UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS

LABORATORIOA DE QUÍMICA ORGÁNICA II

PROFESORA: Dra. Nahir Dugarte FECHA: 15/01/2015

AYUDANTE: Alex Pastuña SEMESTRE: Modulo II Práctica. N° 6

TEMA:

“CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA”

FUNDAMENTO TEÓRICO:

La cromatografía de capa fina es una técnica de adsorción sólido-líquido. El fenómeno

responsable de la separación es la adsorción, la cual implica la distribución de un soluto entre
dos fases inmiscibles de acuerdo a la mayor o menor adsorción del soluto en la superficie de una
fase sólida. La fase estacionaria es sólida y la fase móvil es líquida (disolvente). La adsorción es
un fenómeno de superficie, que se manifiesta sor un aumento de concentración en la interfase
que rodea el medio estacionario. No se debe confundir la adsorción con la absorción, que
consiste en la penetración de una sustancia en el seno de otra. Por 6,'emplo, al escribir, el papel
adsorbe tinta, mientras que una esponja absorbe agua.
La teoría de la cromatografía de capa fina aún no ría podido aclararse en todos sus detalles y es
complicada por varias razones.
1. La velocidad de flujo del solvente no es constante, sino que varía a medida que el frente del
solvente avanza a lo largo de la capa de adsorbente. La velocidad depende de las características
físicas .e solvente empleado. El solvente se mueve constantemente hacia áreas de adsorbente
seco, lo cual tiende a involucrar calores de y consecuentemente distorsiona el equilibrio.
1. Las manchas que se separan pueden sufrir una difusión lateral y probablemente no estarán
uniformemente depositadas sobre el adsorbente. Probablemente, la conclusión más
importante, de toda la teoría desarrollada para la cromatografía de capa fina, es que el mayor
grado de resolución en una capa fina ocurre en el área alrededor de los valores de Rf entre 0,3
y 0,4.

PROCESO DE PARTICIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO.

En su forma básica, un sistema de partición y las fuerzas que gobiernan su operación son
mucho más simples que las de un sistema de adsorción. Está constituido por dos líquidos que
son parcialmente miscibles uno en el otro. Debido al requisito de inmiscibilidad, uno de los
líquidos tenderá a ser mucho más polar que el otro. Cualquiera de los dos líquidos puede ser
un solvente puro o una mezcla de complejidad considerable. Los factores que dictan si un
soluto permanece en la fase estacionaria o si se mueve juntamente con la fase móvil, estarán
supeditados a las diferencias de solubilidad del soluto en las dos fases. La extensión a la cual
un soluto se distribuye entre dos líquidos puede medirse en un embudo de separación. Tales
mediciones, producen constantes conocidas como coeficientes de partición o reparto. Si un
soluto A se disuelve en dos disolventes B y C, se distribuye entre ellos de acuerdo con la
siguiente ley:

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝐴 𝑒𝑛 𝐵
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝐴 𝑒𝑛 𝐶
= una constante a temperatura constante = coeficiente de reparto
Por ende, entonces, podemos decir en forma general que los materiales que tienen diferentes
coeficientes pueden ser separados. Aquellos solutos que son más solubles en la fase móvil se
moverán más rápido que aquellos que son menos solubles y los solutos que son más solubles
en la fase estacionaria tenderán a moverse más lentamente que aquellos que son menos
solubles.

Consideraremos como ejemplo típico la separación de una mezcla de sustancias sobre una tira
de papel de filtro. Se sabe que el papel de filtro está formado por numerosas fibras de celulosa
que portan un cierto porcentaje de humedad. Podemos considerar que las partes individuales
de cada fibra, junto con su humedad asociada, constituyen hipotéticas "células" elementales.
La separación se lleva a cabo al repartirse las sustancias entre la humedad de las células y el
flujo de disolvente entre ellas. El agua de las células permanece estacionaria, mientras que el
disolvente circula sobre ellas. Debido a esto, a las células se llama fase estacionaría, mientras
que al disolvente se le denomina fase móvil.

Podemos ilustrar mejor estos principios haciendo referencia a un ejemplo. Consideremos que
una mezcla de dos compuestos, A y B (cuyo coeficiente de reparto entre las fases estacionaria
y móvil son 2:1 y 1:2, respectivamente, es decir, A es relativamente más soluble en agua), que
se aplican en el origen de una cromatografía de papel. La figura 1 representa un diagrama del
corte longitudinal del papel, que contiene la mezcla disuelta en el agua de una célula en el
origen. Por conveniencia se puede considerar que el reparto tiene lugar entre volúmenes
iguales de la fase en movimiento y estacionaria. En la figura, las moléculas del comportamiento
A están representadas por círculos negros, y las de B, por cruces
Cuando el disolvente penetra en la célula (esto ocurre cuando comienza la separación), las dos
sustancias se repartirán de acuerdo con la ley da reparto, especificada anteriormente. El
solvente conteniendo una cierta cantidad de mezcla correrá a lo largo del papel y encontrara
otra célula que contiene agua, mientras que el disolvente puro se pone en contacto con la
primera célula (figura 1,c) y tendrá lugar en ella un nuevo reparto (fig 1,d). Este proceso se
conoce como distribución en contracorriente continua, en tanto que el disolvente avance a lo
largo del papel: La figura 1e representa la distribución de A y B en el papel después de haber
tenido lugar la separación. Es obvio que los dos componentes ya han comenzado a separarse.
En la práctica este proceso se repite múltiples veces, dando, eventualmente, una separación
eficaz. Haciendo una similitud con el proceso de extracción líquido-líquido, podemos afirmar
que en la multitud de pequeñas celdas formadas por las micelas del papel, la separación tiene
lugar igualmente como sí se dispusiera de extracciones sucesivas. La cromatografía que
resultará de la anterior separación se representa en la figura 2.
A se encontrará a un tercio de la distancia entre el origen y el frente del disolvente, mientras
que B estará a dos tercios de esta distancia.

Uno de los aspectos más importantes de la cromatografía es que, en un sistema

cromatografía) dado, el movimiento relativo de un compuesto con respecto al frente del
disolvente es una propiedad característica y reproducible. En el caso de las cromatografías de
papel y capa fina se expresa el movimiento de un compuesto como un valor de Rf. Este valor,
es una constante característica y constante de cualquier sustancia para un sistema
cromatográfico dado. En la cromatografía sobre papel y capa fina los valores de Rf se expresan
mediante la ecuación:

𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎

𝑅𝑓 =
𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒

Para el caso estudiado tendremos:

𝑅𝑓 (𝐴) = 𝑎/𝑥, 𝑅𝑓 (𝐵) = 𝑏/𝑥

a.- distancia recorrida por la sustancia A, la cual se mide desde el punto de aplicación al centro
de la mancha.

b.- distancia recorrida por la sustancia B, la cual se mide desde el punto de aplicación al centro
de la mancha.

x.- distancia recorrida por el frente del solvente.

COMPARACIÓN CON LA CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL

La cromatografía sobre papel es una técnica muy valiosa. Haciendo uso de ella se pueden
separar forma fácil y rápida, sustancias químicas relacionadas estrechamente en estructura,
bien sean iones orgánicos, así como también, compuestos orgánicos polifuncionales o muy
polares, tales como: amino-ácidos, azucares o pigmentos de plantas. ¿Entonces porqué
usar otros métodos, los cuales aparentemente, a primera vista, hacen exactamente la misma
cosa ?.
La respuesta a esta interrogante es bastante sencilla. Existen un gran número de familias de
impuestos, principalmente en el campo de los lípidos, donde la cromatografía de papel no ha
producido los resultados deseados. Por lo tanto, se necesita una técnica alternativa que sea
capaz de separar, por ejemplo, los ácidos grasos de estructura muy parecida, de una manera tan
simple y fácil como la cromatografía de papel separa los amino-ácidos estrechamente
relacionados en su estructura química.

