INFORME DE LABORATORIO Nº 4

“INMOVILIZACION DE CELULAS”

I. OBJETIVOS

- Conocer un procedimiento para la inmovilización de células o enzimas

- Evaluar la capacidad fermentativa de las levaduras inmovilizadas

II. FUNDAMENTO

Inmovilizar células (o enzimas) es la incorporación de estas en un

sistema de fase sólida que no afecta el intercambio con el medio
(sustratos). Por ello, aunque la biomasa no está libre en el medio sus
capacidades catalíticas permanecen para actuar sobre los sustratos
para la producción de los productos
Se han descrito diversos métodos y matrices inertes para realizar la
inmovilización celular. La inmovilización más empleada se hace en
geles poliméricos hidrofílicos de alto peso molecular, tales como,
agarosa, alginato y carragenano.

Métodos de Inmovilización
Para obtener biocatalizadores inmovilizados que retengan
actividad y sean estables es necesario aplicar un método de
inmovilización adecuado, que dependerá del tipo de actividad catalítica
de interés. Existen diversos métodos para inmovilizar células, los
cuales pueden dividirse en:

- Entrecruzamiento físico (floculación).

- Entrecruzamiento covalente.
- Adsorción sobre matrices insolubles
- Enlace covalente con matrices insolubles.
- Entrampamiento físico en materiales porosos.
- Encapsulamiento.
Según la ruta seguida para su preparación los sistemas pueden
clasificarse en cuatro:

Inmovilización sin Carrier

Es el caso de células unidas con otras células, tanto por adsorción
o por uniones covalentes. La floculación de células, durante su
fermentación o por procesos secundarios mediante variación en
parámetros fisicoquímicos (pH, fuerza iónica) es un proceso de unión
por adsorción. Este proceso puede ayudarse por el agregado de
pequeñas cantidades de agentes de floculación (polímeros). Es
también común el uso de agentes químicos bifuncionales, tal como el
glutaraldheído para unir células mediante entrecruzamiento químico.
El caso típico es la floculación de algunas cepas de Zymomonas
mobilis, empleadas en la producción de etanol. El método de
inmovilización es sencillo, pues espontáneamente se producen flocs
cuando se crecen células en un medio adecuado sin agitación. Los
flocs así formados se utilizan como inóculo de medios de cultivo
frescos, y pueden ser usados en la producción de etanol a partir de
glucosa en reactores especialmente diseñados. Las células
inmovilizadas son retenidas dentro del reactor.
Este método permite alcanzar altas concentraciones celulares, y
se lleva a cabo en condiciones de reacción suaves, que no perjudican
la estabilidad del biocatalizador. Presenta algunas desventajas: se
alcanza una baja resistencia mecánica frente a la agitación y a la
compresión, hay limitaciones difuncionales al transporte de nutrientes,
y está limitado a pocas clases de microorganismos.

Inmovilización del Biocatalizador en Carriers Preformados

Es la estrategia típica en la inmovilización de enzimas,
especialmente por medio de enlaces covalentes. La matriz puede
generarse sin las limitaciones en condiciones físicas y químicas
(temperatura, pH, etc.) impuestas por el biocatalizador, por lo que
pueden mejorarse y optimizarse las características de estabilidad
mecánica, la estructura porosa del material, la resistencia, etc. En el
caso de células, el problema estriba en cómo favorecer la adhesión de
las células (relativamente grandes) a las superficies de la matriz,
manteniendo la estabilidad y la resistencia al lavado. La matriz debe
presentar poros de mayor diámetro que la célula para permitir la
penetración a las superficies internas. Se emplean carriers porosos,
que son embebidos por inmersión en suspensiones celulares. En el
caso de enzimas es necesario activar el soporte, mediante la
generación de grupos reactivos capaces de reaccionar con los grupos
amino o carboxilo libres presentes en la enzima.

Inmovilización durante la preparación del Carrier

Es la estrategia más común en la inmovilización de células
enteras Si bien hay dos métodos, entrampamiento y encapsulamiento,
este último es de limitada importancia. Debido al tamaño de las células
enteras, es relativamente sencillo preparar redes de porosidad tal que
garanticen la completa retención de las células, y que los procesos de
transporte de sustratos y productos sean suficientemente rápidos para
obtener alta eficiencia en la actividad catalítica. La dificultad se
encuentra en la búsqueda de condiciones de preparación de carriers
que cumplan con los requerimientos exigidos para que se retenga la
actividad del biocatalizador y/o la viabilidad celular. Es el método de
inmovilización más usado, debido a su flexibilidad y simplicidad, y a las
poco agresivas condiciones de reacción (en el caso de polímeros
naturales).
Inmovilización por crecimiento de células previamente inmovilizadas

