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EXPERIENCIA EDUCATIVA:
VIRUS Y BACTERIAS
Elaborado por:
Dra. Celia Cecilia Acosta Hernández
Dr. Mauricio Luna Rodríguez
M. C. Paloma Violeta Susan Tepetlan
Dra. Albertina Cortés Sol
M. en C. Lizbeth Estrada Vargas
PRESENTACIÓN. __________________________________________________ 3
NORMAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA ________________ 4
MATERIAL DE TRABAJO POR EQUIPO____________________ ____________ 5
MANEJO DE MATERIAL_____________________________________________ 6
2
AISLAMIENTO DE Rhizobium
PRÁCTICA No. 14:_____________________________________________ 64
RESISTENCIA BACTERIANA
PRÁCTICA No. 15:_____________________________________________ 70
ACCIÓN DE AGENTES QUÍMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO
BIBLIOGRAFÍA. ___________________________________________________ 95
3
PRESENTACIÓN
Para hacer más efectivo el logro de este objetivo, y evitar en lo posible errores, es
recomendable tener una guía de trabajo que permita a los estudiantes anticiparse a las
actividades programadas para cada sesión.
El presente manual, pretende ser esta guía de trabajo, las prácticas aquí presentadas
guardan un orden de acuerdo con el programa teórico y son una recopilación selecta de
técnicas básicas para el sembrado, purificación, tinción, reconocimiento de cultivos
bacterianos y conteo bacteriano, así como, algunas de las técnicas más comunes
utilizadas en la determinación de resistencia de las bacterias a metales pesados y
sustancias tóxicas como insecticidas.
4
NORMAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
2. Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente el guión para adquirir una
idea clara de su objetivo, fundamento y técnica.
5. Fumar, comer o tomar cualquier alimento NO está permitido dentro del laboratorio
8. Las mesas de trabajo deben limpiarse con desinfectante antes y después de cada
sesión.
9. Todos los cultivos y materiales de desecho que hayan entrado en contacto con
microorganismos (pipetas usadas, placas petri o tubos), deben colocarse en bolsas de
autoclave y proceder posteriormente a su esterilización.
12. Todos los cultivos deben marcarse con NOMBRE, NUMERO DE EQUIPO, GRUPO Y
FECHA DE SIEMBRA.
14. Las pipetas se cogerán de forma que sea el dedo índice el que tape su extremo
superior para regular la caída de líquido.
GASA
ALCOHOL
1 litro AGUA DESTILADA.
PLUMÓN INDELEBLE PUNTO FINO
MASKING TAPE ANCHO (1 cm APROX.)
PLIEGOS DE PAPEL REVOLUCIÓN
ALGODÓN PLISADO (1 PAQUETE CHICO)
JABON DE TOCADOR
ESCOBILLON
ESPONJA PARA LAVAR
JABÓN PARA TRASTES
TELA PARA SECAR MATERIAL
CUBRE BOCAS
GUANTES
CERILLOS
ASA BACTERIOLOGICA (2)
1 CAJA DE PORTA OBJETOS
1 CAJA DE CUBRE OBJETOS
TRES FRASCOS PEQUEÑOS (1 para muestra, 1 para guardar cubreobjetos y otro para
portaobjetos)
TIJERAS
EXACTO
PINZAS PUNTA DELGADA
JERINGA 10 ml
6
MANEJO DE MATERIAL
3. Antes de utilizar las asas con hilos de platino que sirven para las siembras, éstas
deben flamearse al rojo en posición vertical bajo la acción de la llama; también debe
flamearse el mango. Antes de efectuar la siembra debe esperarse algunos segundos a
que se enfríen, pudiendo enfriarse también en el borde de la placa de Petri que
contiene el medio de cultivo. Inmediatamente después de haberlas utilizado, deben
flamearse nuevamente (vea figura).
4. Las varillas de vidrio también deben flamearse, para ello primero moje la varilla en
alcohol pásela por la flama, retírela en cuanto se incendia y espere a que se apague la
flama y se enfríe la varilla (vea figura)
5. Las cajas Petri que han sido sembradas deben colocarse en las cámaras de
incubación de manera invertida
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TIPOS DE ASA Y SU USO.
Las asas se utilizan para inoculación o transferencia de cultivos, pueden ser un alambre de
platino, recto en forma de asa, un extremo de ese alambre se interna en un mando cilíndrico
que permite su manejo. Actualmente se utilizan mayoritariamente las asas de siembra de
plástico que además de estar calibradas pueden tener una aguja incorporada cuando se
quiere hacer siembras en profundidad, y que son desechables. Las asas de plástico tienen
una ventaja frente a las de metal, flameadas después de cada uso, con las cual se evita que
se produzcan aerosoles que provocan contaminación.
A. Asa en argolla o anillo, no calibrada. Generalmente son de alambre de nicromo. Sirve para
siembra por estrías e inoculaciones en general
B. Asa recta o en hilo.
Sirve para trasladar una sola colonia o medios de identificación o
subcultivo.
C. Asa de platino amarillo. Calibrada para tomar 0.001 ml de uso frecuente para urocultivos.
E. Asa de alambre grueso en L.
Sirve para purificar colonias de hongos y procedimientos
especiales.
F. Aguja de disección con punta aguda.
Sirve para purificar colonias pequeñas y distribuir
las preparaciones de hongos en fresco.5
8
TÉCNICAS PARA LA ELABORACIÓN Y OBSERVACIÓN DE UNA PREPARACIÓN
FRESCA
La preparación fresca es una técnica útil en los estudios de bacterias para observar
aspectos de las células bacterianas como movilidad y forma. A continuación se indican
dos procedimientos para su elaboración.
Procedimiento.
d) Aplique unas gotas de agua destilada estéril a los bordes del cubreobjetos para
sellarlo y mantenerlo en su lugar.
e) Observe con el lente seco de mayor aumento, este puede ser el de 40x.
B) Método de lámina-laminilla.
b) Coloque una gota de la muestra usando técnica aséptica (con asa o con pipeta
estéril) sobre un portaobjetos limpio y coloque un cubreobjetos sobre esta. Para
prevenir las corrientes de convección y el secado de la preparación, sellar los
bordes del cubreobjetos con petrolato, sellador o esmalte de uñas incoloro.
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C) Preparación fija (frotis) de una muestra microbiana.
El agente fijador ideal preserva las estructuras de la célula con su forma y posición sin
que aparezcan estructuras que no existían en la célula original.
Procedimiento.
b) Secar al aire para fijar las células. Puede acelerar el secado, pasando el
portaobjetos tres veces por la llama del mechero a 15 cm o más de distancia. El
calor hace que las células se deformen y se tiñan defectuosamente, por lo que
es conveniente sostener el portaobjetos con la mano la cual funcionará como
sensor de que no se esté aplicando calor excesivo.
c) Una vez fijada una preparación, sobre el frotis seco pueden emplearse
colorantes básicos para teñir las células, varias de las cuales están referidas en
la Práctica 4.
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PRÁCTICA No. 1
INTRODUCCION
Para poder lograr esto, es necesario cumplir con ciertos requerimientos como son los
nutrientes necesarios, tales como, fuente de carbono, nitrógeno, minerales y factores de
crecimiento, condiciones ambientales apropiadas con son pH, temperatura, presión
osmótica y oxígeno atmosférico, además, de condiciones asépticas estrictas.
Para prácticas posteriores se requiere un cultivo puro, por lo que debemos manejar todo
de tal manera que no introduzcamos organismos no deseados.
