INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE
METODOS DE ANALISIS

Separación de una mezcla de azul de

metileno y fluoresceína usando
cromatografía por adsorción.

GRUPO: 5QV2
INTEGRANTES:
CHAVEZ RICO PABLO
Fundamento.
En la cromatografía por adsorción la separación depende de los equilibrios de adsorción-desorción
de los componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria y la fase móvil. La fuerza con que es
adsorbido un componente depende de la polaridad de este, de la actividad del adsorbente y de la
polaridad de la fase móvil.

Un colorante es una sustancia que es capaz de teñir las fibras vegetales y animales. Los colorantes
se han usado desde los tiempos más remotos, empleándose para ello diversas materias procedentes
de y de animales así como distintos minerales.
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Objetivos.
 Aplicar la técnica de cromatografía por adsorción para la separación de dos colorantes.
 Comprobar la separación con base en el perfil de elución.

Resultados.

Volumen Volumen
Número Número
de de
de A 493 nm A 668 nm de A 493 nm A 668 nm
elución elución
elución elución
(mL) (mL)
1 3 0 0.012 16 48 0.007 -0.002
2 6 0.041 0.667 17 51 0.004 -0.012
3 9 0.137 1.543 18 54 -0.003 -0.012
4 12 0.024 0.19 19 57 0.001 -0.011
5 15 0.026 0.03 20 60 0.009 -0.009
6 18 0.014 0.009 21 63 0.045 -0.005
7 21 0.001 0 22 66 0.483 0.021
8 24 0.002 -0.001 23 69 0.795 0.04
9 27 0.011 0 24 72 0.543 0.04
10 30 0.008 0.002 25 75 0.318 0.011
11 33 0.003 -0.002 26 78 0.203 0
12 36 0.001 0 27 81 0.108 -0.009
13 39 -0.006 -0.009 28 84 0.029 -0.009
14 42 -0.008 -0.012 29 87 0.015 -0.007
15 45 -0.001 -0.012 30 90 0.011 -0.01
 Perfil de Elución
1.8

1.6

1.4

1.2
ABSORBANCIA

0.8 2
0.6

0.4

0.2

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
-0.2
VOLUMEN DE ELUCIÓN(mL)

Absorbancia a 493 nm Absorbancia a 668 nm

Discusión.
Durante la cromatografía, el primer colorante en salir fue el azul de metileno, seguido de algunas
recolecciones incoloras, esto se debe a que la alúmina era de tipo acida (carga positiva) y el
complejo de el azul de metileno de igual forma tiene carga positiva por lo cual las cargas se
repelen impidiendo la fijación de este colorante en la alúmina, además de que gracias a la gran
solubilidad de azul de metileno en agua, la fase móvil de agua pudo arrastrar con facilidad el
azul de metileno.

Una vez que todo el azul de metileno se recolecto, se procedió a cambiar de fase móvil por
regulador de fosfatos porque como la fluoresceína es polar, tiene carga contraria a la alúmina,
esto la fija a ella (puede formar puentes de hidrogeno), y no la permite salir con la primera fase
móvil (agua), pero con la ayuda del regulador de fosfatos básico, alcalinizamos la alúmina,
rompiendo las fuerzas que formo con la fluoresceína, permitiéndola fluir.

Cabe destacar que se tuvo un grave error en el proceso de la cromatografía, el cual fue diluir la
mezcla de colorantes al momento de agregarlo, lo cual provocó un mayor uso de tubos de
recolección además de una mayor dispersión de nuestros datos al realizar la lectura en el
espectrofotómetro por lo que aumentó nuestras probabilidades de error. Como se puede
observar en nuestros datos obtenidos, este error en el método solo afecto en la recolección de
azul de metileno, ya que la recolección de fluoresceína se llevó a cabo en una cantidad más
pequeña de tubos que el azul de metileno.
En la gráfica podemos observar cual es la longitud de onda a la que cada colorante tiene su
mayor absorbancia (668nm para azul de metileno / 493nm para fluoresceína). Comparando
nuestra grafica con la de los demás compañeros, pudimos darnos cuenta que al recolectar los
datos para la absorbancia de 493, ellos obtuvieron un pico no muy grande al principio de los
volúmenes de elución, esto se debe a que a pesar de que el azul de metileno tiene mayor
absorbancia a 668nm, en las gráficas de nuestros compañeros se puede observar que está
absorbiendo una fracción más pequeña de radiación electromagnética a 493nm. La razón por la
cual a nosotros no nos apareció ese pico es debido al error cometido en la cromatografía, al
diluir la muestra de colorantes obtuvimos una mayor cantidad de tubos con azul de metileno
pero con pequeñas concentraciones de este en cada uno por lo cual, al ser leídos a 493nm no
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se detectó una gran absorbancia en los tubos de azul de metileno.

Conclusión.
La cromatografía por adsorción es una metodología bastante útil para la separación y
purificación de soluciones, pero esta conlleva muchos cuidados y consideraciones que se deben
tener en cuenta para poder separar dos o más reactivos, por lo cual debe llevarse a cabo con
extremado cuidado y una alta concentración.

Preguntas extra.
1.-Especifique y defina los elementos del sistema cromatográfico para esta separación:

Fase móvil 1 y 2: Agua y regulador de fosfatos, fase estacionaria: Alúmina acida, soporte:
Columna

2. Defina el termino adsorción y empleando formulas esquematice que fuerzas intermoleculares

participan en el proceso de separación de los solutos.

La adsorción es un proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapados o retenidos en
la superficie de un material en contraposición a la absorción, que es un fenómeno de volumen.

3. Considerando las propiedades de solubilidad de los colorantes, indique que modificaciones

haría para invertir el orden de elución.

Cambiaría la alúmina acida por alúmina básica para que así se retuviera primero el azul de
metileno y la fluoresceína pueda eluir, además de que la primer fase móvil que se usaría seria
el regulador de fosfatos ya que la fluoresceína no es soluble en agua y el azul de metileno si lo
cual haría que no hubiera una buena separación de los colorantes si se usara primero el agua.

Bibliografía.
http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/principios_de_
cromatografia.pdf

P. Molina Buendía, 1989, “Prácticas de química orgánica Volumen 15 of Colección Blanca /

Universidad de Murcia”, EDITUM, paginas consultadas 22.