La cromatografía de capa fina (TLC: Thin Layer Cromatography), es la técnica que cubre estas
expectativas. Podemos comparar la cromatografía sobre papel con la cromatografía de capa fina
(TLC) aspecto a las similitudes de los principios teóricos y las técnicas experimentales empleadas.
En cuanto al fundamento teórico, la cromatografía sobre papel es una técnica de partición
líquido-líquido, mientras que la de capa fina es una técnica de adsorción sólido-líquido. Las
ventajas de la TLC son: mayor velocidad, mejor resolución, (en general las manchas separadas
se presentan más compactas), mayor sensibilidad, (se pueden separar y recuperar con mayor
facilidad cantidades extremadamente pequeñas de compuestos, en el orden de los
microgramos) y más amplia posibilidad en la selección de reactivos de detección, (se puede
esparcir sobre las placas de sílica y alúmina, reactivos reveladores altamente corrosivos como el
ácido sulfúrico, sin afectar la capa de adsorbente). La cromatografía de capa fina tiene otras
ventajas comparada con la de papel. Mientras que la cromatografía sobre papel se desarrolla
sobre una película de pequeño espesor de celulosa soportada sobre el papel mismo, la de capa
fina puede desarrollarse sobre capas finas de una gran variedad de materiales inorgánicos
pulverizados, tales como; sílica gel (óxido de silicio: SiO2.H2O), celita, alúmina (óxido de
aluminio: Al2O2), tierra de diatónicas (kieselguhr) y sobre sustancias orgánicas como: alcohol
polivinílico, celulosa y celulosas modificadas químicamente. Es posible entonces, escoger el
material particular más adecuado, para resolver la separación del grupo de compuestos en
estudio. El tiempo requerido para lograr una separación satisfactoria es considerablemente más
corto en TLC; y por último, la capa de adsorbente puede ser fácilmente retirada con una espátula
fina para recuperar por elución el contenido de una mancha o banda presente en un espacio
determinado de la placa. Adicionalmente, la TLC puede usarse para separar sustancias
hidrofóbicas tales como: lípidos e hidrocarburos que son difíciles de manejar sobre el papel
cromatográfico. Las desventajas de la TLC comparadas con la cromatografía sobre papel son;
mayor dificultad para preservar resultados en TLC, los vales de Rf no son fácilmente
reproducibles en TLC y, los platos para la TLC son más costosos que las hojas de papel.

PRINCIPIOS GENERALES DE LA CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

La cromatografía de capa fina se lleva a cabo sobre una capa delgada uniforme de un adsorbente
adecuado extendida sobre una lámina de vidrio o de algún otro material y activada por
calentamiento en un horno (100 a 250°C). Las muestras de mezclas a separar se disuelven en un
solvente adecuado (aproximadamente al 1%) y se aplican, mediante el uso micropipetas, a lo
largo de un borde de la placa, alrededor de 1 cm del final. Después de evaporado el solvente, las
placas se colocan verticalmente en un recipiente de vidrio cerrado, denominadas cámaras de
desarrollo, que contiene una capa de solvente adecuado en el fondo. Antes, se ha debido
procurar que la atmósfera de la cámara de desarrollo esté saturada con vapor del eluyente. El
eluyente, avanza sobrepasando la mancha de origen. Al cabo de unos pocos minutos los
componentes de la mezcla son separados por el solvente que irá ascendiendo a través de la capa
fina del adsorbente, transportando las manchas a localizaciones diferentes sobre el adsorbente,
por una combinación de adsorción y distribuciones variables del sistema del solvente.

Un ejemplo de separación empleando la cromatografía de capa fina se indica en la serie de

figuras que se muestra a continuación.
Las placas se extraen, precediéndose a marcar rápidamente el frente del solvente antes que el
disolvente se evapore, se secan y se revela con diversos agentes que permiten visualizar los
componentes de la mezcla. La presencia de las sustancias separadas, se comprueban entonces
por algún método de visualización. Las sustancias coloreadas se pueden observar
inmediatamente, algunas fluorescen o absorben luz U.V., y otras se hacen visibles rociándolas
con reactivos específicos.

Como medida de la velocidad de desplazamiento de cualquier sustancia en un eluyente

determinada, se usa, como en la cromatografía de papel, el valor del Rf es decir, la relación de
la distancia que una sustancia se ha movido con la distancia que ha viajado el frente del solvente
de desarrollo.

Los valores de Rf, pueden ayudar en la identificación de sustancias, cuando las mediciones se
realizan bajo las mismas condiciones, esto significa que se deben desarrollar cromatogramas
comparativos al mismo tiempo.

La cromatografía de capa fina se usa para determinar el número de componentes en una mezcla,
para detectar un compuesto particular en una mezcla de reacción, y como un ensayo preliminar,
para determinar las condiciones óptimas para realizar una cromatografía de columna. El uso de
la cromatografía de capa fina está limitado a la aplicación de sustancias relativamente poco
volátiles, ya que las pequeñas cantidades de las mismas se encuentran expuestas en una
superficie abierta.

PROCESOS DE ADSORCIÓN:

Dos factores están involucrados en la cromatografía de adsorción: las fuerzas de atracción entre
los solutos y adsorbentes y las fuerzas que tienden a apartar los solutos de los adsorbentes, de
tal manera que puedan desplazarse con la fase móvil y puedan ser separados. A estos dos
factores se les denomina respectivamente adsorción y desorción.

De esta manera, la separación de componentes de una mezcla por cromatografía de adsorción

depende del equilibrio adsorción - desorción entre los compuestos adsorbidos en la superficie
de la fase sólida estacionaria y la fase líquida móvil.

La fuerza con la que se adsorbe un componente aislado depende de la polaridad de la molécula,

de la actividad del adsorbente, y de la polaridad de la fase líquida móvil. Por lo tanto, la
separación de los componentes de una mezcla depende de los valores relativos del equilibrio de
adsorción - desorción para cada uno de ellos. Por lo general, cuanto más polar es un compuesto,
más fuertemente será adsorbido en la superficie de la fase sólida.
El proceso de adsorción es un fenómeno de superficie. En el sentido cromatográfico el termino
adsorción se limita a las interacciones que implican enlaces por puente de hidrógeno, fuerzas
de Van der Walls o fuerzas de atracción electrostáticas (cuando las interacciones son iónicas el
proceso se denomina intercambio iónico), entre el o los solutos a separar y los centros activos
del adsorbente.

Los centros activos del adsorbente provienen principalmente de los defectos (grietas, filos, etc.)
de la red cristalina del adsorbente donde las fuerzas electrostáticas están proyectadas
parcialmente hacia el exterior. La adsorción es debida justamente a la interacción de estas
fuerzas con las interiores del soluto, provocando de esta manera que las moléculas del soluto se
distribuyan en capas sucesivas diferenciadas.

Las primeras capas de moléculas se adsorben 3 a 5 veces más fuertes que las capas siguientes.
El calor de adsorción para la primera capa adsorbida sobre un sólido está en el rango de 25-35
KcaI/mol, disminuye rápidamente al rango de 5-10 Kcal/mol para capas sucesivas. Cuanto mayor
sea la separación de cargas del soluto (mayor momento dipolar), mayor será la adsorción. Desde
el punto de vista práctico la cromatografía de adsorción se aplica en la separación de sustancias
de media o baja polaridad.

En resumen, podemos decir que las fuerzas que causan la adsorción de los solutos neutros son:

1. Atracciones del tipo dipolo-dipolo entre adsorbentes polares y solutos polares.

2. Enlaces por puentes de hidrógeno entre los grupos hidroxilo dentro de la estructura química
del adsorbente que se usa, especialmente de la sílica, y los átomos de oxígeno y nitrógeno en la
estructura química de los solutos.

3. Las fuerzas de polarizabilidad entre adsorbentes polares y solutos tales como materiales
aromáticos que pueden ser polarizados.

