TEMA 2. BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO. EL AMBIENTE. ADHESIÓN CELULAR.

PROLIFERACIÓN Y DIFERENCIACIÓN CELULAR. SEÑALIZACIÓN CELULAR. ENERGÍA Y

METABOLISMO DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO. SENESCENCIA Y MUERTE CELULAR. APOPTOSIS.

Las células in vivo mantienen interacciones con otras (3D), in vitro como mucho tienen
contacto en 2D, ya que no están localizadas en una parte concreta.

Figura 2.1.En esta imagen vemos a la izquierda células a baja densidad, mientras
que a la derecha encontramos un cultivo con elevada densidad de células .

Aspectos que se tienen que tener en cuenta y modificar en algún caso:

 EL AMBIENTE

El ambiente de las células del cuello uterino se van modificando a lo

largo del ciclo menstrual por hormonas que van por el torrente
sanguíneo, por tanto si quiero observar estas modificaciones, tendré
que añadir esas hormonas al cultivo. Además, las células tienen
interacciones con la matriz, por ello también deberemos hacer una con
matrigel o ECM.

 ADHESIÓN CELULAR

CAM (moléculas de adhesión

celular). Las células se suelen unir
por abajo por la acción de
integrinas, las cuales forman parte
de los hemidesmosomas (unión
adherente, las células epiteliales se
apoyan sobre la matriz del tejido
conjuntivo). Permiten la unión por
la parte basal de la célula a otras
células y a membranas basales. Las
integrinas permiten la unión célula-
placa de cultivo. Las cadherinas
unen entre células.

La tripsina es una enzima que corta péptidos y proteínas, corta las uniones de las integrinas.
Las cadherinas necesitan Ca+2 en el medio, por tanto, si añadimos EDTA, un agente quelante,
secuestraremos el calcio del medio y la unión entre cadherinas no será posible.
Las células tienen capacidad de movimiento, por
ejemplo, aparecen los lamelipodios, que son
proyecciones del citosol, formados por filamentos de
actina que sirven para que la célula se una al sustrato.
Para evitar este movimiento, podemos añadir
inhibidores del citoesqueleto.

 PROLIFERACIÓN CELULAR

En condiciones normales, la célula recibe señales que le inducen a dividirse. Las células en
cultivo tratan continuamente de crecer. Hay puntos de control para una correcta división
celular. Existe una familia de proteínas, las ciclinas, que están involucradas en la regulación del
ciclo celular. Estas proteínas son muy lábiles, distintos tipos aparecen en distintas partes del
ciclo. Determinadas ciclinas se encargan de la activación de una determinada quinasa, que
fosforila a otra proteína concreta de un punto de control. Con esta fosforilacion se activaran o
desactivaran las proteínas de punto de control.

Rb o pRB, es la proteína del retinoblastoma, una proteína supresora de tumores que se

encuentra alterada en muchos tipos de cáncer, como el cáncer de pulmón, el melanoma,
el cáncer de próstata o el cáncer de mama, entre otros. Originalmente se detectó esta
alteración en cáncer de retina, de donde deriva su nombre. Rb inhibe de la progresión del ciclo
celular antes de la entrada en mitosis (regula el inicio), de manera que la célula no entra en
división hasta que está preparada para ello y se dan las condiciones adecuadas: pRb impide la
proliferación celular. Por ello, la inactivación de pRb puede suponer la aparición de un cáncer,
ya que con ello se elimina un importante freno a la proliferación celular. La pRB se activa por
fosforilacion de una quinasa dependiente de ciclina (aparece con un factor, como es el factor
de crecimiento).
Si el punto de restricción no está activo no se
producirá el ciclo celular. Uno de los check point es
controlar que se haya duplicado correctamente el
material genético. El gen p53 o “guardián del
genoma”, resulta esencial para inducir la respuesta
de la célula ante el daño del DNA, deteniendo
el ciclo celular en caso de mutación. Es un gen
supresor tumoral que desempeña un papel
importante en apoptosis y control del ciclo celular. Si
p53 detecta daño en DNA no se produce la
proliferación celular. Un p53 mutado podría permitir
que las células anormales proliferen dando por
resultado cáncer, la mayoría de las células tumorales
tienen euploidias y p53 mutado, por ejemplo, las
células Hela tienen el gen p53 mutado (alrededor de
un 50 % de todos los tumores humanos contienen
mutaciones en p53). Pertenece a una familia de factores de transcripción, a la cual pretenecen
también p63 y p73. p53 es ubicuo, se expresa en todos los tejidos, mientras que p63 y p73
presentan especificidad tisular. Además, parece que todos ellos presentan isoformas, algunas
de las cuales funcionan como activadoras, mientras que otras funcionan como negativas
dominantes.
  DIFERENCIACIÓN CELULAR

Las células en cultivo están en equilibrio entre la proliferación y la diferenciación. Controlando

la densidad celular, podemos saber hacia dónde tiende el equilibrio. Si la densidad es alta, el
equilibrio tiende a la diferenciación. Por tanto, controlando la densidad, puedo cambiar el
perfil de la célula.

 SEÑALIZACIÓN CELULAR

Excepto las células tumorales, las demás

necesitan señales para su supervivencia. Con la información autocrina, la célula es capaz de
informarse a sí misma de su estado. Con homocrina informan a las células vecinas del mismo
tipo celular. Con la paracrina las células de distinto tipo se envían información, y por último,
con la información endocrina, las células pueden informar a otras células que se encuentran
lejos de ellas (mediante hormonas). Por tanto a la hora de realizar un cultivo, debo tener en
cuenta que puedo generar información endocrina intencionada o no, mediante sustancias que
añadimos al medio o no. Debemos estudiar qué vías de señalización se pueden producir o hay
en el cultivo.
  ENERGÍA Y METABOLISMO DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO

Las células en cultivo, en un principio, tienen un exceso de oxígeno, pero este oxígeno
contenido en la botella de cultivo, y que está en contacto directo con el medio, es inaccesible
al estar las células sumergidas, se encuentran en un ambiente anóxico. Se producen especies
reacticas de oxígeno con sustancias que hay en el medio (pueden ser dañinas para las células).

Las células usan glucosa y dan ácido

láctico en su metabolismo. Por esto, el
medio debe contener mucha glucosa.

La oxidación de aa es otra fuente de

energía. Suelen ser muy eficientes
incorporando glutamina(el medio
contiene glutamina). Para compensar el
poco ATP que da el lactato, se incorpora
la glutamina.

Conforme se desarrolla el cultivo, el

medio se acidifica y se agota, por lo que
debem

 SENESCENCIA Y MUERTE CELULAR. APOPTOSIS.

Primero se produce un descenso,
después se estabiliza un poco, y
comienza a crecer el número de
células. Se realizan varios subcultivos
por el acumulado de células, debido a
la limitación de espacio. Al final hay
limitaciones que producen una nueva
estabilización.

LÍMITE DE DIVISIÓN, lo que se conoce

como senescencia. Las células llegan a
un punto en el que no pueden dividirse
más. Este punto determina una línea
celular finita o una contínua.

En curva de crecimiento nos muestra la acumulación en un cultivo, por tanto, podemos

ver cómo aumenta el cultivo en el tiempo.

Pasamos de una línea de células finita a otra contínua, cuando no se puede dividir más. Se
transforma y se crea una línea de división infinita, que se mantenga de forma estable.
 Gráfica de subultivos

En esta gráfica observamos los diferentes aumentos

en el número de células de los diferentes subcultivos.
Al crecer, eliminamos un % de células y estos vuelven
a subir.

TEMA 3. ESTABLECIMIENTO DE LÍNEAS CELULARES EN CULTIVO. INICIACIÓN, EVOLUCIÓN

Y SENESCENCIA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO. TRANSFORMACIÓN Y ESTABLECIMIENTO
DE LÍNEAS CELULARES ESTABLES. PRINCIPALES LÍNEAS CELULARES Y SUS APLICAICONES.

Hay dos estrategias para separar células

-Explante con crecimiento exterior de las células, por la periferia. Todo

depende de la capacidad de las células para sobrevivir fuera del tejido.

-Disgregación de las células. Puede ser mecánica (bisturíes, jeringas…)

o enzimática (tripsina, colagenasa…). Depende de varias cosas.

Todo depende de la Depende de la fase en la

capacidad de las células que se encuentre el
para sobrevivir fuera del cultivo, y otros factores
tejido y dividirse

FACTORES QUE AFECTAN A LA SELECCIÓN DE UN TIPO CELULAR

En la fase de aislamiento, el explante primario depende de que haya o no daño por el proceso
de separación, y de la sensibilidad a este. En la fase de cultivo primario, el explante depende
de la adhesión, de la capacidad migratoria (dispersión) y proliferativa, la tasa de división, más
o menos rápida. En el cultivo primario tendré una población heterogénea:
1) Células que sobreviven y se dividen

2) Células que sobreviven pero no se dividen

3) Células que no sobreviven

El primer caso compensa al tercero, éste último se ve reflejado en el inicio de la gráfica,

cuando desciende.

FACTORES QUE AFECTAN A LA SELECCIÓN DE UN TIPO CELULAR

Antes de que se produzca la confluencia, se tiene que hacer un subcultivo, ya que se produce
una inhibición por contacto entre células.

En los primeros subcultivos morirán las sensibles a la tripsina, las que sobrevivan seguirán
creciendo. Esto provoca que en los 3 primeros subcultivos tengamos una población
heterogénea, luego serán más homogéneas, es decir, más estables, ya que la población se
habrá adaptado. Esto se consigue cambiando su fenotipo y haciéndose muy parecidas. Lo más
importante y lo primero que debemos conseguir para poder trabajar con una línea celular es
estabilizarla.

Hay muchas técnicas para aislar células con poca capacidad proliferativa.

Es muy importante el efecto de la densidad celular en el predominio de células normales o

transformadas, debemos tener cuidado con las densidades bajas.

FACTORES QUE AFECTAN A LA SELECCIÓN DE UN TIPO CELULAR

El momento en el que la curva exponencial comienza a tomar una forma

sigmoidea, se denomina fase de Plateau. La SENESCENCIA supone la
activación de genes que la provocan, genes proapoptóticos, y la
desactivación de otros que mantenían la capacidad proliferativa. Esta
fase se ve reflejada cuando la pendiente comienza a frenarse, supone el
límite de crecimiento.

La telomerasa, se encarga de mantener la longitud suficiente que deben

tener los extremos de los cromosomas. Los telómeros son secuencias finales, que presentan
una secuencia particular para cada especie, la telomeras también es específica para cada
especie.

¿Cómo es la telomerasa?
La telomerasa es un enzima que se encarga de la adición de
desoxirribonucleótidos a los extremos de los telómeros, pero
dicha adición está dirigida por una secuencia de
ribonucleótidos o ARN, por lo que podemos decir que se trata
de una transcriptasa inversa de características especiales. Es
una ribonucleoproteína que siempre sintetiza la misma
secuencia de ADN. Está formada por dos componentes:
componente ribonucleotídico y un componente proteico.

En las células somáticas no hay telomerasa, el cromosoma

pierde longitud, y cuando los telómeros desaparecen, empiezan a perder DNA codificante,
produciéndose fallos en el mantenimiento del control. Las células germinalesy las stem cells
tienen actividad telomerasa, manteniendo una tasa de replicación alta. Las transformadas y
tumorales suelen presentarla también, escapando así del control.

TRANSFORMACIÓN

Tres factores importantes para la transformación:

1. Supone la INMORTALIZACIÓN(capacidad de duplicación infinita), por ejemplo, se le aporta

telomerasa activa, en ausencia de p53 activo normal, el cual es esencial en la inducción de
la respuesta ante el daño del DNA, deteniendo el ciclo celular en caso de mutación. El gen
p53 es un gen supresor tumoral, importante en apoptosis y control del ciclo celular.
2. CONTROL ABERRANTE DEL CRECIMIENTO: pérdida de inhibición de la motilidad celular,
pérdida de la inhibición por contacto de la división y pérdida de la dependencia de anclaje.
Es la pérdida del control del crecimiento.
3. MALIGNIDAD: evidencia por el crecimiento invasivo de los tumores in vivo. La malignidad
de las células tumorales supone que, al introducirlas en un individuo con fallos, provoquen
en él la formación de un tumor. La forma de comprobar que ha mutado, es
introduciéndolas en ratones.

En microbiología la transformación supone un cambio de fenotipo por introducción de DNA, en

cultivos a esto se le llama TRANSFECCIÓN. La TRANSFORMACIÓN supone la introducción de
nuevo DNA, de un cambio fenotípico, y del escape del control celular. Esto provoca una
INESTABILIDAD GENÉTICA, que se produce también en tumores y células transformadas. Esta
inestabilidad produce a su vez, la inmortalización, capacidad de duplicación infinita (gracias a
la telomerasa, actividad de P53 mutado), control aberrante del crecimiento.

Las células normales crecen sobre un sustrato, las transformadas pueden crecer en
suspensión, aunque prefieran un sustrato al que unirse.

Ejemplo de inestabilidad genética

Para la transfección se suelen usar virus normalmente, por ejemplo a SV40LT se le introduce
un gen T largo. La proteína que codifica, produce una modificación de los mecanismos de
control normales. Introduciendo el virus en el individuo podemos transformarlo. También
suele usarse el virus del papiloma humano (HPV), las variantes 6 y 7, que tienen capacidad
transformante de células, este virus produce cáncer de cérvix.

También se pueden introducir genes que no están expresando en la célula como el de la

telomerasa. Con esta introducción, las células se convierten en inmortales.

TEMA 4. EL LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES. DISEÑO, DISTRIBUCIÓN Y

EQUIPAMIENTO. TIPOS DE CABINAS DE FLUJO LAMINAR. INCUBADOR DE CO 2 E
INCUBADORES DE HIPOXIA. MICROSCOPIO INVERTIDO Y DE FLUORESCENCIA.
Para el trabajo con cultivos celulares son necesarias unas condiciones de asepsia, para no
exponer los cultivos a ningún tipo de contaminación. Si entra alguna bacteria crcerá más
rápido que nuestras células.

En los laboratorios de máxima seguridad los investigadores nunca están contacto con el
aire. En los quirófanos se requiere una higiene máxima en las personas, que en este caso sí
están en contacto con el aire, y todo el material está estéril antes de su utilización.

El laboratorio auxiliar o de preparación debe de estar al lado del laboratorio donde se

preparan las muestras. El incubador debe estar en la misma sala en la que se encuentre la
cabina, para evitar una mayor exposición de los cultivos a la contaminación.

Para el trabajo en cultivos necesitamos: una cabina de flujo laminar para la manipulación
(1er elemento importante), un incubador de CO2 (2º elemento más importante), y un
laboratorio auxiliar.

Lo más importante es la cabina de flujo laminar donde aseguramos que trbaajmos en

condiciones de asepsia. Hay varios tipos:

-Las de tipo I protegen al investigador, pero no a la muestra. Se usan para poner

centrífugas que contengan algo peligroso, que por ejemplo pueda desprender gases
perjudiciales para el investigador, los cuales son flitrados.

-Las tipo II protegen al investigador y a la muestra. Son las que se utilizan para los cultivos.
Las de flujo horizontal se usan para cultivos vegetales, NO para animales. Introducen aire
por el filtro, que pasa a la cabina y se dirige al investigador. Para cultivos animales se usan
las de flujo vertical.

-Las tipo IIIen

laboratorios de bioseguridad, en este tipo el aire no se recirculariza.

Hay que valorar la seguridad frente a la eficiencia. La luz UV elimina poco, si por ejemplo la
cabina no está totalmente despejada, la parte de detrás que esté tapado por la cosas que
hemos usado y no hemos quitado, no será esterilizada, y podrá ser un posible foco de
infección. Además con la UV se pueden producir quemaduras, en nuestro laboratorio sólo
se puede poner cuando la tapa está puesta.

INCUBADOR DE CO2

Se necesita menos de un 5% de tensión de CO2 (se bombea activamente CO2), ya que la

tensión modifica el pH de los medios.

-WATER JACKET, están ventilados. Consiste en

una capa intermedia rellena de agua a 37°C,
en la pared del incubador. Necesita una
recircularización del aire, 90%.

-DRY JACKET, no hay agua en las paredes.

El CO2 tiene que estar en una sala ventilada, que sea distinta de la que está el incubador. El
CO2 de las botellas no está totalmente estéril, por lo que se pone un filtro en su entrada al
incubador (37°C, 5%CO2, 95% aire). El 5% de CO2 debe ser constante, en el momento en el
que la sonda detecta una bajada en el nivel de CO2, se bombea para que se mantenga.

Usamos un microscopio invertido para poder ver las muestras de cultivos. La luz viene
desde arriba, pasa por la muestra, y se recoge en los objetivos, que se encuentran debajo
de la muestra. Los objetivos se acercan desde abajo. Los medios de cultivo que se utilizan
son transparentes por abajo, para que tengan las propiedades ópticas adecuadas.

Para ver bien las células no podemos teñirlas y son transparentes. Para estudiarlas se usa
un microscopio de contraste de fases. En el microscopio de contraste de fases, se usan dos
anillos, uno debajo del condensador, que sólo deja pasar luz por el centro, y otro en el
objetivo que es ¿opaco?. Sólo vemos la luz que viene desviándose porque ha chocado con
las células. Por esto vemos los bordes celulares brillantes. Las células redonditas desvían
más la luz, y por ello brillan más.

16/10/2013
Técnica que nos aumente el contraste, necesitamos un metodo fisico de aumento del
contraste, el constraste de fase. Los dos anillos….bla bla bla.

No cogemos luz directa, sino la que se ha desviado, asi podemos contemplar la morfologia
de las celulas.

Epidiminiscencia: incides sobre la muestra luz de una det long de onda para activar los
fluorocromos para que emitan una long de onda diferente…..es lo mismo que epi…??

Autoclave: podemos eliminar todos los microorganismos.

Sistemas de limpieza: lavavajilla de uso industrial, se comporta igual que uno domestico,
hay detergente, subida de Tº, pero el ultimo lavado se realiza con agua destilada.

Necesitamos tambien un sistema que nos proporcione agua pura y ultrapura:

Aquella que hemos eliminado todas las sales-pura

Libre de sales,filtrada y libre de microorganismos-ultrapura

Criopreservación.

TEMA 5: LA TÉCNICA ASÉPTICA……

Recomendaciones para manejar las celulas…

Tener claro que es la tecnica aseptica, trata de mantener completamente separados los
microorganismos que estan en el ambiente de mis celulas que estan cultivandose en el
interior de la botella.

Medios fisicos y tecnicas de manipulacion siguiendo pautas y rutinas que tratan siempre
de mantener en dos espacios difrentes los microorganismos de mis celulas en cultivo.

Portada de revista Science, ser humano 90% bacteria.

Normalmente no se pueden mantener separados los 2 espacios, hy muchos momentos

durante la manipulacion, donde se pone en riesgo las celulas de cultivo.

No hay tampoco una relacion directa….

Puede haber alguna contaminacion puntual.

Mantener las mismas celulas en diferentes botellas puede dar lugar a crisis individuales
debido a una mala tecnica aseptica que se mezcla con una gran cantidad de
microorganismos en el ambiente, esa botella pues se ha de eliminar del cultivo.

A partir de un determinado momento pueden surgir errores en la tecnica aseptica, se

pueden ir acumulando las condiciones de asepsia y eso va ir asociado a un incremento en
los niveles de contaminacion.

El mantenimiento de lineas celulares es muy complejo, hay que mantener siempre

mecanismos que puedan salvar siempre los experimentos como llevar en pararlelo varias
lineas, congelar celulas, no cambiar los medios de diferentes botellas el mismo dia..lo que
no podemos conseguir nunca en un 100% de asepsia, dificil y costoso.
Recomendaciones :

- En cuanto al area de trabajo, trabajar en camara de flujo laminar*

Es muy importante tener la camara ordenada, bajan las probabilidades de
contaminacion.
La mayoria de la superficie de las camaras de flujo no estan perforadas, lo que tienen
es una salida de aire en la parte posterior.
Es importante roziar con alcohol de 70º o desinfectante continuamente para esterilizar
la superficie de trabajo.
- Lavado de manos fundamental, si no se trabaja con patogenos se suele trabajar sin
guantes, importancia de lavarse las manos muy muy muy bien. Después de un lavado
intenso de manos no se pierden los microorganismos del todo, pero si se piere la piel
muerta. Un buen lavado de manos supone una serie de movimientos donde todas las
partes queden ‘’limpias’’
- Gafas de laboratorio evitan la contaminacion de microaerosoles
- El material que utilizemos debe de ser siempre esteril, si es de un solo uso, abrir en
condiciones de asepsia ( cabina ) y aw, si el material no es esteril, hay que esterilizarlo
previamente.
Las puntas de las pipetas tienen un mini filtro.

El medio no se autoclava, se filtra, porque muchos componentes del medio son

termosensibles.

En cuanto a los reactivos, tambien los filtramos con filtros watman en jeringuilla.
- Y la manipulación: Lo que mas fallos puede provocar.
Movimientos suaves dentro de la cabina, movimientos decididos.
Rociar con alcohol de 70º el material que introducimos en el interior de la camara.
Metafora de la sombra para dejar siempre la corriente de aire del flujo laminar para
que nuestros micros de la ropa/piel no caigan en la muestra.
Si dudamos de haber puesto en peligro la esterilidad, tirar a la basura.

Uso de luz UV: bueno , pero baja eficiencia, riesgos para la vista y la piel.
Uso de calor, mediante el uso de autoplacas.
Uso de filtros que tengan un filtro( barrera con poros que solo pueden pasar sustancias
de menor diametro(moleculas,gases..)): >0,2micras libre de bacterias y hongos.
-filtros watman de jeringuilla,filtros de botellas con sistema de succión,filtros de
presión..cualquiera de esos tiene un poro inferior a 0,2micras.
Los mas importantes son los filtros de aire HEPA: Nos permiten tener aire limpio, el
99,97% que tengan un diametro de 0,3 micras son repelidas por ese filtro y el 99,99%
que sean ….en la diapo.las particulas estan arrastradas por la corriente de aire y
acaban impactando con las fibras.
Añadiendo varias capas de HEPA aseguramos el 100% e aire limpio.

Metodos quimicos:
 Agentes quimicos: soluciones alcoholicas de el 70º, el alcohol desnaturaliza proteinas
por deshidratacion y coagula, si yo utilizo alcohol absoluto, puedes no matar y dejar al
microorganismo quiescente y que este luego te genere contaminacion.
Si hicieramos una curva de eficiencia el maximo de eficiencia lo encontramos con
disoluciones al 70% en agua pura y filtrada..--> mejores tasas de desinfección
Ventajas: Podemos rociarla sobre nuestra piel.

El hipoclorito sodico= Lejia produce cloro liquido, este es muy tóxico , problema de la
lejia, que es muy corrosiva para los metales y te cargarias la superficie de la cabina de
flujo laminar, la lejia se utiliza para INACTIVAR
Formaldehido: produce uniones quimicas entre las proteinas fijandolas y una vez fijas,
ya no pueen realizar su funcion y la celula muere formol es la formula liquida del
formaldehidoproblema del formaldehido: agence cancerígeno. Su utilizacion debe
realizarse con precaucion, son gaseosos a partir de 20ºC , se utiliza para ‘’fumigacion’’
cuando hay contaminacion en un incubador, se vacia, y se introduce formol, se
aumenta la temperatura y sus vapores desinfectan todo.

Tres micros fuentes de contaminacion:

Bacterias, se controlan bien, aunque una es producida la contaminacion esta no se

puede frenar y el cultivo no se puede mantener.
Levaduras
Hongos, principal fuente de contaminacion en nuestra zona.

El problema es la contaminacion con Mycolplasma, crecen en el interior de la scelulas,

las parasitan, en principio no se puden observar principios de contaminacion, se
observa un retardo en el crecimiento, aumento de celulas apoptoticas, pero no se
pueden apreciar signos de contaminacion, hay metodos para detectar al mycoplasma ,
por ejemplo con HOESCH, con este reactivo podré ver en el microoscopio de
fluorescencia podre ver agentes biologicos que tienen DNA y que estan en el citosol de
nuestras celulas de cultivo. No son comunes, pero son peligrosas ya que condicionan
los experimentos.