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
1.- Preparar las diluciones de acuerdo a las instrucciones, para mayor comprensión vea la
figura 2
b) Pasar 1ml. de la dilución 10-1 al siguiente tubo con 9 ml. de agua estéril (dilución 10-
2
). Mezclar. UTILICE OTRA PIPETA.
c) Pasar 1ml. de la dilución 10-2 al tercer tubo que contiene 9 ml. de agua estéril
(dilución 10-3). Mezclar. COLOQUE LA TERCERA PIPETA DENTRO DEL TUBO
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0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml
2.- Siembra por extensión en placa de agar tome una pipeta estéril y pase 1 ml. de las
dilución deseada a dos cajas petri con medio sólido, distribuya homogéneamente con
la varilla en forma de “L”. (ver Fig. 3a)
4.- Siembra por vaciado de placa: primero inocule 1 ml. de la dilución deseada en una caja
vacía y estéril posteriormente vacié medio fundido a temperatura media, para
homogenizar mezcle con movimientos suaves. Deje solidificar en una superficie plana
(ver Fig. 3b).
Figura 3. Siembra en caja Petri a) siembra por extensión; b) siembra por vaciado de placa
1. Siembra por estriado de placa: se toma una sola asada del material a inocular y se
disemina sobre la superficie del medio sólido, de una manera suave sin escarbar en el
medio.
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a) Estrías escocesas: Primero dibuje estrías en la mitad de la caja, gire su caja de
manera que el estriado quede de su lado derecho. Queme su asa, enfríela y
tocando el extremo superior del estriado, vuelva a estriar hasta cubrir un cuarto de
la caja, gire de nuevo su caja. Queme el asa, enfríela y vuelva a estriar hasta cubrir
b) Estriado por agotamiento: tome una asada de muestra y estríe toda la caja (Figura
4a).
Figura 4. Siembra por estriado en medio sólido: a) Estrías escocesas: b) estriado por
agotamiento
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2. Para siembra en medio líquido transfiera con una pipeta estéril 1 ml. de la dilución
deseada al tubo con medio líquido. Antes y después de inocular se flamea la boca del
tubo.
3. Siembra por picadura en tubo con medio sólido: Flamee el asa, quite el tapón del tubo
con la mano que tiene el asa y flamee la boca del tubo. Tome una asada de la
muestra. Flamee la boca del tubo e introduzca el asa dentro del medio hasta
aproximadamente ¼ de profundidad. Saque el asa, flamee nuevamente la boca del
tubo y el tapón. Coloque el tapón en el tubo (Figura 5).
4. Siembra por estría en medio sólido inclinado: se lleva el asa (con muestra) hasta
donde empieza el declive del medio y se sube haciendo un movimiento de zig-zag
sobre la superficie dibujando así una serie de estrías. Inocule sólo una asada, en
caso de necesitar más asadas inicie la siembra a partir de donde termino la anterior
(Figura 6).
9.- Selle las cajas con celopack, etiquete con número de equipo, grupo y dilución. Incube
los medios a 37ºC por 48 hrs.
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Manipulación aséptica de cultivos. Métodos de siembra
3. Siembra volumétrica.
4. Siembra masiva.
Siempre que se utilicen instrumentos de siembra de platino o nicrón, deben ser calentados
en la llama del mechero hasta el rojo vivo, antes y después de realizar la siembra, con el
objetivo de destruir a los microorganismos contaminantes de la superficie del instrumento.
Con independencia del tipo de medio y el método de siembra a emplear ésta debe
realizarse en las proximidades de la llama del mechero ya que el calor emanado reduce el
número de microorganismos presentes en sus inmediaciones, lo cual es utilizado como un
recurso aséptico.
Este método de siembra se realiza sobre la superficie de los medios de cultivo sólidos
distribuidos en placas de "Petri" o en tubos de ensayo solidificados en forma de cuña
(Slam).
Para la siembra por estría se utiliza el asa de platino o el hisopo. En algunas ocasiones, se
utilizan ambos instrumentos en la misma siembra.
Procedimientos
1. Sujete el asa de alambre de platino o nicrón por el cabo, en forma similar, a cuando
tomamos el lápiz para escribir.
2. Introduzca el asa directamente en la zona de color azul de la llama del mechero, hasta
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que se ponga al rojo vivo. A continuación introducir lentamente el resto del alambre
para lograr el mismo efecto.
4. Con el asa estéril y fría tome el volumen o fragmento de la muestra que será sembrado y
trasládelo de inmediato para el medio del cultivo seleccionado.
b. Tome el asa bacteriológica con los dedos pulgar, índice y mayor, dejando libres el
anular y el meñique.
c. Con la mano opuesta a la que sujeta el asa, tome el tubo por la porción inferior,
de modo que el fondo del tubo toque la palma de la mano.
d. Con el dedo meñique de la mano que sostiene el asa, retire del tubo el tapón de
algodón o la tapa de rosca y reténgala (no colocar el tapón o la tapa sobre la mesa
de trabajo)
e. Flamee de inmediato la boca del tubo de ensayo, pasándola una o dos veces por la
llama del mechero, con el objetivo de eliminar por incineración los
microorganismos contaminantes que se encuentran en esa zona por la parte
externa del tubo. Esta acción calórica, provoca además una convección del
movimiento del oxígeno presente en el interior del tubo hacia afuera, debido a la
desigualdad de calor, lo cual favorece que decrezca el riesgo de contaminación.
g. Para enfriar el asa, introdúzcala al tubo tocando la pared fría y luego introdúzcala en
el cultivo líquido o si es un cultivo sólido deslícela sobre la superficie de abajo
hacia arriba, para tomar las células a transferir (inóculo).
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• Deslizando el asa, desde el fondo hacia arriba, por toda la superficie de la
cuña, trazando una línea longitudinal.
a. Con la mano opuesta a la que sujeta el asa de platino, tome la placa de Petri,
de manera que la tapa quede hacia arriba. Con ayuda del dedo pulgar abra
parcialmente la placa. Trabajar siempre en el área del mechero (Figura).
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Figura. Apertura manual de la placa de Petra con medio de cultivo.
c. Cierre la placa y gírela varios cm, en contra de las manecillas del reloj, procediendo
a abrirla nuevamente por igual procedimiento.
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Figura. Diversas técnicas para el aislamiento por estría.
Figura. Siembra por diseminación cruzada: a) Trazar con el hisopo que contiene el inóculo
una "Z"en la superficie del medio; b) Completar la siembra con un asa de platino estéril,
imprimiendo movimientos ondulatorios sobre la "Z".
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el medio de cultivo.
C. Siembra volumétrica
Este método de siembra consiste en sembrar una muestra liquida cuyo volumen no puede
ser predeterminado, en medio de cultivo sólidos o líquidos. Por ejemplo: En las muestras
de exudado vaginal tomadas con pipetas de Pasteur, no puede determinarse el volumen,
ya que este tipo de pipeta carece de escala de graduación, sin embargo, la orina
empleadas en el urocultivo o la sangre para el hemocultivo se puede determinar con pipeta
o jeringuilla respectivamente el volumen que será sembrado.
D. Siembra masiva
Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátula de Driglaski.
En este caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la superficie
del medio de cultivo sólido imprimiendo un movimiento en espiral. La siembra masiva
también se puede realizar con un hisopo grueso embebido de un cultivo liquido,
procediendo a su deslizamiento sobre toda la superficie de una placa de agar.
REPORTE
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PRÁCTICA No. 2
INTRODUCCION
Tamaño de las colonias: Es constante dentro de las especies y puede ir desde colonias
diminutas hasta varios milímetros.
Consistencia y textura: La consistencia puede variar desde una colonia seca que puede
moverse sobre el agar con un asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma
filamentos o hilos mucosos cuando se separa del agar. La textura puede parecer granular
o amorfa. La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada
con muescas concéntricas o quebradas.
MATERIAL
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PROCEDIMIENTO
1.- Observe las colonias bajo el microscopio y anote las características basándose en el
texto y en la figura 7.
2.- Para textura destape cuidadosamente las cajas y con una asa estéril toque las
colonias.
NOTA: Ciertas características de las colonias ocurren de una manera uniforme, por lo que
se toman en cuenta para identificar bacterias en cultivos mixtos, pero para hacer un
estudio completo a nivel de especie es necesario hacer un estudio fisiológico e
inmunológico de estas colonias.
