El receptor de quimioquinas C-C 5 (CCR5) se expresa en

posibles células diana del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y

sirve como co-receptor predominante para la entrada viral durante
transmisión inicial y durante las primeras etapas de la infección. UN
mutación homocigota D32 en el gen CCR5 previene CCR5
expresión de la superficie celular y por lo tanto confiere resistencia a la infección
con cepas de VIH tropicales CCR5. Trasplante de hematopoyético
las células madre de un donante CCR5D32 / D32 fueron previamente
exitoso en la eliminación del VIH del receptor inmune
sistema, lo que sugiere que la interrupción CCR5 dirigida puede conducir a
una cura para el VIH Por lo tanto, se está llevando a cabo un intenso trabajo
en las herramientas de edición de genes CCR5 para desarrollar el VIH curativo
terapia. Aquí, revisamos la función natural de CCR5, la
progreso realizado en la edición de genes CCR5 hasta la fecha y discutir el
limitaciones actuales
Introducción
Terapia estándar actual para la inmunodeficiencia humana
infección por el virus (VIH) requiere la administración diaria de por vida
de una combinación de medicamentos antirretrovirales (combinación
terapia antirretroviral; carro). Aunque terapéutico
el control de la replicación viral permite que el sistema inmune
restaurar y retrasar parcialmente la progresión de la enfermedad, la cura
infección por VIH sigue siendo inalcanzable con el uso de
medicamentos disponibles actualmente. Individuos que son naturalmente
homocigotos para la variante del gen CCR5 D32 son resistentes
a CCR5-trópico infección por VIH debido a la falta de
expresión celular de la quimiocina C-C receptor 5 (CCR5)
[1] Previamente, informamos la cura del VIH
infección en un paciente que recibió el tallo hematopoyético
células de un donante con esta variante homocigótica del gen D32. Después del trasplante y la
interrupción de cART,
El VIH se volvió indetectable y los recuentos de células T CD4 + se normalizaron,
demostrando una protección efectiva contra el VIH
replicación [2,3]. Lamentablemente, este resultado podría
no se repetirá en un estudio posterior [4
] El primer caso tiene
sin embargo, trajo mucha atención a la curativa
potencial de estrategias de tratamiento dirigidas al gen CCR5
en pacientes infectados por VIH. En consecuencia, nuevas tecnologías
para la edición de genes se han desarrollado en los últimos
años que pretenden imitar la deficiencia natural de CCR5. En esto
revisión, describimos el papel fisiológico de CCR5, el
avances recientes en el desarrollo de modificaciones CCR5
métodos y discutir su aplicación hacia la terapia del VIH.
Funciones inmunes naturales de CCR5
El receptor de quimioquinas CCR5 es una transmembrana de siete
segmento de proteína y puede interactuar con varios
quimiocinas proinflamatorias C-C motivo que son típicamente
liberado como parte de las respuestas inmunes innatas o adaptativas.
Muchas de estas quimiocinas también son capaces de unirse a
otros receptores de quimiocinas, mientras que la quimioquina (C-C
motivo) ligando 4 (CCL4) parece ser en gran medida específica
para CCR5 [5]. El agonista más potente del ser humano
CCR5 aún descrito es CCL3-like 1 (CCL3L1) [6].
CCR5 se expresa naturalmente en la superficie de un ancho
rango de leucocitos que incluyen células T de memoria / efectoras,
células asesinas naturales, células B, monocitos y presentación de antígeno
células tales como células dendríticas y macrófagos.
Interacción de CCR5 superficial con quimiocinas agonistas
induce vías de señalización intracelular, que (i) median
migración de leucocitos a lo largo del gradiente de quimioquinas para
el sitio de la inflamación y (ii) mejorar la inflamación local
respuestas inmunes al estimular la proliferación
y la secreción de molécula efectora de leucocitos. CCR5 es
por lo tanto, participan en la regulación de la migración celular y local
activación inmune Para completar, debe tenerse en cuenta
que CCR5 también se expresa en células no hematopoyéticas
incluyendo osteoclastos, fibroblastos, endotelio vascular,
epitelio y células musculares lisas vasculares, células hepáticas,
y neuronas donde puede tener otras funciones fisiológicas
que no están directamente relacionados con la respuesta inmune [7].
