14000 rpm a temperatura ambiente durante 10 min y desechar el
alcohol por decantación.
 El DNA precipitado se seca a temperatura ambiente y se adicionan 100 μl de
agua bidestilada estéril.
 Las suspensiones se guardan a -20 °C hasta su uso.

b). Evaluación del DNA extraído.

 El DNA se analizará por electroforesis en gel de agarosa 0.8 % empleando


amortiguador TBE 1X (Tris-base 2.7 g, ácido bórico 1.36 g, 1 ml EDTA 0.5 M
pH 8) como solución tampón de corrida en un sistema horizontal.

 Fraccionar el ADN a 80 V durante 15 min y posteriormente a 100 V por 45


min.

 Teñir el gel con 2 μl de bromuro de etidio (10 mg/ml) en 100 ml de solución


TBE 0.5X durante 20 minutos.

 Sacar el gel y colocarlo en un equipo de fotodocumentación o en su defecto


sobre el transiluminador UV.

 Observar la presencia de una banda bien definida.

c). Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Virus/viroides).

Para la amplificación del DNA viral se empleará el protocolo de Wyatt y Brown (1996)
con los iniciadores degenerados prV 324(+) (5’GCCYATRTAYAGRAAGCCMAG3’) y
prC889(-) (5’GGRTTDGARGCATGHGTACATG 3’), que amplifican el gen de la
proteína de la capside de Begomovirus.

 Preparar la solución de amplificación consistente de 1X de Buffer PCR, 2 mM


de MgCl2, 1.5 mM de dNTP’s, 20 pM de cada iniciador (prV y prC), 1 mg de

89
DNA total y 1.25 U de taq DNApol (Promega), en un volumen de reacción de
25 μl.

 Amplificar el ADN bajos las condiciones térmicas: 94° por 2 min para una
desnaturalización inicial; 35 ciclos de 92° por 1 min, 60° por 20 seg y 72° por
30 seg para desnaturalización, alineamiento y extensión, respectivamente.

 Realizar la separación electroforética de los productos amplificados en gel de


agarosa 1.8% empleando amortiguador TBE 1X como solución tampón de
corrida en un sistema horizontal.

 Fraccionar el ADN a 80 V durante 15 min y posteriormente a 100 V por 45


min.

 Teñir el gel con 2 μl de bromuro de etidio (10 mg/ml) en 100 ml de solución


TBE 0.5X durante 20 minutos.

 Sacar el gel y colocarlo en un equipo de fotodocumentación o en su caso sobre


un transiluminador UV.

 Observar la presencia de un producto de amplificación de alrededor de 600 pb


(Figura) de acuerdo a Wyatt y Brown (1996).

 Fotografiar el gel o en su caso, editarlo con un software para procesar


imágenes de video.

M1 M2
M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
M0 mpm

500 pb

Figura 2. Se muestran los productos de amplificación de ocho muestras de


tejido foliar de Capsicum sp. positivas a Pepper golden mosaic virus. M0:
Positivo al begomovirus Tomato Chino La Paz virus. M1 a M10: Muestra 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. mpm= Marcador de peso molecular.

90
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

CALDO LACTOSADO MARCA MERK: Disolver 13 gr. en 1 lit. de agua destilada .

BILIS VERDE BRILLANTE: Disolver 40 gr. en 1 lit. de agua destilada distribuyéndose en


tubos de 10 ml. para muestras de 1 ml. o menos.

Si las muestras son de 10 ml. disolver 60 gr. en un litro y distribuir en porciones de


20 ml. Esterilizar a 15 lib. por 15 min.

AGAR BASE: Disolver 25.5 gr. en 1 lit. de agua destilada .

CALDO NUTRITIVO: Disolver los siguientes reactivos en 100 ml. de agua destilada.

AGUA DESTILADA (1000ML) Cs.10 ml.

PEPTONA .60 gr. 0.06 gr.

EXTRACTO DE CARNE DE RES .15 gr. 0.15 gr.

EXTRACTO DE LEVADURA .30 gr. 0.03 gr.

ESTE MEDIO SE UTILIZA EN LAS PRÁCTICAS No. 7 Y 8.

AGAR SUAVE: Disolver 7.5 gr. de agar en 1 lit. de agua destilada.

PRÁCTICAS No. 12 Y13.

