Microbiologia General

Trimestre 16-P
8. Cinética microbiológica
CRECIMIENTO MICROBIANO
 Aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de
los microorganismos   en el número de células o en la
masa celular

 El crecimiento de una población se mide a través de:

 Cuenta directa: microscopio
 Número de células
Métodos  Cuenta en placa: solo células viables
directos  Peso seco: filtración, centrifugación
 Masa celular
 Turbidez: DO de una suspensión de células

 Consumo de sustratos  azúcares

 Formación de productos  CH4, etanol

Métodos
 Métodos cinéticos  Respirometría (O2/CO2)
indirectos
 Componentes celulares  ác. nucleicos, proteínas, lípidos, ATP
 Actividades enzimáticas  deshidrogenasa
Estimación de CRECIMIENTO
La selección de un método para cuantificar el crecimiento
microbiano, depende de:

 Propiedades de la biomasa (bacterias, hongos)

 Propiedades del medio de cultivo
 Sensibilidad requerida
 Confianza del método
 Velocidad necesaria
Métodos de crecimiento
 Medida del número de células
 Cuenta directa al microscopio: conteo de células totales 
cámaras especiales para conteo

 Cuenta en placa: conteo solo de células viables

Masa celular  número de células

 se puede estimar uno para
conocer el otro

 Medida de la masa celular

 Peso seco: se recupera la biomasa del medio de cultivo, se
seca y se pesa (filtración, centrifugación)

 Turbidez: cuantificación de la DO de una suspensión de células

 curva patrón con número conocido de células
Cámaras de recuento
 Cámara de Neubauer

Cálculo de no. de células/mL:

X células x 25 cuadros x 104 x

FD [=] número/cm3

1 mm
0.2 mm
Cámaras de recuento
 Ventajas:
 Conteo rápido de microorganismos

 Limitaciones:
 No se distinguen las células muertas de las vivas
 Células pequeñas son difíciles de distinguir
 Se requiere tiempo y habilidad
 Se requiere un microscopio de contraste de fases si las
células no están teñidas
 No es buen método para suspensiones muy diluidas (< 106
células/mL)
Cuenta en placa
 Fundamento: cada célula viable forma una colonia  UFC: se
cuantifica el número de células a través del conteo de colonias

 Ventaja: solo se cuentan las células viables  las que pueden

reproducirse (dividirse)

 Dos técnicas (medios sólidos):

 Siembra en superficie  ≤ 0.1 mL de muestra sobre la superficie del

medio
Colonias superficiales

 Vertido en placa  0.1 - 1.0 mL de muestra en la caja, se vierte el medio

fundido (~45°C) y se homogeneiza
Colonias sub-superficiales
Colonias superficiales
Cuenta en placa: DILUCIONES SERIADAS
 En los métodos de conteo en placa, el número de colonias:
 No debe ser muy alto  para poder contarlas
No. colonias
 No debe ser muy bajo  para que tenga significado
estadístico  30 - 300

de caldo

Muestra
a contar 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

 Normalmente no se conoce el
número de microorganismos
viables  diluciones 
usualmente seriadas
Incontable
Cuenta en placa: DILUCIONES SERIADAS
Turbidimetría
 Método más rápido (espectrofotómetro)
 Turbidez en una suspensión celular  las células dispersan la luz 
se cuantifica la luz transmitida
 No. de células  DO (turbidez)   número
de células   turbidez (DO)

 Desventaja: problemas asociados al medio de

cultivo y a la presencia de partículas

GRAVIMETRÍA
 Se cuantifica el peso seco de una muestra
 Filtración (< 0.2 μm) de la suspensión de BM  secado  peso BM
 Centrifugación  secado  peso del precipitado
 Desventaja: incluye microorganismos muertos, materia orgánica,
polímeros extracelulares
8. Cinética microbiológica
CRECIMIENTO
Incremento ordenado de todos los constituyentes
químicos de los microorganismos  aumento en la
masa microbiana o en el número de células
FASES DE CRECIMIENTO
Fases de crecimiento
Exp Estacionaria Muerte
Crecimiento

