1.

INTRODUCCIÓN Los microorganismos son seres vivos que solo pueden

visualizarse con el microscopio; se encuentran en todos lados: en el suelo, agua,
superficies corporales, alimentos e incluso en el aire. La mayoría son unicelulares
sin embargo también existen microorganismos multicelulares como algunas algas
u hongos, cabe mencionar que también los virus forman parte de los
microorganismos en el campo de estudio de la microbiología aunque no son
considerados seres vivos. Muchos microorganismos no son perjudiciales y juegan
un papel muy importante en la biosfera, dicho papel va desde fijar el nitrógeno para
poder ser absorbido por las plantas hasta descomponer materia orgánica y
transformarla para su reabsorción en la naturaleza; algunos microorganismos son
patógenos, por esta y muchas razones más, su estudio es de gran importancia. La
supervivencia y crecimiento continuo de microorganismos depende de un
suministro adecuado de nutrientes y un ambiente favorable para su crecimiento.
Un medio de cultivo es una solución que contiene los nutrientes necesarios para
permitir el crecimiento de microorganismos, en condiciones favorables de pH y
temperatura. Existen 3 tipos de medios de cultivo según sus cualidades físicas:
líquidos, semisólidos y sólidos. Un medio liquido carece de un agente solidificante
y se denomina caldo de cultivo; si a un caldo se le adiciona un agente solidificante
como agar, se forma un medio semisólido o sólido. Para esta práctica sólo se
utilizaron medios sólidos de agar, por lo que no nos adentraremos en los medios
de cultivo líquidos o semilíquidos. Sembrar o inocular es introducir artificialmente
una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de promover
intencionalmente el desarrollo de éste, en medios de cultivo y condiciones
favorables de laboratorio controladas. La población de microorganismos
desarrollada en un medio de cultivo se denomina cultivo, cuando el cultivo contiene
una sola especie de microorganismo se denomina cultivo puro o axénico; cuando
contiene más de una especie se denomina cultivo mixto: en un cultivo mixto viven
muchas y diferentes especies de microorganismos en forma conjunta. Un cultivo
axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio, y para su obtención se deben
tomar precauciones especiales como asegurarse de trabajar en un ambiente de
asepsia ya sea en una campana de flujo laminar o cerca de la flama de un
mechero (los microorganismos se encuentran en todas partes y pueden
contaminar nuestra muestra si no se trabaja con precisión). Existen varios métodos
de siembra de microorganismos, para nuestra practica utilizamos el método de
siembra por estría en placa y el método de extensión en placa. El método por
estría es el más fácil y el más utilizado para obtener cultivos axénicos, para ello
con un asa se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen
estrías sobre la superficie de un medio sólido, conforme se van haciendo estrías en
zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos
microorganismos los cuales quedan separados e inmovilizados; después se flamea
el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se
continúa la siembra con la misma técnica en la
2. 3. superficie sin sembrar; repitiendo este proceso se logra aislar células
individuales, a continuación las placas se incuban permitiendo que las células
aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias
visibles. A continuación se muestra una imagen de la forma en la que hicimos
nuestro estriado para esta práctica: En el método por extensión en placa, las
células microbianas se diluyen en forma seriada antes de su siembra, las muestras
diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar y se
extienden con ayuda de un asa de Drigalsky de cristal estéril, para esterilizarlas se
sumergen en alcohol y se flamean antes de tener contacto con la muestra diluida.
A partir de colonias separadas suficientemente, es posible obtener un cultivo puro
de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original. El éxito del
aislamiento, depende de la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra.
