UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE BIOMOLÉCULAS
PROF.º DR.º EVERALDO SILVINO DOS SANTOS

Leonete Cristina de Araújo F. M. Silva

Shi, W., Lin, D. Q., Tong, H. F., Yun, J. X., & Yao, S. J. (2015). 5-
Aminobenzimidazole as new hydrophobic charge-induction ligand for
expanded bed adsorption of bovine IgG. Journal of Chromatography A, 1425,
97–105. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2015.10.055

Novembro/2018
1. Introdução
 A adsorção de leito expandido – Expanded Bed Adsortion (EBA) pode
captar proteínas-alvo diretamente da matéria-prima
 A Cromatografia com indução de carga hidrofóbica (HCIC):
 Tecnologia promissora para separação de biomoléculas
 Alta capacidade
 Boa seletividade
 Custo relativamente baixo, sem pré-tratamento com diluição ou adição de
sal.
 A combinação da EBA com a HCIC é uma plataforma potencial para
recuperação de anticorpos com menos tratamento prévios, alta
eficiência e custo relativamente baixo.
1. Introdução
 EBA:
 Tecnologia inovadora desenvolvida na década de 90 que permite a captura
de proteína-alvo diretamente da matéria-prima, combinando uma etapa de
separação sólido-líquido e outra de adsorção.
 Vantagens:
 Reduz o tempo operacional
 Aumenta o rendimento global
 Menor investimento de capital e energia
 Sériede resinas comerciais: Streamline e Streamline Direct →
Necessidade de desenvolver novas sérias de resinas para melhor o
desempenho da EBA.
1. Introdução
 Nas aplicações mais comuns da EBA aplicam-se resinas que atuam por
troca-iônica e interação hidrofóbica. Problemas:
1. Devido à complexidade da estrutura biomelecular, a seletividade dos
dois tipos de ligação é limitada;
2. Necessidade de pré-tratamento:
1. Para troca-iônica, de diluição;
2. Para interação hidrofóbica, adição de sal.
 A HCIC com ligantes bimodais ionizáveis é um novo método de
separação de proteínas. Proposta:
Ligantes:

Anel de imidazale
oferece uma melhor
ligação hidrofóbica
com a proteína-alvo.
1. Introdução
 Resultados anteriores mostram que o ABI se liga de forma favorável ao
IgC, podendo atuar como ligante na HCIC para purificação de
anticorpos.
 O que o trabalho estudou?
1. Processo EBA (Adsorção por batelada e frontal)
2. Absorção do IgC pelas resinas (Efeito do pH e da adição de sal) →
Dinâmica de ligação
3. Separaçao de bIgC da matéria-prima contendo albumina de soro bovino
(BSA) → Expansão do leito e mistura do líquido no leito expandido.
4. EBA para separa o bIgG do soro de leito bovino.
5. Potencial de aplicação de nova resina de HCIC para purificação de
anticorpos – discussão.
2. Materiais e Métodos
 Materiais:
 Ligantes: ABI e MEP (J&K technology, Co.m Ld – China)
 Esfera de agarose → metodologia explicada em publicação anterior
 Globlilina de soro bovino - IgC Bovina (Merck KGaA - Darmstadt,
Alemanha)
 BSA – Sigma (Milwaukee, WI, EUA)
 Leite bovino – Recurso Local
 Demais materiais – adquiridos comercialmente conforme padrão de
qualidade requerido
2. Materiais e Métodos
 Acoplamento de ligantes:
 Ativação da matriz com Brometo de Anila
 Bromadas por N-bromossuccinimida

Mistura em 11 mL de Dimetil sufóxido a 20%: 10 g de esfera de agarose drenada + 4 mL

de brometo de Alila + 5g de NaOH (Agitação: 180rpm, T=50ºC,t=24h)

Matrizes ativadas: Lavagem com água deionizada → Mistura : 10 mL de H2O + NBS 3

Molar (Agitação: 180rpm, T=30ºC,t=1h)

Matrizes bromadas: Mistura em 10mL de Na2CO3 1M de 3 Moles de excesso de MEP e

ABS(Agitação: 180rpm, T=30ºC,t=12h)

Lavagem com: HCL -1M; NaOH – 0,1M; Água deionizada

Armazenamento em etanol a 2-% (v/v)