17/10/13

- Temas sobre la investigacion biomedica y biosanitaria: bioseguridad.

Clasf. Laboratorios etc con sus requerimientos fisicos y tecnicos.

BIOETICA: está relacionada con muchas otras situaciones en el laboratorio, no

unicamente con planteamientos filosoficos, sino que trata el punto de vista del
cumplimiento de normas legales. Abarcan todo el proceso de la linea celular.
Dos posibles situaciones de partida:
Celulas animales o Celulas vegetales.
C.A: en el momento que queramos realizar un explante, lo primero que nos
encontramos es con la legislacion existente en cuanto al uso el cuidado y lo
procedimientos con los animales de exprimentacion, muchos niveles respecto a las
normativas, actalmente hay normas muy claras que deben de seguirse siempre con
animales que tengan sistema nerviosos suficientemente nerviosos como recibir
señales con suficientemente sensibilidad para recibir dolor o sufrimiento en caso de
que se hagan las cosas mal.

Debemos saber cuale s esa legislacion pero no entramos en detalle en ella**.

C.H: si trabajamos con celulas animales humanas, no es la misma legislacion, sino que
aparece la encesidad del consentimiento informado, es decir, el paciente debe ser
informado y documentado de todo el procedimiento.

IRB: institucional review board; cualquier investigacion biomedica realizada en una

insitucion debe haber sido supervisada por un comité de ética.( en el caso de trabajar
con celulas animales o humanas)

Si no pides el consentimiento del comité de etica, la revista cientifica te pide que

entregues formalmente el acuerdo en el que se aprobado el trabajo por el IRB o
comité de etica.

Las normas no son retroactivas* ejemplo de el caso Hela.

Importante que en el laboratorio de cultivos celulares y si estamos trabajando en

células humanas y animales una de las cosas a tener en cuenta es la existencia de
controles de calidad: (documenta el proceso de elaboración)
- Control de calidad propio del trabajo de investigación (protocolos, medidas
correctoras…)

La ISO9000 es un sistema de calidad general, pero ese marco general se puede aplicar
de forma más específica al laboratorio.

La ISO 15189, es un sistema más específico aplicado al laboratorio clínico.

¿Dónde podemos observar todos los principio de calidad?: en cualquier cuantificación

que realicemos recuento y viabilidad celular ( hemocitometro ).
(Azul tripan, dilución de células, cámara neubahuer….--> recuento y cuantificación).

Afortunadamente hay tecnología para el recuento y viabilidad de células, hay

contadores automáticos de células: Tienen todos los parámetros estandarizados y las
propiedades ópticos adecuados con un software de análisis de imagen.

Lo habitual es que una línea celular se comporte de esa manera: imagen de curva de
crecimiento.**

Seeding= siembra, debemos saber cual es la concentración, empieza en una fase en la

que le cuesta arrancar el crecimiento ya que deben de adherirse y adaptarse al nuevo
medio ( fase Lag ) a partir de esa primera fase que dura aprox.48h se produce un
crecimiento exponencial hasta que se alcanza una densidad máxima a la que se
considera que se ha saturado la superficie de cultivo, al no haber espacio las células
dejan de crecer por inhibición por contacto.( fase de meseta o PLateau) han
ocupado todo el espacio disponible.
La parte más importante de nuestra curva de crecimiento y la que podremos
cuantificar nuestra situación real de nuestras células en cultivo es la curva exponencial
en el cual podre obtener el tiempo de duplicación.( nos permitirá caracterixar una
línea celular frente a otra ).

18/10/2013

Línea a exponer: COS-7 células epiteliales de riñón de Mono.

Medición del crecimiento celular: en lugar de recuentos , lisados y calcular

concentración de DNA, otra medida es la masa en seco( ir haciendo mediciones de
peso de nuestro cultivo en seco)

La forma más utilizada es el recuento ya que realizamos una viabilidad de nuestras

células.

Analizando curvas de crecimiento podemos llegar a saber diferente situaciones:

Imagen curvas de crecimiento**

-Curva normal
-Curva donde las células crecen con una menor pendiente, menos velocidad de
crecimiento, células con baja capacidad proliferativa
-Curva con tasa de crecimiento bajo, pero que alcanzan la fase de plateau a una mejor
concentración, es decir, han reducido su densidad de saturación, tienen una inhibición
por contacto antes de la normalidad.
-Línea células con baja supervivencia a la tripsina, se ha generado daño en el momento
del levantamiento de las células durante la tripsinización, a partir de ahí se recupera y
recrea la misma curva que una curva normal, pero lo realiza con más tiempo, es decir
sigue una curva normal desplazada. También nos pueden hacer sospechar por fallos
metabólicos de las células o la presencia de Mycoplasma.

Siguiente imagen**
Nos muestra otra característica típica de las células transformadas( inestabilidad
genética, mayor capacidad proliferativa….)

Las dos curvas representan la misma línea celular con y sin transformación:
Las transformadas tienen una capacidad proliferativa más alta, mayor velocidad de
crecimiento, y reducción de la inhibición por contacto ya que alcanzan una mayor
densidad de saturación.

TEMA 7.RECIPIENTES DE CULTIVO Y SUSTRATOS….

La primera condición para poder utilizar el material en un cultivo es que debe ser
esteril o haber sido esterilizado, en los orígenes del cultivo celular se utilizaba el vidrio,
actualmente vidrio y plástico ( polipropileno, tiene características ópticas muy buenas
lo que hace que podamos utilizar el microscopio para observar su interior.)
Son plásticos inertes, que no liberan ninguna sustancia.

Tipos de recipientes:

-Placas de petri o de cultivo: (suelen presentar modificaciones respecto al resto de

placas: puntos a los extremos de la circunferencia, no encaja la base con la tapa, esos
soportes lo que hacen es separar la base con la tapa para permitir el flujo de aire, la
circulación de gas, aun así no hay contaminación por la forma que tiene, a no ser que
sometamos un gran flujo de aire que pueda transportar bacterias. Por eso no se
utilizan como un recipiente para el mantenimiento de células sino para un
experimento. Si una placa de cultivo la mantengo durante una semana y media es
probable (95%) de que se contamine. Nos permiten colocar cubres en su interior, o
añadir fácilmente sustancias para luego utilizar la misma placa para cambiar alguna
determinación.

Las clasificamos de acuerdo a su diámetro:

Lo más habitual es que vaya entre 35-150 mm, hay más grandes pero no se suelen
utilizar, excepto en ingeniería tisular.

Las más frecuentes las de 35 y 100mm de diámetro. Las de 60mm también se utilizan
bastante caben 2 cubreobjetos y permite realizar duplicados en una misma placa.

Existen placas de cultivo que no son redondas, pueden ser mas o menos rectangulares
o cuadradas, también son habituales, las medidas tambien están optimizadas.
Siempre se optimiza la superficie frente al volumen necesario por eso la mayoría son
circulares.

Placas multipocillo: Nos permiten realizar gran cantidad de diferentes experimentos

con las mismas condiciones, se compartimentaliza toda la superficie en muchos
pocillos (misma Tº y condiciones), ideal para estudios comparativos. Por ejemplo, una
técnica habitual es usar las placas para hacer diluciones a la hora de seleccionar
clones.

Todas las placas tienen el mismo tamaño, para poder mantenerlas apiladas, también
tienen sistema de ventilación, aunque en ocasiones hay tapas herméticas para evitar
contaminaciones en cierto tipos de experimentos. Lo único que cambia es el tamaño
de los pocillos, esto permite una estandarización del equipamiento necesario.

Placas petri experimento en momento

Pocillos experimentos comparativos
 Los D-Flask: son la manera habitual de mantenimiento de las líneas celulares en el
incubador. La nomenclatura indica la superficie que tienen las células para poder
crecer( T25,T75,T125 y T175). Existen flask con morfología cuadrada, pero lo mas
habitual para facilitar el acceso con la pipeta a todas las situaciones la morfología es
como una ‘’piramide’’ donde desaparecen las esquinas permitiendo un mejor uso de
las pipetas…También cambia el ángulo de inclinación respecto al tamaño y también
existen patentes de cada botella, tienen patentada una forma patentada de la botella,
modificaciones en la entrada de la botella, de la boca de entrada, que facilitan el
acceso manteniendo la posición de la botella horizontal.

¿Qué pasa si no me llega con una botella de 175mcuadradoss de crecimiento?

- En el mercado hay Botellas Multisuperficie, tienen una serie de capas que me
permiten que en el mismo tamaño de la botella tengas más superficies de crecimiento
en una misma botella, cada una de las capas tiene un pequeño reborde que permite
que al tumbar la botella todas las capas queden cubiertas.

Las células que crecen en suspensión se cultivan en botellas de cultivo (Erlenmeyer Flask), se
mantienen en el incubador continuamente en movimiento mediante los osciladores. Se
clasifican por volumen, no por superficie de crecimiento.

Otra forma de conseguir que mis células se mantengan en suspensión podemos utilizar
agitadores (Stirrer/Spinner Flask) , tienen como una bala que hace la misma función que la
mosca de un agitador magnético. El agitador ya viene incorporado con la estructura.

Otro sistema de mantenimiento de células, en este caso de células adherentes se utilizan las
botellas de rotación, se utilizan también con un aparataje especial ( rodillos ) que mantienen la
botella en posición horizontal continuamente en rotación ( 1rev/min )…..1 vuelta completa en
1 minuto, lo que sucede es que uno tienen una cantidad de medio pequeña, pero una
superficie de crecimiento de células adheridas muy grande, la solución acuosa nunca se seca,
solo se sumergen por completo durante una parte del ciclo.

Sistemas especiales como el portaobjetos de cultivo, yo puedo colocar cubreobjetos al interior

de una placa petri o preparar una cámara donde yo echo el meido con las células, le coloco
encima un portaobjetos sellando la cámara y le pego la vuelta, asi mi cultvo crece en un
portaobjetos, esto sirve para alta resolución para células in vivo.

Otro sistema especial son las placas petri que tienen en su centro una parte en la que no hay
plástico sino lo que hay es cristal de manera que puedo hacer crecer mis células en la placa
petri pero las mejores condiciones ópticas van a estar en el centro.
El plástico esta tratado para poder ser utilizado en células e cultivo, el tratamiento que recibe
lo hace hidrofobico. Hay muchas células que ncesiten de algún componente que les ayude a
pegarse para poder crecer superficies tratadas ( Feeder Lyer, capas nutritivas )

25/10/2013

Web para buscar trabajo: ATCC.org

La tendencia es llegar a que todas las superficies se consiguieran hacer con componentes
sintéticos.

La tendencia que existe a salir con el medio con suero en el que tenemos un componente
‘’desconocido’’= suero, no sabemos exactamente su composición, la tendencia es ir a medios
definidos y sin suero.

Superficies tratadas:

1) Añadirle proteínas que formen parte de la matriz extracelular: rica en numerosas

proteínas ( colágenos de tipo 1 y 4, fibronectina, gelatina, polilisina, laminina….)

Algunas células epiteliales tienen la necesidad de que exista fibronectina para adherirse y
formar una lamina basal.

Existe un compuesto que se llama Matrigel, es un extracto que secreta un sarcoma de ratón el
EHS, que secretan una matriz extracelular que contiene colágeno, laminina y entactina que
permiten establecer cultivos tridimensionales, formando túbulos y vasos sanguíneos.

2) Añadir sustratos sínteticos que tratan de mimetizar algunas de las porpiedades de la

matriz extracelular, como añadir los grupos amino,grupos carboxilo para dar carga
eléctrica, también componentes sinteticos que simulen el colágeno.
3) Añadir feeder layer, capas de células que aportan ‘’nutrientes’’=mitógenos, factores de
crecimiento y transcripción a las células que hay encima.

Cuando las células (fibroblastos) ocupan toda la superficie, se inhibe su proliferación haciendo
que dejen de sintetizar proteínas, como?, irradiándolas utilizando rayos gamma,X o añadiendo
Mitomicina, que produce roturas de doble hebra en DNA impidiendo la producción de RNA.

Estas células pueden vivir 1 semana aun, además siguen secretando factores de transcripción y
demás para que las células que cultive tengan un aporte extra de estos factores, un ejemplo es
el uso de células como las troncales o STEM CELL, que por si solas, no pueden crecer, necesitan
esos factores de transcripción de las células previamente irradiadas.

Cada vez quieres eliminar el uso de feeder layer, porque el problema es que si no inactivas
totalmente las células, puedes contaminar el cultivo.

TEMA 8:
Primer medio establecido: Medio EAGLE, medio basal en el que establece una serie de
requisitos, EMEM, medio mínimo esencial, en el que retira muchos componentes del medio
basal y lo deja con las necesidades imprescindibles para el crecimiento de las células.

Años más tarde Dulbecco hace una modificación añadiendo más cantidad de componentes.

A partir de esos años empiezan a desarrollarse más medios.

-Medios específicos para células hematopoyéticas: RPMI1640

-Medios complejos que no tienen requerimiento de suero, más controlables y específicos: Ham
F10 y Ham F12.

El más utilizado es el DEMEM, y en casos especiales cuando se quieren tener controladas las
condiciones de cultivo DEMEM + HamF12

Luego podemos añadir aditivos si las células necesitan algún requerimiento adicional.

Los F se utilizan en cultivos primarios, aunque recientemente hay medios para determinados
cultivos primarios.

Característica común que presentan todos los medios:

-Fuente de energía basada en HC

-Ácidos grasos esenciales y lípidos esenciales.

-Aminoácidos (aunque no están todos, algunos se sintetizan las células)

-Sales minerales (casi siempre con 2 papeles, tampón de ph y control de la osmoralidad)

-Oligoelementos

También podemos añadir cofactores como el NADH.

ADITIVOS: (no son esenciales)

Normalmente se adicionan anibioticos, protegen el medio de cultivo de las infecciones, hay un

gran debate, hay pocos partidarios del uso de antibióticos ya que pueden producir alteraciones
en las células, hay que eliminar los antibióticos del medio exponiéndolo a infecciones, por eso
se busca un equilibrio.

Hay que tener un tampón de ph, fundamental.

Se le añada a la mayoría de los medios un indicador de ph, es una cuestión subjetiva, se utiliza
fundamentalmente rojo fenol, aunque puede afectar. A veces se recomienda ir midiendo el ph
a lo largo del experimento, pero en algunos experimentos esto es inviable.

Suero, aunque se puede sustituir y cada vez está mas en desuso.L más habitual es utilizarlo al
10%.

Aditivos específicos como suplemento de piruvato si quiero activar el ciclo del acido cítrico
para que no consuma aminoácidos y reactive el ciclo de Krebs, suplementos de glucosa….
El ph óptimo o fisiológico es de 7,4, auque hay células que crecen mejor entre 7-7,4 y otras que
crecen mejor entre 7,4 y 7,6. Por ejemplo los fibroblastos cuando provienen de un cultivo
primario crecen mejor a 7,6, pero cuando se convierten en línea celular, crecen mejor en un ph
por debajo.

Utilizando el rojo fenol tiene la característica de virar de color depenediendo el ph en el cual se

encuentra.

Se puede acidificar el ph por culpa del crecimiento de bacterias debido a una contaminación, a
veces solo se produce por un sobrecrecimiento de células provocando la liberación de una
gran cantidad de CO2.

La estrategia más utilizada para controlar esto es utilizar un tampón de bicarbonato asociado a
la concentración de Co2 presente en el medio:

Reacciones***

Otras alternativas es utilizar tampones orgánicos como el HEPES,MOPS o los 20 de Gordon.

Tienen a la vez un componente ácido y un componente básico y no hace falta que se disocien.

Ventajas de HEPES: no necesita fuente de CO2 externa, botella cerrada, capacidad de

amortiguación de modificación de ph muy bueno, mantiene muy bien el ph, varia menos al
variar su concentración*.

Problema: Más caro y toxico para las células en determinadas condiciones como la exposición
a la luz produciendo peróxido de hidrogeno.

HEPES se utiliza para tamponar medios de lavado, tiempo breve y sin la necesidad de fuente
de CO2.

La osmoralidad es fundamental controlarla, aunque las células en cultivo tienen un gran rango,
aun asi cada sal que añada al medio debo compensarla retirando otra para mantener un
estado isotónico, porque si fuera hipotónicos el agua entra y si fuera hiper el agua sale.

Aunque a veces interesa utilizar un medio ligeramente hipotónico para compensar la

evaporación, pero no es muy recomendable.

Otra característica es la temperatura:

Células de mamífero 37º y aves ligeramente superior 38,5.

Las células epiteliales de raton 33º.

Viscosidad: Quien le da la viscosidad es el suero y ayuda a que las células que están en
suspensión se mantengan adecuadamente.Tambien al tripsinizar neceitamos que las células se
recuperen en un ambiente ligeramente viscoso.Si no utilizamos suero necesitamos de algún
agente que aporte viscosidad como carboximetil-celulosa o polividilpirrolidona.

30/10/13
Cultivos tema 8. Continuación….

1. Propiedades fisico-quimicas del medio:

a. Optimos de pH = 7,4
b. Cierta viscosidad, el suero aporta la viscosidad q es importnte para evitar
daños. Para que al despegalas haya flotabilidad.
c. La Tº, habria que controlarla. El tampon bicarbonato necesitamos fuente
externa de Co2.
2. Soluciones equilibradas, todos los medios parten de estas soluciones. Que consisten
en una mezcla de sales inorgánicas que tienen papeles muy importantes. Deben
mantener las celulas en una ambiente adecuado para que se desarrollen bien.
Mantienen los niveles de Ph adecuados para q n afecten a las celulas. Ademas de ser la
base es una solucion inorganica, tambien se usa para lavar la celulas o incubarlas en
cortos periodos entre experimentos. Cuando se llevan a cabo disecciones de tejidos
tmb se utilizan. LA mas importantes son
a. el DPBS es un tampon fosfato con unas peqeñas modificaciones realizadas por
dulbeco, con tiene tampon bicarbonato pero n tiene ni calcio ni magnesio, se
puede mantener durante poco tiempo.
b. Si se necesita trabajar durante mas tiempo se utiliza el HBSS el que no tiene
tampon bicarbonato, tiene como tampon EPES que permite mantener mas
tiempo los lavados fuera del incubador y no necesita fuente de CO2.
c. PBS y EBSS solucion basica sin tampon.
3. ADITIVOS
a. Aminoacidos, la mayoria de los medios solo contienen algunos aa. Si son
medios muy sencillos hay que añadirles aa muy sencillos, si tenemos el TMEn
es mas completo, n hace falta añadir aa. Los puedo añadir para cubrir los
requerimientos de nuevas proteinas o para ser una fuente alternativa para q
realice oxidaciones. Lo mas habitual es q se suplemnte todos con glutamina
(2mM), ya q aunq los medios ricos la poseen se degrada rapido. Existe una
formulación especial llamada GLUTAMAX es una patente de una compañía q
sus medios incluyen una asociación mas fuerte entre los aa que mantiene la
glutamina en el medio sin que se degrade, en este caso no seria necesario
adicionar.
b. Vitaminas. El medio minimo de Eagle solo tenia las del grupo B. Ahora los
medios tienen mas tipos de vitaminas. Se pueden realizar aportes de todos
modos.
c. Glucosa. Es fundamental, se necesita utilizarlas en grandes concentraciones.
En los ultimos años se ha multplicado la cantidad de glucosa que hay en el
medio de cultivo. 4,5 g/l glucosa.
d. Otros. Dependen del tipo celular y del experimento a realizar. Los puedo
utilizar para generar medios selectivos, se utiliza en cultivos primarios.
Habitualmente si no tengo un aporte externo de Co2 utilizare piruvato para
contrarrestar la falta de co2 q tengo.
e. Antimicrobianos, Ab para evitar el crecimiento microbiano y antifungicos.
Pueden afectar a la viabilidad de las celulas. Hay partidarios de que no se
utilicen para experimentos para que el mismo muestre los resultados qye
queremos y no se maquillen. Pero para el mantenimiento de las lineas
celulares si. Protege al cultivo pero hay q tener buenas coniciones asépticas.
 En general se utilizan combinaciones de Ab, o se cambia de Ab para que no
desarrolle resistencia.
f. Es mas facil que se propaguen los hongos que las bacterias. Tratamiento
preventivo anfotericina, se utiliza para una contaminación fungica grande. Se
utiliza en un periodo corto de tiempo.
g. Hormonas y factores de crecimiento, son necesarias para las celulas y se
necesitan en el medio para que las celulas crezcan adecuadamente. Ej:
mitogenos para que la celula se divida. Se utiliza un componente que contiene
de todo eso que necesita las celulas y que todavía no sabemos asique se utiliza
el suero pq tiene de todo coproduce y disgrega . De ahí obtenemos los
factores de crecimiento. El suero es de ternera, suero bovino fetal, de caballo
o humano. Inconvenientes del suero: hay tipos celulares que hay lotes de
suero que les funcionan mejor que otro. Solo se mantiene congelado durante
6 meses o un año y no es de la misma calidad. Asiq cada cierto tiempo se
cambia de lote. (DIAPOS)…. Medios libre de suero tienen que tener factores de
adhesión ( es muy importante), inhibidores de la proteasa( tripsina), adicion de
hormonas especificas del cultivo, factores de crecimiento, oligoelementos y
proteinas y poliaminas.
4. SERUM-FREE MEDIA. Cada vez existen mas medios libres de suero, para cultivos
primarios. La ventaja es que esta completamente definido, sabemos la composición
exacta. Inconvenientes: hay que hacer un medio para cada cultivo celular. Ese medio
es especifico de un tipo celular lo que encarece bastante (precios muy altos). Los
reactivos necesitan un grado de pureza muy altos, por eso cmprar los componentes
por separados es muy caro. EJ: para las celulas CHO se necesita un medio especifico….
Asi para todos los cultivos primarios.
TEMA 9: CULTIVOS PRIMARIOS. ESTABLECIMIENTO E INICIACIÓN DE UN CULTIVO PRIMARIO.

 Cultivo primario: cultivo de células realizado justo después de la extracción de células

de un organismo y antes de realizar el primer subcultivo.
 Línea celular primaria: Una línea celular especifica y libre de células heterogéneas, es
una línea pura, con características propias del cultivo primario. Están en los primeros
pasos, pero se comercializan entre el primer y segundo subcultivo. No son células de
un cultivo primario, están purificadas.

(Empresas que purifican un tipo celular que no son líneas celulares estables pero es un
cultivo de una célula que tiene un tipo celular como fibroblastos células
mesenquimales….)**

 Origen de un cultivo células: 2 origenes:

-Tejido embrionario: procedente de diferentes especies como ratón o pollo,
esto es importante porque las células de un embrión tienen una alta capacidad
de proliferación, que los adultos no presentan; el tejido embrionario tiene
telomerasa.
-Tejido de una biopsia de tumor: Existe un sesgo en el punto de partida, ya
que 2 tipos celulares se adaptan a un crecimiento alto.

Hay que buscar un balance entre que sea una fase temprana de desarrollo y
un número de células que puedan sobrevivir a la extracción.
Foto gráfica** Podemos ver como aumenta el numero de células que forman
un embrión mediante el peso a lo largo del desarrollo, en la otra grafica vemos
cuentas células sobreviven a un tratamiento de tripsina en frio y con
temperatura elevada (37º) al final del desarrollo la tasa de supervivencia de
células es mayor BALANCE ENTRE LOS DOS ASPECTOS.

Para obtener los embriones: sacrificamos un ratón hembra que esté gestando 10-20
embriones (cumpliendo la normativa). A partir de ahí se hace una primera disección de esos
embriones tratando de separar diferentes regiones dependiendo el interés del cultivo.
Como alternativa a los embriones de ratón puedo utilizar los embriones de pollo (21 de
desarrollo), entre los Estadíos de Haminton y de Hamburguer.