Cultivo en
lote o “batch”

Tiempo

 Lote (batch): el medio NO se renueva  crecimiento en un

volumen fijo que se altera continuamente por el crecimiento
microbiano

 Continuo: el medio se renueva constantemente  número de

células y estado metabólico constantes  estado de equilibrio
CULTIVO EN LOTE (FASES DE CRECIMIENTO)

Adaptación o latencia: fase Lag

 Los microorg. adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones

ambientales  se prepararan para reproducirse
 Esta fase se puede reducir/evitar:
 Inoculo lo más activo posible  fase exponencial de
crecimiento
 Medio de crecimiento de inoculo  parecido al medio de prod.
CULTIVO EN LOTE (FASES DE CRECIMIENTO)

Exponencial: fase Exp

 Condiciones óptimas para el
crecimiento  los microorg.
crecen y se multiplican 
aumento logarítmico

 La tasa de crecimiento es máxima y el tiempo de duplicación (td)

es mínimo
dx/dt = µx

 La fase Exp no puede durar indefinidamente  p. ej.:

 Si una bacteria con un td de 20 min crece a esa velocidad por 48 h 
población equivalente a 4,000 veces el peso de la Tierra (peso de una
bacteria: 10-12 g)
CULTIVO EN LOTE (FASES DE CRECIMIENTO)

Fase estacionaria
 El cultivo está limitado por
nutrientes y/o por
acumulación de productos

 Tasa de crecimiento = Tasa de muerte

dx/dt = 0

Fase de muerte
 Generalmente también es logarítmica, pero más lenta que el
crecimiento Exp

 Tasa de muerte > tasa de crecimiento

dx/dt = -kx
CULTIVO CONTINUO
 Quimiostato*: tipo más común de cultivo continuo 
control de la densidad de población y la tasa de
crecimiento del cultivo

 Elementos para su control:

Regulador
Medio
 Tasa de dilución  adición fresco
de flujo
de medio fresco a un flujo Aire/gas
constante estéril
Espacio
con aire
 Nutriente limitante  Reactor
nutriente esencial (C/N) en
cantidad limitada
Cultivo

*Permite mantener la población celular

en fase Exp por largos periodos
Efluyente
con
células
CULTIVO CONTINUO
 Tasa de dilución  controla la tasa de crecimiento

   el microorganismo no crece suficientemente rápido

para igualar la tasa de dilución: lavado

   una parte de la población muere por falta de nutrientes

 [nutriente limitante]  controla la Densidad celular (biomasa)

densidad celular (células/mL)

 [Nutriente] limitante   
densidad celular Tiempo de duplicación

Concentración de sustrato

Tasa de dilución
8. Cinética microbiológica
DEFINICIONES
 Crecimiento: incremento ordenado de los
constituyentes químicos de los microorganismos   en
el número de células o en la masa celular

 Tasa de crecimiento: cambio en el número de células o

masa celular por unidad de tiempo

 Tiempo de duplicación (td): tiempo necesario para que a

partir de una célula se formen dos (para que una célula se
duplique)

 Número de generaciones (n): número de divisiones

celulares en un determinado tiempo = generaciones
8. Cinética microbiológica
Crecimiento exponencial
Durante la fase exponencial  incremento de la
población en el que el número de células se duplica cada
cierto tiempo
Tiempo (h) No. células
1 0 1
td
0.5 2
2 1.0 4
td 1.5 8
2x2 2.0 16
td 2.5 32
3.0 64
3.5 128
2x2x2
4.0 256
4.5 512
1  21  22  23  24  ...  2n 5.0 1,024

td = tiempo de duplicación
Crecimiento exponencial
Representando lo anterior en forma gráfica:

4000

3000
Si td es constante el
crecimiento es
2000

exponencial 1000

0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

td td td td
1  2  2x2  23  ...  2n x = número o masa de individuos
td = tiempo de duplicación
n = número de divisiones celulares en un
x = x0 2n determinado tiempo = generaciones
 Crecimiento exponencial
 Obtener información sobre la tasa de crecimiento a partir de
curvas aritméticas es difícil  escala logarítmica (línea recta):
 Fácil uso  podemos estimar tiempos de duplicación (td) a
partir de resultados experimentales

18000 10.0

15000 8.0
x (No. de células)

12000
6.0
9000

ln (x )
4.0
6000 m = 0.693/td
3000 2.0

0 0.0
0 2 4 6 8 0 2 4 6 8
Tiempo (h) Tiempo (h)
TIEMPO DE DUPLICACIÓN
El número de veces que se duplica la biomasa en un cierto
tiempo esta dado por:
Donde:
n = t/td  n = número de generaciones
t = tiempo de la fase Exp
td = tiempo de duplicación

La concentración de biomasa después de un tiempo de crecimiento

exponencial puede cuantificarse, en función de la biomasa inicial, a
través de:

x = x0 2n  Donde:
x = número final de células

x = x0 2t/td 
x0 = número inicial de células
TIEMPO DE DUPLICACIÓN
Con base en la Ec. ❸, si conocemos las poblaciones inicial y
final, podemos calcular el número de generaciones (n) y el
tiempo de duplicación (td)  para expresar la Ec. ❸ en
términos de n:

x/x0 = 2t/td
ln (x/x0) = ln2 (t/td)

ln (x/x0) = 0.693 (t/td)

0.693 t ln x – ln x0 0.693
ln x + ln x0  =
= td t td
Ec. de una línea recta
ln x – ln x0
 t/td = n = 
0.693
TIEMPO DE DUPLICACIÓN:
EJEMPLO 1
Con n expresado en términos de parámetros cuantificables (x y x0),
puede calcularse el tiempo de duplicación (td). P. ej.:
Calcula el td de un cultivo, considerando que:

x0 = 5 x 107 células
ln x – ln x0


x = 5 x 108 células t/td = n =

0.693


 t=6h
20.0 – 17.7
t/td =
0.693

t/td = 3.3  td = t/3.3  td = 6 h/3.3 = 1.8 h

TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 2
A partir de una tabla de datos: número de t (h) x (células) ln x
células vs. tiempo 0 10 2.3
0.5 10 2.3

 Podemos calcular td de una gráfica semi- 1.0 10 2.3

logarítmica durante la fase Exp (crecimiento 1.5 15 2.7

exponencial)
2.0 30 3.4
2.5 60 4.1
3.0 120 4.8
 En donde la pendiente (m) = 0.693/td 3.5 240 5.5

0.693 t
4.0 480 6.2

ln x = + ln x0 4.5 960 6.9

td 5.0 1920 7.6

5.5 3840 8.3

y = mx + b 6.0 7680 8.9

6.5 15360 9.6
25000 12 7.0 20200 9.9
20000 10 7.5 21000 10.0
8.0 20800 9.9
x (No. de células)

8
15000

8.5 20650 9.9

6
ln (x)

10000
4
5000
2
9.0 18400 9.8
0 0 9.5 14350 9.6
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
Tiempo (h) Tiempo (h) 10.0 10250 9.2
TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 2

 Pendiente = m = 1.386 12

Entonces, cómo
10

calculamos td?: 8

ln (x)
m = 0.693/td
m = 0.693/td
4

2
1.386 = 0.693/td 0

td = 0.693/1.386
0 2 4 6 8 10
Tiempo (h)

td = 0.5 h
TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 3
Se desea propagar un cultivo de Escherichia coli, cuyo tiempo
de duplicación es de 20 min, estime:

 El número de generaciones de E. coli después de 10 h

de fase Exp

 El número de células producidas si el medio se inocula

con una célula, suponiendo que la fase Exp no termina
1. Convertir td a horas o t a minutos
20 min 1h
td (h) = = 0.33 h
60 min

ln x – ln x0
2. Cálculo del número de generaciones (n) t/td = n =
0.693

n = t/td  n = 10 h/0.33 h  n = 30.3

TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 3
3. Cálculo del número de células producidas (x) si se inocula
con 1 célula (x0)

 Usando las ecs. (2) o (3): x = x0 2n x = x0 2t/td

x = 1 * 230.3
x = 1.3 x 109 células

ln x – ln x0
 Usando la ec. (4): t/td = n =
0.693
ln x – ln (1)
30.3 =
0.693

ln x - 0 = 30.3(0.693) ln x = 20.9 x = exp(20.9)

x = 1.3 x 109 células

TIEMPO DE DUPLICACIÓN: ejemplos
Temperatura Tiempo de
Microorganismo
(°C) duplicación (min)
Bacillus stearothermophilus 60 11
Escherichia coli 37 20
Bacillus subtillis 37 27
Streptococcus lactis 37 30
Pseudomonas putida 30 45
Lactobacillus acidophilus 37 75
Mycobacterium tuberculosis 37 360
Bradyrhizobium japonicum 25 400
Anabaena cylindrica
25 840
(cianobacteria)
Treponema pallidum
37 1980 (33 h)
(espiroqueta)
8. Cinética microbiológica

µ
Tasa de crecimiento específica
 Tasa específica de crecimiento = μ

 μ es la tasa (velocidad) a la cual una población microbiana se

duplica en un tiempo determinado (fase Exp)

 μ está definida por:

Δx 1 1 dx
μ= =
Δt x x dt
Tasa de crecimiento específica
En una gráfica aritmética de x vs. tiempo:

μ = pendiente entre 2 puntos  el no. de t (h) x (células)

células promedio en esos 2 puntos 0 1
0.5 2
y2 - y1
 Pendiente: m=
1.0 4
x2 - x1 1.5 8

4 - 2 (células) 4 células
m = =
250

1.0 - 0.5 (h) h 200

x (No. de células)
 No. células promedio:
150

100

(2 + 4)/2 = 3 células 50

Fase Exp
0
0 1 2 3 4 5
Tiempo (h)

 μ
4 (células/h)
= μ = 1.33 h-1
3 células
Tasa de crecimiento específica
De acuerdo con lo anterior:

Δx 1 1 dx OJO: t  tiempo que

μ= =
Δt x x dt dura la fase exponencial

Despejando dx/x:
dx dx = x0  x
= μ dt si integramos:
x dt = t0  t
 
x
ln x - ln x0 = μ t ln = μt x = x0 eµt
x0

Y, con base en el crecimiento Exp:

0.693 t
ln x = + ln x0 0.693
td La pendiente (m) = μ μ = 
td
y = mx + b
Tasa de crecimiento específica
 Para corroborar que µ en el ejemplo 1 sea correcta:
 Con la ec. (8) 0.693
µ = µ = 1.33 h-1
td

 Despejamos td:

0.693
td (h) = td = 0.5 h
1.33 h-1
8. Cinética microbiológica
PROBLEMA 1
Si la concentración celular al inicio de la fase Exp en un
cultivo es de 1 x 104 cel/mL y después de 4 h de crecimiento
Exp hay 1 x 108 cel/mL. Calcular:
a) La tasa específica de crecimiento (m)
b) El tiempo de duplicación (td)
c) El número de generaciones (n)

 Datos:  Para calcular (a), podemos usar la

 x0 = 1 x 104 cel/mL
 x = 1 x 108 cel/mL
 t=4h
ec. (6):
ln (1 x 104) = 9.2
ln x - ln x0 = µt
ln (1 x 108) = 18.4

(18.4 - 9.2)/4 [h] = µ

µ = 2.3 h-1
PROBLEMA 1
 Para calcular (b), usamos la ec. (8): 0.693
µ =
td
0.693
td (h) = td = 0.3 h
2.3 h-1