FORMA
SUPERFICIE
BORDE
REPORTE:
Elaborar una tabla con las características observadas de las diferentes colonias.
Investigar los caracteres y pruebas que usa la taxonomía clásica bacteriana para la
identificación de las bacterias.
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PRÁCTICA No. 3
INTRODUCCION
El aislamiento y obtención de cultivos puros posiblemente hayan sido las bases más
importantes en el desarrollo de la Microbiología. Los primeros trabajos en Microbiología se
hicieron en unas condiciones experimentales que no permitían tener la certeza de que se
hubieran obtenido cultivos puros.
Las técnicas para obtener cultivos puros fueron inicialmente desarrolladas por De Bary y
Brefeld para el estudio de hongos y consiguieron aislar células y cultivar hongos sobre
medios sólidos. Pero estas técnicas no eran adecuadas para el cultivo de bacterias.
TÉCNICAS DE AISLAMIENTO
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sobre la superficie de la placa. Al incubar la placa, y dejar crecer las bacterias distribuidas
sobre ella, cada una de las bacterias originará una colonia.
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
1.- Examine las placas y seleccione una colonia aislada, marcando su posición con un círculo
por el lado inferior de la caja de petri.
2.- Flamee el asa. Levante la tapa de la caja de petri y toque con el asa la colonia
seleccionada, verifique que el asa lleve parte de la colonia. Solo transfiera una mínima
parte de la colonia, de preferencia de la parte externa de la misma (Figura 10).
3.- Estríe en otra caja petri con medio, empleando la técnica de estría escocesa o
agotamiento en placa (Figura 10a y b).
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4.- Después de haber obtenido el inoculo, tome un tubo con medio inclinado y siembre por
estriado.
5.- Selle e incube a 37 ºC por 24 hrs.
Figura 10.- Aislamiento de una colonia a) estría por agotamiento en placa; b) estría escocesa
PURIFICACIÓN
b) Seleccione una colonia aislada del cultivo, con una asa toque la colonia y proceda
a sembrar por estriado en tubo inclinado. SOLO UNA (Figura 12).
REPORTE
TINCIÓN SIMPLE
Una vez que se fija una preparación, éstas pueden emplearse para teñir las células
bacterianas.
La tinción simple se basa en que las células bacterianas difieren desde el punto de vista
químico de su medio externo y por eso se tiñen, contrastando con él. Para la tinción simple
de las células puede emplearse los siguientes colorantes básicos: azul de metileno, cristal
violeta o fucsina fenica. Estos presentan diferente afinidad por las células bacterianas y por
ello, los tiempos de aplicación necesariamente serán distintos.
Los microorganismos también difieren física y químicamente entre si y por eso reaccionan de
una manera diferente frente a un determinado proceso de tinción. Esto constituye el
fundamento de las tinciones diferenciales.
Procedimiento.
A. Tinción simple
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Figura 8.- Preparación de un frotis para observación al microscopio.
REPORTE
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PRÁCTICA No. 5
OBJETIVO: Los estudiantes conocerán y aprenderán una de las tinciones diferenciales más
usadas en el laboratorio, distinguiendo las bacterias gram+ y gram-.
INTRODUCCION.
La tinción de Gram utiliza cuatro reactivos: cristal violeta, yodo de gram, etanol al 95% y
safranina. Existen algunas modificaciones de la tinción original, sin embargo el principio
fundamental es el mismo para todas.
La tinción de Gram, la más empleada en bacteriología, es una tinción diferencial. Por este
método se clasifican las bacterias en dos grupos: Gram positivos (Gram +) y Gram negativos
(Gram -), en función de su reacción frente a la coloración.
Según este procedimiento, las células previamente fijadas, se tiñen con solución de cristal
violeta, se lavan y se tratan con lugol. El iodo forma un complejo con el cristal violeta, que
sirve para fijar éste a la célula. Luego se agrega un agente decolorante (alcohol, acetona o
mezclas de ambos) en el cual el complejo iodo-cristal violeta es soluble y por eso algunos
microorganismos son decolorados (Gram -) mientras que otros no (Gram +).
En los Gram - el complejo es extraído por el alcohol mientras que en los Gram + no. Las
bacterias Gram + poseen paredes gruesas de peptidoglicano, se deshidratan por el alcohol.
Esto provoca que se cierren los poros de la pared, impidiendo que el complejo iodo-cristal
violeta se escape. En las bacterias Gram -, la fina capa de peptidoglicano no evita el pase del
solvente y el escape del complejo yodo-cristal violeta de la célula.
Las levaduras, que poseen una pared celular gruesa pero de una composición química
totalmente diferente, se tiñen como Gram +. No son los constituyentes químicos, sino la
estructura física de la pared lo que le confiere la Gram positividad.
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externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con
etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el
colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán
después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.
MATERIAL
Asa, mecheros
Cultivo de bacterias
Microscopio óptico
Pizeta
Portaobjetos y cubreobjetos estériles
Cristal violeta
Yodo de Gram
Etanol al 95%
Safranina
PROCEDIMIENTO
j) Lavar y secar.
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Las bacterias Gram + se verán de color azul-violeta y las Gram - rosadas. La tinción de Gram
es frecuentmente usada para determinar forma, disposición y tamaño relativo y reacción al
Gram de las distintas bacterias presentes.
Medición de tamaño
La medición del tamaño (longitud y diámetro) de las bacterias, no se puede realizar con la
precisión y exactitud deseables debido a dificultades técnicas inevitables. Los
microorganismos en preparaciones fijadas y coloreadas sufren deformaciones que hacen
que las medidas sean solo aproximadas. Además los preparados secos, fijados (aún con
formol) y coloreados no revelan la pared celular.
9.- Examine al microscopio con el objetivo de inmersión. Guíese por las fotos de la figura
13.
NOTA: Las bacterias se pueden fijar con calor, alcohol, acetona o formaldehido.
REPORTE
REPORTE
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PRÁCTICA No. 6
MICROFLORA DE PLANTAS Y SUELO
OBJETIVO: Conocer la microflora normal de las plantas y la del suelo asociada a plantas.
INTRODUCCIÓN
MATERIAL
1 Planta de jardín o bosque
Hisopos estériles
Asas bacteriológicas
Colorantes para tinción de Gram
Medio de cultivo con Agar nutritivo
Medio cultivo Agar-tripticasa de soya
Microscopios
Aceite de inmersión
Porta y cubreobjetos
Estufa de incubación
PROCEDIMIENTO
1. Frote suavemente un hisopo estéril sobre la superficie de una hoja, deposítelo con
cuidado en el extremo de una placa de tripticasa-agar-soya o de agar nutritivo y extiéndalo
en la superficie con un asa bacteriológica, por estría cruzada.
2. Con otro hisopo frote suavemente una parte del tallo y haga un frotis en un
portaobjetos. Deje secar y fije con calor. Tiña con Gram. Observe a 100 X.
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Estudio de la microflora del suelo asociada a las raíces.
1. Tome la planta y elimine el suelo sacudiendo la raíz en un recipiente lo suficientemente
grande.
2. El suelo adherido a la raíz de la planta arrástrelo a una cápsula estéril, aplicando 10 ml
de agua estéril con una pizeta directamente. Ésta solución es su muestra.
3. Haga diluciones de 110, 1100, 11000, 110000 de la muestra y siembre cada una en dos
placas de Agar TSA (Agar Tripticaseína de Soya).
4. Incube a 28°C durante 72 hrs.
REPORTE
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PRÁCTICA No. 7
COLORACIÓN DE ESTRUCTURAS
A) Tinción de Esporas
Las esporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las
técnicas de coloración comunes aparecerán como regiones sin teñir dentro de las células
coloreadas. Por lo tanto, para teñir las esporas específicamente, deben usarse métodos
de coloración especiales; por otra parte, una vez coloreada, la espora resiste fuertemente
la decoloración y el contraste.