En todo caso, en cualquier fenómeno de adsorción influyen tres variables independientes estas
son el adsorbente, el disolvente y las sustancias a cromatografiar.

Las separaciones sobre adsorbentes dependen de la existencia del equilibrio entre las moléculas
adsorbidas en la fase estacionaria y las que están libres en el disolvente (equilibrio adsorción -
desorción). Si las moléculas de un componente particular tienen una elevada afinidad por el
adsorbente pasarán muy lentamente, mientras que otro componente con menos afinidad lo
hará más rápido.

INFLUENCIA DEL DISOLVENTE.

El tipo de disolvente a usar es determinante para lograr una buena separación. La regla general
es elegir la polaridad del disolvente análoga a la de la muestra a emplear y en la mayoría de los
casos adsorbentes poderosos (activos) para sustancias no polares y adsorbentes con menos
actividad para sustancias más polares.

La razón de la primera regla es obvia. Si, por ejemplo, elegimos un disolvente polar para una
mezcla de compuestos no polares, las moléculas del disolvente serán adsorbidas
preferentemente, por lo que la mezcla pasará rápidamente a través del sistema sin conseguir la
separación. Contrariamente, si empleamos un disolvente apolar para una mezcla polar, ésta
permanecería en el origen sin lograrse tampoco la separación.
Existen dos fuerzas las cuales causan que los solutos se muevan con el solvente en un
cromatograma.

La primera, es la tendencia para disolverse y moverse con el solvente, un fenómeno denominado

frecuentemente elución. En este caso, los solventes ideales, deberán disolver los solutos y
deberán ser lo suficientemente buenos como solventes, como para competir con el poder de
adsorción del adsorbente. Este tipo de situación probablemente prevalece cuando se usan
solventes apróticos para desarrollar los cromatogramas como por ejemplo: hidrocarburos,
éteres y compuestos con función carbonílica.

La segunda fuerza que tiende a mover los solutos en un sistema cromatográfico es un fenómeno
de desplazamiento.

Las moléculas del solvente tienden a competir con el soluto por los sitios de adsorción en el
adsorbente y por tanto tienden a mover las moléculas del soluto a lo largo del sistema. Este
fenómeno se denomina desplazamiento. En cierto sentido, la elución es una fuerza de tracción
y el desplazamiento es una fuerza de empuje. El fenómeno de elución prevalece con solventes
apróticos y el de desplazamiento con solventes próticos como los alcoholes.
Para facilitar la elección del disolvente, se les ha clasificado en una serie llamada elutrópica, es
decir en orden de poder eluyente creciente. Él poder eluyente aumenta con la polaridad del
disolvente. La serie elutrópica de Trappe modificada es:

DISOLVENTE CONSTANTE DIELÉCTRICA (𝜇)

Éter de petróleo 2,0
Ciclohexano 2,1
Tetracloruro de carbono 2,2
Benceno 2,3
Tolueno 2,4

Tricloroetileno 3,4

Éter dietílico 4,3

Cloroformo 5,0

Acetato de etilo 6,4

Cloruro de etileno 10,0

Piridina 12,0

Acetona 21,0

n - propanol 22,0

Etanol 26,0

Metanol 34,0

Acetonitrilo 37,0

Agua 81,0

Es importante correlacionar el poder eluyente de un disolvente con su constante dieléctrica ya

que la cromatografía de adsorción está basada en atracciones electrostáticas, las cuales están
gobernadas por la ley de Coulomb.

𝑞1 𝑥 𝑞2
𝐹=
𝜇 𝑥 𝑟2
Esta ecuación establece que la fuerza F, entre dos cargas depende de la magnitud de las cargas
y es inversamente proporcional a la constante dieléctrica del medio y al cuadrado de la distancia
entre las cargas. Si asumimos que los otros factores permanecen constantes, la fuerza de
atracción varía inversamente con la constante dieléctrica del medio. Es fácil demostrar (cómo ?)
que ( el Rf es inversamente proporcional a las fuerzas de atracción entre el adsorbente y el
material adsorbido, esto es:

1
𝐹=
𝑅𝑓
mientras menor es la interacción soluto - adsorbente, mayor es su Rf; si 𝜇 es grande, F es
pequeña, y el Rf, es grande.

Cuando no es posible obtener una buena separación con disolventes puros se usan mezclas de
disolventes, hasta conseguir aquella combinación que permita obtener la separación deseada.
Para que los resultados de la cromatografía en capa fina sean reproducibles se usan disolventes
de alto grado de pureza, ya que las constantes dieléctricas dependen grandemente de la pureza.

INFLUENCIA DE LA ESTRUCTURA QUÍMICA DE LAS SUSTANCIAS A SEPARAR.

La polaridad de las moléculas es un factor muy importante en las separaciones cromatográficas
por adsorción. En general, cuanto más polar es una sustancia, más fuertemente es adsorbida.
Las sustancias adsorbidas fuertemente necesitan disolventes más polares para ser eluidos.

Si la sustancias a separar poseen en la adsorción con un disolvente no acuoso poca afinidad por
los adsorbentes hidrófilos usuales, entonces se trabajará con un absorbente activo y eluyentes
poco polares. Por el contrario, se emplearán adsorbentes poco activos y eluyentes polares
cuando la afinidad de adsorción de las combinaciones es grande. Por esto es muy importante
conocer qué características de la estructura química de las sustancias influyen en la fuerza de
unión por adsorción.

Los principios en los que esto se rige se indican a continuación:

1.- Los hidrocarburos saturados son poco o nada adsorbidos, la introducción de enlaces dobles
aumenta la afinidad de adsorción, tanto más, cuanto mayor es su número y más todavía si están
conjugados. Con la introducción de enlaces dobles, especialmente enlaces dobles conjugados,
aumenta la facultad de polarización de las moléculas y con esto la fuerza de la unión adsortiva
a la superficie de los adsorbentes hidrófilos.

2.- Si se introducen grupos funcionales en un hidrocarburo, aumenta generalmente la afinidad

de adsorción, pudiéndose observar la siguiente serie de adsorción descendente: -COOH, -
CONH2, -OH, -NHCOCH3, -NH2, -OCOCH3, -COCH3, -N(CH3)2, -NO2 -OCH3, -H, -Cl. Las
combinaciones carbonílicas se adsorben más débilmente que las hidroxílicas y amínicas. Los
grupos C - metilo están sin una influencia especial.

3.- Si en una molécula están presentes varios grupos funcionales de distinta naturaleza, sus
influencias separadas en la adsorción son aproximadamente aditivas. Los efectos estéricos son
importantes y pueden variar grandemente el grado de adsorción.

Los factores que hay que tener en cuenta en la selección de adsorbentes y eluyentes apropiados,
se pueden resumir sinópticamente en el esquema que se presenta a continuación.
De aquí resulta que para la separación de sustancias poco polares (vértice del triángulo
punteado señalando hacia abajo a la izquierda en la dirección de mezcla a separar no polar), hay
que emplear un adsorbente con actividad alta (vértice del triángulo punteado señalando hacia
arriba a la izquierda en la dirección de la fase estacionaria con actividad I) y un eluyente con
poco poder de elución (vértice del triángulo punteado señalando hacia la derecha).

NATURALEZA DEL ADSORBENTE.

La adsorción de sustancias en la superficie del sólido que actúa como adsorbente es mayor
cuanto mayor es la polaridad del absorbente. La presencia de agua disminuye la actividad del
adsorbente. La actividad del adsorbente (poder de adsorción), depende del tipo de material y
del modo cómo se preparó. Muchos de los sólidos empleados como adsorbentes en
cromatografía de capa fina son óxidos metálicos, óxidos hidratados y sales. Las sustancias
adsorbidas, llamadas también adsorbatos, son combinaciones polares o polarizables.