(Todos los estadios de los embriones de pollo y rata están descritos en un Atlas)**

Nomenclatura:

- En embriones de ratón, la nomenclatura se basa en los estadíos, tal que: Estadío 1 E1,
estadío 2, E2, etc. Y los subcultivos, del E1: E1.1, E1.2, E1.3…
- En el pollo la nomenclatura no corresponde a los estadíos con los días de éste (como
en el ratón), se corresponde a una nomenclatura numeral. 13.5: día 13, subestadío 5.
Los embriones de pollo son más grandes que los de ratón facilitando la disección, de
forma que cuando queremos hacer un cultivo a partir de una estructura determinada
usaremos el embrión de pollo.

Para extraer las células del tejido hay dos formas:

- Realizar explantes: Primero realizamos una disección fina del tejido del embrión,
técnica de chopping, existen máquinas con una cuchilla que accede a la muestra desde
la parte superior y realiza cortes hacia abajo, pero se suelen usar dos bisturís bien
afilados para ello, realizando una disección fina. Es importante que estén bien afilados
para minimizar el daño que se produce.
Se lavan los trozos de tejido que nos quedan para evitar la presencia de hematíes y
una vez lavado se siembran los pedacitos en un flask o en una placa de cultivo. Se
coloca una fina capa de medio, para que queden sólo parcialmente cubiertos por el
medio, tras el crecimiento se llena de medio por completo y aproximadamente a la
semana, cuando se cambie al medio, levantamos el tejito y observamos las células que
ya se van adheriendo.
- Disgregar las células mecánica o enzimáticamente.
o Enzimática: La enzima más usada es la tripsina, se una en conjunto con otras
enzimas, también mezclada con colagenasa, con DNAsas (el DNA que queda
puede interferir en el cultivo porque puede generar estructuras
macromoleculares, por ejemplo, por ello la eliminamos. Hay que usarla antes
de añadir la trp, para observar cómo afecta. Colagenasa y trp podemos usarlas
a la vez).
Dos protocolos para usar trp:
- Tripsina en caliente, 37ªC: Chopping del tejido, lavado, se introduce en una botella con
mosca, para que no se adhieran a la superficie, centrifugar y añadir frio. Una vez
disgregado valoramos la viabilidad con azul tripán y hacemos el cultivo.
- Tripsina en frío: 4ºC, lo realizamos en una sala fría, nevera o recipiente para
mantenerlo a esa temperatura. Choping, lavar, añadir trp toda la noche, eliminar la
trp, realizar recuento, viabilidad y finalmente sembramos.
 o Mecánica: Para hacer un cultivo de células que tienen receptores o algo de
importancia en la membrana y no quiero dañarlos con un tratamiento
enzimático.
Scrapping, más fino que el chopping, más tiempo con el bisturí disgregando
más el tejido para que haya regiones con células aisladas, suficientes para
llevar a cabo el tejido. Luego con una jeringuilla de determinado grosor, vamos
reduciéndolo (aumentango Gauss), y succionando el tejido arriba y abajo.
Incluso podemos coger el émbolo de la jeringuilla y pasarlo por el fondo
removiendo, rompiendo células como un mortero. También usamos filtración
con lana de vidrio.
Las células que hayamos podido disgregar las introducimos en un medio y
esperamos la proliferación. Mueren muchas células pero interesa hacer crecer
las que sobreviven. Finalmente realizamos un subcultivo, puedo hacer otra
selección, una vez hecha la disgregación celular, usando ese medio de
selección para seleccionar otro tipo celular específico, para ello eliminamos un
determinado factor de crecimiento que afecte a las células que no queremos
que proliferen.

Alternativas para los cultivos primarios: CULTIVOS ORGANOTIPICOS E HISTOTIPICOS: quiero

ver cómo se comportan las células manteniendo su estructura de órgano y
tejidoRequerimientos: controlar muchísimo el medio en el cual vas a hacer crecer el órgano,
cambios continuos de medio debido a cambios en el requerimiento nutricional y metabólico,
además hay sustratos especiales que se pueden utilizar.

Se utilizan placas con un pocillo central, colocas el órgano en el pocillo y luego podes agua para
que tenga humedad, pero no debe estar totalmente sumergido, así consigues que los órgaos
de interés se creen encima sin sumergirse del todo.

CULTIVOS HISTOTIPICOS: Necesitas las condiciones adecuadas para que se forme el tejido;
feeder layer, para conseguir las condiciones adecuadas, pero eliminando las capacidades
proliferativas, sólo usándolas para crecer otras células sobre estas. Este también es un cultivo
primario pero más difícil de establecer.
TEMA 10: TÉCNICAS DE SUBCULTIVO Y ESTABLECIMIENTO DE LINEAS CELULARES.
PROPAGACIÓN, CRECIMIENTO, CICLO CELULAR Y SUBCULTIVO.

Línea celular finita, si no la hemos transformado,

tiene 3 etapas:

1ª Retardo en la proliferación: Fase lat o de

latencia. Las células tripsinizadas tienen que
adherirse al sustrato, no proliferan, primero
comienzan a realizar sus funciones.

2ª Crecimiento de dinámica exponencial: Fase log

o de crecimiento logarítmico, crecimiento
constante del número de células, cuando alcanzan
un número tal que son capaces de ocupar toda la
superficie, se produce inhibición por contacto, hasta la fase de Plateau.

3ª Fase de Plateau: Se sigue produciendo proliferación pero no aumenta la concentración

celular, ya que las células no se encuentran en perfecto estado y pueden mantenerse sin
producir casi divisiones, y comienzan los procesos de diferenciación.

Para mantener las células:

- Mantener el medio con las mejores características

- Ir realizando subcultivos (Antes de la fase de Plateau). Tras cada subcultivo se produce
la fase lat.

Split ratio 2: Poner la mitad de subcultivo en un frasco y la otra mitad en otro, i, e. hacer una
división 1:2, diluyendo a la mitad mis células.

Cuando trabajamos con líneas celulares estables o continuas, tienen un límite de división
mayor y tenemos que diluir 4 u 8 veces las células, ya que su tasa de división es muy alta.

“Passage” de la línea celular: Número que indica las veces que mi cultivo ha sido pasado a un
nuevo frasco. Indica cuanto le queda a la célula hasta llegar a un proceso de senescencia. En el
frasco apuntamos el nombre, la fecha y el passage que se ha realizado para saber en qué fase
estamos. En las continuas ponemos el tiempo de duplicación de la problación.

Population doublé time: Informa cuanto dura el ciclo celular no de una célula, sino del
conjunto de la población, donde afecta la apoptosis, etc. No es reflejo de lo que dura el ciclo
celular de una célula.

DT= · Donde T es el tiempo de incubación; N0 es el número de células al principio del

( )

cultivo y N1 el número de células al final.

Se realiza tras la fase lat, esta medida está afectada por las condiciones del cultivo.

Factores que indican la necesidad de la sustitución del medio:

- pH: Las células dejan de crecer si el pH baja, normalmente de 7 a 6,5 y el pH es
demasiado bajo empiezan a morir, entre 6,5 y 6. Al bajar, el indicador cambia de rojo a
amarillo pasando por el naranja.
- Concentración celular: Las altas concentraciones de células agotan el medio más
rápido que las concentraciones bajas.
- Tipo de célula: Las células normales en general dejan de dividirse en alta densidad por
aglomeración celular, el agotamiento de factores de crecimiento, etc. Las células
quedan arrestadas en la fase G1 del ciclo celular y se deterioran muy poco, incluso si se
deja durante dos o tres semanas, a veces más.
- Deterioro de la morfología: Este factor se debe comprobar con frecuencia. Siempre se
debe tener en cuenta la morfología celular, ya que esto puede revelar la presencia de
contaminación.
TEMA 11. Caracterización, clonaje y selección de tipos
celulares. Técnicas de separación celular. Aislamiento, replica
y expansión de tipos celulares monoclonales. Caracterización
morfológica, genética y fenotípica de las células en cultivo.
Transformación e inmortalización de células en cultivo.

Una fase importante del establecimiento de cultivos celulares es conseguir una población
homogénea, mantenerla y comprobar, con el tiempo, que sigue siendo la misma población de
células. ¿Cómo podemos separar las células para quedarnos con una población lo más
homogénea posible? podemos dejar que crezcan y quedarnos con las que tengan mayor
proliferación. Para ello lo que me conviene son técnicas de separación, de clonaje (expandir
líneas celulares a partir de una sola célula) y de selección de tipos celulares.

Técnicas de separación celular

Diferenciamos varios grupos en función del principio en el que se basan:

Técnicas físicas
 Centrifugación diferencial. Para separar tipos
celulares en función de un gradiente de
densidad. Centrifugamos el tubo y la fuerza
envía las células hacia el fondo, separándolas
en capas en función de su densidad, quedando
las menos densas se en la superficie y las más
densas en el fondo. No usar un medio
citotóxico si no inerte, hay muchas sustancias
que se utilizan para generar gradientes de
densidad.

 Elución por centrifugación (para

separar en función del tamaño):
creamos un flujo de solución salina
de manera que las células no
compiten por la densidad para
avanzar en el tubo, si no con una
corriente de PBS en sentido contrario
a ella. De esta manera las células mas
grandes avanzan hacia el fondo del
tubo y las más pequeñas quedan
encima.
Técnicas inmunológicas o antigénicas
 Inmunoadsorción. Tenemos una placa con Ac fijados contra un Ag determinado.
Las células que presenten el Ag específico a ese Ac quedaran fijas en la placa y al
lavar elimino el resto de células que no presentas el Ag.

 Mediante sorting magnético puedo realizar dos

tipos. Es una separación negativa que consiste en
eliminar el tipo celular que no me interesa  Añadimos
un Ac para un Ag que presenta una célula que no quiero
tener en mi población, y ese Ac esta unido a una bolita
magnética. Cuando coloco un imán al lado, las bolitas
son atraídas y con ellas las células que no me interesan
y en el medio se quedará la población que quiero. Se puede hacer en positivo pero
es negativo es el habitual.

 Columnas MACS: (alternativa al sorting

magnético). Las columnas MACS están diseñadas
para poder seleccionar una población que me
interesa, la enriquezco. Un Ac marcado con una
bolita magnética, pero el Ac va frente a un Ag que
presentan las células que si que quiero. Paso las
células por una columna que pasa entre unos
imanes, de esta manera quedan retenidas solo las
conjugadas con el Ac que son las que me
interesan. Posteriormente con un embolo hago
presión para extraer mi población. De esta manera
es más puro, más homogéneo, no lleva células que
no quiero. Esta técnica es más sensible por lo que
los resultados son más precisos.

 Técnicas de FACS (fluorescence activated cell

sorting): esta técnica es la que consigue los
mejores resultados de selección, conjuga la
capacidad de análisis del citómetro de flujo con
una técnica de sortirg. Actúa marcando
fluorescentemente las células de interés y se hacen
pasar por un citómetro de flujo. Lo puedo hacer en
positivo o en negativo. Hago un flujo tan fino de
manera que solo quepa una célula dentro de ese.
En el tubo pasan por un laser y un detector, de
manera que cuando pasa una célula con
fluorescencia manda una señal y la detecta y
además le da una carga eléctrica. A las no
fluorescentes no se le aporta la carga. A
continuación tenemos dos electrodos con cargas
positivas y negativas, separando así ambas
poblaciones. Se pueden hacer hasta 8 canales con
 diferentes niveles de potencia. Puedo separar células de una misma población en
función de la intensidad del color que lleva asignándole una intensidad de carga
eléctrica.

Técnicas electroforéticas, cromatografía, etc.

Aislamiento, replica y expansión de tipos celulares monoclonales

 Clonación: para hacer una

población pura a partir de una única célula.
Hacer una dilución a baja concentración y
sembrar en una placa, me irán quedando
células aisladas. Incubo la placa
aproximadamente 3 semanas en las que
cada célula de dividirá y duplicaremos
aproximadamente su población.

Procedimiento: hago muchísima más dilución de manera

que cuando ponga 100 microlitros de medio haya una célula
y siembro en una placa multipocillo; de esta manera en
algún pocillo cae una sola célula, en otros ninguna y en
otros dos. Con el MO se observa cual tiene una única y al
cabo de unos días puedes diferenciar cual tiene, de cual no
en función del color del medio. Cuando tengas células
suficientes, tripsinizas y las pasas a una botellita y así ya has
seleccionado un clon
 Cuando no existían los multipocillo se hacía en una
placa petri. Elijes una célula y la marcas con un
anillo de clonaje pasado por grasa de silicona,
luego tripsinizas dentro de un anillo y las aíslas
pasándolas a una botellita de cultivo

Clonaje en células en suspensión: las coloco a baja

concentración en una placa y con una micropipeta al
microscopio cojo una única célula y la paso a una
botellita. Otra manera seria por diluciones seriadas
hasta obtener una única célula

Técnicas de caracterización morfológica, genética y fenotípica

 Morfológica: por observación

 Cariotipo: estudio del contenido cromosómico. Normalmente el cariotipo te da
suficiente información pero puedo hacer más cosas, como el cromosom banding
(marcaje de bandas), cromosom painting (marcaje de genes).

 De expresión genética: puedo ver una secuencia específica, estudios de expresión.

 Inmunomarcado y cuantificación de proteínas de interés: desde un inmunomarcado

para una proteína de interés o hacer un lisado, extraer proteínas hacer electroforesis y
luego pasarlo a una membrana, incubarlo junto con un Ac y ver si está presente o no
esta proteína. Esto son técnicas de cuantificación.
Transformación e inmortalización
.

Para caracterizar si mis células han sido transformadas: las células en cultivo cuando llegan a
confluencia no se inhiben y siguen creciendo encima de las otras identificación por foto.

También podemos comprobar su malignidad viendo si son capaces de colonizar otro tejido de
manera que, coloco mis células transformadas al lado en un corazón de embrión de pollo
(órgano hueco que no tiene circulación) y ver si mis células tienen la capacidad de penetrar en el
interior.
TEMA 12. Criopreservación, almacenamiento y transporte de
células en cultivo y tejidos animales. Pirncipios físico-
químicos de la criopreservación. Vitrificación. Técnicas y
protocolos de congelación y descongelación. Bancos de células
y tejidos animales.

La criopreservación consiste en una conservación en condiciones de “vida suspendida” a

temperaturas entre -80ºC y -º96ºC. Se basa en dos principios fundamentalmente:

- Principio de Ósmosis
- Principio de Descenso del Punto de Congelación.

En base a estas dos características podemos distinguir situaciones donde se producen daños
celulares. No se puede evitar al 100% los daños celulares, de hecho, hay una alta tasa de
mortalidad tras una criopreservación.

El problema que presenta la congelación es que se pueden dañar las células por la formación de
cristales en su interior (dañando los orgánulos): esto es posible evitarlo mediante el control de la
temperatura. A mayor concentración de sales en un fluido, menos temperatura requiere para su
congelación. Cuando empiezo a congelar la concentración de solutos es mayor fuera que dentro,
y comienza a congelarse el agua de exterior celular. Si disminuyo la temperatura lentamente el
agua de dentro tiende a salir por ósmosis para compensar la congelación del exterior. De esta
manera la célula se va quedando solo con los solutos de su interior (se congela fuera pero dentro
no). Estrategias a seguir:

 El proceso de congelación puede llevarse a cabo de manera muy lenta, donde se va

congelando el medio externo y por ósmosis sale el líquido del interior de la célula. El
interior celular quedará más concentrado. De esta manera no llegan a formarse cristales
en el interior celular, solo aparecen cristales en el exterior.
Si la congelación es rápida no baja el punto de congelación dentro de la célula,
entonces sí se formarán cristales en el interior.
La congelación excesivamente lenta tampoco es adecuada ya que la célula se deshidrata
por completo y pierde su viabilidad. Por encima del 30% de deshidratación las células
mueren. Hay que mantener un equilibrio entre el tiempo y el descenso de la
temperatura.
  El enfriamiento ultrarrápido, es prácticamente instantáneo. Consiste en dar un salto de
temperatura de 4ºC a -196ºC. No llegan a formarse cristales ni en el medio externo ni en
el interior celular, ya que ocurre un proceso de vitrificación. El agua interna y externa
se convierte en una sustancia amorfa, una sustancia vitria.

Lo ideal sería realizar un enfriamiento lento. Es de los protocolos más utilizados.

Cuando hacemos curvas de supervivencias, hay que

encontrar el óptimo de velocidad de congelación. Este
puede variar entre células vegetales, animales, granos de
polen, células individuales, etc. La media óptima de
descenso es de 1ºC/min.

Si esta gráfica la continuásemos hasta llegar a una tasa

de enfriamiento de 5 000ºC/min, observaríamos que la
tasa de supervivencia vuelve a subir. Esto representaría
el protocolo de vitrificación.

Por encima de los 5000ºC/min en la tasa de enfriamiento, de repente vuelve a subir la tasa de
supervivencia. Esto ha llevado a establecer dos protocolos óptimos de congelación: Vitrificación
o congelación ultrarrápida (500ºC/min) y Congelación lenta (1ºC/min).

Para la congelación de embriones, la vitrificación es el protocolo óptimo. En cambio para la

mayoría de líneas celulares, cualquiera de los dos protocolos es útil.

Existen aparatos específicos programados para realizar tablas de descenso de temperatura.

Crioprotectores
Además, para la criopreservación es necesario añadir sustancias que protejan las células del
daño que puedan sufrir. Estas sustancias se denominan crioprotectores. Se pueden distinguir dos
tipos:
  Agentes penetrantes. Son compuestos de bajo peso molecular y son permeables a
través de la membrana. Actúan desplazando el agua del interior de las células evitando
así la formación de cristales de hielo intercelulares. Tienen un punto de congelación
mucho más bajo que el del agua, de esta manera se congela el medio donde están
embebidas las células antes de que se congelen ellas.
Estos crioprotectores se utilizan en congelaciones a velocidad muy lenta y los más
comunes son:
o Dimetil sulfóxido (DMSO). Es muy tóxico a temperatura ambiente, pero si se
aplica a baja temperatura es el que posee mejor resultado. Es muy tóxico por
encima de 4ºC.
o Glicerol. Muy utilizado para mantener enzimas entre los -5 a 4ºC sin
congelarse.
Tanto el DMSO como el Glicerol son disolventes orgánicos capaces de penetrar
en la célula y sustituir el agua.
o Etilenglicol
o 1,2 – Propanodiol (PROH)

 Agentes no penetrantes. Son compuestos de elevado peso molecular que no son

permeables a través de la membrana, sino que actúan fuera de la célula promoviendo
una rápida deshidratación de la misma. Provocan una mayor concentración de solutos
en el exterior, por lo que agua de las células sale por ósmosis. No puede salir todo el
agua del interior celular, porque las células moriría.
Se utilizan en congelaciones a velocidades muy altas y los mas conocidos son:
o Polivinil pirrolidona (PVP). La PVP no tiene un movimiento rápido tisular (a
través de los tejidos), por lo que se utiliza mucho en embriones.
o Lipoproteínas de la yema de huevo
Estos dos agentes anteriores, son capaces de crear un medio con una cierta
densidad que atrapan los cristales de hielo en el exterior, evitando así que
penetren en el interior celular. De esta manera, el medio se vuelve más viscoso.
o Proteinas de elevado peso molecular
o Polietilenglicol (PEG)

Técnicas y protocolos
Técnica de Congelación. Primero tripsinizamos las células y
luego las resuspendemos en un medio de congelación. Para
prácticamente todas las células en cultivos celulares se utiliza
el DMSO al 5 – 10% (lo más habitual es al 10%). Añadimos
mucho suero al medio, para generar unas condiciones de mayor
densidad del medio externo y atrapar los cristales de hielo.

Utilizamos criotubos, son recipientes preparados para soportar

temperaturas de -196ºC. Presentan un tapón con rosca, que les
permite soportar los cambios de presión. Todo esto se realiza
en condiciones de esterilidad. Una vez llenados los criotubos,
llevo a cabo el protocolo de congelación:
 - Colocando mis células en la parte gaseosa del N líquido. Hay que buscar la distancia
óptima a la que se consigue una tasa de congelación de 1ºC/min. Existen sondas que te
permiten calcular la altura óptima.
- Colocando mis células en el interior de un recipiente con una cubeta por debajo en la
que puedo colocar una sustancia (disolvente orgánico de temperatura de congelación
baja, que lo que hace es amortiguar el descenso de temperatura). Ese recipiente lo
coloco en un ultracongelador de -85ºC.
- Otra alternativa es una botella de N. Se compran unos tacones
con un cestillo donde puedo colocar mi criotubo. Y si tienes
mucho dinero puedes comprar un congelador programado. El
investigador le indica cómo quieres que sea la congelación, y el
va disminuyendo la temperatura para ir alcanzando la tasa de
congelación que le has dicho.

Una vez congelado lo podemos conservar en el ultracongelador a -85ºC, que me durará 6 meses,
o sumergirla en un recipiente con N líquido donde si se mantiene la cantidad adecuada de N
tiene una duración indefinida.

Las células siempre se deben congelar cuando están en mitad de la fase Log, para obtener los
mejores resultados. Aún así, la tasa de supervivencia está en torno al 60%, por ello hay que
congelar una alta concentración de células.
 Vitrificación
La vitrificación se está utilizando mucho en las técnicas de
reproducción asistida. Conlleva el uso de crioprotectores
no penetrantes.

Se sumergen las células en el crioprotector, normalmente

hay que ir haciendo un gradiente de concentraciones
ascendente para que el agua no salga tan rápidamente de
las células.

Se colocan las células en unas pajuelas, son unas pajitas

muy finas que se han modificado y se denominan también
criotps. Todo el recipiente debe estar llego y a penas debe
tener aire.

Se sella por los extremos y lo que se hace es lanzarla al

interior de un recipiente con N líquido. De esta manera
realizamos una congelación instantánea.

Se mantiene la pajuela en N líquido.

Descongelación
La descongelación depende de cómo hayamos conservado las células. Es un proceso que
también debe llevarse a cabo de forma rápida.

Se sumerge el criotubo o las pajuelas en agua a 37ºC. Pueden explotar por el cambio de
temperatura. Se debe sacar del N líquido y meterlo en un recipiente y taparlo.
Transporte
El transporte se puede realizar de dos maneras:

- Enviarlas congeladas en los criotubos, con la precaución de sumergirlos en hielo seco,

nieve carbónica con una temperatura de -90ºC.
- Enviarlas in vivo, creciendo en cultivo. Para ello tengo que enviar las células dentro de
un flask, un bote de cultivo, que se pueda cerrar. Con la precaución de llenarlo
totalmente de medio antes de cerrar el flask, para que con cualquier movimiento durante
el trayecto las células estén sumergidas en medio.
Las células aguantan sumergidas en medio de 24 a 72h. Si el tiempo de envío va a ser
mayor hay que enviarlas congeladas.

Una alternativa es que el medio tenga una gran cantidad de suero. Así, si hay golpes, y las
células se sueltan de la superficie, puedan mantenerse estables en suspensión.
 TEMA 14. CULTIVO DE CELULAS TRONCALES (STEM CELL). TIPOS DE CELULAS TRONCALES: ESC, PGC, SSC, HSC,
Ipsc. MEDIOS, SUSTRATOS Y OTROS REQUERIMIENTOS ESPECIALES. CUERPOS EMBRONARIOS Y EL PROCESO DE
DIFERENCIACION IN VITRO. CULTIVO DE CELULAS TUMORALES.

CARACTERISTICAS Y TIPOS DE CELULAS TRONCALES

Stem Cells Self-renewal (autorenovación): capacidad que posee una célula troncal. Tiene una capacidad infinita de
reproducción debido a la presencia de telomerasa activa, por ello no hay pérdida de esta en los cromosomas
(añaden la región telomérica para compensar la pérdida). Debido a ello estas células no presentan daño por
acortamiento celular. Esta capacidad se lleva a cabo por dos mecanismos:

 División asimétrica: la célula troncal a través de mitosis da como resultado dos tipos de células muy
diferentes entre sí (ciclo de división asimétrico), una de ellas va a mantener las características de una
célula troncal propiamente dicha y otra cuya capacidad de división es limitada ya que va a empezar un
proceso de diferenciación, es decir será una célula diferenciada que realizara una determinada función en
el organismo. Si continuamos el cilco de la celula troncal volvemos a tener otro ciclo de división
asimétrico.
 División estocástica: en este caso el resultado pueden ser dos células troncales, dos células diferenciadas
o una célula troncal y otra diferenciada.