Deficiencia de CCR5 y resistencia natural al VIH
CCR5 es uno de los principales correceptores para la entrada del VIH en
CD4 + células diana. Una eliminación natural de 32 pares de bases
en el marco de lectura abierto CCR5 (CCR5D32) presenta
un codón de parada prematuro y genera un acortamiento
forma de la proteína que no aparece en la célula
superficie. La frecuencia alélica de la deleción CCR5D32
varía en poblaciones de diferentes grupos étnicos. En personas africanas y asiáticas CCR5D32 es
casi inexistente,
mientras que en caucásicos, la frecuencia del CCR5D32
alelo es 10-20% y la prevalencia de la homocigótica
la mutación es del 1-2% [8-10]. El genotipo homocigoto
(CCR5D32 / D32) conduce a la superficie celular ausente permanente
expresión de CCR5 y media la resistencia al VIH
cepas que usan CCR5 para la entrada de células [11, 12]. Estas observaciones
han inspirado el desarrollo de terapias contra el VIH
que interrumpe la interacción entre el virus y
CCR5.
Las personas con deficiencia natural de CCR5 se encuentran en gran medida en
condiciones clínicas saludables, excepto inmunodeficiencias
respuestas a algunos patógenos [13-16]. Ausencia de CCR5
la expresión superficial también puede ejercer un efecto protector en
afecciones inflamatorias que incluyen aterosclerosis y
enfermedad cardiovascular relacionada, artritis y endotoxemia
debido a un defecto en leucocitos y monocitos / macrófagos
tráfico [17-19]. En general, CCR5 parece ser
prescindible para el correcto funcionamiento del sistema inmune,
convirtiéndolo en un objetivo excelente para la terapia del VIH
incluidos los enfoques de curación.
Cura de VIH por CCR5D32 / D32 stem cell
trasplante
Evidencia del potencial curativo de la interrupción de CCR5
en personas infectadas por el VIH proviene del éxito en
eliminando la infección del VIH por trasplante alogénico
de células madre hematopoyéticas naturalmente deficientes en CCR5 en un
paciente con infección por VIH conocida hace mucho tiempo y recientemente
diagnosticado leucemia mieloide aguda que tenemos primero
informó hace unos seis años [2, 3]. Después del agotamiento
del CCR5D32 del paciente / sistema inmune de tipo salvaje,
Las células progenitoras donantes CCR5D32 / D32 injertados, expandidos,
y diferenciado en linfoide maduro y mieloide
células que son resistentes a la infección por VIH a través de CCR5 [2]
(Figura 1). El paciente permaneció fuera de cART siguiendo el
trasplante y VIH en sangre periférica y ciertos
los tejidos permanecieron continuamente indetectables. Hoy, esto
paciente se considera como curado de la infección por VIH y conocido
como el "paciente de Berlín". Debido a este notable éxito
en eliminar el VIH del sistema inmune, permanente
reemplazo de células que expresan CCR5 por CCR5 deficiente
células se considera como el enfoque más prometedor
interrumpir de manera eficiente la interacción del VIH con su anfitrión
Células. Sin embargo, el trasplante de donantes naturalmente resistentes
las células para la terapia curativa del VIH no pueden ser generalizadas
aplicación en la práctica clínica porque el tallo alogénico
los trasplantes de células en sí son riesgosos, con un 40-55%
tasa de mortalidad [20-23], y por lo tanto solo son éticamente
aceptable en pacientes con cáncer sin alternativas de tratamiento.