En general, están ligadas a la superficie del adsorbente por medio de fuerzas electrostáticas las
cuales también son responsables de la cohesión de la red cristalina. Aquí, las tensiones
reticulares actúan en parte hacia afuera. Los centros activos de adsorción en el adsorbente son,
por lo tanto, aristas, secciones de rotura, ángulos y lugares defectuosos de la superficie, en tos
que los iones están más o menos al descubierto. Con esto se hace comprensible el paralelismo
entre la actividad de adsorción y la escala de dureza, que representa una medida de la magnitud
de las fuerzas reticulares.

Por las tensiones eléctricas superficiales se inducen momentos dipolares en las

combinaciones no polares, o se intensifican los momentos dipolares ya existentes en
combinaciones polares. Así pues, la unión del adsorbato a la superficie del medio de adsorción
está producida por fuerzas ion, dipolo q dipolo-dipolo respectivamente. En caso extremo la
polarización puede conducir a la ionización de las moléculas adsorbidas. Los puentes de
hidrógeno participan, a menudo de la unión entre el adsorbente y la sustancia adsorbida. Las
moléculas, que forman puentes de hidrógeno internos, se adsorben más débilmente en silicagel,
óxido de aluminio hidratado, que los compuestos isómeros que no poseen estas propiedades.
Además, los puentes de hidrógeno influyen en la movilidad entre la sustancia y el eluyente. La
serie de poder adsortivo de los adsorbentes más usados que se presenta en la tabla fue
establecida por H. H. Strian.
 Para facilitar la elección del sistema, se ha preparado una lista de adsorbentes y disolventes
ordenados de menor a mayor polaridad (actividad y poder eluyente respectivamente). Esta se
ha elaborado a base de conocimientos prácticos y se representa a continuación.

Adsorbentes por orden de menor a mayor Disolventes por orden de menor a

poder adsortivo mayor poder eluyente

Azúcar, almidón Hexano, éteres de petróleo

Inulina Heptano
Nitrato magnético Ciclohexano
Talco Tetracloruro de carbono
Sosa Benceno
Carbonato potasio Tolueno
Carbonato cálcico Cloroformo
Fosfato cálcico Éter dietílico
Carbonato magnético Acetato de etilo
Magnesia Piridina
Ácido silicio activado Acetona
Silicato de magnesio activados Propanol
Óxido de aluminio Etanol
Carbón animal activado y magnesia activada Metanol
Agua
Mezcla de ácidos, bases con agua, alcoholes o
piridina

Aunque esta relación es muy útil, hay que tener cuidado, especialmente con los disolventes, ya
que con frecuencia se encuentra inversión de los resultados, entro dos disolventes
determinados, en las mismas condiciones.

Virtualmente puede emplearse cualquier líquido como disolvente en la cromatografía de

adsorción, pudiendo combinarse mezclas de dos, tres e incluso cuatro líquidos de polaridad
diferente. De esta manera, el número de disolventes disponibles es mucho mayor que el de
adsorbentes. Los adsorbentes más usados en TLC, en orden de importancia son la silicagel, y la
alúmina. En determinados casos también se emplean otros adsorbentes especiales como
kieselguhr, celulosa, carbón activado y el polvo de poliamida (nilón).

En la práctica sólo se emplean con frecuencia solamente dos adsorbentes, la sílica gel y la
alúmina, desarrollando la separación empleando el disolvente apropiado o cambiando la
polaridad del adsorbente por adición de agua. Para conseguir la forma más activa del
adsorbente, se calienta fuertemente, eliminando todo el agua y cualquier impureza orgánica.

Los grados de menos actividad se consiguen por adición de cantidades conocidas de agua. A este
proceso se le denomina desactivado.

Algunos adsorbentes contienen un aglomerante el cual aumenta la adhesión del adsorbente a

la placa de vidrio. Los aglomerantes más comunes son el sulfato de calcio (yeso) y el almidón.
Sin embargo, los productos modernos tienen mejores propiedades adhesivas, siendo, en
muchos casos, superfluo e incluso indeseable el empleo de aglomerantes.
SILICAGEL: (ÁCIDO SILÍCICO).

Es el adsorbente más extensamente usado en TLC y probablemente el mejor material para

realizar las pruebas iniciales de separación, ya que posee una capacidad de adsorción muy
elevada.

Si los compuestos a separar son neutros y contienen uno o dos grupos funcionales, pueden ser
resueltos sobre capas de silicagel activada usando para el desarrollo de la cromatografía
solventes orgánicos puros o mezclas de solventes. Si los/compuestos a ser separados son bases
orgánicas, el solvente de desarrollo deberá contener una pequeña cantidad de hidróxido de
amonio de dietilamina.

Del mismo modo, se deberá añadir una pequeña cantidad de ácido acético a los solventes
usados para el desarrollo del cromatograma cuando se desea separar mezclas de compuestos
ácidos. La silicagel puede usarse con todos los solventes, aún cuando exhibe capacidad de
enlazamiento por puentes de hidrógeno con algunos solutos y solventes cuando está presente
el agua.

Esta capacidad de enlazamiento conjuntamente con el factor de hinchamiento y por tanto la

disminución de la velocidad de flujo, en presencia de agua, metanol y etanol, causa algunas
limitaciones a su uso general. Los compuestos muy polares, tales como: alcoholes, aminas o
ácidos carboxílicos, se adsorben fuertemente a la superficie de la sílica, formando puentes de
hidrógeno con los residuos de ácido silícico de la forma Si--O--H.

Por lo tanto, se requiere de un solvente muy polar para hacer que este tipo de compuestos se
mueva a lo largo de la superficie de la silicagel. Los compuestos apelares no serán muy atraídos
por la silicagel y se moverán rápidamente aún en la presencia de solventes apolares. La silicagel
puede adquirirse en formas muy diversas.

Las más comunes son la silicagel G y la silicagel H. La forma G, (la G significa Gypsum o yeso de
París, es decir sulfato de calcio. Cuando este aglomerante se expone al contacto con el agua o la
humedad, se convierte en una masa rígida de CaSO42H2O, el cual se enlaza al adsorbente y a la
placa de vidrio), contiene un 13% de aglomerante: El tamaño medio de sus granos es de 5 a 25
mieras, la silicagel H no contiene aglomerantes.

Igual que la forma G, posee un tamaño medio de granulación de 5 a 25 mieras. Las capas de
silicagel H poseen una buena estabilidad. Los tiempos de recorrido, en comparación con los de
la silicagel G son algo superiores. También pueden obtenerse silicagel H y silicagel G, con
indicadores de fluorescencia (silicagel GF254 y silicagel HF254). La materia fluorescente inorgánica
(un silicato de zinc activado con manganeso), hace innecesario en muchos casos, tener que
colorear tas sustancias. Se observa el cromatograma en la luz de una lámpara UV de onda corta.
Las sustancias que absorben la luz UV aparecen como manchas de absorción oscuras sobre un
fondo fluorescente.

ALUMINA:

Hasta ahora el óxido de aluminio (alúmina), se ha utilizado con menor frecuencia en la

cromatografía de capa fina que la sílica gel. Las múltiples posibilidades de aplicación de la
alúmina incluyen por ejemplo la separación de terpenos, alcaloides, esteroides, combinaciones
alicíclicas, alifáticas y aromáticas.
 La alúmina tiene reacción alcalina, por lo tanto se usa frecuentemente para la separación de
compuestos con características básicas en preferencia o la sílica gel. Debido a su naturaleza
básica, no.se requiere añadir cantidad alguna de base al solvente de desarrollo.
La cromatografía de capa fina sobre alúmina también se usa como una herramienta
complementaria para la cromatografía de columna, técnica en la cual la alúmina se emplea más
extensamente que la sílica gel. La alúmina presenta sitios de adsorción de estructura química
variada del tipo: Al5+, Al - OH, Al – O-, Al – OH+ y dependiendo de su preparación iones sodio o
hidronio.
La alúmina puede obtenerse en tres formas: acida, básica y neutra. La alúmina acida es una
alúmina lavada con ácido, la cual produce una suspensión en el agua con un pH de
aproximadamente 4.