CALDO BASE: Disolver en 75 ml. de agua los siguientes reactivos:

PEPTONA 0.4 gr.

EXTRACTO DE CARNE DE RES 0.1 gr.

EXTRACTO DE LEVADURA 0.2 gr.

PUEDE SUSTITUIR AL CALDO LACTOSADO

DILUYENTES AGUA DE PEPTONA: Peptona al 1%

FENOLFTALEINA: Se disuelve 1 gr en 100ml de etanol al 95%. La solución es incolora a


pH 8.3 y roja a pH 10.

91
PREPARACIÓN DE REACTIVOS

TINCIÓN SIMPLE

A. Cristal violeta (Fórmula de Hucker)

Cristal violeta ........................... 2.0 g


Etanol 95% (v/v) ...................... 20.0 mL
Oxalato de amonio 1% (v/v) ...... 80.0 mL

Disolver el cristal violeta en etanol. Agregar el oxalato de amonio y dejar 48 horas


antes de usar.

B. Azul de metileno (Fórmula de Loeffler)

Cloruro de azul de metileno ................ 1.6 g


Etanol 95% (v/v) ............................... 100.0 mL
Hidróxido de potasio 0.01% (w/v)...... 100.0 mL

Preparar una solución alcohólica saturada de azul de metileno agregando el


colorante al alcohol. Agregar 30 mL de esta solución a la de KOH.

Preparación de reactivos para la tinción de Gram (técnica de Hucker)

A. Cristal violeta (fórmula de Hucker)

De acuerdo a la formulación indicada en la tinción simple.

B. Lugol

Yodo ................................. 1.0 g


Yoduro de potasio ............. 2.0 g
Agua destilada ................. 300.0 mL

Disolver el yodo y el KI en el agua. Dejar de un día para el otro si es necesario,


para disolver completamente. Almacenar en frasco oscuro.

C. Safranina

Safranina 2.5% (w/v) en alcohol 95% .. 10.0 mL

Agua destilada .................................... 100.0 mL

Preparación de reactivos para la tinción de esporas


92
A. Verde de malaquita

Verde de malaquita ................. 0.5 g


Agua destilada ........................ 100.0 mL

B. Safranina

Safranina 2.5% (w/v) en alcohol 95% .. 10.0 mL


Agua destilada .................................... 100.0 mL

Preparación de reactivos para la tinción de cápsula.

A. Fuccina fenica fuerte

Fuccina básica 10.0 g

Etanol (95%) 100.0 mL

Mezclar y disolver en un frasco tapado y mantener a 37ºC durante toda la


noche.

Preparación de reactivos para la tinción de flagelos.

A. Solución Mordiente

Ácido tánico 20.0 g

CrO3 Sol. Acuosa al 2.5% 15.0 mL

Agua caliente 80.0 mL

El ácido tánico se disuelve en 80ml de agua caliente, y se agrega la solución


de CrO3, se mezclan y se guardan en el refrigerador durante 4 días en un
recipiente oscuro. Para emplear, el mordiente se debe filtrar previamente.

Preparación de reactivos para tinción de gránulos metacromáticos.

A. Solución Colorante de Albert.

Verde de malaquita 0.2 g

Azul de toluidina 0.15 g

Etanol 95% 2.0 mL


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Ácido acético glacial 1.0 mL

Agua destilada 100.0 mL

El colorante se disuelve en etanol y el ácido se mezcla con agua y se agrega a


la solución del colorante. La mezcla se deja reposar por 24 h y se filtra.

Preparación de reactivos para la tinción de bacterias ácido resistentes (técnica


de Ziehl-Neelsen).

A. Carbofucsina

Fucsina básica ....................... 0.3 g


Etanol 95% (v/v) .................... 10.0 mL
Fenol (cristales fundidos) ......... 5.0 mL
Agua destilada ........................ 95.0 mL

Disolver la fucsina básica en el etanol; luego agregar el fenol disuelto en el


agua. Mezclar y dejar varios días, filtrar antes de usar.

B. Alcohol-ácido

Etanol 95% (v/v) .................. 97.0 mL


HCl conc. ............................. 3.0 mL

C. Azul de metileno

Cloruro de azul de metileno ..... 0.3 g


Agua destilada ....................... 100.0 mL

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BIBLIOGRAFIA

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management and rural development. Improvement of Crop Plants for Industrial
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