Cabe mencionar que una vez realizado el cultivo se puede analizar la morfología
de las colonias obtenidas:
3. 4. OBJETIVO Identificar y aprender los métodos para cultivar microorganismos y la
importancia de éstos para su aislamiento e identificación. MATERIALES Cepas
activadas de E. coli, Salmonella, S. aureus, Pseudomonas aeruginosa Tubos
c/diluyente de peptona (DP) c/5 mL c/u Asa calibrada Placas de Agar soya
Tripticaseína (AST) Varillas de vidrio estériles Incubadora de 35° Placas de Agar
Eosina Azul de Metileno (EMB) Asas calibradas y rectas Alcohol 70% Placas de
Agar Sangre (AS) Micropipeta de 1 y 0.1 mL 3 asas de Drigalsky Placas de Agar
Verde Brillante (AVB) Hisopos estériles con aplicador de madera 3 tubos de
ensayo con tapón de rosca. Placas de Agar Baird Parker (ABP) Puntas
p/micropipeta de 1 mL y de 0.1 mL estériles 1 mechero bunsen Placas de Agar
Pseudomonas F (AP) Baño maría METODOLOGÍA Pasos para sembrar
microorganismos por el método de siembra por estría en caja de Petri. 1. Prender
el mechero bunsen 2. Destapar la caja de Petri cerca del mechero Fisher 3.
Flamear el asa hasta que se ponga al rojo vivo, dejar enfriar, tomar muestra con la
punta del asa 4. Ya con la muestra, estriar aproximadamente ¼ de la superficie
total del agar; las estrías deben ser varias y muy juntas. 5. Flamear el asa
nuevamente 6. Jalar 2 estrías de la primera parte y proceder con el estriado a un
lado esta vez ya sin tocar las primeras estrías, las estrías deben ser menos y estar
más separadas que la primera vez. 7. Proceder con el estriado de la siguiente
parte sin flamear el asa. Las estrías deben ser menos y estar más separadas que
la segunda vez. 8. Estriar la última parte del agar tener en cuenta que deben estar
más separadas y ser menos en cantidad a la tercera vez. El agar debe verse de la
siguiente manera:
4. 5. 9. Tapar la caja de Petri, escribir los datos necesarios (nombre del
microorganismo, nombre del medio, dilución de la muestra (si la hay), nombre del
grupo y fecha), voltear y proceder a incubar por 48 horas. 10.Hacer este
procedimiento para el agar soya tripticasa y agar pseudomonas con agua de
tortuga, para el agar verde brillante utilizar la muestra de tierra, y para el agar
eosina azul de metileno utilizar muestra de heces fecales. Pasos para sembrar
microorganismos usando el método por extensión en caja de Petri. 1. Tomar la
muestra nasal o bucofaríngea con ayuda de un hisopo estéril y diluir en un tubo de
ensayo con tapón de rosca. Agitar. 2. Prender el mechero bunsen 3. Poner las
asas de Drigalsky en un vaso de precipitado con alcohol 4. Calibrar una
micropipeta para tomar 100µL de muestra 5. Abrir la caja de puntas para
micropipetas cerca del mechero, tomar una punta y proceder a tomar 100µL de la
muestra ya diluida 6. Abrir la caja de Petri cerca del mechero 7. Poner los 100 µL
encima del agar y volver a tapar la caja de Petri. 8. Flamear el asa de Drigalsky 9.
Abrir la caja de Petri nuevamente y extender la muestra en toda la superficie del
agar con el asa de Drigalsky hasta que seque. 10.Tapar la caja de Petri, escribir
los datos necesarios, voltear y proceder a incubar por 48hr. 11.Hacer este
procedimiento con el Agar Sangre y con el Agar Baird – Parker utilizar la misma
muestra nasal o bucofaríngea para los dos. Cabe mencionar que existen otros
métodos para la siembra por estrías, aquí hay otro ejemplo de estrías:
5. 6. Diagrama de flujo para la siembra de microorganismos por método de estrías y
por el método por extensión en caja de Petri. Inicio Tomar las muestras a sembrar
en los medios de cultivo de la práctica anterior; diluir según sea el caso Prender el
mechero bunsen Destapar caja de Petri cerca del mechero Método por estrías
Tomar 100µL de muestra previamente diluida y agitada Flamear el asa Tomar
muestra Método por extensión en placa Abrir la caja de puntas para micropipetas
cerca del mechero y tomar una Calibrar micropipeta a 100µL Vaciar la muestra en
la caja de Petri Poner las asas de Drigalsky en un vaso de precipitado con alcohol
Estriar la cuarta parte de la superficie aproximadamente Si Si No No Estriar el resto
de la superficie teniendo en cuenta que cada vez las estrías deben ser menos y
más separadas Jalar 2 estrías de la primera parte Flamear el asa de Drigalsky y
extender la muestra en la superficie del agar hasta que seque Tapar la caja de
Petri, escribir los datos, voltear y proceder a incubar por 48 hr.Fin
6. 7. RESULTADOS Referencia MEDIO DE CULTIVO CEPA DE REFERENCIA # DE
COLONIAS COLOR BORDE ELEVACIÓN TAMAÑO AST – Agar soya tripticasa
Salmonella 1 Crema traslucido Regular Plana >1mm – 3mm VB – Agar verde
brillante Salmonella 2 1. Rosa cremoso traslucido 2. Amarillo cremoso opaco 1.