Esta alúmina es adecuada para la separación de compuestos con propiedades acidas tales como
aminoácidos y ácidos carboxílicos. La alúmina neutra (pH aproximadamente 7) se puede usar
para la separación de cetoesteroides, glicósidos, cetales, lactonas, algunos esteres y para la
deshidratación de solventes.

La alúmina básica (pH aproximadamente 10) es adecuada para la separación de compuestos

con características básicas como las aminas.

Este tipo de alúmina, posee el más amplio espectro de aplicación. Los .compuestos altamente
polares se, adsorben fuertemente sobre, este material, mientras que los compuestos no-polares
(excepción hecha con los hidrocarburos insaturados) se enlazan débilmente. La acetona, no
debe usarse como solvente de elución con alúmina básica de alto grado de actividad, ya que
puede condensar por una reacción de condensación aldólica.

Existen varios tipos de alúmina dependiendo de su grado de actividad, la cual se mide en la

escala de Brockman, de acuerdo al contenido de agua. Los grados de actividad son los siguientes:

Grado de Actividad I II III IV V

Peso de agua (% en 0 3 6 10 15
peso)

Para la alúmina, el grado de mayor actividad se define como actividad I de Brockman. El

contenido de agua posee un significado decisivo, ya que las moléculas de agua fácilmente
adsorbibles bloquean los puntos activos de la superficie.

La cromatografía de los ácidos y bases se desarrolla en forma diferente. De los adsorbentes que
más se emplean en cromatografía de capa fina, la sílica gel es relativamente acida y la alúmina
es relativamente básica. SÍ se intentara cromatografiar solutos con propiedades acidas sobre.,
alúmina, estos se unirán fuertemente al adsorbente mediante fuerzas iónicas.

Debido a este hecho, se moverán con mucha dificultad a lo largo de la capa de adsorbente, por
lo tanto, su separación será muy difícil.

Igual situación ocurrirá con solutos básicos sobre sílica gel. Es así como, las bases deberán ser
cromatografiadas sobre alúmina, donde podrán ser adsorbidas en casi la misma extensión que
los alcoholes. Los ácidos y fenoles, deberán ser separados sobre sílica gel, donde podrán ser
adsorbidos en una extensión un poco mayor que los alcoholes.
KIESELGUHR Y CELULOSA:

El kieselgur adsorbe más débilmente que la sílica gel y la alúmina. Por eso es especialmente
apropiado para separaciones de combinaciones polares (en particular para cromatografía de
reparto). Estos dos adsorbentes se usan como soportes para películas líquidas en la
cromatografía de partición.

Este tipo de cromatografía se usa siempre para la separación de moléculas muy polares como
los amino-ácidos, los carbohidratos y algunos otros compuestos hidrofílicos naturales y
frecuentemente para la separación de isómeros estrechamente relacionados. Se debe tener
cuidado de asegurar que las capas contengan un líquido corno fase estacionaria, generalmente
agua. Esto es .especialmente el caso, cuando las capas se preparan por el método de inmersión.
El sistema de solventes usado con estos adsorbentes contiene generalmente varios
constituyentes, uno de los cuales es la fase estacionaria liquida, por ejemplo, agua.

CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA A APLICAR.

La cantidad de muestra en la cromatografía de adsorción es muy importante, puesto que el
poder adsorbente de la superficie disminuye marcadamente con el incremento de la .cantidad
de muestras, ya que se ocupan primero los centros más activos. El resultado es la aparición de
"colas" en dirección al origen.

Los mejores resultados se consignen al aumentar tanto como se pueda la relación

adsorbente/muestra. Lo normal es que sea de 1000 a 1, para obtener resultados satisfactorios.
En todo cuso, tas cantidades que se pueden cromatografiar sin formación de cola, son distintas.
Dependen del nivel de adsorción total, es decir de la clase de adsorbente y de su capacidad, que
en general va paralela con la actividad de adsorción.

Para un espesó de capa de 250 𝜇, las cantidades de sustancias que se pueden

cromatografiar en cada capa de silicagel ascienden a unos miligramos, sobre las capas de óxido
de aluminio menos activadas, la décima parte, mientras que sobre capas de Kieselgur inactivas,
se pueden cromatografiar solamente 25 hasta 50 𝜇g de mezclas de sustancias.

ETAPAS PARA REALIZAR-UNA CROMATOGRAFÍA DECAPA FINA

PREPARACIÓN DE LA PAPILLA DE ADSORBENTE

Sobre las placas se esparce en forma homogénea una papilla de adsorbente dispersado en un
solvente adecuado. Si el adsorbente no contiene aglomerante, las papillas de adsorbente
pueden conservarse en frascos cerrados, casi indefinidamente.

Normalmente, las papillas se hacen con agua que, si es necesario, puede contener ácidos, bases,
lampones o reactivos acomplejantes. El mayor problema en esta técnica es conseguir una
consistencia correcta. Si la papilla es demasiado diluida correrá rápidamente, dando lugar a
capas, excesivamente finas. Por el contrario, si es muy espesa se extiende muy difícilmente,
siendo fácil obtener líneas o grumos a lo largo de las placas. La papilla con agua debe usarse
inmediatamente después de su preparación, de lo contrario comenzará a formar grumos. Esta
no debe emplearse si la misma ha estado sin uso después de un periodo de tiempo. Las placas
preparadas con una papilla acuosa deben secarse en una estufa antes de su uso.

Aún cuando, se pueden usar un gran número de solventes, para preparar la papilla, el cloruro
de metileno y el cloroformo son probablemente los más convenientes. Poseen dos ventajas,
ambos tienen bajos puntos de ebullición y la habilidad para evitar que el adsorbente forme
grumos. Los bajos puntos de ebullición significa que no es necesario secar las placas revestidas
de adsorbente en una estufa. Además, fas placas preparadas con estos solventes son estables
por varios días. Tienen la desventaja, que la capa de adsorbente formada sobre el vidrio es frágil
y por tanto se debe tratar cuidadosamente.

Por esta razón, algunas personas prefieren añadir una pequeña cantidad de metanol para hacer
posible que el aglomerante se fije más firmemente. El metanol solvata el sulfato de calcio tanto
como el agua.

La papilla se prepara convenientemente en un recipiente de tamaño mediano con tapa

hermética. Se requieren de 3 ml de diclorometano por cada gramo de sílica gel.

Para obtener una papilla sin grumos, se deberá añadir la sílica gel al solvente, mientras la mezcla
está siendo agitada. Añadir solvente al adsorbente usualmente causa la formación de grumos
en la mezcla. Cuando la adición del solvente es completa, se coloca la tapa del recipiente y se
cierra herméticamente, se agita vigorosa y para asegurar un mezclado completo.
PREPARACIÓN DE LAS PLACAS.

Las placas para la cromatografía de capa fina se pueden adquirir comercialmente revestidas de
capas muy uniformes de sílica gel o alúmina sobre láminas de plástico. Estas placas pueden
obtenerse con o sin un colorante fluorescente impregnando la superficie del adsorbente. Sin
embargo, generalmente se usan placas de vidrio, de tamaño variable según las necesidades de
la aplicación particular. Las dimensiones más comunes son:

7,5 x 2,5 cm (portaobjeto)

20 x 5 cm
20x10cm
20x20 cm (para cromatografía bidimensional)
100 x 20 cm (para cromatografía preparativa)

Las placas deben lavarse con jabón y agua, lavadas nuevamente con agua y luego con metanol
acuoso al 50%. Seguidamente, se permite que las placas se sequen completamente sobre toallas
de papel. La manipulación de las placas debe hacerse por los extremos, debido a que las huellas
digitales sobre la superficie de las placas hacen dificultoso que el absorbente pueda adherirse al
vidrio.

Para la preparación de placas de capa fina sobre láminas de vidrio en el laboratorio se usan
frecuentemente dos métodos:
(i) por revestimiento
(ii) por inmersión.