Procedimiento
g) Observar al microscopio por inmersión. Se verán las esporas verdes y los cuerpos
celulares rosados. Si se dispone de un microscopio con contraste de fases, se
puede observar la endospora sin teñir como una estructura densa, blanca dentro
de la célula.
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Observe y registre los datos siguientes:
B) Tinción de Cápsula
Procedimiento 1
a) Colocar una gota de tinta china en un portaobjetos limpio y mezclarla con una
muestra de crecimiento colonial.
c) Observar al microscopio por inmersión. Las cápsulas aparecen como zonas claras
alrededor del organismo refractil sobre fondo oscuro.
Procedimiento 2
c) Cubrir la lámina con fuccina fénica fuerte y calentar ligeramente durante 1 minuto.
f) Lavar con agua y posteriormente con etanol durante 30 segundos o bien, hasta que
el frotis tome un color rojo pálido.
C) Tinción de Flagelos
Son tan delgados que solo se pueden ver al microscopio común luego de una coloración
especial que hace uso de un mordiente. Este promueve la fijación de las moléculas de
colorante al flagelo dando lugar a la formación de un precipitado a lo largo del flagelo,
haciéndolo visible.
Procedimiento
d) Secar al aire.
f) Escurrir y enjuagar con agua de la llave evitando que el agua caiga de golpe sobre
la preparación.
i) Dejar secar.
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Observar y registrar la flagelación característica de la célula bacteriana, la cual
puede tener uno o más flagelos dispuestos en distinta manera y en base a eso se
clasifican en:
En las fotos se observan flagelos teñidos con ácido tánico (mordiente) y fucsina básica, en
disposición perítrica.
Procedimiento
Fijar al aire.
Procedimiento
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a) Colocar el portaobjetos sobre un soporte para tinciones.
Cubrir con solución de fucsina básica y calentar, por debajo, con el mechero hasta
que se desprendan vapores (sin hervir). Mantener así durante 5 min con
calentamiento intermitente según sea necesario. No recalentar.
d) Cubrir con solución de contraste (azul de metileno) y dejar durante 20-30 seg.
Lavar con agua de la llave, secar con papel de filtro.
e) Observar por inmersión. Las bacterias ácido resistente se verán rojo-rosadas y las
demás azules.
38
PRÁCTICA No. 8
Procedimiento.
g/L
Peptona 2.0 g
NaCl 5.0 g
K2HPO4 0.3 g
Agar 3.0 g
7. Adicionar a uno de los tubos inoculados, 0.5 a 0.8 ml de aceite mineral, vaselina o
parafina estéril (alcanzar un nivel de 5 mm de altura).
NH4H2PO4 0.5 g
K2HPO4 0.5 g
MgSO4.7H2O 0.2 g
NaCl 5.0 g
NOTAS:
Para las sustancias difíciles de disolver, como la salicina, disolverla en un volumen mayor
de agua y adicionarla al Medio C, y esterilizar tres días sucesivos.
3. Tomar con un asa, una muestra del cultivo bacteriano y estriarlo sobre el medio.
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PRÁCTICA No. 9
•Producto
PROCEDIMIENTO
100.0 ml 3.0 ml
N,N dimetil-para-fenilen-diamina 1.0 g 0.03 g
(Puede usarse Hidrocloruro de tetrametil-p-fenilen-diamina)
Disolver el reactivo en agua destilada y guardarlo en frasco gotero ámbar. Nota: Es
conveniente utilizar reactivo recién preparado.
3. Obtener con palillos de madera o asa de platino, una muestra del cultivo bacteriano y
depositarlo sobre el papel filtro impregnado con la solución de N,N dimetil-para-
fenilen-diamina.
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Nota: Se recomienda que el cultivo sea no mayor a 48 h y preferentemente crecidos
en medios NA o KB.
PROCEDIMIENTO
100.0 ml 10.0 ml
Peróxido de hidrógeno 3.0 ml 0.3 ml
Agua destilada 97.0 ml 9.7 ml
Mezclar el reactivo en agua destilada y guardarlo en frasco gotero. Es conveniente
utilizar reactivo recién preparado.
3. Obtener con el asa una muestra del cultivo bacteriano, depositarlo y mezclarlo
con la solución de peróxido de hidrógeno.
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PROCEDIMIENTO
1L 100.0 ml
Peptona 1.0 g 0.1 g
NaCl 5.0 g 0.5 g
K2HPO4 0.3 g 0.03 g
Rojo de fenol 3.0 g 0.3 g
L(+) Hidrocloruro de arginina 10.0 g 1.0 g
Agar 3.0 g 1.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Disolver los componentes en agua destilada y ajustar a pH 7.2, distribuir en tubos y
esterilizar a 121°C durante 15 min.
PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO 1.
1L 100.0 ml
Extracto de carne 3.0 g 0.3 g
Peptona 5.0 g 0.5 g
Gelatina 120.0 g 12.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
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Agregar la gelatina al agua destilada y dejar reposando durante 15-30 min. Calentar y
disolver la gelatina, agregar los componentes y ajustar el pH a 7.0, distribuir en tubos
y esterilizar a 115°C durante 20 min.
PROCEDIMIENTO 2.
1L 100.0 ml
Gelatina (grado bacteriológico) 120.0 g 12.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Agregar la gelatina al agua destilada. Calentar y disolver la gelatina y ajustar el pH a
7.0, distribuir en tubos y esterilizar a 121°C durante 15 min.
PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO 1.
1L 100.0 ml
Agar nutritivo 23.0 g 2.3 g
Almidón soluble de papa 15.0 g 1.5 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Agregar los componentes y esterilizar a 121°C durante 15 min. Vaciar a cajas petri.
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PROCEDIMIENTO 2.
1L 100.0 ml
Agar 16.0 g 1.6 g
Almidón soluble de papa 10.0 g 1.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Agregar los componentes y esterilizar a 121°C durante 15 min. Vaciar a cajas petri.
PROCEDIMIENTO 3.
1L 100.0 ml
Agar PDA (Bioxon) 39.0 g 3.9 g
Almidón soluble de papa 10.0 g 1.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Agregar los componentes y esterilizar a 121°C durante 15 min. Vaciar a cajas petri.
Las peptonas son producto de la degradación de las proteínas por la pepsina, y son el
sustrato para la acción de diversas enzimas proteolíticas, por lo que aporta a un medio de
cultivo, principalmente, aminoácidos y péptidos. El indol es un compuesto orgánico
aromático heterociclico cuyo nombre es derivado del índigo. El indole está presente en
numerosos compuestos organicos como el triptofano (aminoácido) como en las proteínas
que contienen triptofano, y en los alcaloides y pigmentos.
PROCEDIMIENTO
A. PROCEDIMIENTO 1. (Indol)
1L 100.0 ml
Peptona (libre de indol) 10.0 g 1.0 g
45
NaCl 5.0 g 0.5 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Agregar los componentes, ajustar el pH a 7.2, vaciar a tubos de ensayo y esterilizar a
121°C durante 15 min.
a. Caldo nutritivo
1L 100.0 ml
Bacto-Triptona 10.0 g 1.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
2. Inocular cultivo bacteriano a los tubos.
5. Agitar moderadamente.
PROCEDIMIENTO 2. (Indol)
1. Preparar el medio:
1L 100.0 ml
Medio SIM (Bioxon) 30.0 g 3.0 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Agregar los componentes y disolver por ebullición, ajustar el pH a 7.3 ± 0.2, vaciar 3 ml a
tubos de ensayo y esterilizar a 121°C durante 15 min. Dejar enfriar en posición
vertical.
3. Incubar a 25 °C ± 2, durante 48 h.
46
5. Observar: Positivo: Presencia de una anillo rojo en la superficie.
NOM-114-SSA1-1994.