2. Materiais e Métodos
 Para verificar o comportamento estático de adsorção do bIgC nas
resinas MEP e ABI foram realizados experimentos de equilíbrio de
adsorção.
 Soluções:
 Tampão de Acetato de Sódio 20mM (ph 5,0).
 Tampão de Fosfato20mM (ph 6,0 7,0 8,0).
 Tampão de glicerina 20mM (ph 9,0 10,0).
 Concentração de proteína sobrenadante determinada por
espectofotômetro On Drop com leitura a 280 nm.
 Ajuste da isoterma de adsorção: Langmuir.
 Influência de sal: Sulfato de amônio e cloreto de sódio.
2. Materiais e Métodos
 Para avaliação do leito empacotado:
 Coluna (diâmetro: 1 cm; resina: 13,5mL; altura do leito: 19 cm)
 Carga: Solução bIgC (2mg/mL) em velocidades (200 cm/h, 200 cm/h e 200
cm/h).
 Cálculo da capacidade de ligação dinâmica a 10% de penetração.
 Determinação da proteína: leitura a 280 nm.
 Separação da matéria-prima contendo bIgG e BSA na mesma coluna:
 Monitoramento de pH
 Tampão de carga: (Fostato e glicerina) pH 9,0
 Tampão de eluição: (acetto) pH 3 3,5 4 4,5
 Matéria-prima: mistura protéica de 2mg/mL de bIgC e 10mg/mL de BSA
2. Materiais e Métodos
 Equilíbrio da coluna: Tampão de carga + 2 mL de mistura proteica
 Após carregamento, lavagem com tampão de carga e eluição com
tampão de acetato.
 Regeneração da coluna com NaOH 0,1M.
 Re-equilíbrio com tampão de carga para o teste seguinte.
 Monitoramento da cromatografia: leitura a 280 nm.
 Análise das frações (SEC-HPLC) e (SDS-PAGE)
2. Materiais e Métodos
 Estudo no leito expandido:
 Coluna (diâmetro: 1 cm; resina: 13,5mL; altura do leito fixo: 19 cm)
 Temperatura ambiente
 Leito expandido → 20 mM de tampão de fostato
 Tempo de equilíbrio: 20 a 30 min
 H → medida 3 vezes para calcular o valor da expansão do leito
 Teste com fator de expansão (FE): 1,6 – 1,8 – 2,0 – 2,2 – 2,4 – 2,6
 Critério de avaliação: medida e análise da distribuição do tempo de
residência (RTD)
 Calcula o coeficiente de dispersão
2. Materiais e Métodos
 Adsorção frontal em leito expandido:
 Para determinar a capacidade de ligação dinâmica de bIgC
 Coluna (diâmetro: 1 cm; resina: 13,5mL; altura do leito fixo: 19 cm)
 Leito expandido → 20 mM de tampão de fostato pH 8
 Tempo de equilíbrio: 20 a 30 min
 H → medida 3 vezes para calcular o valor da expansão do leito
 Teste com fator de expansão (FE): 1,8 – 2,0 – 2,2 – 2,4
 Quebra da proteína na saída detectada a 280 nm com LC3000
 Capacidade de ligação medida a 10% de penetração
2. Materiais e Métodos
 Separação de bIgG da mistura de proteína com leito expandido
 Separação de bIgG do soro bovino com leito expandido
 Análise SEC-PHLC e SEC-HPLC:
 Sistema LC3000 com coluna TSK G 3000 5WxL (7,8mmm x30cm)
 Análise SDS-PAGE
 SDS-PAGE não redutor a 12%
 Gel coomasie blue
 Sistema de imagem Doc2000 para imagem de gel de proteína.
3. Resultados
 3.1 Preparação da Resinas:

 Densidade do ligante Resina T-MEP: 86 mol/mL de resina

 Densidade do ligante Resina T-ABI: 76 mol/mL de resina
 Procedimento adotado foi adequado
 Eficiência no acoplamento dos ligantes foi semelhantes.
3.2 Equilíbrio da Adsorção de bIgG nas resinas

Queda
drástica da
capacidade
de adsorção

Maior
capacidade
de adsorção
3.2 Equilíbrio da Adsorção de bIgG nas resinas

pH ácido
para eluição

Faixa de pH
adequada
para adsorção
do bIgC
3.2 Equilíbrio da Adsorção de bIgG nas resinas
Capacidade de adsorção
ligeiramente inferior ao T-
MEP, devido a densidade do
ligante ser também
ligeiramente inferior.