REVESTIMIENTO.

En este método, placas de vidrio del mismo espesor se disponen en hilera sobré un soporte
especial, extendiendo la papilla de adsorbente con un extendedor de capa fina. Si las placas de
vidrio poseen distinto espesor se usa un aparato con un dispositivo que permite colocar las
placas de tal manera que todas ellas tengan la superficie superior en un mismo plano, para
asegurar que cada placa recibe el mismo espesor de adsorbente., al deslizar el extendedor con
el adsorbente tal como se indica en la figura:
El nivelador automático de placas tiene una manivela frontal, la cual, con un giro, hace que
suban fas placas y queden niveladas por la parte superior, ofreciendo una superficie total en
un mismo plano, aunque el grosor de las placas sea diferente.

Las placas se aplican por medio del extendedor, el cual cuenta con una serie de calibraciones
para conseguir capas de 0,25 ; 0,50 ; 0,75 ; y 1 mm de espesor.

Habiendo preparado las placas, el paso siguiente es el pecado, lo que se consigue

alentándolas en una estufa a una temperatura de.100 - 125 °C durante un par de horas. De
esta forma se activan, lo que las hace adecuadas para la cromatografía de adsorción.

INMERSION.

Este es el método más ampliamente usado para preparar placas revestidas de adsorbente,
tipo portaobjetos, con fines didácticos en el laboratorio.

Consiste en sumergir un par de portaobjetos de vidrio de similares dimensiones adheridos uno

contra el otro y sujetados por un extremo con los dedos índice y pulgar, dentro del recipiente
que contiene la papilla a una velocidad constante hasta que aproximadamente 0,25 cm desde
el borde superior de las placas permanezca sin revestimiento de adsorbente. A continuación,
se extraen las placas, lentamente a una velocidad constante: La operación puede visualizarse
en la figura:
La operación total del procedimiento oscila entre 3 y 5 segundos. Se requiere de cierta práctica
para ajustar el tiempo correcto. Después de extraídas, se permite escurrir la suspensión
sobrante en el otro extremo de la placa, apoyando el borde inferior de las placas en la parte
superior del envase que contiene la papilla. Las placas se separan, limpiando con un dedo el
exceso de absorbente que haya quedado en los bordes y en la superficie no cubierta de las
placas, para finalmente colocarlas sobre una toalla de papel para completar el proceso de
secado.

APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS SOBRE LAS PLACAS.

Los métodos son prácticamente los mismos que para la cromatografía de papel, teniendo en
cuenta que la mayor delicadeza de lar> capas finas exige mayor cuidado al aplicar la muestra.
Las muestras se aplican con un capilar sobre la línea base, dejando evaporar el disolvente (Ver
figura).

Los capilares que se usan son una extensión muy fina del tipo empleado en la determinación
de puntos de fusión. (ver figura). La evaporación del disolvente en la capa fina es tan rápida
que no es necesario el empleo de un secador de pelo u otro aparato similar. El diámetro de las
manchas en el origen debe ser lo más pequeño posible.

Las solución es no muy concentradas se pueden aplicar varias veces dejando evaporar el
disolvente entre cae a aplicación. El volumen de la muestra suele ser de 1 microlitro. No se
debe olvidar marcar la placa de forma adecuada, antes -de-comenzar la cromatografía. Lo más
sencillo es enumerar los puntos de origen de izquierda a derecha, anotando las sustancias
que se aplican en cuaderno de laboratorio.
ELECCIÓN DEL DISOLVENTE

Para obtener resultados reproducibles, en la cromatografía se deben usar solamente

disolventes muy puros. En general, se procura emplear disolventes (eluyentes) sencillos, de uno
o dos componentes. En caso de disolventes de varios componentes, hay que evitar que los más
volátiles se evaporen si se emplean recipientes que no cierran herméticamente. Cuando
se trata de mezclas de sustancias desconocidas, lo mejor es emplear en primer lugar como
disolvente benceno o cloroformo (con contenido de alcohol). Si las sustancias se quedan durante
la cromatografía cerca del origen, entonces o bien se elige un medio disolvente de mayor
polaridad o se agrega aldisolvente empleado otro miscible con él de mayor polaridad.

Si las sustancias se desplazan demasiado aprisa (cerca del frente), se emplea entonces un
disolvente, con menor polaridad. En todo caso, la elección del disolvente dependerá de la
naturaleza, de los compuestos que se van a separar y del material adsorbente sobre el cual se
desarrollará la separación. Una regla general para la elección del disolvente es establecer la
comparación de polaridad del mismo con respecto a las polaridades de las sustancias a separar.

Así, para sustancias solubles en agua se elegirán capas de celulosa o silicagel, empleándose un
disolvente polar. Para sustancias menos polares se elegirán capas de alúmina o silicagel
activadas, empleándose un disolvente no acuoso apropiado.
Una técnica sencilla para la elección del disolvente a emplear en una determinada separación
consiste en colocar una serie de manchas de la muestra a -intervalos en una placa. Los
disolventes se prueban aplicándolos en los centros de las manchas mediante un capilar muy
fino, lo que permite desarrollar las manchas radialmente (ver figura).
En el caso representado el disolvente 2 resulta ser el más apropiado, debido a que resulta en
la separación del mayor número de componentes de la mezcla en estudio.

DESARROLLO DE LAS PLACAS.

El desarrollo se lleva a cabo por el método ascendente en cubetas especiales para

cromatografía o en recipientes adecuados tales como frascos pequeños con tapa de rosca,
vasos de precipitados cubiertos con vidrio de reloj, etc, del tipo que se muestran en las figuras
anexas.

En el interior de la cámara de desarrollo debe colocarse un papel de filtro, empapado de

disolvente, que cubra las paredes interiores de la misma, para conseguir que la atmósfera esté
saturada de vapor del disolvente.

El fondo de la cubeta se cubre de disolvente hasta una altura de 0,5 a 1 cm y, después de un

periodo de tiempo apropiado, en el que se consigue el equilibrio, se introduce la placa.
Durante el desarrollo no puede moverse la cubeta. Por lo general, cuando se desarrolla una
placa se deja que ascienda el disolvente unos 10 cm por encima del origen y se saca la placa.
El frente del disolvente se marca cuidadosamente con un lápiz puntiagudo y se deja evaporar
el mismo, operación que dura unos pocos minutos. Si es necesario se calienta la placa,
estando lista para el revelado.

REVELADO DE LAS PLACAS.

Los procedimientos empleados para revelar las placas son análogos a los que se usan en la
cromatografía sobre papel. Sin embargo, existen algunas diferencias interesantes. En principio,
el método de bañado no es recomendable, ya que las placas se estropean fácilmente con este
método.

Una de las ventajas de la cromatografía en capa fina sobre la de papel es la posibilidad de

revelado con agentes corrosivos tal como los ácidos concentrados .y compuestos fuertemente
oxidantes,, a alta temperatura, debido a la naturaleza inorgánica de la capa. Otro reactivo muy
empleado son los vapores de yodo.

En un recipiente con tapa hermética que contiene en el fondo unos pocos cristalitos de yodo,
se introduce el cromatograma y se deja unos minutos.

El yodo tiende a concentrarse en los sitios donde están los compuestos, por lo que aparece una
mancha marrón oscuro, sobre un fondo amarillo pálido. En tanto que el yodo no reaccione con
los compuestos revelados, el método es extraordinariamente bueno como revelador no
destructivo.

Otros métodos que no afectan a los productos en el revelado son la fluorescencia y la

radiactividad: Muchas placas llevan impregnadas sustancias fluorescentes como aditivos para el
revelado de los compuestos, localizándose los mismos por la aparición de manchas no
fluorescentes. Además, muchas veces los compuestos a separar absorben en el ultravioleta,
siendo este el método más sencillo para localizarlos.