Se desconoce la razón de porque unas veces realizan una división asimétrica y otras estocástica, al igual que
tampoco se conoce las razones que se obtienen en la división estocástica. Por ello decimos que coexisten ambas
divisiones en las células troncales. Debemos tener en cuenta que a partir de una célula diferenciada no se puede
obtener una célula troncal.

Stem Cells Potency (Potencia): esta es otra de las características que presentan las células troncales, que es la
capacidad de formar otro tipo de célula. Esta capacidad o potencia que tienen las células troncales esta graduada,
hay diferentes tipos, que son:

 Totipotente: uno de los tipos más importantes de células madre porque tienen el potencial de convertirse
en cualquier célula que se encuentra en el cuerpo humano, quedan limitadas al cigoto. Pueden
convertirse en cualquier tipo de célula, lo que las hace ideales para la terapia genética, así como la
ingeniería de tejidos para trasplantes y la sustitución de las células enfermas. Esto significa que el valor
terapéutico de las células madre totipotentes es enorme.
 Pluripotente: son capaces de generar prácticamente todo tipo de tejidos que forman parte de cualquiera
de las tres láminas embrionarias (ectodermo, endodermo y mesodermo). tiene limitada su capacidad para
diferenciarse, ya que capaces de de formar tejidos que provienen de estas tres capas pero no pueden
formar tejido extraembrionario. Esta célula madre en particular, puede dar lugar a hueso, músculo,
cartílago, grasa y otros tejidos similares. Surge a partir de células madre totipotentes y pluripotentes
 Multipotentes: son células no especializadas que tienen la capacidad para auto-renovarse durante largos
períodos de tiempo y diferenciarse en células especializadas con funciones específicas, es decir estas
células están determinadas. Tiene limitada su capacidad para diferenciarse. Funcionan para reponer las
células del cuerpo a lo largo de la vida de un individuo (células neuronales, músculo cardiaco y glóbulos
rojos).
 Oligopotentes: son capaces de regenerar diferentes tipos celulares y diferentes tejidos pero con las
mismas características.
 Unipotentes: células que pueden diferenciarse a lo largo de sólo un linaje. Se encuentran en tejidos
adultos. Una célula madre unipotente, en comparación con otros tipos de células madre, tiene el
potencial más bajo diferenciación, ya que generan un solo tipo de célula. Prácticamente todos los tejidos
de nuestro organismo presentan células unipotentes que son las encargadas de mantener un órgano.

EMBRYONIC STEM CELLS (ESC)

 Pluripotente
En esta imagen podemos ver las distintas fases de diferenciación a través
de una serie de células pluripotentes que proceden de la masa celular
interna del blastocisto que dará lugar al individuo. Estas células
pluripotentes formaran los tejidos de las tres capas embrionarias. Las
células de la masa interna del blastocisto provienen de células
totipotenciales (mórula).

PRIMORDIAL GERM CELLS (PGC)/ EMBRYONIC GERM CELLS (EGC)

 Pluripotente

Otro tipo de células pluripotentes son las células germinales primordiales, estas se forman fuera del embrión
durante el desarrollo en el pared del saco vitelino. Cuando el embrión ha avanzado estas células germinales
migran a través del cordón umbilical y se
colocan dentro de la gónada primitiva
(situada dentro del embrión). Estas células
germinales se forman fuera del embrión y
migran a la gónada. Estas células las
podemos extraer antes de que llegue a la
gónada y cultivarlas, en este caso podemos
ver cómo al ser pluripotentes pueden dar
lugar a todos los tejidos de los organismos si
los extraemos antes de que lleguen.

SOMATIC STEM CELLS (SSC)/ ADULT STEM

CELLS (ASC)

 Multipotente

Aquí podemos ver diferentes tipos de células troncales multipotententes en distintos lugares del cuerpo humano.
En los dientes por ejemplo tenemos un tipo celular y en las mamas también están presentes que son capaces de
dar un grupo muy amplio de tipos celulares. Las células que forman la medula ósea también son células
multipotentes en las que tenemos son dos tipos, las
formadoras hematopoyéticas (series blancas de la
sangre) y células troncales adultas (células
mesénquimales), estas últimas también pueden formar
diferentes tejidos. En el tejido adiposo, en el musculo,
en la cresta neuronal (células troncales neuronales, a
partir de aquí se formaran células del sistema
nervioso) y en el testículo (la mayoría se han
descubierto a partir de formación de tumores).
En cada uno de estos lugares podemos encontrar
células troncales las cuales se llaman reservorios.

HEMATOPOIETIC STEM CELLS (SSC)

 Multipotente
Células hematopoyéticas y del estroma son un ejemplo de células multipotentes que forman todas las células
sanguíneas. Estas células son
multipotentes porque no son capaces
de crear tejidos de otras láminas
embrionarias. Otro ejemplo donde
podemos encontrar células
multipotentes es en el tejido de
“Wharton”, es un tejido perteneciente
al cordón umbilical amorfo distinto al
resto. A partir de las células que
forman este tejido se han obtenido
células con capacidad regenerativa. Se
ha empleado en la regeneración de la
piel obteniendo buenos resultados, por
ello estas células suponen la creación
de un banco de piel.

INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS (iPSC).- CELULAS PLURIPOTENTES INDUCIDAS

 Pluripotente

En el año 2000 se supo que se puedia reprogramar las células ya diferenciadas. La primera vez que se consiguió
fue mediante infección vírica. Ahora estamos en capacidad de introducir proteínas o RNA de interferencia
pudiendo reprogramar las células (representada la evolución en la tabla). Como células pluripotentes solo
hablábamos de células embrionarias que suponía un problema ético y legal pero esta capacidad nos permite
acabar con todo esto de cara a la medicina regenerativa. Ha disminuido la eficiencia (programación en todas las
células infectadas) y hemos ganado en efectividad. Ahora queda trabajar en la eficiencia.
También se han obtenido células pluripotentes a través del
cultivo de células troncales embrionales (extraídas de la masa
celular interna de un blastocisto), células germinales
embrionarias (extraídas de un feto) y células que provienen de
un teratocarcinoma (cáncer de testículo de un adulto). Tras el
cultivo todas ellas se han unido en una misma placa de cultivo y
se ha visto que presentan pluripotencialidad.

MEDIOS, SUSTRATOS Y OTROS REQUERIMIENTOS ESPECIALES

MARCADORES DE CELULAS PLURIPOTENTES

Nos ayudan para saber si una célula es pluripotente y así aislarla en cultivo, por ello debemos tener en cuenta la
presencia de:

 SSEA-1, SSEA-3 y SSEA-4 (Stage Specific Embryonic Antigen): proteínas antigénicas de membrana que solo
se expresan en las células de la masa interna en un desarrollo normal al igual que en la línea germinal.
 OCT-4 (Octamber-binding transcription factor 4): factor de transcripción que permite identificar que
estamos trabajando con células pluripotentes.
 Nanog (homeobox protein): proteína relacionada con los patrones de desarrollo corporales.

MEDIO DE CULTIVO

Para el cultivo de células troncales se usa un medio basal

(DMEM/F12) libre de suero. También se necesitan dos aditivos
específicos:
  Β-Mercaptoethanol  Agente antioxidante para evitar el efecto de especies radioactivas (es toxico)
 Leukemia inhibitory factor (LIF)  Evita la diferenciación de las células. Se emplea sobre todo en la
primera fase de cultivo sobretodo.

Una vez extraídas las células de la masa celular interna del

blastocisto humano y haber aislado las células
pluripotenciales a través de los marcadores mencionados
anteriormente, procedemos a cultivarlas. Hay tres formas de
cultivarlas:

A) EMBRYOID BODIES (CUERPOS EMBRIOIDES)

Mediante la gota pendiente, hacemos crecer las células

embrionarias en esta posición ya que por efecto de la
gravedad se consigue la unión máxima de estas como la
masa celular interna del blastocisto (forma esferoidal). Las
gotas se ponen a través de unos poros en unos pocillos que están en un soporte común.
Cuando llegan a la forma similar a la de la masa celular interna se da una diferenciación
dando dos capas similares al epiblasto e hipoblasto. Mediante la adicción de factores y el
empleo de medios de cultivos específicos darán lugar a un tipo celular u otro.

B) COCULTURE OR CONDITONES MEDIUM CULTURE (CO-CULTIVO)

Si cultivamos las células junto con otras (feeder layer) tendremos mucha contaminación
genética; por lo que se hace un co-cultivo en el que ponemos las células con otras en un
medio condicionado, es decir, que contenga factores de crecimiento y todo lo que me
aportan los fibroblastos que poníamos como matriz. Primero se siembran los
fibroblastos y cuando liberen los factores necesarios se coge ese medio (feeder-layer) y
se siembran las células troncales. Aparte hay que usar una matriz gelatinosa para que se
adhieran mis células.

C) 3-D SCAFFOLDS

En este caso se usan moldes o armazones, es decir, un andamiaje. Estos son soportes que tienen en su interior
una morfología particular que ha permitido derivar células embrionarias en gametos. Las células se ponen sobre
este andamiaje y se consigue por ejemplo un túbulo seminífero,
tejido cartilaginoso, óseo…. Utilizando moldes que sitúan a la
célula es una posición determinada.
Tema 18. Producción in vitro de metabolitos
secundarios en cultivos de células y tejidos vegetales
Un ejemplo de las aplicaciones que tiene la obtención de metabolitos secundarios es el taxol.
Se usa en tratamientos de cáncer, se obtiene a partir del taxus pero la producción de ese
compuesto es muy costosa. Para producir una cantidad apreciable se tiene que talar muchas
plantas. Después de muchos años se han conseguido líneas celulares que pueden obtener
producto de manera estable.

 Metabolismo secundario, se utiliza para restar la incapacidad de movimiento que tienen

las plantas, entre ellos están los pigmentos, productos bioquímicos, enzimas.

 Los productos del metabolismo primario con interacciones celular y tisulares que al final
producen metabolitos secundarios:

 Como se observa en la imagen;

obtenemos diferentes productos como
las taninas, alcalodies… A partir de
compuestos sencillos. Estos
compuestos son muy difíciles de
obtener en el laboratorio por eso se
utilizan las plantas para ello.
 Pueden acumularse en vacuola, plastidios,
sistemas de transporte 

 Representación de los compuestos según a

partir de donde provengan. Se ve como
interaccionan los metabolitos y el ambiente.

 Poseen un coste muy elevado en el mercado

Ventajas:
 Independientes de variaciones geográficas,
estacionales, ambientales o políticas
 Producción uniforme en cantidad y calidad más
rápida
 Obtención de nuevos compuestos que no se
encuentran en la planta.

 Ejemplos de líneas celulares con elevada producción

de metabolitos secundarios:

 Estrategias para aumentar la producción de metabolitos secundarios en cultivos celulares:

1) Análisis y selección de líneas celulares altamente productivas:
 Las líneas celulares se inician a partir de plantas que tengan una elevada
producción del metabolito que se desea producir y los cultivos se
establecen con explantes de los órganos en los que se detecta esa mayor
concentración.
  El establecimiento de los cultivos celulares genera diferentes líneas de
células en las que el metabolito debe ser cuantificado durante su ciclo
celular para detectar las que sean más productivas (líneas con alto
rendimiento).
 Las líneas seleccionadas pueden ser expuestas a mutágenos para obtener
líneas con una mayor producción del metabolito.

2) Se coge una especie en la que sea rentable llevar a cabo el proceso, y que sea rara
o este en peligro. ¿que hacemos con las células?
 Coger la parte de la
planta que tenga mas
cantidad del producto
 Obtener una suspensión
celular
 Mirar cual de las líneas
tiene un rendimiento
mas alto para
seleccionarla
 Se aíslan y se siguen
cultivando.
 Pasarlo a tamaños
mayores (biorreactores)
evaluando como afecta.

3) Manipulación del medio de

cultivo para incrementar la producción:
 La expresión de muchas rutas del metabolismo secundario puede ser
alterada fácilmente mediante cambios en factores externos relacionados
con la nutrición de las células.
 Niveles de carbohidratos (regulación de la actividad metabólica)
 Concentración de Nitratos (regulación de los niveles
de aminoácidos y proteínas) y Fosfatos (regulación
del crecimiento celular).
 Reguladores del crecimiento (algunas auxinas como
el 2,4 D inhiben la síntesis de metabolitos
secundarios)
 Suministro de precursores
 La optimización de las condiciones del medio
ambiente de cultivo:
 Temperatura
 Iluminación
 PH
 Agitación
 Aireación
 Elicitación
 Permeabilización
 Elicitación
1) Aplicar a las células agentes químicos o biológicos,
causando de alguna forma estrés que la planta puede
experimentar in vivo. Si la estresamos hasta cierto punto
podemos obtener niveles mas altos del compuesto que
nos interesa, pero sin pasarnos.

2) Como funciona el mecanismo de elicitación.

 Los compuestos que puedan afectar la
membrana, pueden provocar cambios a nivel
vacuolar y liberar compuestos de interés.
 También pueden afectar a otras partes celulares.

3) Durante muchos años se usaban los elitizadores sin saber la

función exacta (hasta hace 10 años)
4) Hay que tener cuidado entre la viabilidad celular y la aplicación
de los elitizadores.

 Permeabilización y compartimentación
a. Generalmente los metabolitos secundarios se acumulan en las vacuolas
de las células vegetales, estos pueden ser liberados mediante la
permeabilización de las membranas celulares facilitando su liberación.

b. La permeabilidad de las membranas puede ser cuantificada

indirectamente mediante la determinación de actividades enzimáticas específicas como
por ejemplo hexoquinasa, citrato o malato sintetasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

c. Los métodos químicos de permeabilización incluyen la aplicación de solventes orgánicos

como isopropanol, DMSO y polisacáridos como el quitosano.
d. También se pueden emplear procedimientos físicos como la ultrasonicación, la
electroporación.

e. Existen diferencias entre las células animales y vegetales:

 Los metabolitos en las células vegetales se sintetizan en el
retículo endoplasmático y posteriormente son
transportados a las vacuolas para su almacenamiento.

 Cultivos de raíces vegetales para la obtención de metabolitos

secundarios:
 a. Las raíces se cultivan fácilmente con unas mínimas condiciones podemos obtener
cultivos estructurados

b. Biotransformación, utilizando los materiales bioquímicos para aumentar la producción

de algún compuesto determinado.
 Podemos establecer en que lugar de la ruta hay que añadir o quitar para dirigirla al
aumento de la producción del compuesto de interés.

 Cultivos de células inmovilizadas para producción de metabolitos secundarios

a. La inmovilización es una técnica que confina a las células metabólicamente activas
dentro de un soporte fijo que evita su desplazamiento hasta la fase líquida (medio de
cultivo). Las células son incluidas en geles que polimerizan a su alrededor.

b. Los cultivos inmovilizados pueden ser empleados tanto en biotransformación como en la

síntesis directa de metabolitos. La producción mediante células inmovilizadas debe
reunir las siguientes condiciones:
 La producción del metabolito a sintetizar no debe estar asociada al
crecimiento de forma estricta.
 Las células inmovilizadas
deben mantener una
viabilidad prolongada y
una elevada capacidad
biosintética .
 El metabolito producido
debe difundir desde las
células a través de la
matriz al medio de cultivo.

 Ingeniería metabólica aplicada a la producción de metabolitos secundarios:

1. En plantas las rutas son mas complejas debido al metabolismo secundarios.
La metabolómica:

"La ciencia se construye con hechos, como una casa es con piedras. Pero un conjunto de actos
f no es más una ciencia que un montón de piedras es una casa "-. Jules Henri Poincaré

1. Definiciones:
Metabolómica: Determinación sistemática completa y simultánea de los niveles de
metabolitos en el metaboloma y sus cambios con el tiempo como consecuencia de estímulos
o Emergente campo de la investigación 'ómicas'.

Metabolome: Se refiere a todo el conjunto de metabolitos de pequeñas moléculas

o dinámico

Los metabolitos: Los intermedios y productos del metabolismo

o Ejemplos incluyen antibióticos, pigmentos, carbohidratos, ácidos grasos y
aminoácidos
o Metabolitos primarios y secundarios

2. Recolección de datos: Cuatro puntos principales en el análisis de los datos de la

metabolómica:
o Eficiente e imparcial
o Separación de analitos
o detección
o Identificación y cuantificación

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
1. Cromatografía de gases (GC): Sobre todo en Química Orgánica
o Alta resolución cromatográfica
o Exigir la transformación química
o La fase móvil y estacionaria
o nombres alternativos

2. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC):Bioquímica y

química analítica
o Baja resolución cromatográfica
o Amplia gama de analitos
o La fase móvil y estacionaria
o tiempo de retención
 3. Electroforesis Capilar (EC ): Introducido en 1960
o Eficiencia de separación Superior HPLC
o Amplia gama de metabolitos de GC
o analitos cargados

4. Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)

COMBINACIÓN DE TÉCNICAS
1. GC-MS
2. HPLC-MS

TÉCNICAS DE DETECCIÓN
1. Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear
(RMN) :
o Una corriente que pasa por (verde) genera un
fuerte campo magnético polariza los núcleos en el
material de muestra (rojo).
o Está rodeado por la r.f. bobina (negro) dicta la r.f.
generadas por ordenador melodías que inician la
danza cuántica nuclear.
o En algún momento en el tiempo, el interruptor se
enciende y ahora la danza se registra a través de
la tensión que induce la señal de RMN, en el r.f.
bobina. Las señales de transformada de Fourier
(FT) muestra "líneas" para distintos núcleos en
diferentes entornos electrónicos.

 Un típico 950-MHz de espectro RMN de orina que muestra el grado de complejidad

espectral

2. La espectrometría de masa (MS): Identificar y

cuantificar los metabolitos
o Sirve tanto separada y detectar
o Misa a cobrar proporciones
o El uso de haz de electrones
o La fuente de iones, un analizador de masas y
un detector

3. Análisis de datos e interpretación:

Los datos recogidos se representa en
una matriz
Enfoque Quimiometría
 Análisis de componentes
principales (PCA)
  Modelado Independiente Soft de Analogía Class (SIMCA)
 Partial Least-Squares (PLS) Método de proyecciones para Estructuras latentes
 Ortogonal PLS (OPLS)

PCA:
 sin supervisión
 El análisis multivariado basado en métodos de
proyección
 Principal herramienta utilizada en la
quimiometría
 Extraer y mostrar la variación sistemática en los
datos
 Cada Principio de componentes (PC) es una
combinación lineal de los parámetros de los
datos originales
 Cada PC sucesiva explica el importe máximo de
la variación posible, no explicada por las PCs
anteriores
 PC ortogonales entre sí la conversión de datos original lleva a dos matrices, conocidas
como las puntuaciones y cargas
 Las puntuaciones (T) representan un avión de pocas dimensiones que se aproxima
mucho a las combinaciones X. lineales de las variables originales. Cada punto
representa un único espectro de la muestra.
 Una carga Solar Solar / dispersión (P) muestra la influencia (peso) de los X-variables
individuales en el modelo. Cada punto representa una intensidad espectral diferente.
 La parte de X que no se explica por el modelo de forma de los residuos (E) X = TPT =
t1p1T + t2p2T + ... + E

SIMCA:
 Método de aprendizaje supervisado
basado en PCA
 Construir un modelo PCA separada
para cada clase conocida de
observaciones
 Modelos PCA utilizados para asignar la
clase que pertenece a las
observaciones de clase de origen
desconocido
 Los límites definidos por el 95% intervalo de clase
 Se recomienda su uso en un caso de clase o de clasificación, siempre se necesita
ninguna interpretación
 Problema de una sola clase: Sólo observaciones enfermedades definen una clase;
muestras de control son demasiado heterogéneos, por ejemplo, debido a otras
variaciones causadas por las enfermedades, el género, la edad, la dieta, el estilo de
vida, etc
 Problemas de dos clases: la enfermedad y control observaciones definen dos clases
separadas
PLS:
 Supervisado método de
aprendizaje.
 Recomendado para los
casos de dos de clase en
lugar de utilizar SIMCA.
 Principios que de PCA. Pero en PLS, se utiliza una segunda pieza de información, a
saber, el conjunto etiquetado de las identidades de clase.
 Dos tablas de datos consideran a saber, X (datos de entrada a partir de muestras) e Y
(que contiene los valores cualitativos, como la pertenencia de clase, el tratamiento de
las muestras)
 Se busca la relación cuantitativa entre las dos tablas.
o X = TPT + E
o Y = TCT + E
 El algoritmo PLS maximiza la covarianza entre las variables X y las variables Y
 PLS modelos afectados negativamente por la variación sistemática en la matriz X que
no están relacionadas a la matriz Y (no forma parte de la estructura de correlación
conjunta entre XY.

4. Observaciones sobre la clasificación de patrones

 Intención en el uso de estas técnicas de clasificación no identificarse compuesto
específico
 Clasifique en categorías específicas, condiciones o estado de la enfermedad
 Química clínica tradicional dependía de la identificación y cuantificación de
compuestos específicos
 Perfiles Quimiometría interesado en ver todos los metabolitos a la vez y hacer una
clasificación fenotípica de diagnóstico

5. Perfiles y patrones:
 Perfiles metabolómica dirigida es fundamentalmente diferente de la mayoría de los
enfoques quimiométricos.
 En metabolómica dirigida de perfiles de los compuestos en un biofluido dado o
extracto de tejido identificado y cuantificado comparando el espectro de interés para
una biblioteca de espectros de referencia de compuestos puros.
 Ventaja Clave: No requiere colección de juegos idénticos = Más susceptibles de
estudios en humanos o de estudios que requieren menos supervisión del día a día.
 Desventaja: el tamaño relativamente reducido de la mayoría de las bibliotecas
espectrales actuales = identificación de metabolitos sesgo y la interpretación.
 Una tendencia cada vez mayor hacia la combinación de las mejores características de
ambos métodos quimiométricos y específicas.

6. Bases de datos:
 Gran cantidad de datos
 Necesidad de bases de datos que se pueden buscar fácilmente
 Mejores bases de datos le ayudarán en la combinación de métodos de perfiles
quimiométricos y específicas
 Bases de datos de reciente aparición
 HMDB buen modelo para otras bases de datos
 Desafío de la normalización
 7. Integración de la metabolómica con otros campos "ómicas"
 La integración de la genómica y la metabolómica para las vías metabólicas de la planta
de ingeniería - Kirsi-Marja Oksman-Caldentey y Kazuki Saito (2005)
 El análisis proteómico y metabolómica de cardioprotección: Interacción entre la
proteína quinasa C épsilon y delta en la regulación del metabolismo de la glucosa de
los corazones murinos
 Estudios recientes (2005) para integrar la transcriptómica, la proteómica y la
metabolómica, en un esfuerzo para mejorar la eficiencia de la producción en
condiciones de estrés de las uvas.
 Nutrigenómica es un término generalizado que une la genómica, la transcriptómica, la
proteómica y la metabolómica para la nutrición humana.

8. Aplicaciones:
 evaluación de Drogas
 toxicología clínica
 Nutrigenómica
 genómica funcional

IVF:
 estadística
 Sistema de evaluación basado en la morfología del embrión y las tasas de la escisión
de los pilares de la evaluación del embrión en todo el mundo
 No lo suficientemente precisa
 Las investigaciones para demostrar la diferencia metabólica subyacente entre los
embriones resultantes en el embarazo y las que no lo hacen.
 Objetivo del método:
o Para aumentar las tasas de embarazo y reducir el número de embriones
implantados
o Para mejorar los resultados del tratamiento y una reducción en la tasa de
nacimientos múltiples
o Para reducir el tiempo y el costo de lograr un embarazo exitoso
o Para ampliar el mercado de la FIV

 Puntaje de viabilidad calculado usando (A) NIR y (B) los

espectros Raman de los medios de cultivo se muestran
para los embriones que implantan y que conducen a la
entrega (vacío) y los que no se implantan
(sombreado).
 Resultado:
o concentraciones Glutanate
o índices de viabilidad
 conclusión: La correlación de perfil metabólico de
estado medios de cultivo del embrión con potencial reproductivo de embriones

9. Desafíos y el futuro desarrollo

 base de datos
 Normalización
 Diversidad / variación de los datos de metabolómica
 Formas más eficientes de identificación
 Mejores modelos de interpretación de los datos
 Integración con otras «ómicas»
Tema 19: Células madre vegetales: Caracterización e
implicaciones biotecnológicas.
1. Definición y Ubicación: Tanto en animales como en plantas son células que pueden
autoperpetuarse y al mismo tiempo generar los todos los tipos de células maduras
diferenciadas que componen los diferentes órganos.
 Son células totipotentes durante toda la vida de la planta.
 Se encuentran en los meristemos apical, axilar y en el cambium del tallo, ocupando
nichos en los que se mantienen en un estado indiferenciado controlado por los
grupos de células circundantes.
 Se pueden caracterizar mediante marcadores moleculares específicos.