En realidad es un caso particular del criterio anterior. Esta

estrategia es utilizada para aumentar la concentración de células
dentro del carrier, por lo que, evidentemente, sólo sirve para
inmovilización de células. Permite inmovilizar células que contienen
sistemas multienzimáticos, ya sea en estado estacionario o en
condiciones de crecimiento. La desventaja es, al igual que en caso de
células libres, la existencia de reacciones laterales no deseadas.
Generalmente se realiza por entrampamiento en redes iónicas. Es
posible restaurar la actividad catalítica, e inclusive aumentarla. Es un
método útil para obtener células difíciles de inmovilizar como tales,
como por ejemplo micelio celular. La técnica en este caso consiste en
la inmovilización de esporos en matrices insolubles, los cuales
originarán micelio una vez inmovilizados en la matriz.

Tipos de Carriers

Desde el punto de vista químico, las sustancias usadas para

soportar a los biocatalizadores pueden ser divididas en inorgánicas u
orgánicas, y el origen de las mismas puede ser natural u obtenido por
síntesis.

a).- Inorgánicos:
- Naturales: arena, silicatos, arcillas.
- Sintéticos: vidrios de porosidad controlada, cerámicas.

b).- Orgánicos:
- Naturales: virutas de madera, antracita, colágeno, celulosa, alginatos,
carragenatos, albúmina.
- Sintéticos: PVC, polipropileno, poliacrilamida, resinas de intercambio
iónico, epóxidos, poliuretanos.

La selección del material se realiza siguiendo algunos criterios

heurísticos:
 materiales de alta disponibilidad y bajo costo
 materiales que permitan un proceso de inmovilización simple y
efectivo respecto de la retención de la actividad.
 materiales con alta capacidad y eficiencia
 materiales que permitan un diseño de reactores sencillo.

Los dos primeros criterios apuntan al uso de materiales naturales

y que permitan técnicas de inmovilización por adsorción. Los dos
últimos criterios dirigen la elección hacia carriers orgánicos complejos.
Obviamente la elección final deberá tener en cuenta el biocatalizador a
utilizar, el proceso en el cual va a participar y, fundamentalmente, el
producto que se desea obtener.

De todos los métodos mencionados se hará especial énfasis en

aquellos que involucran la formación de redes poliméricas a partir de
prepolímeros de cadena larga, tales como alginatos y kappa-
carragenatos (K-carragenatos). La variedad de sistemas de este tipo es
tan grande que pueden subdividirse según los mecanismos de
formación de las redes poliméricas:

1. Precipitación: formación de red sin reacción química, por separación

de fases.
2. Gelificación: formación de redes sin reacción química, por transición
de fase debida a cambios de pH, temperatura, etc.
3. Gelificación ionotrópica: formación de redes con reacción química
(intercambio de iones) debido al entrecruzamiento de cadenas
poliónicas con contraiones multivalentes.
4. Entrecruzamiento covalente: formación de redes con reacción
química debida al entrecruzamiento de polímeros multifuncionales
entre sí o con reactivos bifuncionales de bajo peso molecular.
III. MATERIALES

- Agar agar - Agua destilada - Levadura

- Jeringas de 10 - 20 ml - Beakers - Autoclave
- Baño María. - Cocinilla eléctrica -
Refractómetro
- Balanza analítica, - Termómetro -
Erlenmeyers
- Probetas - Colador - Aceite
 IV. PROCEDIMIENTO

Para el Soporte
- Pesar 2 g de agar, colocar en beaker y añadir 80 ml de agua destilada.

- Calentar en cocinilla eléctrica hasta completa disolución. (60 – 70°C)

- Dejar enfriar hasta Tº de trabajo. (45°C)

Para la solución de levadura
- Pesar 2 g de levadura, colocar en beaker y añadir 20 ml de agua destilada
(activar la levadura)

Para la inmovilización
- Cuando el soporte este a Tº de trabajo añadir la levadura

- Mezclar hasta homogeneidad y coloque rápidamente en las jeringas

 - Adicione lentamente el contenido de las jeringas sobre la solución de
ClCa2

Para la Evaluación
Adicione perlas a una solución de glucosa y verifique al día siguiente la
presencia de burbujas (o los ºBrix).
V. RESULTADOS
- Represente en un flujo las operaciones desarrolladas

PARA EL SOPORTE: PARA SLN DE LEVADURA:

PESADO DEL AGAR PESADO DE LA

LEVADURA (2 g)

MEZCLADO
(agar + agua destilada) MEDICION DEL
AGUA DESTILADA
(20 ml)
CALENTADO DE LA
MEZCLA
MEZCLADO
( levadura + agua
ENFRIADO destilada)

ADICION DE
LEVADURA EN EL
SOPORTE

MEZCLADO

COLOCACION EN
JERINGAS

ADICION SOBRE
SOLUCION DE ClCa2

VERIFICAR LA
PRESENCIA DE BURBUJAS
- Calcule la cantidad en peso de levaduras por perla
Indique los ºBrix de la solución al inicio y al final (y/o verifique presencia
de burbujas)

Datos:
- Peso de agar: 2.0127g (T°63)
- Peso de levadura: 1.0340 g (T°40)
- ml de solución de ClCa2: 60 ml (T°42)
- Peso azucar: 20.3700 g

Datos de los pesos del día siguiente:

- Peso de solidos de ClCa2: 4.4371 g

- Peso de solidos de azúcar: 4.6584g
- Grados Brix: 15
- Temperatura: 20.1 C

VI. CONCLUSIONES

- Se logró conocer el procedimiento adecuado para la inmovilización de

células o enzimas
- Además se logró evaluar la capacidad fermentativa de las levaduras
inmovilizadas.

VII. DISCUSION
- La inmovilización de levaduras disminuye la mayoría de los
problemas que plantea la fermentación utilizando células libres. Este
sistema tiene la ventaja de poder manejar la densidad celular,
previaal inicio de la fermentación. Además, facilita el sistema de
operación del proceso de fermentación continua, evitando el paso de
eliminar las levaduras del fermentador. La inmovilización celular
desacopla el crecimiento microbiano de los procesos metabólicos de
 interés industrial. Es así, que diversos grupos de investigación han
empleado este sistema de levaduras inmovilizadas.

VIII. CUESTIONARIO

1. ¿Por es importante la inmovilización de las células?

- Porque facilita el manejo de una mayor densidad celular

comparado con los procesos tradicionales, además de lograr un
mejor control en sistemas continuos y la posible recuperación de
la biomasa para su posterior reutilización. los materiales para
inmovilizar células deben cumplir importantes requisitos como: ser
grado alimenticio (según sea el caso), bajo costo, disponibilidad,
no degradables y aptos para condiciones de pH y temperatura
bajas y la incorporación de levaduras en matrices sólidas.

2. Efectos de la inmovilización de las células

- La inmovilización enzimática produce cambios en la actividad de

preparación con respecto a la actividad de la forma natural, estos
cambios se refieren a la alteración del comportamiento de las
enzimas.
Tras una inmovilización, la actividad puede disminuiré incluso
perderse por diversas razones como la unión al soporte, reacción
de los grupos reactivos con algún aminoácido del centro activo,
cambios conformacionales o desnaturalización de la proteína.
Para evaluar los resultados de la inmovilizaciones necesario
estudiar la cinética de las reacciones enzimáticas para lo que se
emplea el modelo me Michaelis – Menten.
3. Mencione el uso de las levaduras en la industria alimentaria

Las levaduras son responsables de los procesos de

fermentación alcohólica, a partir de azúcares y en ausencia de oxígeno
las levaduras generan alcohol, dióxido de carbono y aromas.
Este proceso bioquímico es imprescindible para la producción de
alimentos consumidos diariamente por millones de personas en nuestro
planeta: el vino, el pan y la cerveza.
Se tiene constancia del uso de levaduras por parte de los egipcios en la
fabricación de pan y cerveza, hace más de 5.000 años.

Por otro lado se han encontrado restos de vino en recipientes que datan
del neolítico. La producción de vino, pan y cerveza ha sido, es y será
uno de los usos de los microorganismos que más beneficios ha
reportado a la calidad de vida de los seres humanos.

En industria alimentaria y restauración se utilizan desde hace tiempo los

extractos de levadura, empleados como fuentes de aroma y sabor
en salsas y platos preparados.

Hoy en día, se sigue investigando

en el uso de variedades de
levaduras más eficientes y
adaptadas a los nuevos métodos
de producción de estos
alimentos. En el caso del pan
destaca el uso de levaduras
adaptadas especialmente a la producción de panes congelados y panes
de molde, a la producción de bollos y pasteles, a la producción de panes
artesanales más aromáticos, etc.