Cuando se emplea una lámpara UV, cualquier material orgánico, que contenga un cromóforo,
aparecerá sobre la placa como una mancha oscura sobre un fondo luminoso. Teniendo en
cuenta que el material orgánico se deposita sobre la superficie del adsorbente, si se tiene un
cromóforo, actuará como una sombra o cortina que evitará que la radiación UV alcance la
superficie del adsorbente. La posición de la mancha debe delinearse como se mencionó antes.
Si se desea emplear el revelado UV, se coloca la placa seca bajo una lámpara UV,
preferiblemente en un recinto oscurecido. Existen diversas lámparas de luz UV, pero las dos más
comunes son una que puede manipularse con la mano y colocarse directamente sobre la placa
y otra con un recinto cerrado por todos los lados, provista de un trapo oscuro en la parte frontal
y una mirilla en la parte superior. Si se emplea una lámpara de mano, se mantiene sobre la placa
a una altura de 10 cm aproximadamente, tal como se muestra en la figura. Mírese sólo la placa,
evite siempre mirar directamente a la lámpara.
CONSERVACION DEL CROMATOGRAMA

La conservación de los cromatogramas en capa fina es difícil y generalmente indeseable, puesto

que tas placas se utilizan muchas veces. Interesa, por tanto, encontrar un medio para conservar
los cromatogramas obtenidos. El espesor del vidrio y la naturaleza tan delicada de la capa son
obstáculo para guardar los cromatogramas. La posición de las manchas después del revelado
puede fotografiarse o dibujarse. Un método que puede usarse convenientemente, consiste en
adherir con sumo cuidado sobre la superficie del adsorbente, una cinta plástica transparente de
una anchura un poco mayor que el de la placa y, tratar que el cromatograma se pegue en la
cinta de manera que conservarlo por largo tiempo.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA EN QUÍMICA ORGÁNICA.

La técnica de cromatografía en capa fina tiene muchos usos importantes en química orgánica.
Puede usarse en las siguientes aplicaciones.
1.- Establecer si dos compuestos determinados son idénticos.
2.- Determinar el número de componentes en una mezcla.
3.- Determinar el solvente apropiado para una separación en columna cromatográfica.
4.- Monitorear la separación de una columna cromatográfica.
5.- Comprobar la efectividad de separaciones realizadas en columna, o mediante técnicas de
extracción o cristalización.
6.- Registrar el progreso de una reacción.

En todas estas aplicaciones, la cromatografía de capa fina tiene la ventaja sobre otras técnicas,
que en esta, se usan pequeñas cantidades de material para realizar los análisis. Con muchos de
los métodos de visualización, se pueden detectar cantidades tan pequeñas como 10 -7 gramos.
Por otra parte, pueden utilizarse cantidades relativamente grandes como 1 miligramo.

El uso de la cromatografía de capa fina, puede servir para establecer la identidad química de dos
compuestos que se sospechan son idénticos. Simplemente se aplican ambos compuestos en una
misma placa y se desarrolla en un solvente adecuado. SÍ ambos compuestos recorren la misma
distancia, es decir tienen el mismo valor de Rf estos serán probablemente idénticos. Si en
cambio, la posición de ambas manchas no es la misma, se puede asegurar en forma definitiva y
concluyente que los dos compuestos no son idénticos.
Es importante, aplicar ambos compuestos en la misma placa. Esta precaucion.es especialmente
importante cuando se usan placas preparadas por inmersión, puesto que estos varían de uno a
otro. Dos placas preparadas de esta forma no tendrán exactamente el mismo espesor de
adsorbente.

La cromatografía en capa fina, también encuentra aplicación para establecer si un compuesto

es una sustancia pura o en su defecto se trata de una mezcla. Una sustancia pura produce una
sola mancha sin importar el solvente que se use para desarrollar la placa. Por otra parte, el
número de componentes de una mezcla puede establecerse probando varios solventes para
desarrollar la mezcla.

Sin embargo, los resultados deben tomarse con cuidado, ya que a menudo resulta difícil,
conseguir un solvente adecuado que pueda separar una mezcla de compuestos con propiedades
muy similares tales como los isómeros. La falta de separación no es prueba absoluta de que un
aplicación particular de una muestra sea una sustancia pura.

Podernos emplear la cromatografía de capa fina para determinar el mejor solvente que podrá
ser usado en la resolución de una mezcla que ha de ser separada utilizando la técnica de
cromatografía en columna. El proceso consiste en preparar varias placas, impregnadas con el
mismo adsorbente que será usado en la separación por cromatografía en columna, aplicar la
solución de la mezcla en cada una de las placas y analizar los resultados que se obtienen al
desarrollar la cromatografía de capa fina en solventes de diferente polaridad. El solvente que
proporciona una mejor resolución en capa fina, muy probablemente funcionará mejor en
columna. Estos experimentos en pequeña escala tienen la virtud de ser rápidos, usa pequeñas
cantidades de material y ahorrar tiempo.

En forma similar, la técnica de TLC, puede usarse para monitorear el progreso de una separación
por cromatografía de columna. Una situación hipotética se analiza en los diagramas de la figura
que se muestra a continuación.

El análisis preliminar por cromatografía de capa fina revela que un solvente determinado,
separa la mezcla en cuatro componentes (A-D). Por lo tanto, se usa este solvente para eluir la
columna. Este proceso conduce a la obtención de 11 fracciones de 15 ml cada una.

El estudio detallado de las distintas fracciones por TLC muestra que las fracciones 1, 2, y 3,
contienen el componente A, las fracciones 4, 5, 6, y 7, el componente B, las fracciones 8 y 9, el
componente C y las fracciones 10 y 11, el componente D. Se observa que las fracciones 3, 4, 7 y
9 se obtienen con una pequeña contaminación de otro componente. La fracción 3 está
contaminada O con algo de B. la 4 con A, la 7 con C y la 9 con D.

Otro ejemplo de la aplicación de la técnica de TLC, se encuentra en el análisis de una mezcla

producto de una reacción. El análisis del producto de reacción por TLC, produjo dos manchas, A
y B. Después de la cristalización del producto, se procedió a analizar los cristales obtenidos por
TLC, encontrándose que los cristales eran puros e idénticos al componente A, mientras que las
aguas madre contenían una mezcla de A y B. Estos resultados conducen a pensar que el proceso
de purificación resulta satisfactorio para e! componente A.

Finalmente, es posible usar la técnica de TLC para monitorear el progreso de una reacción. A
intervalos de tiempo específicos, durante el transcurso de la reacción, se toman muestras de la
mezcla de reacción y se someten a análisis por TLC. Un ejemplo se detalla en las figuras
esquematizadas a continuación:

En este caso, se desea convertir el reactante A en el producto B. Al comienzo de la reacción (0

hr), se preparó una placa en la cual se aplicaron los compuestos puros A y B, además de la
mezcla de reacción. Análisis similares se condujeron a 0,5; 1; 2; y 3 horas después del inicio de
la reacción. Las placas muestran que la reacción se completa en 2 horas: Cuando el tiempo de
reacción se prolonga por más de 2 horas, comienza a aparecer un producto colateral nuevo C.
Por lo tanto, e! tiempo óptimo tío reacción es de 2 horas.
 “CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA”

1. INTRODUCCIÓN

La palabra cromatografía proviene del griego chromo (color) y graphos (escrito). La cromatografía es
un sistema analítico que permite separar los diferentes componentes de una muestra problema por
distribución entre dos fases, una estacionaria y otra móvil, con el fin de identificarlos y/o
cuantificarlos.

 Fase Móvil (eluyente): Efecto de desplazamiento ejercido sobre los componentes de la mezcla
por una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas, sobre una fase estacionaria. Cuando
se utiliza un líquido como fase móvil mediante una serie eluotrópica se escoge la mejor
combinación de solventes miscibles para una buena separación cromatográfica de una
muestra en sus componentes, para lo cual se pueden emplear éter de petróleo, hexano,
benceno, tolueno, cloroformo, etc.
 Fase estacionaria (adsorbente): Efecto de retención producido sobre los componentes de la
mezcla por una fase estacionaria, que puede ser sólida o líquida, anclada a un soporte sólido.
Si es un líquido, puede estar distribuido en un sólido, el cual puede o no contribuir al proceso
de separación. El líquido puede también estar químicamente unido al sólido (Fase Ligada) o
inmovilizado sobre él (Fase Inmovilizada). Los adsorbentes más utilizados son: sílica gel (SiO2)
y alúmina (Al2O3).