Ejemplos de nichos con células madre en

animales y vegetales:
Rojo: células que generan la señal de control.
Azul obscuro: Células madre.
Azul claro: descendientes de las células madre.
 OC: centro organizador
 SC: células madre
 zp: zona periférica
 LP: primordio foliar.
Ilustración 1: a) Germinarium de Drosofila. B) Médula ósea. C)
meristemo apical .D) meristemo radicular

Ilustración 2: Nichos específicos de células madre vegetales I

2. Diferenciación: Interacción entre los diferentes genes implicados en la regulación de la

función meristemática
 Estructura del meristemo apical:
A. zonas en que se diferencia el meristemo apical
de arabidopsis (modelo).Cz o zona central
contiene las células madre, PZ (zonas
periféricas) genera los primordios de órganos
laterales, Rz (zona interior) genera las células
diferenciadas del tallo en crecimiento.

B. El meristemo apical se divide en tres capas

de células, L1: capa de una sola célula genera
la epidermis, L2 y L3 generan el mesófilo y los restantes tejidos.

 Ultraestructura de las células madre.

Isodiamétricas, con elevada
relación núcleo: citoplasma,
núcleo esférico con uno o
varios nucleolos con
abundante heterocromatina,
citoplasma denso y vacuola
muy fragmentado. Tienen
unas paredes celulares
delgadas interconectadas mediante plasmodesmos para facilitar el movimiento de los factores
de transcripción.

 Asimetría
Asimetría divisional: La continuidad en la
división de las células madre está controlada
mediante señales intercambiadas entre ellas y
las de su nicho circundante. Flechas amarillas:
promoción. Rojas: inhibición.

Asimetría poblacional: El resultado final de la división de las

células madre depende de su nicho. Las células madre pueden
dividirse asimétricamente para producir células TA (de
amplificación transitoria o generar nuevas células madre. La
población de células en diferenciación envía constantemente
señales a las células del nicho y células madre para regular su
división.

 Genes importantes en el desarrollo de

meristemo apical:
 Fenotipos de algunos mutantes de arabidopsis que han
servido para caracterizar los genes reguladores de la
diferenciación del meristemo apical de las células madre
vegetales: Fenotipos de los mutantes de arabidopsis en genes
que regulan el SAM. (plántulas de 7 días). En sección
longitudinal.
 Clavata (clv): sam más ancho y alto que WT
 Wuschel (WUS): sam más plano que WT con una sola capa
 (Shoot meristemless) STM: sam casi inexistente y unido en la
base con los cotiledones.

Ilustración 3: A) CONTROL. B) CLV-1. C) WUS-1. D) STM.

 Interacción entre los diferentes genes implicados en la

regulación de la función meristemática

 MARCADOR DE CELULAS MADRE:

Bucle de retroalimentación negativa que regula las células madre en el meristemo apical de
arabidopsis. Las células madre tienen como gen marcador a clv3.
 Coordinación de la proliferación y evolución celular en el
meristemo apical:
A: Sistema clavata-wuschel.
B: transducción de señales del sistema clavata a nivel celular.

El sistema del bucle CLV-WUS se compone de una señal mediada

por WUS desde el centro organizador que especifica la identidad
de las células madre en las capas superiores las cuales retornan
una señal reguladora mediante el sistema CLV que limita su vez el
tamaño del domino celular que expresa el gen WUS en el centro
organizador. La transducción de la señal mediada por el complejo
CLV lleva a la regulación negativa del gen WUS en el núcleo con la
posible mediación de varias proteínas kinasas.

 Regulación de la diferenciación del meristemo apical.

Modelos de estructuras y cascadas de señalización de la SAM y la memoria RAM.

A) Estructura de SAM y la expresión de genes reguladores. El

SAM está dividido en tres zonas, la zona periférica (PZ), la zona
central (CZ) y la zona de costilla (RZ), y tres capas, L1, L2 y L3.
CLV3 se expresa en la célula madre (amarillo), mientras que
WUS se expresa en el centro de organización (OC, rojo). La
estructura coordinada SAM está regulado por
retroalimentación negativa WUS- CLV3.

B) los componentes moleculares que intervienen en el

mantenimiento SAM. Precursor CLV3 se maduró y se secreta al
espacio apoplástica, entonces recibida por grupos de
receptores, CLV1, CLV2 y SOL2/CRN. Los receptores transmiten
la señal para regular la expresión WUS. Péptidos sintéticos
aplicados exógenamente presumiblemente actúan a través de
la misma vía.

C) Estructura de la RAM. El centro de reposo (QC, rojo) está

rodeado de células madre (amarillo), y las células
meristemáticas (azul) se encuentra en la zona superior.
Homeobox relacionado con el WUSCHEL 5 (WOX5) se expresa
en las células de control de calidad. La región de la expresión
de los genes CLE en la memoria RAM permanece para ser
encontrado.
 Mecanismos moleculares que regulan la evolución de las células madre en el meristemo
apical de Arabidopsis.

Las células madre están

situadas en las capas celulares
más externas del centro del
meristemo (verde). Esta
población se mantiene
mediante una seña X que se
genera por las células WUS del
centro organizador (naranja).

Las células madre expresan CLV3 que codifica una molécula señal (.) que se desplaza hacia los
lados y la parte inferior de las capas celulares subyacentes. CLV3 activa un sistema de
transducción de señales mediado por CLV1 y CLV2 que limita la expansión del dominio celular
que expresa WUS.

Los reguladores transcripcionales ULT1 y HAN restringen la expansión del domino que expresa
WUS mediante vías independientes de CLV. Las proteínas PHB, PHV y CNA regulan
negativamente el nivel de mRNA WUS que es transcrito por las células del centro organizador.
Las proteínas anteriores están así mismo sujetas a una regulación negativa por el
microRNa166. /5.
 La proteína STIP regula positivamente la expresión de WUS en el centro organizador y es
regulada negativamente por los genes CLV.
 Las proteínas FAS1/FAS2 y SYD actúan mediante procesos mediados por cromatina para
prevenir la activación ectópica de WUS en células fuera del centro organizador y mantener
los niveles de WUS elevados dentro del centro organizador.

 La ruta CLAVATA es antagonista del gen WUS: Los genes CLAVATA y WUS forman parte
de un circuito regulador de retroalimentación que controla la actividad del meristemo.
Artículos:

Detección de mRNA CLV3 en un meristemo de

arabidopsis:
 Regulación de meristemos axilares

 Los cambios en los patrones de expresión de genes (tabla izquierda) y morfología (dibujos a la
derecha) durante el desarrollo de primordio.

Durante la primera etapa de la iniciación de órganos

de una pequeña población de células que incluyen
las células fundadoras primordios comienzan a ser
reclutados en la periferia de meristemos. Al
principio, esta contratación no es absoluta, y las
células todavía pueden adoptar otros destinos. Esto
cambia durante la segunda etapa, cuando la
población de células fundadoras se define
estrictamente en la periferia de meristemos. En esta
etapa, las células comienzan a expresar también
marcadores tales como LFY y ANT, y una zona
límite que se caracteriza por la expresión de genes
de contorno genes como CUC. En el tercer paso,
estas células crecerán para formar un primordio que
mostrará los primeros signos de polarización
durante la cuarta etapa.
The Plant Cell, Vol. 18, 598–611, March 2006. Arabidopsis
REGULATOR OF AXILLARY MERISTEMS1 Controls a Leaf Axil
Stem Cell Niche and Modulates Vegetative Development.
Gen RAX1 (regulatory of axyllary meristems.

Ramificación Shoot es un determinante importante de la variación

en la estatura de la planta. Las ramas, que forman los ejes de
crecimiento secundario, se originan de las células madre que se
activan en axilas de las hojas. Los pasos iniciales en la que se
especifican los meristemos axilares (AMS) y sus células madre organizadas son aún poco conocidos.
Identificamos ganancia y alelos de pérdida de función en el regulador Thaiana Arabidopsis DE AXILAR
MERISTEMS1 (RAX1) locus. RAX1 es codificada por el factor de transcripción MYB37 Myb - como y es
un homólogo de Arabidopsis del tomate (Solanum lycopersicum) gen ciego. RAX1 se expresa
transitoriamente en un pequeño dominio central dentro de la zona límite que separa meristemo apical del
brote y de la hoja primordios temprano en primordio de hoja development.RAX1 interacciona
genéticamente con cotiledón forma de copa genes (CUC) y es necesario para la expresión de CUC2 en la
expresión RAX1 de dominio, lo que sugiere que actúa a través de RAX1 CUC2. Proponemos que las
funciones RAX1 especificar posicionalmente un nicho de células madre para la formación de AM. RAX1
también afecta a los tiempos de las transiciones de fase de desarrollo, regulando negativamente los
niveles de ácido giberélico en el ápice del brote. Por lo tanto RAX1 define una nueva actividad que une la
especificación de la formación de AM con la modulación de la tasa de progresión a través de fases de
desarrollo.

Un mutante dominante con una reducción de ramificación

roseta fue identificado. Este mutante define un locus RAX1
designado, y nos referimos a que el alelo dominante como
rax1-1D. Observamos dos clases fenotípicas en las
poblaciones segregantes, lo que correspondía al estado
hemizygous homocigotos o del rax1-1D alelo (Figura 1), lo
que sugiere que los efectos de este alelo eran dosificación
dependiente. Cuando se compara con la línea de FA4C
parental (Figura 1A), individuos hemicigotos, que nos
referimos como rax1-1D / þ, fueron poco empequeñecido y
formaron rosetas compactas con más pequeño, más
redondos y ligeramente arrugadas hojas (Figura 1B). Después
de la transición a la floración, estas plantas forman un
número significativamente menor de roseta ramas que el tipo
salvaje (Tabla 1).
3. Aplicaciones biotecnológicas:
 Aislamiento y cultivo??.
 Transformación directa de sus dominios específicos mediante agroinfección o biolistica.
 Localización en explantes para transformación independiente del genotipo ubicándolas
previamente. Mediante agroinfección.

 Metodología propuesta en el sistema de transformación independiente del genotipo

El objetivo es la localización mediante sus marcadores moleculares específicos de las células
madre en los explantes procesados para la transformación independiente del genotipo en
diferentes especies. El marcador más indicado para situar la población de células madre en los
explantes es el CLV3 (marcador operativo).

Para delimitar su dominio específico se estudiará la localización de los genes CLV1, WUS y STM
Estudiando la localización de su expresión se podrá determinar la ubicación de las células
madre por hibridación in situ de su RNAm. Una vez localizadas las células madre se podrá
seguir su evolución durante el proceso de regeneración en los explantes transformados

Para delimitar su dominio específico se estudiará

la localización de los genes CLV1, CLV3, WUS y
STM

 Inducción ectópica de morfogénesis por sobreexpresión de los genes reguladores de las

células madre como alternativa para mejorar la regeneración en especies recalcitrantes:
Ejemplos de la aplicación de esta tecnología:

WUSCHEL induces shoot stem cell activity and

developmental plasticity in the root meristem Genes Dev.
2004 18: 375-38
La expresión de WUS en la tapa de las raíces laterales indujo
el desarrollo de hojas ectópico. (A- C) secciones ópticas de
raíces J2301 (canales de yoduro de propidio GFP y
combinados).(A) J2301 , UAS : punta de la raíz GFP, 4 días
después de la germinación , la flecha indica la expresión de
GFP en la tapa de las raíces laterales . (B) J2301, UAS: GFP,
punta de la raíz UASWUS, 7 d después de la germinación, la
flecha indica la proliferación celular anormal. Sección (C)
Maduro de J2301, UAS: GFP, raíz UASWUS, 7 d después de la
germinación, la flecha indica la expresión de GFP en
atrichoblasts. (D- E) ectópico primordios foliares (flechas) en puntas de las raíces secundarias
de J2301, UAS: GFP, plantas UASWUS, 21 d después de la germinación. (F) hojas ectópicos en
la punta de la raíz primaria de J2301, UAS: GFP, UAS: Planta WUS, 21 d después de la
germinación. (G -I) tinción GUS de J2301, UAS: GFP, UAS: WUS, CLV3: puntas de las raíces GUS.
(G, H) punta de la raíz primaria, 7 d después de la germinación. (I) punta de la raíz secundaria,
21 d después de la germinación, las flechas indican CLV3: expresión GUS (señal azul) asociado
con primordios foliares ectópicos. Bares: A- E, H, 40 micras, F, G, I, 200 micras.
Nuestros resultados mostraron que la expresión WUS hizo raíz células de desarrollo flexible y
capaz de ser dirigido a embrión, hoja, o el desarrollo de órganos florales, dependiendo señales
adicionales. La capacidad de entrar en el desarrollo alternativo vías, en combinación con la
expresión de un vástago marcador de células (CLV3), indica que la expresión de WUS en la raíz
causada activación ectópica de las funciones de la célula madre. Los órganos ectópicos y
estructuras tipo embrión, sin embargo, no mantener un grupo estable de células madre, y su
desarrollo finalmente termina.

Tejidos florales en las raíces de los 21 días de edad

WUSMOS, 35S: Plantas LFY, 19 d después de choque térmico.
(A) los sépalos en la punta de las raíces laterales. (B) Sépalo y
órganos carpelo como en la punta de las raíces laterales. (C)
La flecha indica la antera se originó desde la punta de las
raíces laterales. (D-F) Cryoscanning micrografías electrónicas
que muestran tejido carpelos en la punta de la raíz primaria
(D), sépalos (se) y carpelos (bis) los tejidos en la punta de las
raíces laterales, con la flecha indicando papilas estigmáticas
(E), y una célula epidérmica con la epicuticular crestas suelen
verse en los órganos florales (F). Bares: A-C, 1 mm; D, E, 200
m; F, 10 micras.

Desarrollo de embriones en raíces de arabidopsis. The Plant Journal (2002) 30(3), 349±359

Embriogénesis somática en pga6-1 explantes de raíz mutantes. El análisis

SEM de la embriogénesis somática de condiciones pga6-1 (cultura
idénticos a los de la Figura 2). (a) Etapa Pro-embrión antes de la división
celular embrionaria rst ® (flechas) y estadio de dos células después de la
división asimétrica RST ® con un toppositioned más pequeña de células
(A) y una célula inferior situado más grande (B). (b) Los embriones en el
globular (G) y el corazón a temprana edad (H) etapas. (c) Un embrión en
germinación. C, cotiledón, H, hipocotilo. (d) Un embrión somático
anormal con tres cotiledones (C) anclado en el hipocotilo (H). Las barras
de escala, 10 mm (un); 100 mm (b ± d).

La sobreexpresión XVE-o 35S controlada-de ADNc de WUS fenocopias el fenotipo pga6. (a, b)
de callo embriogénico (a) o embrión somático (b) la formación de la raíz consejos de plántulas
XVE-WUS cDNA T2 cultivadas durante 15 días en medio MS suplementado con 10 mM de B-17-
estradiol. (c ± f) 35S :: plántulas WUS T1 (15 días de edad). Las puntas de
raíz se ampliaron y una estructura en forma de embrión como era visible
en la punta de la raíz adventicia (c); WUS inducida tanto organogénesis y
embriogénesis de la sobreexpresión las raíces (d); disparar meristemo
apical se alteró dramáticamente y así como la formación de los órganos
laterales con forma alterada, dio lugar a adventicia brotes y embriones
somáticos (E); toda la yema apical expande y los órganos laterales se
transforman en los tejidos meristemáticos (f).
Transición de un estado vegetativo a embriogénico en explantes de pimiento. Plant Cell Tiss
Organ Cult (2009) 96:279–287
Inducida por la expresión de
WUSCHEL en explantes
transformados de C. chinense con
C58 pER10W-35SRed en medio
MS. un grupo-C Después de 15 días
de tratada, sin una inmersión, b
con la inmersión sólo con DMSO, c
con inmersión en 17 b-estradiol
(10 lm) y D después de 30 días de
inmersión en 110 LM en la 17 b-estradiol, e inversa del Norte para detectar la expresión
WUSCHEL en tallos: 1: control positivo WUSCHEL producto de PCR; 2: agua; 3: no
transformado y no inducido por tallo; 4: no transformado y el tallo inducido; 5: pER10 W-
35SRED indujo tallo transformado. Las barras de escala: a y b 0,4 cm, cyd 0,2 cm

Evaluación de diferentes tejidos de C. chinense transformó con C58 pER10 W-35SRed. Una
amplificación del correspondiente fragmento de 862 pb esperado para WUSCHEL. Línea 1:
escalera de ADN (1 Kb), 2: pER10 W-35SRed, 3: tallo transformado, 4: transforma meristemo
apical, 5: la raíz transformada, 6: Hoja transformada, 7: sin carga, 8: tallo, 9: meristemo apical,
10: root, 11: hojas, y 12: mezcla de PCR. b PCR de Vire, 1: escalera de ADN (1 Kb), 2:
Agrobacterium, 3: mezcla de PCR, 4: tallo transformado, 5: meristemo apical transformado, 6:
transformado raíz, 7: Hoja transformada, 8-9: sin carga, 10: tallo, 11: meristemo apical, 12:
root y 13: Hoja. Control C interna un-tubulina. Línea 1: transformado tallo, 2: meristemo apical
transformado, 3: root transformado, 4: hoja
transformado, 5: sin carga, 6: tallo, 7: meristemo
apical, 8: root, 9: hoja. dye plántulas obtenidas in
vitro 4 meses de edad: no d transforman y e
transformadas con pER10 W-35SRed. Las barras de
escala: d y e 2 cm.
Transición de un estado vegetativo a embriogénico en explantes de café. Plant Cell Tiss
Organ Cult (2008) 94:171–180

El análisis histológico de las raíces de Coffea

canephora plantas después de 40 días de
exposición a 5 lM 17-b-estradiol. (a) Raíz de una
planta de tipo salvaje. (b) Sección longitudinal
de un pERW-35SRED raíz transformada
mostrando un aumento aparente de la célula la
proliferación a través de la raíz. (c) la raíz lateral
aparente formación de la estructura primordial-
como en un pERW-35SRED raíz transformada.
Southern blot de un pERW-seleccionada 35SRED
planta transformada se utiliza para verificar que
WUS fue introducido en el genoma. Cinco y 50
LG de ADN genómico fueron cargados ya sea
para el control (GFP planta transformada) o
WUS transformó planta. El ADN genómico se
digirió con Hind III o EcoRI durante 5 horas a 37
º C. RT-PCR se llevó a cabo como se describe en
Materiales y métodos. ARN de una sola ya sea
GFP transformado o WUS transformado plántulas fue utilizado. Las plántulas se cultivaron con
o sin 5 lM de estradiol. ARN fue tratado con o sin SuperScriptTM III durante 1 h.

La sobreexpresión de WUS induce la

embriogénesis secundaria en embriones
somáticos de Coffea canephora. (a-d) Chúcaro
tipo de café embrión somático se muestra en el
lado izquierdo de la el panel, y el embrión
somático transformado con pERW-35SRED
callos de conformación se muestra a la derecha.
(a) después de 10 días. (b) después de 30 días.
(c) 2 Meses, (d) 6 Meses. (e) Las plantas de café
16 meses de edad completamente regenerada a
partir embriones somáticos secundarios. Todos
los tratamientos se mantuvieron en un medio
que contiene MS + ANA + Kinetina (a-e) 5 lM 17
- b-estradiol (a-d).
Tema 20.Embriogénesis Somática.
La embriogénesis somática es un proceso por el cual las células somáticas se diferencian en
embriones somáticos. Los embriones somáticos se asemejan morfológicamente a embriones
cigóticos; son bipolares. Sin embargo, se desarrollan través de una vía diferente. La
embriogénesis somática se produce en una medida limitada en condiciones naturales, dentro
de los óvulos y más raramente en hojas.

La embriogénesis somática puede ser lograda para todas las especies de plantas, siempre que
el explante sea el adecuado, los medios de cultivo y las condiciones del medio ambiente sean
las adecuadas. Los embriones somáticos se utilizan como un sistema modelo en Los estudios
embriológicos. Sin embargo, el mayor interés de los embriones somáticos se centra en su
práctica solicitud de propagación vegetativa a gran escala, sobre todo debido a la posibilidad
de ampliar el propagación mediante el uso de biorreactores en Además, en la mayoría de los
casos, los cultivos de embriones somáticos o embriogénicos pueden ser criopreservados, lo
que hace posible establecer bancos de genes. También son un objetivo atractivo para los
genes transformación.

La Embriogénesis comienza con el cigoto y pasa a través de una secuencia estereotipada de

etapas características. Aunque la morfogénesis se produce después de la germinación de la
semilla, el embrión es una fase crucial, ya que es aquí donde los meristemos y el específico
patrón corporal con brotes y raíces se establece.

La mayor parte de los estudios realizados sobre embriogénesis somática se han centrado en
los diferentes estadíos en que se divide. El primero implica una fase de inducción en la que los
tejidos somáticos adquieren directa (sin una desdiferenciación precia) o indirectamente
(precedidos de una fase de callo) competencia embriogénica. Esta fase se continúa con la
expresión del proceso de embriogénesis somática, en el que la células competentes o
proembriones inician su desarrollo despues de recibir un estímulo adecuado los estadíos
coinciden con los de la embriogénesis cigótica (globular, corazón, y torpedo). Finalmente
durante la maduración loa embriones somáticos se preparan para la germinación mediante
desecación y acumulación de reservas.

La figura 9.1 Descripción esquemática de las angiospermas (Arabidopsis) y gimnospermas

(Picea) el desarrollo del embrión. Abreviaturas: EP - embrión propiamente dicho, PU – primaria
nivel superior, pE: nivel embrionario primario, E: nivel embrionario, S:tier suspensor, U: nivel
superior , EM: la masa embrionaria, SS: secundaria suspensor.
1. Zanahoria como sistema modelo:
La embriogénesis somática (SE) es un proceso
de desarrollo notable que permite a las células
vegetales nonzygotic, incluyendo las células
haploides, la formación de embriones y,
plantas fértiles. Una expresión de totipotencia,
es que este proceso asexual implica la
desdiferenciación de una célula nonzygotic y
posteriormente la re-diferenciación
(reprogramación), lo que resulta en la producción de todas las células características de la
planta madura. Aunque se considera principalmente en el contexto de la embriogénesis
somática in vitro a partir de tejidos o células cultivadas, la embriogénesis somática es también
un medio de origen natural de reproducción asexual en algunas especies. Por ejemplo, los
embriones somáticos se forman en las hojas suculentas de Kalanchoe y la apomixis, un proceso
de reproducción clonal donde los embriones se derivan de las células en el óvulo de la semilla,
se produce en un número evolutivamente divergentes de especies. Esta se centra en la
embriogénesis somática in vitro, pero una comprensión de este proceso es aplicable a todas
las formas de la embriogénesis somática. Fue demostrado por primera vez hace 50 años con la
zanahoria.