Regular 2. Irregular 1. Plana 2. Elevada 1. >1mm – 3mm 2. 1mm – 2mm EMB –
Agar eosina azul de metileno Escherichia Coli 1 Morado cremoso opaco Regular
Plano convexa 1mm – 2mm AS – Agar sangre Staphylococcus Aureus 1 Blanco
opaco Puntiforme Convexa >1mm – 2mm AP – Agar pseudomonas Pseudomonas
1 Crema traslucido Circular Plano convexa >1mm a 5mm ABP – Agar Baird Parker
Staphylococcus Aureus 1 Negro opaco Puntiforme Convexa >1mm – 1mm Muestra
1 – Rebeca MEDIO DE CULTIVO ORIGEN DE LA MUESTRA # DE COLONIAS
COLOR BORDE ELEVACIÓN TAMAÑO AST – Agar soya tripticasa Agua de
tortuga 2 1. Blanco opaco 2. Crema traslucido 1. Irregular 2. Regular 1. Plana 2.
Elevada 1. >1mm – 16mm 2. 1mm – 5mm VB – Agar verde brillante Agua de
tortuga 2 1. Amarillo verdoso traslucido 2. rojo traslucido 1. Regular 2. Regular 1.
Plana 2. Plano convexa 1. >1mm – 2mm 2. >1mm EMB – Agar eosina azul de
metileno Heces fecales de animal 1 Rosa opaco Circular Convexa >1mm – 2mm
AS – Agar sangre Nariz 1 Blanco opaco Circular Plana >1mm – 4mm AP – Agar
pseudomonas Tierra 1 Crema traslucido Circular Plano convexa >1mm a 3mm
ABP – Agar Baird Parker Nariz 1 Negro opaco Puntiforme Convexa >1mm
7. 8. Muestra 2 – Marina MEDIO DE CULTIVO ORIGEN DE LA MUESTRA # DE
COLONIAS COLOR BORDE ELEVACIÓN TAMAÑO AST – Agar soya tripticasa
Agua de tortuga 4 1. Crema opaca 2. Crema opaca 3. Crema opaca 4. Crema
traslucida 1. Irregular 2. Irregular 3. Regular 4. Regular 1. Plana 2. Plano convexa
3. Convexa 4. Convexa, rugosa en el centro 1. 5mm 2. 7mm 3. 4mm 4. 1mm VB –
Agar verde brillante Agua de tortuga 3 1. Amarillo opaco 2. Naranja traslucido 3.
Amarillo traslucido 1. Regular 2. Regular 3. Regular 1. Convexa 2. Plana 3. Plana
1. 2mm 2. 1mm 3. 1.5mm EMB – Agar eosina azul de metileno Heces fecales de
animal 1 Rosa opaco Regular Convexa >1mm AS – Agar sangre Garganta 2 1.
Cremosa traslucida 2. Crema opaca 1. Irregular 2. Regular 1. Convexa 2. Convexa
1. >1mm 2. 1mm AP – Agar pseudomonas Tierra 3 1. Opaca verdosa 2. Crema
traslucida 3. Verde opaca 1. Regular 2. Irregular 3. Regular 1. Convexa 2. Plana 3.