El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria,

impulsados por la fase móvil, recibe el nombre de elución. El orden de elución de un compuesto se
incrementa al aumentar la polaridad de la fase móvil o eluyente.

CROMATOGRAFÍA DE PAPEL

La cromatografía en papel es la técnica de separación e identificación de sustancias químicas

mediante un disolvente que se mueve sobre hojas o tiras de papel de filtro. Es la más sencilla de las
técnicas, pero sólo dará resultados cualitativos. El método se basa en un mecanismo de reparto, y
consiste en depositar una pequeña cantidad de muestra en el extremo de una tira de papel de filtro,
que se deja evaporar. Luego se introduce la tira en una cubeta que contenga el disolvente, de manera
que éste fluya por la tira por capilaridad (fig. 1).

Figura 1. Cromatografía de papel

Fuente: OpenCoursiveWare, Cromatografía, 2011.

CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

Es la técnica utilizada para separar los componentes puros de una mezcla, de acuerdo con su
polaridad. Consiste, en que la fase estacionaria se encuentre sobre un plano formando una capa de
partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio o aluminio ((Thin Layer
Chromatography, TLC), la muestra es aplicada en puntos o en banda, para posteriormente ser eluída
dentro de un tanque cromatográfico como se ilustra en la figura 2.

Figura 2. Diagrama de una cromatografía de capa fina

Fuente: biomodel.uah.es, Cromatografía, 2008.

La cromatografía en capa fina como método cualitativo y cuantitativo, siempre requiere contar con un
estándar de referencia para comparar su valor de factor de retardo (Rf) y el color de la mancha del
estándar al ser revelada con agentes químicos, con los datos experimentales obtenidos.

Para el caso de cromatografía de papel y de capa fina se analiza el factor de retardo de la siguiente
manera:

 Factor de retardo (Rf): Es un valor relativo para cada sustancia y depende de las condiciones
cromatográficas con que se haya trabajado (fase móvil, fase estacionaria, eluyente y el
tiempo de saturación). El valor de Rf es el coeficiente de la distancia recorrida por el
compuesto (DM) para la distancia recorrida por el disolvente (DF), se lo puede visualizar el la
figura 3.

Figura 3. Representación del factor de retardo

Fuente: Martínez, et al., Manual de prácticas de laboratorio de farmacognosia y fotoquímica, 2008.

 Revelado de la placa: Se denomina revelado de placa a los métodos empleados para la

visualización de los componentes no coloreados de la muestra. El revelado de las placas se
puede realizar mediante dos métodos: método químico (por inmersión o rociado de reactivos
colorantes como yodo); y método físico (mediante la radiación con luz UV).
2. OBJETIVO

 Aplicar cromatografía de capa fina (CCF) para muestras de analgésicos y colorantes.

3. MATERIALES Y REACTIVOS

Muestras

Cafeína
Analgésicos con contenido de cafeína
Rojo congo (0.1% m/v)
Rojo de fenol (0.1% m/v)
Azul de metileno (0.1% m/v)

Reactivos

Butanol
Agua
Ácido acético
Hexano

Materiales

Papel filtro
Tubos de ensayo
Vasos de precipitación
Matraces erlenmeyers
Mortero y pistilo
Vidrios reloj
Pipetas
Probetas
Espátulas
Varillas de agitación
Embudos
Tijera
Regla

4. PROCEDIMIENTO

PREPARACION DE LAS MUESTRAS

Preparar una solución de los colorantes a una concentración de 0.1% (5 ml).

Para los analgésicos se trituran por separado hasta obtener un polvo fino. Intentar disolver 0.2gr en
5 ml de etanol al 95%. Filtre y conserve el filtrado para aplicar en las placas de capa fina. El patrón
de cafeína se prepara disolviendo 0.1 gr de cafeína en 10 ml de etanol al 95%. En caso de no
disolverse, someter a baño maría.

PREPARACIÓN DE LA PLACA PARA CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

Cortar un trozo de la lámina de sílica gel para CCF según lo requerido.

Trazar una línea con lápiz a 0,5 cm del borde inferior y a 0,5 cm del borde superior del papel.

En el borde inferior, marcar un punto con el lápiz a 0.5 cm del borde izquierdo donde se colocara la
primera siembra, la segunda siembra se la realizara a 0.5 cm de la primera aplicación (continuar
con el mismo proceso para las demás aplicaciones), la última siembra se la realiza a 0.5 cm de
distancia del borde derecho de la placa.

Aplicar las diferentes muestras sobre la placa cromatográfica en los puntos de señalados.

Colocar en un vaso de precipitación el solvente a emplear (figura 4).

Dejar eluir y evitar que el solvente llegue a la línea superior marcada con lápiz y con las muestras
aplicadas, retirar y dejar secar los cromatogramas.

Figura 4. Cromatografía de capa fina y preparación de muestra

PREPARACIÓN DEL SOLVENTE

Preparar la solución que se indica en la tabla 1 para un volumen de 5 ml para cubrir la base del
recipiente a emplear (que no sea mayor a 0.5 cm de altura):

Tabla 1. Relación para mezcla del solvente

Mezcla Solventes Relación

M1 1-Butanol:Ácido Acético: Agua: Hexano 4:3:5:1
Fuente: Laboratorio de Química Orgánica, 2015

5. DATOS OBTENIDOS

Reportar los datos de distancias recorridas por los colorantes y los analgésicos sobre las placas de
capa fina.

6. RESULTADOS
Calcular el Rf para cada color y para los analgésicos con cada mancha observada.

Tabla 2. Datos obtenidos

Colores Distancia recorrida (cm)

Solvente Marca Color Rf
separados Rx (solvente) Rx (colores/analgésicos)

Fuente:

Elaborado por:

Reportar los gráficos (fotografías) .

6. DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES

8. CUESTIONARIO

 Indique la clasificación de la cromatografía de acuerdo al estado físico del eluyente y del

mecanismo de separación.
 ¿En qué consisten las fuerzas propulsoras y las fuerzas retardantes en cromatografía?
 ¿Qué es el RF?
 El valor del Rf ¿Depende del eluyente?
 ¿Qué es el TR?
 Explique las razones por las cuales unos solventes son más polares que otros. Considerar los
solventes utilizados en la práctica.
 ¿Por qué se dice que la cromatografía en capa fina es un criterio parcial y no total de
identificación?
 ¿Cuál es la importancia y las aplicaciones de cromatografía de capa fina?
 ¿Qué significa que una sustancia tenga: Rf menor a 0.5, mayor a 0.5 e igual a 0.5?
 ¿Según lo realizado en la práctica cuál será el resultado de los siguientes errores en
cromatografía en capa fina?
-Aplicación de solución muy concentrada
-Utilizar eluyente de alta polaridad
-Emplear gran cantidad de eluyente en la cámara de cromatografía

9. BIBLIOGRAFIA

1. Introducción a la Cromatografía, David Abbott y R.S. Andrews, Tercera Edición., Alhambra

S.A. Madrid., 1973.
2. Paper, Thin Layer Chromatography and Electrophoresis, A Teaching Level Manual, Smith Ivor
and Feinberg, J. G. Shandon, London, 1965.
3. Experimental Methods in Organic Chemistry, Moore, J. A.., and Dalrymple, D. L., Second
Edition., W. B. Saunders Co., Philadelphia,, 1976.
4. Introduction to Organic Laboratory Techniques. A Contemporary Approach, Second
Edition., Pavia, Lampman y Kriz