2. Sincronización:
La sincronización de la embriogénesis somática se logró en un
cultivo en suspensión de zanahoria por tamizado de la población
inicial de células heterogénea, por centrifugación en gradiente
de densidad en soluciones Ficoll, y por centrifugaciones
repetidas posteriores a una velocidad baja (50gr) para un corto
período de tiempo (5
segundos), seguido por la
transferencia de los grupos de
células obtenidos, que se
componen de 3 a 10 células, a
un medio que contiene
zeatina (0,1 micromolar), pero
no la auxina. La frecuencia de
la formación del embrión llegó
a más de 90%, y se observó la
sincronía del proceso de la
embriogénesis al menos en las
primeras etapas del proceso.
El sistema establecido en el
presente trabajo ofrece un
sistema útil para la
investigación bioquímica en
los mecanismos de la
embriogénesis somática.
3. Embriogenesis Somatica Directa E Indirecta:
Existen dos tipos de embriogénesis somática in vitro, la embriogénesis somática directa y la
indirecta. La forma directa implica la existencia de células somáticas predeterminadas a seguir
la vía embriogénica de desarrollo y las células del explanto primario se desarrollan para formar
embriones (como por ejemplo, la nucela de los cítricos). La forma indirecta implica la
necesidad de una inducción para que las células sigan la vía embriogénica, tras pasar por una
fase proliferativa (callo) y cambiar su competencia a la expresión de embriogénesis. El proceso
ocurre en dos etapas: en la primera de ellas, las células competentes aisladas en medios ricos
en auxinas forman grupos de células embriogénicas denominadas centros embriogénicos. En la
segunda fase, una vez repicados los centros embriogénicos a un medio de cultivo sin auxinas,
éstos proliferan de forma lenta e indiferenciada. Luego se producen una serie de rápidas
divisiones celulares en distintas zonas del centro embriogénico y se conforman embriones
globulares, que al crecer pasando por los estados de corazón y torpedo y tras una fase de
maduración y germinación darán lugar a plantas completas.5 La embriogénesis somática como
método, sistema o tecnología de propagación de plantas presenta una serie de ventajas frente
a otros sistemas. Así, es posible obtener una enorme capacidad de propagación, lo que la
torna aplicable industrialmente, permite obtener en un solo proceso estructuras completas
con ápice y raíz, que pueden ser almacenadas y encapsuladas perfectamente, dando lugar a
semillas sintéticas.

 Embriogénesis Somática Directa Ej: Pothos:

Direct somatic embriogénesis and plan regeneration from leaf, petiole and stem explants of
golden photos.

 Embriogénesis Somática Indirecta. Ej: Azafrán:

Somatic embryogenesis in saffron (Crocus sativus L.):
Morphological differentiation and the role of the
antioxidant enzymatic system
4. Participación de los reguladores del
crecimiento vegetal en su
determinación y progresión.
Entre los diferentes tipos de reguladores
del crecimiento vegetal, las auxinas son las
más utilizadas para promover la transición
de células somáticas a embriogénicas. En una revisión reciente, más del 80% de los trabajos
sobre inducción de embriogénesis somática requirieron la presencia de auxinas solas o en
combinación con citoquininas. La auxina más empleada es el 2,4 D que se caracteriza por su
efecto herbicida. Tambien se emplean aunque en menor frecuencia NAA, AIA e IBA.

La forma en que actúa el 2,4 D puede

regular la embriogénesis somática puede
deberse a su fuerte efecto auxínico que
afecta al el metabolismo de los reguladores
del crecimiento endógenos de los tejidos.
También puede regular la embriogénesis
induciendo diferentes tipos de estrés.

En muchos casos en los que se emplean

auxinas para inducir embriogénesis ésta se
consigue mediante su retirada o disminución
en el medio de cultivo. Par justificar este
efecto se ha propuesto que la exposición
continuada de los tejidos a elevados niveles
de auxinas en el medio interfiere con el
gradiente polar de auxinas que se establece
durante la embriogénesis evitando el correcto
establecimiento de la polaridad apical-basal
necesaria para diferenciar los embriones.
Evolution of endogenous hormone
concentration in embriogenic
cultures of carrot during early
expression of somatic
embryogenesis.

La diferencia entre explantes

competentes e incompetentes para
la embriogénesis somática se ha
relacionado frecuentemente con los
contenidos endógenos de
reguladores del crecimiento. Se ha
comprobado una clara correlación
entre los niveles endógenos de AIA y
la competencia embriogénica de los tejidos cultivados. También se han determinados niveles
reducidos de Citoquininas en los tejidos competentes.

Durante la progresión de los diferentes estadios del embrión somático se producen variaciones
en los niveles endógenos de reguladores del crecimiento, especialmente la concentración de
auxinas a partir del estadío globular. En los estadíos finales del desarrollo del embrión
somático se produce un incremento de los niveles de ABA, especialmente durante su
maduración

5. Marcadores estructurales.ECMSN
Las células embriogénicas muestran características
estructurales específicas relacionadas con la composición
de su pared celular y la disposción de su citoesqueleto.
Por ejemplo la presencia de la ECMSN (red superficial de
la matriz Exterior) es característica de las masas de
células proembriogénicas.

Se observa preferentemente en las etapas Tempranas de la embriogénesis

hasta el estadío globular y desaparece progresivamente cuando se forma la
Protodermis durante el estadío de torpedo.

La ECMSN se compone de lectinas unida a la N-acetilgalactosamina, AGPs

(Arabinogalactano proteinas) y pectinas
6. Marcadores estructurales. AGPs
Las AGPS (arabinogalactanoproteinas) son un
tipo de moléculas específicas de las plantas que
pertenecen a la familia de las glicoproteinas ricas
en hidroxiprolina altamente glicosiladas. Estos
proteoglicanos están implicados en el desarrollo
celular tanto vegetativo como reproductivo y
también en apoptosis.

Characterization of
the structure,
extression and
function of pinus
radiata D. Don
arabinogalactan-
proteins.

Arabinogalactan-proteins: structure, expression

and function

Las AGPS son esenciales para la adhesión y

expansión celular y tienen un papel esencial en
el proceso de embriogénesis somática. Las AGPS
añadidas al medio de cultivo han inducido
embriogénesis somática en diferentes especies
incluso en líneas celulares no embriogénicas.

Characterization of proteins secreted during maize

microspore cultura: arabonigalactan proteins (AGPs)
stimulate embryo development

Los epitópos de las AGPs han sido considerados

como marcadores para diferentes estadíos de
embriogénesis en zanahoria, maiz y achicoria.
En cultivos en suspensión, las AGPs y
endoquitinasas secretadas al medio de cultivo son
necesarias para la embriogénesis somática. Se ha
demostrado que las quitinasa puede degradar las
AGPs y estan modificadas por la quitinasa actuan
como señales en el control de la embriogénesis en
zanahoria.

7. Marcadores estructurales. Citoesqueleto

Los dos componentes fundamentales del citoesqueleto que son los microtúbulos y los
microfilamentos de actina participan en la polarización del embrión y en su desarrollo. EL
citoesqueleto controla la posición de las divisiones celulares y regula la
expansión de la células especialmente en los estadíos más iniciales del proceso
de embriogénesis tanto somática como cigótica.
La citocinesis representa el estadío final de la división celular
y depende de una estructura del citoesqueleto llamada
fragmoplasto que sustenta la placa celular.

En células de embriogénicas de maiz los fragmoplastos se

encuentran enriquecidos tanto en microtúbulos como en
actina. Este alineamiento de los componentes del
fragmoplasto señalaría su implicación en el establecimiento de
la polaridad necesario para el proceso de embriogénesis.

También durante el proceso de embrigénesis somática en maiz tiene lugar una modificación en
el desarrollo durante la transición del estado prembriogénico hasta el inicio de la polarización
en los estadíos tempranos de diferenciación del embrión somático. Esta transición de induce
al retirar la auxina del medio de cultivo lo que genera una importante redistribución de los
componentes del citoesqueleto incrementándose la cantidad del citoesqueleto cortical lo que
resulta esencial para la futura diferenciación mediante polarización del embrión somático.
8. Somática.Expresión diferncial. Gen Serk

De todos los genes que se han caracterizado

durante el proceso de embriogénesis somática
solamente uno, el gen Serlk(somatic
embryogenesis receptor-like ha sido confirmado
como un marcador capaz de reconocer células
embriogénicas individuales en cultivos
embriogénicos de zanahoria.
También se ha clonado en Arabidopsis ( AtSerk)
donce su sobreexpresión multiplicó por cuatro
la producción de embriones en cultivos
embriogénicos

A leucina-rich repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to
from embryos
9. Expresión génica diferencial
Aunque el cigoto recién formado contiene tanto
información genética materna y paterna, parece que la
actividad de muchos genes que actúan durante la
primera la formación del embrión y el endospermo
puede depender exclusivamente en la transcripción de
los alelos heredados por vía materna ya que el genoma
paterno es silenciada inicialmente

La característica general que subyace a la expresión de

secuencias de ARNm específicos del embrión es el que
aparecen y la decadencia en varios momentos durante la
embriogénesis. Esto indica que la expresión de cada
conjunto de genes es controlado por señales reguladoras
específicas. Qué provoca la activación de genes
específicos en específica etapas de la embriogénesis no
se entiende bien. La implicación de los genes
homeodominios de plantas en embriogénesis se
demostró por primera vez por el análisis de la mutante
de Arabidopsis STM . que aparece en el desarrollo
temprano en la embriogénesis
La caracterización de la expresión génica durante el desarrollo del embrión , la maduración y
germinación ha llevado a la identificación de clases distintas de genes regulados por el
desarrollo de las angiospermas . Estos genes se puede dividir en cinco clases principales de la
siguiente manera:
• Clase 1. Los genes expresados constitutivamente cuyos productos están presentes en todas
las etapas y tienen funciones requeridas durante el crecimiento normal de la planta . Estos
genes tienen funciones de mantenimiento esenciales para muchas plantas células, incluyendo
aquellas en el embrión.
• Clase 2. Genes específicos de embrión cuya expresión se limita al propio embrión, y cesa
antes de o en la germinación.
• Clase 3. Los genes altamente expresados durante la primera embriogénesis hasta la etapa de
los cotiledones.
• Clase 4. Los genes que representan a los genes de proteínas de semillas, expresado durante
la expansión de cotiledones y maduración de la semilla.
• Clase 5. Los genes expresados abundantemente en etapas de la embriogénesis avanzada
hasta maduración de la semilla.
 TEMA 21. ORGANOGÉNESIS.
INTRODUCCIÓN
La regeneración de órganos de novo en cultivos de tejidos ha proporcionado un
sistema útil para el estudio de los mecanismos de regulación implicados en el
desarrollo de los vegetales. Una de las observaciones más significativas
deducidas a partir de los estudios fisiológicos sobre organogénesis fue la
identificación del papel predominante que en él juegan la relación
auxinas/citoquininas. Desde esta primera evidencia se ha avanzado mucho en
su caracterización fisiológica, bioquímica y molecular.
La organogénesis es el resultado de la expresión visible de un conjunto de
procesos complejos. Implica la formación de nuevas estructuras y conlleva
alteraciones en la morfología y en la función.
Se pueden diferenciar varios factores diferentes que influencian el desarrollo
celular dentro de un tejido:

Fases progresivas en la capacidad de una célula para adquirir competencia morfogénica.

REGULADORES DEL CRECIMIENTO

El proceso de organogénesis depende de la aplicación de fitoreguladores exógenos (fundamentalmente auxinas y
citoquininas) y de la capacidad del tejido para responder a los mismos en un momento dado.
A menudo, los medios óptimos para la inducción y crecimiento de callos a partir de explantes primarios no son los
mismos que para el establecimiento de suspensiones celulares; el nivel óptimo de auxinas y citocininas, p.ej.
puede ser diferente
 Las citoquininas o citocininas constituyen un grupo de hormonas vegetales que promueven la división y la
diferenciación celular. Mediante este proceso predominantemente citocinínico, las células vegetales son
transformadas en otro tipo de células específicas para formar un órgano en particular, ya sean raíces,
hojas, flores o frutos, ya que cada uno tiene diferentes tipos de células. Estos eventos, no se realizan de
manera exclusiva por las citocininas, desde luego, sino que estas hormonas son las encargadas de causar
el efecto diferenciación celular, de «dar la orden» y de dirigir el proceso, en el cual intervienen otras
sustancias con las que las citocininas realizan esta tarea conjuntamente. Sin las citocininas,
probablemente no habría diferenciación de órganos vegetales.
 Las auxinas son un grupo de fitohormonas que funcionan como reguladoras del crecimiento vegetal.
Esencialmente provocan la elongación de las celulas. Se sintetizan en las regiones meristemáticas del
ápice de los tallos y se desplazan desde allí hacia otras zonas de la planta, principalmente hacia la base,
estableciéndose así un gradiente de concentración. Este movimiento se realiza a través del parénquima
 que rodea a los haces vasculares. La presencia e importancia de las hormonas vegetales se estableció por
los estudios de las auxinas.
Al llegar la auxina a la célula va a provocar dos respuestas, una rápida y otra lenta. La rápida va a
aumentar la velocidad del movimiento de vesículas, va a estimular los genes que sintetizan para ATPasas
y enzimas hidrolíticas de la pared.
La caída de las hojas y frutos, así como la iniciación de la raíz, también parece ser gobernada por las
auxinas.

Ejemplos
a) Interacciones entre la auxina – citoquinina y auxina – giberelina
durante la morfogénesis de las jojas compuestas del guisante.
Se ha demostrado que las auxinas desempeñan un papel muy
importante en el desarrollo de las hojas del guisante. Se intenta
demostrar en este estudio si la giberelina desempeña algún papel
en la morfología de las hojas del guisante. Los resultados tras todo
un procedimiento mostraron que tanto la auxina como la
giberelina desempenñan funciones similares y significativas en el
desarrollo de las hojas del guisante.
 La giberelina es una fitohormona. Se producen en la zona
apical, frutos y semillas. Sus funciones son:
- Interrumpir el período de latencia de las semillas, haciéndolas germinar.
- Inducir la brotación de yemas.
- Promover el desarrollo de los frutos.
- Crecimiento longitudinal del tallo

b) Aplicación de tipos de auxina y citoquinina determinan la activación del

desarrollo de la organogénesis en la manzana.
Efecto de la auxina (1 mg l-1 IAA, IBA, 2,4-D) suplementado con TDZ (5 mg
l-1) en la sesión de regeneración de cv. Topred explantes de hoja. Las
barras verticales indican el error estándar (± S.E.).

c) Influencia de la luz sobre la citoquinina

Debido a la oscuridad la síntesis de clorofila se ve
disminuida, en la imagen vemos el aspecto
morfológico del explante después de 45 días de
incubación en la oscuridad. El efecto de la
concentración de citoquinina en el medio de la
formación de yemas, el porcentaje de brotación brote,
y la formación de brotes en el extremo apical de los explantes se incubaron en la luz. Los
valores son la media de tres experimentos separados. Las barras verticales indican la
diferencia significativa más bajo calculado a partir del do residual del cuadrado de la
ANOVA.
ASPECTOS MOLECULARES
Las citoquininas son los reguladores del crecimiento vegetal más eficientes para la inducción de tallos in vitro
aunque en algunos casos se combinen con auxinas.
Recientemente han sido identificados unos cuantos componentes implicados en la ruta de transducción de
señales mediada por citoquininas a nivel molecular entre los que destacan el CRE1 (receptor de citoquininas) y
sus genes regulados AHPs y ARRs. También se ha identificado el gen ESR1 cuya expresión parece suficiente para
inducir tallos adventicios incluso en ausencia de reguladores.
Además de los anteriores también se han identificado varios genes de importancia decisiva para el desarrollo y
mantenimiento del meristemo apical. Entre estos se encuentran los genes KNOTTED1, STM, WUS y CLV1-3.
También se han encontrado evidencias crecientes que confirman la interacción existente entre el ciclo celular, el
metabolismo de las citoquininas y del desarrollo del meristemo apical.

Gen ARR
Son genes reguladores de la respuesta en Arabidopsis (ARR) que son similares a las
proteínas bacterianas de dos componentes llamados reguladores de respuestas.
Hay dos clases: ARR tipo A, cuya transcripción está regulada positivamente por
citoquininas; ARR tipo B, cuya expresión no se ve alterada por citoquininas.

Gen CRE1, AHP, ARR

 El gen CRE1 es un gen de Arabidopsis que codifica un receptor proteico de
citoquininas similar a las histidina quinasas bacterianas de dos
componentes.
 AHP proteínas que interactúan con ARR.

La figura anterior es un modelo de citoquinina transducción de señales vía en Arabidopsis. Señal de citoquinina se
percibe externamente o internamente por múltiples proteínas quinasas histidina en la membrana plasmática. En
la percepción de la señal de citoquinina, cinasa de proteína histidina inician una cascada de señalización a través
de la phosphorelay que resuslta en la translocación nuclear proteínas AHP os desde el citosol. AHP proteínas
activadas interactúan con proteínas ARR secuestrados o complejos ARR, y liberan el tipo de activación de las
proteínas ARR de represores pulative en el núcleo. Las proteínas ARR liberadas se unen a múltiples elementos cis
en el promotor de los genes diana. La activación de la transcripción es esencial para la proliferación celular, la
formación de brotes y el retraso en la senescencia de la hoja. La activación del tipo represor de genes ARR como
citoquinina genes de respuesta primaria proporciona un mecanismo de retroalimentación negativa. RD, dominio
respuesta; BD , el dominio de unión a ADN , AD , dominio de activación de la transcripción; PM , membrana
plasmática , N núcleo; R, represor pulative , H histidina; D , aspartato .

Gen CRE1
El gen CRE1 es un gen de Arabidopsis que codifica un receptor proteico de las citoquininas similar a la histidina
quinasa bacterias de dos componentes.

Ejemplo: citoquininas y el desarrollo de los brotes

Las citocininas promueven el desarrollo de un programa de expresión génica compleja en cultivo de tejidos que
resulta en la formación de brotes. Mucho se ha aprendido sobre la señalización de citoquinina en los últimos
años, el reto ahora es entender cómo los pasos conocidos en citocinina señalización interfaz con el proceso de
desarrollo de los brotes en la cultura y en la planta. Se han encontrado varias maneras de bloquear o anular el
requisito de citoquininas, y estos resultados han puesto de manifiesto las medidas de control clave en el proceso
de desarrollo de los brotes. Control de la instalación se ejerce no sólo en la promoción del desarrollo de brotes,
sino también en su contención en condiciones en que los brotes que no se forman normalmente.

En la figura vemos eventos de desarrollo durante la regeneración

de brotes a partir de explantes de raíz en El cultivo de tejidos de
Arabidopsis. Los explantes adquieran competencia durante la
preincubación en medio de inducción de callo (CIM) para responder
a la hormona de señalización en rodaje medio de inducción (SIM). A
mitad del periodo de incubación SIM, disparar el desarrollo se hace
independiente de la presencia de citoquininas (CKs) (shoot
compromiso). Flechas de colores representan los perfiles de
expresión de algunos de los genes más importantes involucrados en
el desarrollo de meristemos rodaje. Arrow anchura y degradados de
color aproximadas intensidades de expresión génica relativa. De
modificación, con permiso, de [64]. Abreviaturas: 2,4 D, auxina
sintética 2,4 ácido dichlorophenyoxyacetic; CUC, COPA cotiledón
FORMA; IAA,-3-indol acético ácido; iP, N6-(D2-isopentenil) adenina;
RIM, medio de inducción de raíz; STM, SHOOTMERISTEMLESS;
WUS, WUSCHEL.

Aquí vemos citoquinina Genérico (CK) modelo de vía de señalización

representado como un multi-paso sistema phosphorelay involucra varios
componentes modulares. Membranelocalized histidina quinasas sensoriales
(HKS) sirven como receptores de CK y sobre grupos de activación, fosforilo
transferencia a histidina elementos fosfotransferencia (HPS o HPTS). Se
proponen las postas de salud para actuar como un servicio de transporte que
trasladen su fosforilo grupos y activar los reguladores de respuesta nuclear-
localizado (RR). RR de tipo B tienen Dominios de unión de ADN y se han
reportado para funcionar como transcripcional activadores de genes, como
los que codifican los RR de tipo A CK-activado. RR de tipo A se cree que
actúan como represores y / o activadores de la transcripción, tal vez por
interacción con los RR de tipo B. Otros elementos no identificados pueden
funcionar como represores de los RR de tipo B, y la señal de un HP activada
podrían servir para liberar a una de tipo B RR de un represor. Abreviaturas:
CUIDADO, cis-actuando reglamentario elemento; D, ácido aspártico, H
histidina.

Interacción hipotético entre citoquinina (CK) de señalización y de genes de

acción vías durante el desarrollo de brotes. Eventos durante la preincubación
en la inducción de callo medio (CIM) se muestran por encima de la línea
discontinua azul, y los eventos siguientes transferir a disparar medio de
inducción (SIM) se muestran debajo de la línea discontinua azul.
CKI1 es capaz de promover la señalización de CK independiente en CKI1 que
sobreexpresa plantas y está regulada positivamente antes del compromiso
rodaje. KNAT1 sobreexpresión es correlacionados con los niveles más altos de
CK endógenos. CUC2 se altamente upregulated sobre el momento del
compromiso de brotes y CUC1 o expresión CUC2 activa STM función. Los genes
en la vía de desarrollo de los brotes se ordenan según sus patrones de
expresión, y, con la excepción de CUC1, CUC2 y STM, el orden no implica una
relación causal en la acción de los genes. TSD, PAS y PRZ1 están pensados para
prevenir la desviación de la señal de desarrollo de los brotes de callo
formación. Sin embargo, en ausencia de su función, callo hyperproliferates.
Abreviaturas: CKH , citoquinina HIPERSENSIBLE ; CKI , citoquinina
INDEPENDIENTE ; CUC , COPA cotiledón FORMA ; ESR , potenciador del
desarrollo de brotes ; IRE, AUMENTO regeneración de órganos ; KNAT1 , anudadas a 1 COMO EN Arabidopsis
thaliana ; PAS , Pasticcino ; PRZ , Proporz ; RRs , la respuesta reguladores ; STM , SHOOTMERISTEMLESS ; TSD , el
desarrollo de brotes tumorales ; WUS , WUSCHEL .

Gen ESR1 (Enhancer of shoot regeneration).

Ejemplo: sobreexpresión de ESR1 inducido por la iniciación de la regeneración de brotes

El cribado funcional de una biblioteca de cDNA de Arabidopsis permitió la identificación de un nuevo ADNc, ESR1
(por Enhancer de regeneración de brotes), que puede conferir la formación de brotes - citoquinina independiente
cuando se sobreexpresa en explantes de raíz de Arabidopsis. Ni la inducción de callo, ni la formación de raíces se
vio afectada por ESR1 sobreexpresión. ESR1 codifica un factor de transcripción putativo con un dominio
AP2/EREBP. Sorprendentemente, la sobreexpresión ESR1 también aumentó en gran medida la eficiencia de la
regeneración de brotes a partir de explantes de raíz en la presencia de citoquinina, con un cambio en la
concentración óptima de citoquinina requerido para este proceso. Los efectos de ESR1 sobreexpresión en la
regeneración de brotes son sinérgicos con los de citoquinina. La sobre-expresión de ESR1 no puede inducir la
formación de callos o de formación de la raíz, lo que sugiere que sus efectos son específicos para la formación de
brotes. En las plantas de Arabidopsis de tipo salvaje, la expresión de ESR1 fue inducida por la citoquinina. Niveles
de transcripción ESR1 también aumentaron transitoriamente durante la regeneración de brotes a partir de
explantes de raíz, probablemente en respuesta a citoquinina en el medio de tiroteo inductor. Este aumento
transitorio se produjo después de la adquisición de la competencia para la regeneración y antes de la formación
de brotes, lo cual es consistente con los efectos fisiológicos de ESR1 sobreexpresión. Nuestros resultados sugieren
que ESR1 podrá regular la inducción de la regeneración de brotes después de la adquisición de la competencia
para la organogénesis.

(A) placas representativos 4 semanas después de la transformación. Cultivos de raíces de Arabidopsis

transformadas con el vector solo (pER10) o pER10-ESR1 se cultivaron en SIM con o sin citoquinina (25 mM 2-IP) o
un inductor de la transcripción (5 M 17β-estradiol).

(B) El número de brotes transformados de 0,1 g

de peso fresco de la cultura de raíz. Los datos
representan la media de cuatro experimentos
independientes, y las barras de error indican las
desviaciones estándar. Columnas abiertas
muestran transformantes con el vector solo
(pER10), y las columnas rayadas muestran los
transformantes con pER10-ESR1.