Menores de valores de Kd na
faixa de ph entre 7,0 e 9,0
3.2 Equilíbrio da Adsorção de bIgG nas resinas:
Isotermas de absorção Influência do pH na
Adsorção do bIgG

T-MEP T-ABI
Efeito da adição de sais no
equilíbrio da adsorção de
bIgG (ph 8,0)
T-MEP
Apesar de haver mudança
na capacidade de adsorção
com a mudança da
concentração de sal, não
foi considerada
significativa.
Em baixa concentração
salina, ligação
predominante são as
pontes de hidrogênio.
Aumentando a
concentração salina,
expõe a área
hidrofóbica da
proteína melhorando a
T-ABI interação hidrofóbica
entre o ligante e o
bIgG.
3.3 Capacidade de ligação dinâmica e
separação proteica
• Experimento: Adsorção frontal de
15,15
leito fixo

6,74 5,21
5,65
3,6
2,53

Diminuição de Q10%
Aumento da velocidade
3.3 Capacidade de ligação dinâmica e
separação proteica
T-ABI→ O ligante pode oferecer interações hidrofóbicas
mais fortes com a molécula bIgG, melhorando a taxa de
adsorção.
T-ABI → É mais adequado para Adsorção com Leito
Expandido com alta velocidade de fluxo.

Diminuição de Q10%
Aumento da velocidade
3.3 Capacidade de ligação dinâmica e
separação proteica

Melhor resultado do experimento!

Purificação de bIgG da mistura proteica :
pHeluição:
4,0
Purificação de bIgG da mistura proteica :
pHeluição:
4,0

R: 70,2%
P: 74,4%

R: 82,2%
P: 72,4%

R: 74,4%
P: 76,8%
Escolhido para os
experimentos de
separação
 Purificação de bIgG da mistura proteica :
Otimização do
pHeluição: 3,0
3,5 4,0 4,5
 Purificação de bIgG da mistura proteica :
Otimização do R: 94,3%
pHeluição: 3,0
3,5 4,0 4,5 R: 92,3%

Aumento da
altura dos
picos → R: 82,2%
Melhor eluição
de bIgG em
condições
ácidas. R: 61,9%
Maior pureza: 90,3%
 Purificação de bIgG da mistura proteica :
Otimização do
pHeluição: 3,0
3,5 4,0 4,5

Pureza baixa

Relacionando
Recuperação e Pureza
→ Faixa adequada para
separação do bIgG da
mistura proteica
 Leito expandido
Teste para verificação o fator de extensão, tendo
em vista seu papel no desempenho da adsorção.
Conclusão: Leito permanece estável, ainda que
em altas velocidades.
Valores de Q10% do leito expandido se
aproximaram do leito empacotado.
Esta é a curva de ruptura na melhor capacidade
de ligação dinâmica.
 Adsorção competitiva, com
Separação de bIgG da mistura proteica alta carga é mais forte,
assim as moléculas de BSA
(pHcarga: 8,0 pHeluição:3,5) era substituídas pela de
bIgG, aumentando a pureza
Melhor condição de Melhor condição de e reduzindo a recuperação.
operação operação

R: 80,6% R: 80,6%
P: 78,2% P: 78,2%
 impurezas

Separação
de bIgG do
soro de leite
bovino
(condições
ABI como ligante é
otimizadas:
uma tecnologia
FE: 2,0
promissora para a
pHcarga: 8,0
purificação do IgG.
pheluição: 3,5)
4. Conclusões
 T-MEP e T-ABI → Comportamento estático similares: Alta adsorção de
bIgG, dependência de Ph e tolerância ao sal.

 T-ABI:
 maior capacidade dinâmica no leito fixo (relacionada à propriedade
hidrofóbica relativamente forte do ligante).
 Pode ser utilizado à alta velocidade mantendo a estabilidade do leito
expandido.
 Pode ser usada na separação de bIgG de matéria-prima complexa com alta
eficiência de separação.
4. Conclusões
 Condições otimizadas para separação de bIgG (Fator de expansão (FE):
2.0 / pHcarregamento: 8,0 / pHeluição: 3,5):

Matéria-prima Recuperação (%) Pureza (%)

Mistura proteica 90,6 78,2
Soro bovino bruto 78,2 80,6

 O uso da absorção do leito expendido (EBS) com ligante de indução de

carga hidrofóbica seria uma tecnologia promissora para purificação de
anticorpos.