PROCEDIMIENTO 3. (Indol)
1. Preparar el medio:
1L 100.0 ml
Triptona 10.0 g 1.0 g
Triptofano 1.0 g 0.1 g
Agar 15.0 g 1.5 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Agregar los componentes y esterilizar a 121°C durante 15 min. Vaciar a cajas petri ydejar
enfriar.
3. Incubar a 25 °C ± 2, durante 48 h.
4. Concluido el tiempo, colocar sobre papel filtro en caja petri, 2 o 3 gotas de una solución
p-dimetilamino-cinamaldehido (1 g en 100 ml de ácido hidroclorico 10%).
47
PROCEDIMIENTO 1. (recomendado por Schaad et al. para Pseudomonas)
1. Preparar el medio:
1L 100.0 ml
Extracto de levadura 5.0 g 0.5 g
KNO3 3.0 g 0.3 g
NH4H2PO4 1.0 g 0.1 g
KCl 0.2 g 0.02 g
MgSO4.7H2O 0.2 g 0.02 g
Agar Noble 1.0 g 0.1 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Disolver los componentes, vaciar a tubos de ensayo y esterilizar a 121°C durante 15 min.
Dejar enfriar.
2. Inocular cultivo bacteriano por punción y sellar la superficie del tubo, adicionando 1
ml de solución de agar noble 3% o aceite mineral estéril.
4. Observar...
1. Preparar el medio:
1L 100.0 ml
KNO3 3.0 g 0.3 g
48
Peptona 5.0 g
Extracto de levadura 5.0 g 0.5 g
Agar Ion Oxoid No.2 1.0 g 0.1 g
Agua destilada 1.0 L 100.0 ml
Calentar el agua y disolver los componentes, ajustar el pH a 7.1 ± 0.1, vaciar 4 ml a tubos
de ensayo. Esterilizar a 121°C durante 15 min. Dejar enfriar.
4. Una vez concluido cada periodo de incubación (24 h y 5 días). Tomar el tubo
inoculado y el control, a los cuales se agrega 1 ml de solución A y 1 ml de solución
B (Sol. A y B, para reducción de nitratos).
Si no aparece el color rosa, adicionar polvo de zinc al tubo, el cual reaccionará con los
nitratos produciendo un color rosa, confirmando así que la prueba es negativa. Sin
embargo, si el color rosa no aparece, indica que la denitrificación ha sido completa y
la prueba se considera positiva.
Los tubos control verificarán cada paso de la prueba para evitar un error debido a la
absorción del ácido nitroso del aire.
H) Fermentación de Lactosa.
49
PROCEDIMIENTO 1. Producción de ácido a partir de carbohidratos (medio C de
Dye).
2. Los organismos que utilizan lactosa, cambiarán el color del medio a amarillo como
resultado de la presencia de ácido.
1. Preparar medio Levine EMB Agar (Difco: 37g/litro) ajustando el pH 7.1 ± 0.2 a 25°
C; esterilizar a 121-124° C/15 min./15 psi; y vaciar en placas.
4. Observar y registrar:
3. Inocular por estría en la superficie inclinada y por punción hacia el fondo del tubo
con TSI.
50
5. Observar y registrar:
Evento Resultado
PROCEDIMIENTO
2. Inclinar los tubos, procurando que la inclinación inicie a partir de la parte media del
tubo.
51
4. Inocular por estría en la superficie inclinada y por punción hacia el fondo del tubo
con TSI.
6. Observar y registrar:
Evento Resultado
Procedimiento
PROCEDIMIENTO
1L
NH4H2PO4 1.0 g
KCl 0.2 g
52
MgSO4.7H2O 0.2 g
Azul de bromotimol 1.0 ml
(1.6% w/v en etanol de 50 a 95%)
o bien, ...... 3.0 ml
(1.0% w/v en etanol de 50 %)
Agar 12.0 g
Agua destilada 1.0 L
Ajustar el pH a 7.2 ± 0.1 y esterilizar.
NOTAS:
Preparar medio sin fuente de carbono para utilizarlo como control negativo.
3. Tomar con un asa, una muestra del cultivo bacteriano y estriarlo sobre el medio.
(Para Enterobacterias...)
PROCEDIMIENTO.
1 L
NH4H2PO4 0.5 g
K2HPO4 0.5 g
MgSO4.7H2O 0.2 g
NaCl 5.0 g
Extracto de levadura 1.0 g
Púrpura de bromocresol 0.7 ml
(1.5% w/v en etanol 95%)
Agar 12.0 g
Agua destilada 1.0 L
53
Ajustar el pH a 6.8 y esterilizar.
NOTAS:
3. Tomar con un asa, una muestra del cultivo bacteriano y estriarlo sobre el medio.
5. Comparar el vire del indicador con el de las cajas o tubos control y registrar
resultados.
(Para Agrobacterium...)
PROCEDIMIENTO.
1 L
NH4H2PO4 1.0 g
KCl 0.2 g
MgSO4.7H2O 0.2 g
Extracto de levadura 1.0 g
Azul de bromotimol 1.0 ml
(1.6% w/v en etanol de 50 a 95%)
o bien .... 3.0 ml
(1.0% w/v en etanol de 50 %)
Agar 12.0 g
Agua destilada 1.0 L
54
Ajustar el pH a 7.1 ± 0.1 antes de adicionar el Agar.
NOTAS:
Esterilizar por autoclaveado y posteriormente adicionar por filtración la solución 10% (w/v)
de la fuente de carbono (eritritol, melezitosa o sacarosa) en una proporción de 1: 9 (fuente
de carbono : medio basal).
3. Tomar con el asa, una muestra del cultivo bacteriano y estriarlo sobre el medio.
55
PRÁCTICA No. 10
INTRODUCCION
Este método se lleva a cabo inoculando en una caja de petri estéril un volumen
dado de muestra, se mezcla con medio de cultivo fundido y frío y se deja solidificar. Cada
célula viva en el medio dará origen a una colonia visible. Se cuentan las colonias y se
estima el número de bacterias por milímetro o gramo de muestra. Este es uno de los
métodos más comúnmente usados y de los más exactos. Sin embargo se debe ser
cuidadoso para evitar errores por manipulación durante la dilución.
MATERIAL
10 ml de Muestra
2 Mecheros
4 Cajas petri estériles
3 Pipetas estériles de 1 ml
3 Tubos de ensayo estériles con 9 ml. de agua
Gradilla
PROCEDIMIENTO.
2.- Bajo condiciones asépticas realice las diluciones de la muestra 10 -1, 10-2, 10-3 (Figura
56
14).
3.- En una caja de Petri vierta 1ml. de la muestra concentrada y adicione de 10 a 15 ml. de
medio fundido frío, mezcle con movimientos circulares suaves. EL MEDIO NO DEBE
TOCAR LA TAPA DE LA CAJA. Etiquete.
4.- En las otras tres cajas vierta 1ml. de cada dilución (una dilución para cada caja) y
adicione de 10 a 15 ml. de medio fundido frío, mezcle con movimientos circulares
suaves. EL MEDIO NO DEBE TOCAR LA TAPA DE LA CAJA. Etiquete.
5.- Deje solidificar en una superficie plana, selle e incube a 37 ºC observando a las 24 y 48
hrs.
7.- Cuando observe crecimiento bacteriano (máximo a las 48 hrs) cuente el número de
colonias en un contador de bacterias.
CUENTA
Seleccione las placas en las que el número de colonias sea entre 30 y 300 (a veces se
realiza el conteo en placas de menos de 30 colonias). La cuenta se debe hacer por lo
menos en dos placas.
57
Ci = N x D x 10
D = dilución
Obtenga el promedio y este será el resultado del número de bacterias por mililitro de agua
sin diluir por la temperatura de incubación.