Convexa 1. 3mm 2. 3mm 3. 4mm ABP – Agar Baird Parker Garganta 1 Gris oscuro
Regular Convexa >1mm Muestra 3 – Juana MEDIO DE CULTIVO ORIGEN DE LA
MUESTRA # DE COLONIAS COLOR BORDE ELEVACIÓN TAMAÑO AST – Agar
soya tripticasa Agua de tortuga 2 1. Crema 2. Amarillo opaco 1. Circular 2. Circular
1. Plana 2. Plana 1. 9mm 2. 4mm VB – Agar verde brillante Agua de tortuga 3 1.
Amarillo 2. Rojo 3. Anaranjado 1. Regular 2. Regular 3. Circular 1. Plana 2. Plana
3. Plana 1mm EMB – Agar eosina azul de metileno Heces fecales de animal 1
Negro Circular Plana 2mm AS – Agar sangre Garganta 1 Amarillo cremoso Circular
Plana 1mm AP – Agar pseudomonas Tierra 1 Crema Circular Plana > 1mm ABP –
Agar Baird Parker Garganta 2 1. Negro 2. Gris 1. Circular 2. Fusiforme 1. Plano
convexa 2. Plano convexa 1mm
8. 9. 1. Separar los medios de cultivo a utilizar 2. Con un hisopo estéril tomar una
muestra nasal y sumergir en un tubo de ensayo con disolución 3. Agitar el tubo de
ensayo para desprender los microorganismos del hisopo 4. Poner las asas de
Drigalsky en un vaso de precipitado con alcohol 5. Calibrar la micropipeta a 100µL;
abrir la caja de puntas para micropipeta cerca del mechero y tomar una 6. Tomar
100µL de la muestra diluida
9. 10. 7. Vaciar la muestra a la caja de Petri 8. Flamear el asa de Drigalsky 9.
Extender la muestra en la caja Petri con ayuda del asa de Drigalsky hasta que
seque. Tapar y voltear 10.Flamear el asa calibrada para siembra en estrías
11.Tomar muestra 12.Abrir caja de Petri y estriar de la forma como fue explicado
10. 11. 13.Tapar, voltear e incubar por 48 hr. 14.Observar la morfología de las colonias
obtenidas 15.Describir las morfologías diferentes y reportar resultados DISCUSION
DE RESULTADOS La siembra en cajas Petri nos permite cultivar microorganismos
gracias a que contiene los nutrientes necesarios para su desarrollo. El crecimiento
 de los microorganismos se manifiesta de formas diferentes dependiendo de la
técnica utilizada para su siembra y del tipo de medio en el que se realizó dicha
siembra, de esta forma es posible obtener características morfológicas distintas
cuando se realizan siembras de una misma muestra en diferentes medios de
cultivo o viceversa, esto queda mejor explicado en los resultados que obtuvimos en
la morfología colonial de nuestro agar verde brillante en el cual se observó que
algunas colonias tenían un color amarillo verdoso y otras eran rojas, esto se debe
a que dicho agar tiene colorantes que nos permiten diferenciar las bacterias
fermentadoras de lactosa de las no fermentadoras de lactosa; las formas
observadas fueron variadas (regular, puntiforme, circular e irregular) y en cuanto a
elevaciones tuvimos planas, elevadas, planoconvexas y convexas.
11. 12. CONCLUSIÓN El desarrollo de colonias formadas a partir de los métodos
realizados por estrías y por extensión en placa difieren en forma, borde, elevación,
superficie y estructura interna, lo cual es notablemente influenciado por las
concentraciones de carga microbiana del medio en el cual dichas colonias se
desarrollaron así como por el mismo medio de cultivo, por eso inclusive en
nuestras cepas de referencia la salmonella se visualizó con algunas diferencias
morfológicas cuando se cultivó en agar soya tripticasa y en agar verde brillante. En
general aprendimos a sembrar microorganismos por dos métodos diferentes
obteniendo resultados satisfactorios. También aprendimos a describir la morfología
de las colonias que obtuvimos así como compararlas con las cepas de referencia
que se nos proporcionó; tuvimos un poco de dificultad para la siembra por estrías
en el agar eosina azul de metileno debido a que el agar estaba muy suave sin
embargo aun así pudimos realizar 2 de 3 siembras satisfactoriamente.
BIBLIOGRAFÍA Biología de los microorganismos – Michael T. Madigan, John
Martinko, Jack Parker – Editorial Pearson Intro. a la Microbiología – Gerard J.
Tortora – Editorial Medica Panamericana