ORGANOGENESIS
En esta imagen tenemos una serie de patrones de expresión de genes implicados en el mantenimiento de la
integridad de la zona central. CLAVATA3 (CLV3) ARNm se limita a la capa epidérmica (L1) y la capa subepidérmica
(L2) de la zona central, mientras que se detecta CLV1 ARNm en el corpus (L3) de la zona central. Durante
WUSCHEL develompment vegetativo (WUS) ARNm se limita a unas pocas células dentro en L3 , debajo de la capa
más superior de la L3 . Se ha propuesto que CLV3 actúa como un ligando
secretada por el receptor de CLV1, y que esta señalización es REPONSABLE para
restringir el tamaño de la zona central. Por el contrario, WUS se requiere para
mantener una zona central activo, posiblemente por la falta de células que
confieren una identidad autónoma de células madre en las células que recubren
su dominio de expresión. Las superposiciones relativos en la expresión de estos
tres genes en esta figura se estima con base en comparasions de los datos
publicados, aunque la detección simultánea de estos genes podría alterar este
punto de vista. Flor filamentosa (FIL) expresión de marca Anlagen órgano lateral
en la zona periférica.

En este caso vemos la coordinación de la proliferación celular y las decisiones del destino celular a través de la
meristemo apical del brote (SAM). (a) la regulación de células madre en el SAM a través del bucle de
retroalimentación clavata - WUSCHEL. CLAVATA3 (CLV3 expresión está restringida principalmente a la L1 y L2 de
la zona central, mientras que CLV1 ARNm sólo se puede detectar en la L3
de la zona central y la zona torácica. WUSCHEL (WUS) se expresa en
algunas células centrales de la zona torácica. el bucle de realimentación
CLV- WUS se compone de una señal mediada por Wu desde el centro de
organización ( OC ) que especifica identidad de la célula madre en las capas
más externas , que señal de vuelta a través de la vía de CLV para limitar el
tamaño de la OC WUS - expresando . (b) CLV vía de transducción a nivel
celular. El CLV1 y CLV2 repeticiones ricas en leucina (LRR) proteínas
receptro podría homo o heterodimerize mediante la formación de puentes
disulfuro entre los pares de cisteínas conservadas (SS) que flanquean el
dominio LRR . la unión de CLV3 a CLV1 y / o CLV2 podrían promover el
ensamblaje del complejo 450kDa , que también contiene una proteína
fosfatasa ( KAPP ) y una GTPasa Rho -like (ROP), KAPP es un regulador
negativo de la señalización CLV , capeable de dephosphorylating CLV1 . Rop
transduces la señal desde el complejo de CLV a downstrea, objetivos. Por
analogía con los sistemas animales, la unión de la ROP a CLV1 pueden estar
mediados por una proteína enlazador, la naturaleza de los cuales queda
por determinar. La cascada de señalización de la CLV unido a la membrana
plasmática complejo conduce a la regulación a la baja de la transcripción
WUS en el nucleu. Esta cascada de señalización intracelular podría implicar
las proteínas quinasas activadas por mitógenos ( MAPKs) , basado en el
ejemplo de otra LRR similar al receptor de una quinasa .

Las interacciones entre las hormonas y factores transcripcion en el

meristemo apical (SAM). Top ahora: los patrones de expresión de los genes
de Arabidopsis STM (un gen KNOX), CUC y WUS son mostrados en un
esquema dibujado SAM. Medio ahora: distribución de auxina, giberelina
(GA) y cytokinnin (CK) predijo, se muestra más de un
microscopio electrónico de exploración de la imagen de
barrido (SEM) de un tomate SAM. La distribución se
hypotheseized sobre la base de la interpretación de los
datos presentados. P1 es el primordio de la hoja inicial
más joven. P2 es la siguiente hoja más vieja, y P0 designa
la región reclutado a producido el primordio de hoja ext.
Bottom ahora: un modelo de la generación de un límite
directo entre el SAM y la actividad de la CK localmente por
la represión de ARR. La alta CK resultante: relación auxina
y baja concentración GA promueve el crecimiento
indeterminado. En la región de P0, altas concentraciones
de auxinas restringen la expresión de STM y CUC, y
reprimen ciosynthesis CK. Las altas concentraciones de GA
futher disminuyen la actividad de CK. El resultado es un
bajo CK: relación auxina, y un alto nivel de GA, que en
conjunto a promover la iniciación de órganos lateral. La
imagen SEM fue promovided por Amon Brand.

Expresión de CDC2Zm y KNOTTED1 durante la proliferación de meristemos axilares in vitro y la formación de

brotes axilares en el maíz (Zea mays L. ) y cebada ( Hordeum vulgare L. ).
Expresión de CDC2Zm y KNOTTED1 (KN1) en el maíz (Zea mays L.) y sus proteínas de reacción cruzada en la
cebada ( Hordeum vulgare L.) fue estudiada mediante inmunolocalización durante la proliferación de meristemos
in vitro brotes axilares y la formación de meristemas de brotes adventicios . Expresión de CDC2Zm , una proteína
implicada en la división celular , más o menos correlacionada con la proliferación celular in vitro y en las cúpulas
meristemáticas expresión CDC2Zm se activó durante la proliferación in vitro . Análisis de la expresión de KN1, una
proteína necesaria para el mantenimiento del meristemo disparar, mostró que KN1 o KN1 - homólogo (s) de
expresión se mantuvo en células meristemáticas durante la proliferación in vitro de los meristemas de los brotes
axilares. Múltiples meristemas de brotes adventicios parecían formar directamente desde el homólogo (s) que
expresan KN1 - o KN1 células meristemáticas en el in vitro la proliferación de cúpulas meristemáticas . Sin
embargo, a diferencia de Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ) y el tabaco ( Nicotiana tabacum ) hojas ectópica
expresar KN1, el maíz transgénico hojas de sobre-expresión de KN1 eran incapaces de iniciar meristemas de
brotes adventicios en sus superficies ya sea in planta o in vitro . Por lo tanto, la expresión de KN1 no es el único
factor desencadenante responsable de inducir la formación de brotes adventicios de meristemo in vitro la
proliferación de meristemas de brotes axilares en el maíz. Nuestros resultados muestran que los genes críticos
para la división celular y el desarrollo de las plantas tienen utilidad en la definición de la morfogénesis in vitro de
plantas a nivel molecular y, en combinación con las tecnologías de transformación, serán herramientas de gran
alcance para identificar el factor desencadenante molecular y genética - o fundamental (s) responsable de la
reprogramación de células de la planta durante la morfogénesis de plantas in vitr .
Aquí vemos la ploriferacion de los meristemos axilares y la expresión de CDC2Zm y KN1 en el maíz:

Aquí tenemos los distintos eventos durante la adquisición de la competencia para la regeneración de brotes, los
brotes de Arabidopsis se regeneran a partir de explantes de raíz a través de un proceso que implica la CIM
preincubación seguido de incubación en SIM, lo que conduce a la formación de callo verde y desarrollo de los
brotes. Durante la competencia preincubación CIM
para expresar diferentes genes marcadores de
desarrollo y someterse a varios pasos del desarrollo
durante la incubación SIM posterior se adquieren
progresivamente. Se requiere la progresión del ciclo
celular durante la CIM preincubación para la
adquisición de algunas competencias, pero no en
otros.

La expresión de Brostm , un gen KNOTTED1 – como gen que marca el tipo de célula y el momento de in vitro de
inducción de brotes en Brassica oleracea.
Se estudiaron los eventos tempranos de la formación de novo de los meristemas de brotes adventicios en
segmentos de tallo de Brassica oleracea. Se utilizó un sistema de regeneración que es eficiente, rápido, altamente
sensible a las citoquininas y no implica la formación de callo, permitiendo así que los estudios sobre un
interruptor de desarrollo directo de las células en el segmento de tallo para formar células meristemáticas de
brotes adventicios. Disparar células meristemáticas y células que se dividen fueron marcados desde etapas muy
tempranas usando en los estudios de hibridación in situ con Brostm, un homólogo de Brassica del gen de
Arabidopsis SHOOTMERISTEMLESS (STM), y una sonda de caja derivado de ciclina, Brocyc , respectivamente . Se
demuestra que el proceso de conmutación de desarrollo comienza antes de que ocurra cualquier división celular
en los explantes de tallo. Esta conmutación se produce sincrónicamente tanto longitudinal como
transversalmente en el explante, en grupos de 5-7 células del parénquima del floema que subtienden haces
vasculares en el explante. Brostm es inducida específicamente en respuesta a una citoquinina, benciladenina ,
dentro de 4 h de tratamiento y las transcripciones persisten durante la proliferación celular que conduce a la
diferenciación disparar . También se muestra que durante la formación de brotes adventicios, las células que
expresan Brostm son distintas de las que expresan Brocyc . Por último, nuestros datos sugieren que, aunque el
desarrollo de conmutación se inicia de forma sincrónica dentro de 4 h de tratamiento, se requiere de 8 h de
tratamiento para el establecimiento de Determinance organogénica. El último proceso es asincrónico, lo que
implica que se requieren factores adicionales nombrado a más tardar Brostm para lograr niveles máximos de
determinadas poblaciones de células para formar brotes adventicios in vitro.

Histología de la regeneración de brotes en segmentos de tallo de ciclo rápido en Brassica oleracea cuando se
coloca en un medio de inducción de brotes. Aparición de los explantes de tallo a los 3 días (ad), 8 días (EH) y 14
días (IL) después del cultivo. Las secciones transversales de los explantes de tallo (a, e y i), primer plano de los
haces vasculares (B, F y J) y secciones longitudinales del borde del corte del explante (c, g, k) muestran la división
celular progresiva en la región vascular, seguido por la formación de primordios de rodaje en la superficie de
corte del explante (d, h y L). Morfología bruto de los explantes madre. Las flechas indican el sitio de la división
celular inicial (A), seguido por la formación de meristemoides (g),
y, finalmente, la aparición de primordios rodaje (k). Dispara a los
brotes desarrollan a lo largo de la longitud del explante tallo
reducido a la mitad después de 17 días whenincubated lado
cortado hacia abajo, en un medio de tiroteo inductor.

Los análisis de transferencia de

ADNc de la expresión génica
Brostm en ciclo rápido Brassica
oleracea. Expresion Brostm en
hoja (L), tallo (St), disparar ápice
(Sht) y explantes madre
regeneradora de tejidos cultivados
7 días de edad. (b) la expresión
Brostm en la regeneración de explantes madre colocados durante 2 semanas en
medio de rodaje inducir que no contienen (O) BAP (mirar en el pie de pagnina las
cantidades). (c) Brostm y la expresión génica de la ciclina en explantes madre
concentrada durante 2 semanas con 5 microM BAP (BA) y 8 microM 2,4-D (2,4 D).
(d) Brostm expresión en explantes de tallo colocados en medio Dhoot inducir
durante 0 días (0), 2 días (2), 4 días (4), 8 días (8) y 10 días (10). Los blots fueron
despojados y reprobados con un gen de la actina para normalizar la carga en cada
carril.

Alta frecuencia en la regeneración de brotes a través de una capa fina de células transversas en cultivo en
Dendrobium Candidum.
Disparar la organogénesis en explantes TTCL. (a) la desdiferenciación de
las células vasculares conduce a la formación de un número de regiones
meristemáticas; (b) las células meristemáticas de unos pocos haces
vasculares cerca de la haz vascular de la hoja de la vaina (Lsvb)
proliferaron para formar una protuberancia bien organizado compone
de diferentes tipos de células, (c) Una estructura bien organizada tiroteo
apical meristema-como derivado de la protuberancia; (d) Un brote
intacto con meristema apical y hojas priordium demarcada del tejido
madre.

BROTACIÓN ADVENTICIA
Formación de yemas adventicias: Es la formación de novo de yemas a
partir de meristemos preexistentes o tejido no meristemático, las cuales
se originan de una o de un pequeño grupo de células, cuando se cultivan
los explantes en medios de concentraciones elevadas de citoquininas.
Con esta técnica es posible producir un mayor número de plantas por
unidad de tiempo en comparación con el método de yemas axilares y a
la vez presenta mayores posibilidades de mecanización automatización,
existiendo ya varios ejemplos de utilización de birreactores para su
producción. Sin embargo, al igual que el método de yemas axilares tiene
la limitante de que el proceso productivo es realizado en dos etapas:
producción de brotes y crecimiento-enraizamiento. Adicionalmente
presenta el inconveniente de que puede ser una fuente de variación genética debido al propio origen unicelular
de las yemas adventicias. Este método ha tenido su mayor aplicación en la propagación de plantas ornamentales
donde la ocurrencia de plantas fuera de tipo no es un problema.
 TEMA 22. MICROPROPAGACIÓN: TECNOLOGIAS Y APLICACIONES

CLON
Colección, reunión o montaje genéticamente idéntico de individuos reproducidos en su totalidad por vegetativa
significa partir de una sola planta.

MICROPROPAGACIÓN
Ventajas
 De uno a muchos propágulos (parte o estructura de un organismo) rápidamente
 Multiplicación en condiciones de laboratorio controladas
 Ronda continua propagación años
 El potencial de propágulos libres de enfermedades
 Barato por planta una vez establecido

Desventajas
 Equipo especializado / instalaciones necesarias
 Más conocimientos técnicos necesarios
 Protocolos no optimizados para todas las especies
 Las plantas producidas pueden no caber estándares de la industria
 Relativamente caro de instalar

Aplicaciones
 Rápido aumento de las existencias de nuevas variedades
 Eliminación de las enfermedades
 La clonación de los tipos de plantas que no se propagan fácilmente por métodos convencionales (unos
vástagos / coles / semillas; datileras, helechos, nandinas)
 Los propágulos se han mejorado las características de crecimiento (carácter multibranched; Ficus,
syngonium)

Explante
 De la célula, tejido u órgano de una planta que se utiliza para iniciar cultivos in vitro
 Muchos explantes diferentes se pueden utilizar para la micropropagación, pero yemas
axilares y meristemos se utilizan más comúnmente

Elección del explante

Las propiedades deseables de un explante son:
 Fácilmente esterilizable
 Juvenil
 Sensible a la cultura
 Brotaran yemas
 Yemas axilares
 Semillas
 El hipocótilo (desde la semilla germinada)
 Hojas

Métodos de microporpagacion
 Ramificación axilar
 La formación de brotes adventicios
 La embriogénesis somática
 > 95% de toda la micropropagación
 Genéticamente estable
 Simple y directo
 Eficiente, pero propensos a inestabilidad genética
 Poco utilizado. Potencialmente extraordinariamente eficiente
Cuatro pasos en microporpagación: en el paso 1: introducimos y
establecemos un cultivo aséptico. Paso 2: multiplicación. Paso 3:
enraizamiento y preparación. Paso 4: aclimatación (in vitro o ex vitro),
si es en ex vitro, es decir, in vivo, se transplantar. Antes de todos estos
cuatro pasos hay un paso cero que se basa en la preparación de la
planta madre.

MICROPROPAGACION:TECNOLOGIA Y APLICACIONES. EST 0

Etapa 0: fue originalmente concebido para mejorar las condiciones higiénicas de las plantas madres. Al evitar el
riego por aspersión de explantes limpios, pueden ser cosechadas. También se puede utilizar la termoterapia.
También permite el estado fisiológico de la planta madre para mejorar, de manera que los explantes son más
susceptibles para iniciar los cultivos. El estado fisiológico de la fuente de explantes se puede mejorar mediante
varias tecnicas.

MICROPROPAGACION: TECNOLOGIA Y APLICACIONES. EST. 1

Objetivo
 para iniciar un cultivo
 en principio, el método usado debería ser reproducible
 100% de éxito no es necesario
 es un compromiso entre un procedimiento de esterilización adecuada y una buena tasa de supervivencia
de los explantes "no contaminados".

Procedimiento
 Más a menudo se utilizan brotes axilares o los meristemas. En ciertos casos se inician los cultivos de otras
partes de la planta. Ej. es difícil de probar axilar "no contaminada" de ramificación en la etapa 2.
 Con mayor frecuencia, no se recomienda a la propagación de estrella durante la etapa de iniciación.
 Véase también cultivos de meristemos, organogénesis, embriogénesis.
MICROPROPAGACION: TECNOLOGIA Y APLICACIONES. EST.2
Inducción de centros meristemáticos y una rápida
propagación. Un sistema comercial puede ser rentable a
partir de una relación de multiplicación de 2 por mes. En la
figura. 1 la producción anual teórica se muestra para una
tasa de multiplicación mensual de 2 y 4.

Estabilización de los cultivos

Multiplicación mediante micropropagación de rosa

MICROPROPAGACION: TECNOLOGIA Y APLICACIONES. HIPERHIDRATACIÓN

• La hiperhidratación es una alteración de la fisiología de los cultivos
micropropagados que tiene como consecuencia una hipertrofia de las
hojas y los tallos que tienen un exceso de contenido en agua.
Generalmente resulta irreversible y los tejidos afectados no se pueden
subcultivar.
• Esta anomalía tiene su origen en las condiciones ambientales en que se
desarrollan los cultivos in vitro: exceso de humedad relativa, medios
semisólidos, elevados niveles de citoquininas, enrarecimiento de la
atmósfera del contenedor de cultivo, generación de estrés oxidativo.
• Para corregir esta alteración se han desarrollado diferentes
procedimientos como cambios en el medio de cultivo, reducción de los
niveles de citoquininas y sistemas de refrigeración basal
MICROPROPAGACION: TECNOLOGIA Y APLICACIONES. HIPERHIDRATACIÓN. REFRIGERACION BASAL.

La parte inferior de la mayoría de los contenedores se calienta por el calor

producido por unas lámparas que se encuentran en la parte baja. Como el agua se
evapora y se condensa, como consecuencia el agua se evapora y condensa en la
parte más fría, la tapa.
La humedad relativa en el recipiente se puede controlar por enfriamiento inferior,
como el vapor de agua de condensación sobre la superficie del medio. Cuanto
mayor sea la diferencia entre la temperatura media y la temperatura justo por
debajo de la tapa, menor es la humedad relativa.
Con el transcurso del tiempo de reversión de hiperhidricidad en los brotes de
clavel, se mantiene con un dispositivo inferior de enfriamiento en la cámara de
cultivo. Los datos corresponden a un solo experimento de dos repeticiones similares.

MICROPROPAGACION: TECNOLOGIA Y APLICACIONES. EST.3

Elongación:
 En muchos casos el alargamiento es un requisito previo para el enraizamiento adecuado
 Medios de alargamiento, por lo general no contiene citoquininas o una citoquinina más débil que la
utilizada en la etapa 2
 También podría ser necesario para añadir carbón vegetal para neutralizar el efecto de citoquinina
restante de la etapa 2
 Dependiendo del tipo de planta, la elongación puede tener lugar en los brotes individualizados o en
grupos.

Enraizamiento y preparación:
 Más a menudo se utilizan auxinas para inducir el enraizamiento. Con demasiada frecuencia se olvida que
las auxinas inhiben la elongación de la raíz. Mejor enraizamiento se logra por lo general en los medios de
comunicación con un bajo contenido de sal
 In vitro raíces desarrolladas no siempre se adaptan a las condiciones de efecto invernadero y raíces largas
que podría crear problemas de plantación.
 Inducción de raíces se llevará a cabo el rodaje individualizadas y en grupos.
 Aparte de inducción de raíces esta etapa también debe favorecer la aclimatación. Las posibilidades son:
favoreciendo autotrofia, la carga de las plantas con los hidratos de carbono, la reducción de la humedad
relativa en el recipiente, micorrización, el uso de sustrato inerte ...
MICROPROPAGACION: TECNOLOGIA Y APLICACIONES. EST.3.
Formación de raices adventicias
Las raíces adventicias son aquellas que no provienen de la
radícula del embrión, sino que se originan en cualquier otro
lugar de la planta, como por ejemplo en alguna porción del
vástago, en tallos subterráneos y en raíces viejas.

a) Corte longitudinal de un tallo. Raíz primordial

desarrollada cercal del cilindro vascular
b) Corte transversal de un tallo: la laiz adventicia originada
a partir del cilindro vascular.

En esta figura vemos las secciones transversales de microesquejes

castaños de origen rodaje basal 0 ± 5 d, después de la raíz IBA tratamiento
inductivo. A y B, la estructura anatómica de la base del tallo en el
momento de la escisión (día 0); cerca de un haz vascular (B) en la que el
cambium (c) está delimitado externamente por el floema (ph) e
internamente por el xilema (x ). C, la base del tallo 24 h después del
tratamiento, mostrando activación temprana de células con núcleos y
nucleolos agrandados, y una división periclinal (flecha) en la zona cambial.
D y E, la base del tallo 48 h (D) y 4 d (E) después del tratamiento de
inducción. Tenga en cuenta la respuesta progresiva de los derivados del
cambium, con un creciente número de células que se están implicados en
la reactivación celular y (flecha) división. F, Día 5. Cúmulos localizados de
células meristemáticas densamente teñidas conforman la organización de
una meristemoide (m) por las divisiones celulares y transformación de las
células adyacentes. Bares ¯ 132 lm en A; 33 lm en B y F; 16 lm en C y D, y
13 lm en E. co, Cortex, pi, médula; s, esclerénquima; se, elemento de
tamiz.

En esta figura vemos las secciones transversales de microesquejes castaños de origen rodaje basal 6 ± 14 d
después del tratamiento de la IBA. Una, 6 d después del tratamiento. Primordios radicales preliminares muestran
una tendencia a formar estructuras en forma de cúpula, y sus extremos distales han alcanzado el anillo
esclerenquimático ® bre (s). B, detalle de una raíz meristemoide convertirse en un primordio de la raíz a través de
las divisiones organizadas de sus células distales (flechas ¯ mitótico ® guras).
C, Día 8. Un primordio radicular bien desarrollado ha empujado a la corteza.
D, 10 d, después del tratamiento. Sobresaliendo primordio de la raíz, que
muestra la formación de procambium (pr), meristemo suelo y cofia. E y F,
Emergente raíces adventicias 10 d (E) y 14 d (F) después del tratamiento,
que muestra la diferenciación completa de su sistema vascular, que ahora es
continua con la del vástago de microtallo. Bares ¯ 164 lm en A y C; 26 lm en
B, y 219 lm en D, E y F. co, Cortex, rc, cofia, rp, primordios de raíz.

Introducción a la aclimatación a condiciones ex vitro

Ecofisiología In vitro / In vivo
Recipiente de cultivo  Ecosistema

Habitación de cultivo  ecosistema.

Ecosistema cerrado
 Intensidad luminosa reducida y estable (baja actividad fotosintética)
 Elevada humedad relativa del aire (95%) (deficiente transpiración)
 Reducido intercambio gaseoso con el exterior
 Concentración de CO2 variable (limitada fijación fotosintética de C)
 Presencia de etileno (Inducción de senescencia al final del subcultivo)
 Potencial hídrico del medio reducido por la presencia de carbohidratos
 Nutrientes minerales en concentraciones óptimas iniciales (absorción por difusión)
 Carbohidratos presentes en el medio (inhibición de la biosíntesis de Rubisco)
Ecosistema abierto
 Intensidad luminosa elevada y variable (adecuada actividad
fotosintética)
 Moderada humedad relativa del aire (60) ( transpiración funcional)
 Concentración de CO2 estable (permite la fijación fotosintética de C)
 Potencial hídrico del medio alto (establecimiento de un gradiente de
potencial)
 Nutrientes minerales en concentraciones óptimas (absorción por
flujo de masa)
Nutrición mineral in vitro(imagen inferior derecha)
Suplemento de carbohidratos in vitro:

MICROPROPAGACION: TECNOLOGIA Y APLICACIONES. EST.4

El objetivo de esta etapa es la de optimizar la transferencia de in vitro a condiciones de invernadero o de campo.
Las principales tareas son para minimizar las pérdidas y para acelerar los procedimientos.