EJEMPLO:
Si cuenta 159 colonias en la placa con dilución 10-1, el número de colonias por
mililitro de agua sin diluir será: 1.59 x 10-3
INTERPRETACION
El número máximo de bacterias permitidas para una agua inocua no debe ser mayor a 100
x ml. a 37 ºC. Los microorganismos que normalmente se encuentran en el agua se
desarrollan mejor a 20ºC, los organismos coliformes a 37ºC. Si la cuenta total de las dos
temperaturas es aproximada, es muy probable que haya bacterias de los desagües. En las
cuentas habituales repetidas de una misma fuente tiene un valor definitivo la elevación
brusca del número total de bacterias, lo cual indica una contaminación súbita.
REPORTE
58
PRÁCTICA No. 11
INTRODUCCIÓN
Para determinar si una masa de agua puede ser utilizada o no con seguridad para
consumo humano (beber, preparar alimentos o aseo personal) es necesario hacer un
reconocimiento sanitario de la misma. Este reconocimiento incluye pruebas de laboratorio
tales como 1) examen microscópico; 2) análisis físico-químico y 3) análisis microbiológico.
La prueba convencional es la del Número Más Probable (NMP) la cual incluye una
reacción en tres etapas; la primera es la Prueba presuntiva, en donde la formación de gas
en caldo lactosa es indicadora de contaminación por bacterias coliformes fecales y no
fecales; la segunda es la prueba confirmativa, para realizarla es necesario transferir los
cultivos positivos resultantes en lactosa al medio verde brillante bilis que inhibe el
crecimiento de todas las especies formadoras de gas a excepción de los bacilos
coliformes y la tercera la prueba completa en la cual se demuestra que cultivos puros
aislados de colonias de tipo coliforme en las placas contienen bastones gram negativos no
formadoras de esporas que forman gas en caldo de lactosa
59
Para el recuento de coliformes se consultan las tablas donde se indica el número estima
de bacterias coliformes en 100 ml de agua, que corresponden a varias combinaciones de
resultados positivos y negativos en las cantidades utilizadas para los ensayos. Estas
tablas son básicamente las calculadas originalmente por McCrady con ciertas
correcciones debidas a cálculos más precisos de Swaroop.
El método que se utilizará en esta práctica es el Método Estándar de los EE:UU:, para el
cual se usan 15 tubos de fermentación, conteniendo cada uno de ellos 20 ml de caldo
lactosado al 0.5%. Se siembran con 5 x 10 ml, 5 x 1 ml y 5 x 0.1 ml de la muestra de agua.
Se incuban a 35ºC y se examinan comprobando la formación de gas tras 24 y 48 horas.
La presencia de gas en 48 horas es presunta evidencia de bacilos coliformes (Collins and
Lyne 1989)
MATERIAL
MÉTODO DE TRABAJO
PRUEBA PRESUNTIVA
2.- Coloque los tubos Durham invertidos dentro de los tubos con medio. NO DEBEN
FORMARSE BURBUJAS.
3.- Coloque los tapones a los tubos y esterilice a 15 libras durante 15 min.
60
4.- Cuando estén fríos agregue la muestra de la siguiente forma.
3 10
3 1
3 0.1
6.- Incube a 35ºC por 24 hrs. y observe si hubo formación de gas dentro de los tubos
Durham. En caso de que los resultados sean negativos incube por otras 24 hrs, revise
y anote la lectura.
7.- Para la lectura de los tubos elabore una tabla con la posición del tubo y la cantidad de
muestra inoculada, registrando positivo si se presenta formación de gas o negativos si
no se presenta formación de gas.
PRUEBA CONFIRMATIVA
1 Prepare tubos de fermentación con 10 ml. de caldo verde bilis brillante (de la misma
forma que los tubos con lactosa) por cada tubo positivo de la prueba anterior.
2.- Aquellos tubos que resulten positivos deberá resembrarlos en Verde Brillante bilis
transfiriendo 1 ml. a cada tubo.
3.- Incube a 35ºC durante 24 ºC y observe la formación de gas, aquellos que resulten
positivos regístrelos de la misma forma que la prueba anterior.
REPORTE
61
Tabla 1. Número más probable de bacterias
62
PRÁCTICA No. 12
INTRODUCCIÓN
Los hábitats de las bacterias, al igual que los de cualquier microorganismo, son
extremadamente diversos. Cualquier hábitat adecuado para los seres superiores, también
lo es para los microorganismos. En muchos lugares donde las condiciones ambientales
son extremas, no se encuentran organismos superiores, pero pueden existir
microorganismos variados. Algunas bacterias de las encontradas naturalmente en el
medio ambiente, son utilizadas en la industria o en proyectos ecológicos contra la
contaminación. En la naturaleza todos los microorganismos conviven en poblaciones
mixtas que interactúan entre sí, estableciendo relaciones de diferente grado de
complejidad. Estas relaciones pueden ser benéficas, perjudiciales o indiferentes,
repercutiendo sobre uno o sobre ambos microorganismos involucrados. Simbiosis
(mutualismo): hay beneficio para ambos organismos, ya sea entre dos microorganismos,
entre un microorganismo y un organismo superior, por ejemplo mamíferos rumiantes y
protozoarios, o como las bacterias fijadoras de nitrógeno asociadas con raíces de plantas
leguminosas. Comensalismo: en esta relación sólo uno de los organismos resulta
beneficiado y el otro no es afectado. Un ejemplo común lo constituyen los organismos
aerobios, que al consumir el oxígeno permiten el desarrollo de los anaerobios. Otro
ejemplo es en las cadenas de degradación orgánica, donde cada etapa es desarrollada
por un grupo diferente de organismos. Antagonismo: Una de las especies inhibe a la otra o
causa su muerte, por ejemplo en el caso de las bacterias productoras de antibióticos.
Sinergismo: Aquí la actividad cooperadora de dos organismos es mayor a la suma de las
dos actividades realizadas por separado.
MATERIAL
Suspensiones de dos aislado bacterianos de prácticas anteriores
Medio agar nutritivo
Medio ELMA
Medio agar tripticasa de soya
Asas bacteriológicas
Microscopio de disección
Azul de lactofenol
Hipoclorito de sodio
Agua estéril
Colorantes para la tinción de Gram
PROCEDIMIENTO
I. Comensalismo.
Entre dos bacterias:
1. Con un marcador divida a la mitad externamente, dos cajas con agar nutritivo.
63
2. Siembre la mitad de cada placa con un primer aislado y la otra mitad con el segundo
aislado.
3. Selle los bordes de la placa con celopack e incube a 32°C durante 24 horas y compare
el crecimiento en ambas cajas, sin quitar la cinta adhesiva. Vuelva a incubar hasta
completar 48 y 72 horas.
1. Elija raíces de buen tamaño de plantas leguminosas (frijol, trébol, alfalfa, otros),
eliminando el tallo y lávelas con agua. Separe en un vasito los nódulos más grandes,
cortando con un bisturí.
2. Cubra los nódulos con un poco de alcohol y agite con unas pinzas por 10 segundos.
Escurra y lleve el vaso al área de esterilidad del mechero y enseguida agregue agua
estéril agitando para enjuagar y escurra.
3. Cubra los nódulos con hipoclorito de sodio comercial (cloralex) al 5%, agitando con las
pinzas por 1 -3 min. Escurra y enjuague con agua estéril agitando. Repita el lavado tres
veces.
4. Transfiera los nódulos a un mortero estéril y agregue 5 gotas de agua estéril y triture
para favorecer la salida de las bacterias, de los nódulos.
5. Siembre una asada del material por estría cruzada, en placas de medio ELMA (extracto
de levadura-manitol-agar-rojo congo), e incube a 28°C de 3 a 7 días.
6. Seleccione una colonia blanca y mucosa y tiña con Gram. El Rhizobium es un bacilo
corto Gram negativo
7. Resiembre una colonia bien aislada en tubos del mismo medio para purificar la bacteria.
REPORTE
I.- Comensalismo: Mida el crecimiento de los aislados bacterianos. Distinga cuál es el
organismo beneficiado y cuál es el afectado.