Destacar también las líneas de investigación encaminadas a dar las

levaduras nuevos usos que incrementen la biodisponibilidad de
vitaminas y minerales presentes en el pan, lo que permitirá un mejor
aprovechamiento de este alimento básico. En el caso del vino mencionar
las líneas de investigación dedicadas a seleccionar levaduras que
aporten aromas específicos de las distintas zonas de producción de uva,
con el fin de potenciar el carácter local de los caldos.

Las levaduras como pro-bióticos

Desde hace algunos años es conocido el

papel de la levadura como alimento pro-
biótico, tanto en seres humanos como en
animales. Una vez ingeridas, ya dentro
del sistema digestivo del animal, las
levaduras desarrollan una acción
altamente beneficiosa: favorecen el
equilibrio de la flora intestinal, favorecen
la sensación de bienestar, potencian el
sistema inmunológico, mejoran el estado
fisiológico y el tracto del sistema digestivo, etc. Relacionado con el
equilibrio de la flora intestinal, es destacable el papel de las levaduras no
solo favoreciendo el crecimiento de bacterias beneficiosas para el
organismo, sino también impidiendo el acceso de patógenos a ciertos
tejidos, efecto barrera, y la inactivación de ciertas toxinas generadas por
microbios indeseables.

En relación con la potenciación del sistema inmunológico y la mejora del

estado fisiológico y el tracto digestivo, los investigadores están
avanzando en la decodificación del “diálogo” y las relaciones
bioquímicas que se establecen entre las levaduras, la flora intestinal y el
propio sistema digestivo del animal. Estas relaciones y “diálogos” tienen
implicaciones en ciertas enfermedades y los avances en este campo son
una auténtica revolución tecnológica.

El efecto pro-biótico de las levaduras es especialmente beneficioso en

la producción ganadera desde hace años. Incluir levaduras en la dieta de
vacas lecheras ayuda a mejorar significativamente el bienestar de los
animales y la calidad y cantidad de leche producida. El uso de levaduras
en la dieta de lechones y pollos potencia su crecimiento y su salud,
reduciendo los costes de producción y evitando el uso de antibióticos
que pueden provocar resistencias posteriores en seres humanos.

Reseñar por último el uso de levaduras como aditivo en alimentos para

perros y gatos, su uso favorece el proceso digestivo, incrementando el
aprovechamiento de los alimentos y reduciendo las diarreas. También
incrementa la vitalidad de las mascotas y su resistencia a enfermedades.

Las levaduras en nutrición y salud

Las levaduras han formado parte de la dieta

de los seres humanos y de los
animales desde hace siglos. Su
composición nutricional es excepcional.
Tanto las levaduras en si, como partes de
sus células o las moléculas por ellas
sintetizadas, presentan un gran interés en
salud y nutrición de seres humanos,
animales, plantas e incluso otros
microorganismos.
Cada vez son más importantes los
descubrimientos relacionados con el uso de levaduras en la fertilización
y protección de cultivos. Estos avances permiten reducir el uso de
fertilizantes y fitosanitarios de síntesis química en agricultura. El uso de
levaduras para controlar diversas enfermedades de los cultivos es ya
hoy en día una realidad. La utilización de levaduras para evitar el
desarrollo de hongos en los frutos representa también una alternativa
importante a los tratamientos anti-fúngicos tradicionales. Ciertas
levaduras mejoran la capacidad de las plantas en el proceso de
absorción de nutrientes del suelo, favoreciendo con ello su crecimiento y
permitiendo mejorar los rendimientos agrícolas.
 El uso de levaduras en nutrición humana, bien como suplemento
dietético o como alimento funcional, es ampliamente conocido. Los
nutricionistas aseguran que el alto contenido en proteínas, enzimas,
minerales como el zinc, cromo, selenio… y vitaminas de los grupos B y
D hacen a los suplementos dietéticos de levadura especialmente
atractivos en dietas vegetarianas o situaciones de carencia en alguno de
esos nutrientes. También indican que es interesante el consumo de
levaduras para asegurar una buena salud del cabello, uñas y piel.
Por otro lado, el consumo de levaduras enriquecidas en determinados
nutrientes, como el selenio, incrementa la biodisponibilidadde este
mineral cuya presencia en la dieta de humanos o animales presenta
múltiples beneficios para el sistema inmunológico, tejido muscular,
corazón, mantenimiento de las membranas celulares, como antioxidante,
etc.

IX. BIBLIOGRAFÍA

- http://www.posgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM/No.%206/5.ht
ml
- https://es.calameo.com/read/00342856905dda8f3beaf
- https://www.lesaffre.es/levaduras-nuevos-usos/