En condiciones naturales las plantas son autótrofas y su fuente de carbono es el CO2 del medio ambiente. En
cultivo de tejidos las fuentes de carbono son los hidratos de carbono que se encuentran en el medio, por una
parte una el CO2 en el espacio de cabeza en el otro lado (mixotrofía). En comparación con las plantas en
invernadero o siembras cultivadas, en la mayoría de los casos las bajas tasas de fotosíntesis tienen que ser
registradas para las plantas en cultivo.
 evolución de la fotosíntesis durante la aclimatación
 evolución de azúcar y reservas de almidón durante la aclimatación.
Completa autotrofía bajo condiciones TC requiere CO2 adicional, así como la posibilidad que entra en el
recipiente y de alta PAR. Sin embargo, las plantas autótrofas no son necesariamente mejores que la mixotrofia
(forma de nutrición combinada)

Directamente después de la transferencia al invernadero, las plantas cultivadas de tejido tienen que desarrollar
un aparato fotosintético funcional. Algunos investigadores dividieron las plantas cultivadas en dos grupos
distintos: uno en el que in vitro deja nunca desarrollan la
capacidad fotosintética cuando se cultivan en un medio
con sacarosa, y una en la que las hojas son capaces de
adaptarse a condiciones autótrofos. En la figura 1 la
evolución de la fotosíntesis neta y la respiración oscura
tanto in vitro y ex vitro hojas de Spathiphyllum y Calathea
pantlets formado se caracterizan por una respuesta
fotosintética positiva en el trasplante (planta autótrofa),
mientras Calathea es un exampe de una cultura
mixotophic. En ambas especies de plantas nuevas
desarrollado deja una capacidad fotosintética más alta.

Aclimatación ex vitro de plantas micropropagadas de rosa y plántulas micropropagadas de rosa en diferentes

etapas de la micropropagación:

Túneles de aclimatación
El control óptimo del clima es el factor más importante para un establecimiento satisfactorio en un cultivo tisular
de plantas. En los invernaderos se utilizan carpas de humedad (películas de plástico blanco lechoso o
transparente, lisos o perforados) y neblinoso o sistemas de nebulización para mantener una alta humedad
relativa. Durante el invierno la luz de asimilación puede ser utilizada.
En algunos casos, se utilizan unidades de climatización o cuartos de crecimientos completamente cerrados. Las
plántulas se cultivan la frecuencia en diferentes estantes por encima de la otra para hacer un mejor uso del
espacio disponible.
Las plantas se trasplantan en diferentes sustratos: turba y la turba se mezcla con arena o perlita para mejorar la
aireación; sustratos inertes como la vermiculita, lana de roca, oasis, espuma.

El trasplante y transporte de plántulas in vitro de es principalmente mano de obra. Las partes del proceso pueden
ser automatizadas.
Hay que tener en cuenta los típicos cambios en la concentración de CO2 dentro de los contenedores donde se
encuentran las plantas.

Parametros y usos durante la aclimatacion

 Humedad: mientras que controlando la humedad se debe evitar que el sustrato se vuelve demasiado
húmedo. Por lo tanto se recomienda el uso de un dispositivo que produce niebla (ver Infraestructura).
 Temperatura: La temperatura extrema debe ser evitada. Calor inferior puede favorecer el enraizamiento.
 CO2: una alta concentración (900 ppm) mejora el proceso de destete en algunos casos.
 Luz: demasiado alta intensidad de la luz inmediatamente después de transferir a condiciones de
invernadero es perjudicial. A veces se requiere iluminación de asimilación en época de invierno.
 El fotoperiodo: elegir el fotoperíodo adecuado para evitar la floración y, finalmente, la tuberización.
 Fertilizantes: como para esquejes y plántulas no se requieren fertilizantes durante el período inicial.
 Pesticidas: el uso de pesticidas durante la aclimatación debe reducirse al mínimo. Algunos fungicidas
pueden provocar anomalías graves debido a las interacciones con los reguladores del crecimiento de
plantas.

MICROPROPAGACION: TECNOLOGIA Y APLICACIONES. AUTOMATIZACION. BIOREACTORES.MEDIO LÍQUIDO

La automatización de los sistemas de
micropropagación en medio líquido requiere la
inducción de nuevos procesos morofogéncicos como
son los nódulos meristemáticos, la aplicación de
retardante del crecimiento específicos para prevenir
la hiperhidratación por inmersión en el medio líquido
(ancimidol y paclobutrazol –inhibodores de la
biosíntesis del ácido giberélico que inducen la
miniaturización de los explantes y nuevos diseños de
bioreactores.
Los biorreactores a gran escala no son favorecidos para la micropropagación porque son demasiado caros y
demasiado arriesgados. Pequeños biorreactores dan más flexibilidad y las diferentes unidades que contienen las
mismas plantas se pueden permitir. Estos son algunos ejemplos:

Nódulos meristemáticos de narciso en medio líquido

 TEMA 23. TÉCNICAS DE CONSERVACIÓN EX SITU MEDIANTE CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS.

CONSERVACION DE GERMOPLASMA VEGETAL

Conservación mediante cultivo de tejidos
Conservación en condiciones de crecimiento retardado
Crioconservación

CONSERVACIÓN DE GERMOPLASMA
Extensión de las técnicas de micropropagación, dos métodos:
1. Técnicas de crecimiento lento
 ↓ temp., ↓ Luz, suplementos de medios (inhibidores osmóticos, retardadores del crecimiento),
la deshidratación del tejido, etc
 Almacenamiento de mediano plazo (1 a 4 años)

2. Crioperservación
 Ultra bajas temperaturas. Detiene los procesos de división celular y del metabolismo
 Muy largo plazo (indefinido)

El almacenamiento de germoplasma es más económico - ¿por qué no las semillas?

 Algunos cultivos no producen semillas viables
 Algunas semillas permanecen viables durante sólo un tiempo limitado y son recalcitrantes al
almacenamiento
 Las semillas de ciertas especies se deterioran rápidamente debido a las semillas transmitidas por
patógenos
 Algunas semillas son muy heterocigóticas y no es adecuado para mantener fiel a su tipo de genotipos
 Enfoque eficaz para evitar los problemas anteriores puede ser la aplicación de la tecnología de
criopreservación

EXPLANTES CRIOGÉNICOS
 Células vegetales indiferenciadas
 Suspensión embrionaria
 Callo
 Polen
 Semillas
 Los embriones somáticos
 Dispara ápices
Preparación
 Pretratamiento
 Método de crioconservación
 Método de descongelación
 Método de recuperación es crítico

Las plantas aumentan el uso de técnicas de micropropagación para asegurar un número

adecuado de puntas de los brotes para las pruebas de exposición y la colocación en el
almacenamiento a largo plazo.

Algunas plantas pueden requerir una etapa de condiciones frías durante 1-6 semanas
antes de disparar la yema de escisión.

disparar las yemas consiste en clonar la zona apical y 2-3 primordios foliares se
diseccionan con una aguja de disección con microscopio de disección en la preparación
para el tratamiento previo, la carga y la fase de crioprotector.
 La salida de las yemas son llevadas a crioviales y son emergidos en LN2

Los crioviales se colocan rápidamente en agua tibia, sin tope salarial y 1,2 M
de sacarosa se coloca sobre las puntas apicales

CRIOBIOLOGÍA
 Es el estudio de los efectos de las temperaturas extremadamente bajas en los sistemas biológicos, como
las células u organismos.
 Criopreservación
- un aspecto aplicado de criobiología
- ha dado lugar a métodos que permiten el mantenimiento de una diversidad de células de
baja temperatura
CRIOPERSERVACION
Requisitos:
• Precultivo-Por lo general, una tasa de crecimiento rápido para crear células con vacuolas pequeñas y de
bajo contenido de agua
• Crioprotección-glicerol, DMSO, PEG, etc ..., para proteger contra el daño de hielo y alterar la forma de
los cristales de hielo
• Congelación-La fase más crítica, uno de dos métodos:
• La congelación lenta permite una deshidratación citoplasmática
• Los resultados de congelación rápida en la congelación intracelular rápido con poca
deshidratación
VITRIFICACIÓN.
Los tratamientos para crioconservación por vitrificación para obtener la máxima viabilidad de los tejidos deben
alcanzar un equilibrio entre los valores correspondientes a varioa parámetros:
 Concentración de los crioprotectores.
 Duración del tiempo de exposición a los crioprotectores a temperaturas no congelantes.
 Temperatura a la que tiene lugar la exposición.
Los tejidos vitrificados de forma viable y enfriados a ultrabajas
temperaturas se encuentran en un estado de animación suspendida en
la que los procesos metabólicos se detienen y pueden ser reactivados
cuando el tejido sea desvitrificado y su temperatura alcance los valora
normales.
En estas condiciones los tejidos pueden ser conservados a ultrabaja
temperatura teóricamente por tiempo indefinido.

Este esquema ilustra los pasos involucrados en el uso de una solución de

vitrificación y enfriamiento rápido para puntas de los brotes
crioconservación. Stock planta (A) con yemas axilares bien desarrollados
(círculo). Brotes extirpados (puntas de los brotes) (B) están expuestos a
la solución de vitrificación (C) y luego se colocaron en pajuelas de semen
8D). Las pajuelas están expuestos a alrededor de -160 C (E) antes de la
inmersión en LN (F). Para advertencia, pajas se mantienen en el aire
durante 10 segundos (G) antes de la inmersión en agua durante 1 min
(H). Las puntas apicales se diluyen a partir de la solución de vitrificación
(I), se cultivaron en agar (J), cuando ocucurs crecimiento suficiente, se
transfirió a medio de crecimiento normal (K).

ENCAPSULACIÓN
Este esquema ilustra los pasos realizados en utilizando la deshidratación por encapsulación y refrigeración como
método fro puntas de los brotes crioconservación. Un lote de plantas (A) seleccionado y disparar consejos (área
de un círculo en A) se extirpa (B) y se coloca en una solución de alginato de calcio libre (C). Puntas de los brotes se
dejan caer en una solución de calcio (D) para formar la perla. Las cuentas se incubaron en soluciones de azúcar (E)
y luego parcialmente desecados (F). Los granos se colocan en cryoampoules (G) y los cryoampuoles directamente
sumergidos en LN (H). El calentamiento es mediante la inmersión en
agua (I). Las cuentas se cultivaron directamente en agar (J) durante el
cual los rehidrata de talón (K). Cuando el crecimiento suficiente Ha
ocurrido, brotes pueden ser transferidos a medio de crecimiento
normal (L).
 TEMA 24. BASES MOLECULARES Y CELULARES PARA LA TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS VEGETALES.
METODOLOGÍAS DE TRANSFORMACIÓN.

Todos los métodos de transformación estable consisten en tres pasos:

 La entrega de ADN en una sola célula de la planta.
 Integración de ADN en el genoma de la célula de la planta.
 La conversión de la célula transformada en una planta entera.

TRANSFORMACIÓN MEDIADA POR AGROBACTERIUM

La transformación genética mediada por Agrobacterium rhizogenes es un método de transformación utilizado
en ingeniería genética de plantas que permite la introducción de ADN exógeno a una célula y la regeneración de
esta célula transformada para obtener una planta genéticamente modificada empleando la
bacteria Agrobacterium rhizogenes como vector.
A. rhizogenes (sin.: Rhizobium rhizogenes) es una bacteria patógena de plantas, gram
negativa, que habita en el suelo y provoca la enfermedad denominada «raíces en
cabellera» o «hairy roots», que ocasiona la proliferación de raíces en el sitio de
infección. Esta proliferación se produce por la transferencia de un T-DNA
del plásmido Ri de la bacteria al genoma de la planta. El T-DNA contiene genes que
codifican para la síntesis de opinas, que a su vez codifican para la síntesis de hormonas
vegetales y su metabolismo, y otros genes que estimulan
la división celular en el sitio de infección. El cultivo de
raíces trasformadas por A. rhizogenes presenta muchas
ventajas en comparación con el cultivo de células y de
raíces sin transformar. Algunas de las cuales son un
crecimiento más acelerado y una mayor productividad de
metabolitos secundarios. Entre los metabolitos secundarios
producidos en raíces transformadas se encuentran
los terpenoides, la hiosciamina y la escopolamina Los
cultivos de raíces transformadas son una fuente potencial
de compuestos farmacéuticos

PLÁSMIDOS COMO VECTOR

Los plásmidos se utilizan como vectores de clonación en ingeniería genética por su capacidad de reproducirse de
manera independiente del ADN cromosomal así como también porque es relativamente fácil manipularlos e
insertar nuevas secuencias genéticas.

Cointegración vs plásmidos binarios

En 1983, Hoekema et. al. y de Frammond et al. Encontraron que
la región T y los genes vir podrían ser separados en dos replicones
diferentes. El plásmido auxiliar Vir generalmente contiene una
deleción completa o parcial de la región T, haciendo que las cepas
que contienen este plásmido no puede incitar a los tumores.
Cepas de Agrobacterium como LBA4404, GV3101 MP90, AGL0,
EHA101, EHA105 (derivado de EHA101), y NT1 todos contienen un
plásmido auxiliar Vir.

¿Cuáles son los componentes de plásmidos vector de transformación? Las regiones fronterizas (o al menos una
frontera a la derecha)

UN GEN MARCADOR SELECCIONABLE

 Sorprendentemente hay pocos
 Resistencia a la kanamicina, nptII
- NOS PROMOTOR --- NPT II --- NOS 3 'secuencia de poliadenilación
 Resistencia a la higromicina, hpt
 Gen bar (para la resistencia al herbicida fosfinotricina)
 Gen DHFR (para la resistencia a metotrexato)
 Gen PTU (para la resistencia al herbicida Round-up)

UN GEN MARCADOR PUNTUABLE (opcional, pero muy útil)

 Actividad NPT II
 opinada producción
 actividad de la beta-glucuronidasa (GUS)
 Proteína fluorescente verde (GFP)
 La actividad de luciferasa

Un sitio de clonación para el gen de interés es:

LOS ORÍGENES DE REPLICACIÓN PARA LA REPLICACIÓN DEL PLÁSMIDO EN BACTERIAS

Existencia de un gen de resistencia a antibiótico para la selección y mantenimiento del plásmido en bacterias
Las secuencias para la recombinación homóloga (en plásmidos de co-integración)
 Secuencias de ADN-T
 pBR 322 secuencias

Uno de los vectores binarios primeros construido fue el

pBIN19, hecho por M. Bevan en 1984. Después de eso, las
modificaciones se hicieron en estos vectores para ampliar la
gama de su utilidad y mejorar su eficiencia de transformación

Vectores binarios más pequeños como la serie pPZP son

estables en Agrobacterium y fácil de manejar.

Los vectores binarios como la serie pCAMBIA se

construyeron a partir pPZP con más opciones de
marcadores de selección (nptII, bar o HPT) y periodistas
(GUS o GFP).

Las nuevas versiones de los vectores binarios tienen sus marcadores de selección cerca de la frontera izquierda
para asegurarse de que el marcador de selección es la última cosa que se transfirió a las plantas. Por lo tanto,
todas las plantas seleccionadas deben tener un T-ADN completa.

VECTORES SUPERBINARIO
Vectores superbinario contienen copias de
virB, virG y Virc, y han hecho la
transformación mediada por
Agrobacterium de monocotiledóneas como
el arroz japónica posibles (imagen de la
derecha).

Sistema binario de BAC (BIBAC) puede

transferir 150 kb de ADN en plantas
(imagen de la izquierda)

GEN DE INTERÉS
 Puede venir de cualquier fuente
 Por lo general, quimérico (que se compone de partes de diferentes genes)
 Promotor: CaMV 35S, otros
 Terminator: NOS, CaMV 35S, otros
 Otros elementos

¿Cómo se hace una transformación de plantas con Agrobacterium Hecho?

 Co-cultivar el A. tumefaciens por ingeniería extraer el contenido del gen de interés con un explane del
que se ha regenerado plantas que pueden ser obtenidas.
  Cultivo del explante en un medio de regeneración en presencia de un agente selectivo (tales como
kanamicina si el T-ADN contiene NPT II) y un antibiótico para matar el Agrobacterium o retrasar su
crecimiento (carbinecillin, cefotaxima, timitin).
 Después de un cierto período de tiempo, seleccione los vástagos regenerados (o embriones) que son
resistentes.
 Se tamizan los brotes regenerados para la expresión del marcador calificable.
 Brotes de raíz y las plantas producidas.
 Prueba de las plantas transgénicas para la presencia y expresión de los genes introducidos.
 Producir una progenie de la planta transgénica y determinar si el gen introducido es heredable.

Puntos importantes
 El proceso es ineficiente, y sólo una pequeña fracción de las células diana se transforman.
 ADN debe ser integrado en un cromosoma para la transformación estable.
 Cada célula transformada es único.


En la transformación de planta de Arabidopsis

LA INFILTRACIÓN DE VACÍO
 Infiltración al vacío se realiza mediante la colocación de plantas con flores al revés en un vaso de
precipitados con una solución que contiene Agrobacterium tumefaciens y 5% de sacarosa. Las plantas se
colocan de tal manera que se sumergieron sólo inflorescencias.
  Este vaso y plantas se colocaron en la cámara de vacío y el vacío (0,05 bar) se llevó a cabo durante varios
minutos.

INMERSIÓN FLORAL
 Las plantas se colocaron en una manera similar a la infiltración al vacío, pero no se aplicó vacío.
 Las plantas se mantuvieron en la solución durante varios minutos antes de la extracción.

ROCIADO FLORAL
 Aerosol floral hecho por pulverización flores de Arabidopsis
con soluciones de Agrobacterium.
 Es mucho menos perjudicial para las plantas y puede ser
aplicado muchas veces.
 Todos los métodos de transformación de tejido reproductor
femenino.
 Los informes mostraron que sólo la aplicación de
Agrobacterium para aceptor polen producirá transformantes.
 Los informes también mostraron que la expresión de GUS sólo
se puede observar en los ovarios después de flores fueron
infectados con Agrobacterium llevando ACT11-gusA-intrón.
 Zona de elongación de la raíz es la zona más altamente
susceptibles a la transformación mediada por Agrobacterium.
 Para los métodos de inmersión / rociado florales, visibles brotes florales inmaduros son los más
susceptibles a la transformación.

TRANSFERENCIA DE ADN DIRECTO

 Bombardeo de micropartículas
 PEG / electroporación de protoplastos
 Otros

TRANSFORMACIÓN BIOLÍSTICA
Es un método de transferencia directa de genes en una célula, con el objetivo de crear
organismos transgénicos. Es el método de transferencia directa más utilizado para
transformar las células vegetales. Consiste en propulsar los genes de interés dentro de
las células con la ayuda de un cañón de ADN, con lo cual se modifica el ADN de las
células.
 ADN se mezcla con microscópica (de 1 a 10 micras de diámetro) de partículas
de tungsteno o de oro y el ADN se precipita sobre las partículas.
 Las partículas recubiertas de ADN se colocan en el extremo de una bala de
plástico más grande.
 La bala se carga en un cañón de la pistola y el objetivo - el tejido vegetal que
desea transformar - se coloca en el extremo del cañón.
 La pistola se dispara, la aceleración de la bala en el extremo del cañón.
 Una placa con un pequeño agujero en el extremo del recorrido de la bala de plástico.
 Las pequeñas partículas recubiertas de ADN mantener el impulso y pasan a través del agujero y golpear el
objetivo.
Se utilizan microesferas de metal cubiertas de ADN (bolas
de oro otungsteno de un micrón de diámetro). Se proyectan a enorme
velocidad sobre las células que deben modificarse con el fin de cruzar su
pared. Estas bolas se retrasarán progresivamente cruzando las distintas capas
celulares. Algunas de las células alcanzadas van entonces a integrar
espontáneamente los genes en su genoma. Pero el
núcleo de la célula incluye el ADN de
manera aleatoria.
Algunas de las partículas pasarán a través de la
pared celular y entrar en las células individuales.
Algunos de los ADN se darán a conocer a partir de la partícula, terminan en el
núcleo y se integran en un cromosoma, lo que resulta en la transformación.
¿Cómo? No lo sabemos.
 Varias copias de transgenes puede llevar a silenciar
 Los consumibles son caros

Puntos importanes
 Gama de huéspedes ilimitado.
 El tejido no tiene que ser totipotente.

TRANSFORMACIÓN MEDIADA POR PEG

La inserción de genoma foráneo por medio del genoma separado del cloroplasto se puede hacer por tres
métodos: “biolistics”, transformación mediada por glicol de polietileno (PEG) y por expansión “Galistan” por una
femto-aguja.
La transformación mediada por PEG requiere la preparación del protoplasto (la célula vegetal sin la pared). Los
protoplastos se fusionan mediante el PEG, se obtienen híbridos y, por recombinación, células transgénicas. Para
esto, también requiere que la proteína al producirse sea regenerable por el mismo. Su principio envuelve que el
cloroplasto adquiere ADN en presencia de PEG por cambios en la membrana plasmática, de forma que este entra
al citoplasma y es transportado al cloroplasto donde es añadido como parte integral de su genoma original.
Luego, como el cloroplasto es parte esencial del proceso fotosintético, todas las plantas tienen múltiples copias
de ellos, factor que ayuda en altos niveles de expresión.
La técnica “Galistan” es la más novedosa y por lo tanto, la menos practicada. Esta trata de la microinyección de
ADN al cloroplasto utilizando la expansión de un líquido dentro de la aguja inducido por el calor (“Galistan”) que
obliga la transformación del plásmido de ADN dirigido. También se utiliza la técnica de inyección, a nivel macro y
micro, para insertar el material genético foráneo directamente al núcleo de la célula. Este método presenta
menos errores aleatorios por su eficacia.
La ingeniería metabólica trata sobre la modificación de procesos metabólicos de las células enfocados en cambiar
genes estructurales y genes regulatorios, como los genes que codifican para los promotores. Al modificar un
promotor se puede controlar no tan solo la cantidad de proteína sintetizada, sino que se puede controlar la
acumulación de esta proteína en áreas específicas en la célula de la planta.
Finalmente, el último método utilizado es la producción de proteínas por el cultivo de células. En estos proyectos,
usualmente, insertan el ADN en la célula de la planta y la crecen en un cultivo dentro de un caldo nutricional. De
esta forma, las células producen rápidamente la proteína y ésta es desechada al medio, donde su extracción es
más sencilla. Sin embargo, por el comportamiento de ciertas proteínas en medio líquido, hay veces que se
requiere un equipo sofisticado para una extracción efectiva, como un bioreactor que separa las proteínas por
cromatografía de afinidad después de que estas hayan sido sintetizadas (“Affinity-Chromatography Bioreactor” o
ACBR).
 Digerir las células con celulasa para obtener protoplastos con PEG induce
reversible permeabilizationof la membrana plasmática
 Bajo la viabilidad de protoplastos
 Baja eficiencia de transformación (1-2%)
 Difícil para regenerar

El requisito de regeneración in vitro para la transformación de protoplastos y la pistola

de genes que también puede conducir a cambios somaclonales, que puede ser problemático.
Liposomas
 ADN dirigidos encapsulado en una bicapa lipídica esférica denomina un liposoma
 En la presencia de PEG, se produce la endocitosis.
 Después de la endocitosis, el ADN es libre para recombinar e integrar con el genoma del hospedador
La electroporación
 Campo eléctrico intensivo conduce a poros en la membrana plasmática, lo que permite ADN para entrar
 La regeneración de protoplastos es todavía un problema
Las fibras de carburo de silicio
 Use fibras de carburo de silicio para perforar agujeros a través de las células de plantas cultivadas
 Fibras de carburo de silicio y células de plantas cultivadas se añaden a un tubo y se agitó vigorosamente
  La fuerza mecánica generada por el vórtice lleva las fibras en la célula
Microinyección
 Utiliza agujas finas de vidrio para inyectar el ADN extraño directamente en la célula huésped
 Desarrollado para inyectar ADN en protoplastos, cultivos de suspensiones de células embrionarias y
multicellularstructures
 Consume tiempo
Desecación
 Embriones secos se pueden mezclar con una solución de nutrientes que contiene el ADN extraño
 El ADN debe ser tomado como los rehidrata de embriones y plantas de semillero se puede germinó en
presencia de un medio de selección para evaluar la incorporación de ADN extraño

La sonicación - JJ Finer
La sonicación es el acto de aplicación de la energía del sonido (generalmente ultrasonidos) para agitar las
partículas de una muestra, con diversos fines científicos o industriales.