64
PRÁCTICA No. 13
AISLAMIENTO DE RHIZOBIUM
INTRODUCCION
La fijación biológica de nitrógeno se efectúa solo por las bacterias, de las cuales el grupo
más importante es el género Rhizobium que infectan la raíz de las plantas leguminosas y
conducen a las formaciones de nódulos simbióticos que fijan el nitrógeno.
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
65
REACTIVOS CANTIDAD gr.
K2HPO4 0.5
MgSO4 0.3
NaCL 0.2
FeCl3 0.01
Extracto de levadura 0.5
Manitol 10
Agar 20
Colorante Rojo Congo al 0.25 %
c) Diluya 0.7 gr de rojo congo en 30 ml. de agua destilada tibia, filtre con papel
filtro fino y esterilice a 10 libras de presión.
3.- Esterilice el medio YEM y cuando esté frío (no permita que solidifique) añádale el rojo
congo y agitando suavemente.
4.- Vacié el medio a las cajas petri previamente esterilizadas y deje que solidifique.
5.- Corte los nódulos y lávelos quitando el exceso de tierra.
9.- Coloque los nódulos dentro de los tubos con agua y macháquelos con macerador.
10.- Tome una muestra con el asa, capturando una película, estrié la caja de petri con el
medio YEM.
REPORTE
66
PRÁCTICA No. 14
RESISTENCIA BACTERIANA
INTRODUCCIÓN
Podemos solucionar este problema con lo que llamamos remediación. Para definir este
término podemos decir que es el uso intencional de procesos de degradación químicos o
biológicos para eliminar sustancias contaminantes ambientales que han sido vertidas con
conocimiento o accidentalmente en el ambiente. Los procesos de remediación pueden
efectuarse in situ, o sea en el mismo lugar en el que ha ocurrido el derrame, o bien ex situ,
separando la porción contaminada y trasladándola a un reactor. Tal es el caso de
efluentes industriales o domiciliarios que se tratan previamente al vertido al medio
ambiente.
MATERIAL
3 tubos de ensaye con tapón estéril, con 5 ml. De agua (p/ muestras de
67
aceite). 1 tubo de ensaye con tapón (p/ caldo nutritivo).
8 cajas petri estériles, 4 pipetas estériles de 5ml, 1 pipeta estéril de
1ml. Muestra de aceite o solución de algún contaminante (10ml.)
Caldo y medio nutritivo
Mecheros, Gradilla, Asa bacteriológica, 4 matraces erlenmeyer de 250ml.
MÉTODO DE TRABAJO:
7. Una vez estéril el material, se esteriliza la mesa de trabajo y se prenden los mecheros,
mientras el material se enfría.
9. Se toma una asada de una colonia aislada con anterioridad en un tubo con medio de
cultivo inclinado (la colonia debe estar en la estufa a 37º para evitar un choque debido
a la diferencia de temperatura entre el caldo y el medio inclinado).
12. Al cabo de las 24 hrs. Sacar el material del refrigerador y poner a baño maría los
matraces y tubos con el medio.
13. Hacer los cálculos necesarios para obtener las concentraciones a trabajar de los
elementos a estudiar, considerando el uso de la sal más soluble disponible del metal
pesado. Considerar que la primera solución se hará en 10 ml de agua.
14. Dentro de la zona estéril, abrir el tubo de ensaye vacío y poner la sal ya pesada, abrir
el tubo que contiene agua y pipetear 10 ml, agitar y preparar las concentraciones a
usar en los matraces según los cálculos hechos anteriormente.
15. Disuelto el medio de los tubos, sembrar en cada uno 0.1 ml del caldo nutritivo
68
inoculado.
16. Poner en las cajas 10ml. de medio de cultivo, 2 con la concentración y el blanco,
pasando a cada caja aproximadamente la mitad del contenido de cada matraz.
Esperar a que solidifique.
17. Agregar el contenido de los tubos de ensaye, esperar a que solidifique, empaquetar e
incubar de 24 a 48 hrs. a 37ºC en espera de ver crecimiento de colonias.
18. Realizar el conteo bacteriano y aplicar la fórmula de CMI para reportar los valores de
resistencia bacteriana a la sustancia probada.
---------------------------------------------------------------------- X 100
REPORTE
CMI
69
PRÁCTICA No. 15
INTRODUCCIÓN
Un agente químico es una sustancia (sólido, líquido o gas) que se caracteriza por una
composición molecular definida y que causa una reacción. Por ejemplo, los compuestos
fenólicos, los alcoholes, los halógenos y sus derivados como el cloro, el bromo y el yodo:
los metales pesados y sus compuestos, los detergentes, los aldehídos y los quimio-
esterilizantes gaseosos como el óxido de etileno.
MATERIAL
Hisopos estériles
Antisépticos, limpiadores, comerciales y domésticos, colorantes, desinfectantes, jabones
Medio de cultivo (Agar nutritivo)
Cultivos de bacterias aisladas en prácticas anteriores
1 gr de suelo
Agua estéril
Solución salina fisiológica
Detergente o jabón antiséptico
Estufa de incubación
PROCEDIMIENTO
I. Actividad bacteriostática o bactericida de algunos compuestos químicos (incluyendo
antibióticos)
1. Siembre la superficie de una placa totalmente, por medio de un hisopo estéril
impregnado de una suspensión bacteriana. Cuide que no quede un espacio sin sembrar.
2. Distribuya varios círculos de papel impregnados con antisépticos, limpiadores
comerciales y domésticos, colorantes, desinfectantes, jabones, etc. Aproximadamente
cuatro círculos cerca de la orilla de la placa y uno en el centro. Deben ser los mismos para
las dos bacterias. En el caso de antibióticos, los círculos impregnados se obtienen
comercialmente.
70
3. Incube a 37°C por 24 horas, mida el radio de inhibición alrededor de cada círculo de
papel para cada compuesto y compare entre las dos bacterias probadas. Determine si hay
diferencias en el efecto de cada compuesto para las dos bacterias.
II. Efectividad del lavado de manos con detergente
1. Un primer estudiante se vacía unas gotas de suspensión de suelo (1gr de tierra fresca
obtenida por debajo de la superficie del suelo, en 9 ml de agua estéril) en la palma de la
mano derecha y la extiende en toda la superficie de la palma.
3. Con un hisopo estéril humedecido en solución salina fisiológica (s.s.f.) estéril se frota la
mitad de la palma de la mano usada en el saludo y se descarga el inóculo en la mitad de
una placa de agar nutritivo. Se repite la operación con el segundo estudiante y se siembra
en la mitad de otra placa nueva de agar nutritivo, y así sucesivamente con los otros
estudiantes.
REPORTE
Compare los resultados de las siembras de manos sin lavar y manos lavadas:
a).- cuantifique el número de colonias desarrolladas
b).- Describa la morfología colonial de las colonias diferentes
c).- Explique las diferencias en cada caso.
71
PRÁCTICA 16
PROCEDIMIENTO
2. Preparación de Agar. El Agar Muller Hinton es el más usado para este fin aunque
también puede realizarse en Agar Nutritivo (AN).
72
2. Preparar una suspensión acuosa densa de células bacterianas a partir de cultivos
jóvenes (24-48 h). Se recomienda que el cultivo se realice en el mismo medio de
cultivo en que se probará la sensibilidad al antibiótico.
73
PRÁCTICA No. 17
INTRODUCCION
Una de las razones por las cuales las bacterias del suelo pueden ser afectadas por los
herbicidas se debe a su carácter de organismos autotróficos y también porque ellas se
desarrollan principalmente sobre la superficie del suelo, donde la exposición a los
herbicidas es más probable.
MATERIAL
REPORTE
75
PRÁCTICA No. 18
Introducción
Existen bacterias anaerobias que solo pueden vivir en ausencia de oxigeno (anaerobias
estrictas), las cuales son especies propias de ambientes con poco oxigeno o que carecen
de él. Estos ambientes pueden ser intestinos de animales, suelos profundos, sedimentos
de cuerpos de agua (mar, lagos, lagunas) y pantanos; lugares donde el oxígeno está casi
ausente.