 Para calcular (c), usamos la ec. (4): ln x – ln x0

n=
0.693

18.4 - 9.2
n= n = 13.3
0.693
PROBLEMA 2
Un fermentador que se inocula con 2 x 106 cel/mL inicia su
fase de crecimiento Exp después de 2 h. ¿Cuánta biomasa se
produce después de 12 h si la bacteria tiene un td de 3.5 h y la
fase Exp no termina?
 Datos:  Para calcular x, primero necesitamos
 td = 3.5 h calcular m  ec. (8):

 x0 = 2 x 106 cel/mL 0.693

µ =
 t = 12 – 2 [h] = 10 h td

 x=? 0.693
µ (h-1) = µ = 0.2 h-1
3.5 h

 Calculamos x con las ecs. (6) o (7): x = x0 eµt

x = (2 x 106 cel/mL) e(0.2*10) x = (2 x 106 cel/mL) * (7.4)

x = 1.5 x 107 cel/mL

PROBLEMA 3
La bacteria Streptococcus lactis tiene un tiempo de
duplicación de 0.5 h a 37°C. Si se inoculó un fermentador con
1 x 108 células/mL ¿Cuánta biomasa se producirá después de
300 min de crecimiento Exp?

 Datos:  Primero tenemos que pasar TODO

 td = 0.5 h a las mismas unidades:
 x0 = 1 x 108 cel/mL 300 min 1h
=5h
 t = 300 min 60 min
 x=?

 Podemos calcular x con la ec. (2), pero x = x 0 2n t/td = n

primero necesitamos calcular n

n = 5 h/0.5 h n = 10
PROBLEMA 3
 Sustituimos n en la ec. (2)

x = x0 2n n = 10 x0 = 1 x 108 cel/mL

x = (1 x 108) x 210 x = (1 x 108) x (1024)

x = 1.02 x 1011 cel/mL

PROBLEMA 4
¿Cuánto tiempo tarda un cultivo en alcanzar una concentración
de biomasa de 17 g/L si se inoculó con una concentración de
0.4 g/L y la tasa específica de crecimiento fue de 0.8 h-1?

 Datos:  Podemos calcular t con la ec. (5):

 x0 = 0.4 g/L
ln x - ln x0 = µ t ln (17) = 2.83
 x = 17 g/L ln (0.4) = -0.92
 μ = 0.8 h-1
t = (ln x - ln x0)/µ
 t=?

t = [2.83 - (-0.92)] / 0.8 h-1

t = 3.75 / 0.8 h-1

t = 4.7 h
PROBLEMA 5
En un experimento de laboratorio se obtuvieron los datos de
crecimiento de Escherichia coli que se muestran en la tabla.
Con base en ellos, calcula:
a) La tasa específica de crecimiento (µ)
t (h) x (células) ln x
b) El tiempo que tarda en duplicarse la 0 1.0E+04 9.2
población de E. coli y el número de 1 1.1E+04 9.3
generaciones 2 1.5E+04 9.6

23
3 1.5E+05 11.9
6.E+08
4 1.0E+06 13.8
20
5.E+08
5 1.9E+07 16.7
17
4.E+08
6 2.6E+08 19.4
14
3.E+08
7 4.2E+08 19.9
ln X
X

11
2.E+08
8 5.5E+08 20.1
8
1.E+08 9 5.3E+08 20.1
5
0.E+00 10 4.5E+08 19.9
00 22 44 66 8 Identificamos
10
10 12
12 la
11 1.5E+08 18.8
Tiempo (h)
Tiempo (h)
fase Exp
12 2.0E+07 16.8
 La pendiente de la recta es μ:

 μ = 2.4 h-1

 μ = 0.693/td, entonces:

 td = 0.3 h

 n = t/td, entonces:
 td = 0.3 h
 t = ??? t = tiempo que dura la fase exp

t = 6 - 2 [h] = 4 h

n = 4 h / 0.3 h n = 14