Las bacterias que producen metano forman parte de la población bacteriana que se
encuentran dentro del rumen de los organismos herbívoros. Estas baterías juegan un
papel importante en la regulación de la fermentación al reducir el CO 2 con el H2 gaseoso
y producir CH4. Las bacterias metanógenicas al mantener baja la concentración de H 2 en
el rumen mediante la formación de CH4, promueven el crecimiento de otras especies
bacterianas en el rumen y permiten una fermentación más eficaz. Dentro de las bacterias
metanogénicas se encuentran Methanobrevibacter ruminantium, Methanobacterium
formicicum y Methanomicrobium mobile.
Material:
Cámara de incubación
Matraz erlenmeyer de 1000 mL
Probeta de 500 mL
Mortero de porcelana
Tapón de hule
Manguera de plástico
Recipiente de plástico de boca ancha con tapa de rosca de 700 a 900 mL aprox.
Excretas frescas de vaca o borrego (inóculo- liquido ruminal)
76
Pasto, alfalfa o paja fresca (sustrato)
Envase térmico (hielera de unicel)
NaOH (5N)
Solución de NaCl (300 g/L)
77
7. Llenar la probeta de 500 mL con la solución de NaCl (300 g/L)
10. La unidad experimental se agitará una vez al día por un lapso de 10 segundos
12. Registrar el volumen de biogás diariamente (dos veces al día por una semana)
Reporte:
Elabora una tabla con las medidas de generación de gas diario por la fermentación de las
bacterias anaerobias estrictas. Explica el proceso de fermentación metanogénica por
estas bacterias
78
PRÁCTICA 19
INTRODUCCIÓN
Entre ellas, las técnicas que emplean enzimas marcadoras, conocidas como ensayos
inmunoenzimáticos. La sensibilidad de ELISA es superior a otras pruebas serológicas,
por lo que ha sido extensamente utilizada para la detección de patógenos en humanos,
animales y plantas.
79
determinar los resultados visualmente y cuantificarlos espectrofotométricamente por
medio de un lector de placas.
Reactivos
Materiales
Equipo
Balanza analítica
Parrilla de agitación magnética
Potenciómetro
Macerador de rodillos (opcional)
Macerador u homogeinizador de tejidos de columna vertical (opcional).
Balanza granataria
Incubadora
Lector de placas ELISA e impresora
Refrigerador (4 a 6 ºC)
Micropipetas (100 µl) (opcional: multicanal o unicanal)
80
PROCEDIMIENTO
Este, es un método general utilizado para la mayoría de los kits (AGDIA) para el
diagnóstico de virus y bacterias.
81
Albúmina de huevo, grado II ................... 2.0 g (0.2%)
Tween-20 ................... 20.0 g
Azida de sodio ................... 0.2 g
Ajustar a pH de 7.4
Nota: Almacenar a 4-6 ºC y usarse como máximo una semana después de su
preparación.
Nota: Esta solución amortiguadora debe ser preparada el mismo día en que se realiza la
prueba o usar hasta tres días después, pero debe ser almacenada a 4-6° C.
PROCEDIMIENTO GENERAL.
Los pasos para realizar la técnica serológica de ELISA-DAS, son los siguientes:
82
Nota: Antes de iniciar el ensayo de dicha técnica, es necesario realizar la revisión del
protocolo incluido con el kit adquirido; así como los componentes y las especificaciones
de preparación de los reactivos, enzimas o soluciones en caso de contenerlos, dado que
pudieran ser variables dependiendo del patógeno a diagnosticar.
A) Sensibilización de la placa.
e. Lavar con la ayuda de una pizeta que contiene PBS-T se llenan los pozos de la placa
de microtitulación y se vacían de inmediato, invirtiendo la placa sobre el lavadero.
Este proceso se repite 3-5 veces. El lavado elimina de la placa, la gammaglobulina no
adherida a ella.
f. Secar, golpeando con firmeza la placa de microtitulación sobre el papel secante hasta
eliminar completamente el PBS-T.
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(a) Adsorción del antígeno. Se agregan 100 microlitros de macerado
de tejido a un pozo de la placa. Debe utilizarse una micropuntilla para cada
muestra.
- Muestra y su duplicado,
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(a) Diluir el conjugado enzimático en un recipiente en la proporción conjugado:
SOLAM, señalada por el proveedor. Cuidar que se adicionen todos los
componentes del conjugado que proporciona el kit (en la mayoría de los casos
el conjugado consta de únicamente un bote, pero en algunos otros, viene en
dos recipientes, bote A y bote B.
(b) Agregar a cada pozo de la placa 100 microlitros (0.1 ml) del conjugado
diluido.
4. Las pruebas que resulten positivas deberán analizarse una segunda o tercera
vez, según el criterio del analista, para su confirmación.
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PRÁCTICA No. 20
OBJETIVO: Que el alumno conozca uno de los protocolos de PCR empleados para la
detección de begomovirus, virus de ADN, patógenos comunes en plantas.
INTRODUCCIÓN
Hoy en día las técnicas de biología molecular resultan ser altamente específicas para el
patógeno y también, altamente eficientes en la detección de las variantes virulentas.
PROCEDIMIENTO
Reactivos
MATERIALES
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Tubos para microcentrifugación de 1.5 – 2.0.
Tubos para PCR de 0.2 o 0.5 ml.
Espátula de acero inoxidable.
Papel aluminio.
Papel kraft.
EQUIPOS
PROCEDIMIENTO
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Adicionar 500 μl de cloroformo y mezclar por inversión.
Incubar a 37°C durante 30 min.
Agregar 1 ml de isopropanol (2-propanol) frío y mezclar por inversión para
favorecer la precipitación del DNA.
Centrifugaron las suspensiones a 14000 rpm a temperatura ambiente durante
10 min y después decantar el sobrenadante.
Agregar 1 ml de etanol 75% al material precipitado.
Centrifugar a 14000 rpm a temperatura ambiente durante 10 min y desechar el
alcohol por decantación.
El DNA precipitado se seca a temperatura ambiente y se adicionan 100 μl de
agua bidestilada estéril.
Las suspensiones se guardan a -20 °C hasta su uso.
Para la amplificación del DNA viral se empleará el protocolo de Wyatt y Brown (1996)
con los iniciadores degenerados prV 324(+) (5’GCCYATRTAYAGRAAGCCMAG3’) y
prC889(-) (5’GGRTTDGARGCATGHGTACATG 3’), que amplifican el gen de la
proteína de la capside de Begomovirus.
89
DNA total y 1.25 U de taq DNApol (Promega), en un volumen de reacción de
25 μl.
Amplificar el ADN bajos las condiciones térmicas: 94° por 2 min para una
desnaturalización inicial; 35 ciclos de 92° por 1 min, 60° por 20 seg y 72° por
30 seg para desnaturalización, alineamiento y extensión, respectivamente.
M1 M2
M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
M0 mpm
500 pb
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PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
CALDO NUTRITIVO: Disolver los siguientes reactivos en 100 ml. de agua destilada.
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PREPARACIÓN DE REACTIVOS
TINCIÓN SIMPLE
B. Lugol
C. Safranina
B. Safranina
A. Solución Mordiente
A. Carbofucsina
B. Alcohol-ácido
C. Azul de metileno
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BIBLIOGRAFIA
Rincón B., Borja R., Martín M.A., Martín A. 2009. Evaluation of the
methanogenic step of a two-stage anaerobic digestion process of
acidified olive mill solid residue from a previous hydrolytic-acidogenic
step. Waste Manage. 29, 2566-2573.
Schaad, N.W., Jones, J.B. y W. Chun (2001). Plant pathogenic bacteria. 3ra. Edición.
American Phytopathological Society. Minesota. p. 151-174.
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