Además, la baja prevalencia del gen CCR5D32 / D32
variante en la población general limita la disponibilidad
de células donantes naturales deficientes en CCR5 para células madre trasplante. Métodos
alternativos que imitan el natural
Deficiencia de CCR5 y son ampliamente aplicables a los humanos
son por lo tanto necesarios.
Deficiencia artificial de CCR5
En teoría, hay varias formas posibles de lograr
Deficiencia artificial de CCR5: (i) bloqueo extracelular de
CCR5 en células diana de VIH, (ii) regulación negativa post-transcripcional
de la expresión del gen CCR5 por mediación de ARN mediada
silenciamiento génico (knockdown), o (iii) permanente
alteración del gen CCR5 (knockout).
Bloqueo de la superficie celular CCR5 por drogas exógenas y
el silenciamiento de genes por métodos de interferencia de ARN puede reducir
pero no elimina la función CCR5 como correceptor del VIH,
y por lo tanto, solo puede servir como un complemento de la
terapia convencional contra el VIH. Por el contrario, edición de genes
métodos cambian el código genético y pueden proporcionar un
eliminación completa e irreversible de la función del gen.
En el caso del gen CCR5, esto crearía una genética
resistencia a la infección por VIH en el trópico CCR5. Por lo tanto,
Los métodos de edición de genes dirigidos a CCR5 han ganado considerable
atención en el campo de la investigación de curación del VIH
Edición de genoma de host
Nuevas tecnologías que permiten cambios específicos del sitio en
el código genético incluye nucleasas con dedos de zinc (ZFN),
nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN),
y el palíndromo corto agrupado regularmente entre espaciado
reaperece (CRISPR) -sistema de proteína 9 (Cas9).
Actualmente el sistema más utilizado en relación con el VIH
los estudios de edición de genes humanos es el sistema ZFN [24].
ZFN son enzimas de restricción sintéticas compuestas por
el dominio de unión al ADN del dedo de zinc específico del objetivo y
dominio de endonucleasa que permite la secuencia selectiva
escisión del ADN genómico diana [25,26]. Después de la división,
Las vías de reparación del ADN celular completan la edición precisa.
ZFN se puede utilizar para interrumpir el locus CCR5 y permitir el
generación de novo de células deficientes en CCR5 [27]. De este modo,
la disrupción bialélica del gen CCR5 elimina por completo
Expresión de superficie CCR5, mientras que modificación de gen monoalélica
potencialmente reduce la densidad de superficie de la molécula.
Tipos de células más frecuentemente utilizados para la edición de genes
modificación son células T CD4 + y CD34 + hematopoyético
Células madre. En teoría, en presencia de CCR5-uso viral
cepas, células T CD4 + modificadas proporcionan un conjunto de VIH
células resistentes con una ventaja de supervivencia sobre la no modificada
células y, en consecuencia, se expanden dentro del receptor
sistema inmune. Las células madre hematopoyéticas modificadas tienen
la ventaja añadida de producir continuamente varios
tipos de células de progenie distintas, incluidos monocitos / macrófagos resistentes al VIH
y células dendríticas. Ha sido
demostró que la aplicación de ZFN dirigidas a CCR5
conduce a un 17-25% de disrupción genética en las células madre humanas
e interrumpe el 50% de los alelos CCR5 en humanos primarios
Células T CD4 +, por lo que la frecuencia del gen bialélico
interrupción dentro del grupo de celdas modificadas variaba entre
33 y 40% [28
, 29
, 30
] En inmunodeficiente
ratones, trasplante de poblaciones totales de humanos
Las células tratadas con ZFN condujeron a la reducción de los niveles del VIH
[28
, 30
] Otro estudio demostró seguridad y viabilidad
de infusiones de células T CD4 + autólogas modificadas con ZFN-CCR5
en pacientes infectados por VIH [31]. Más recientemente, un
ZFN optimizado que produce modificaciones CCR5 dentro del
La región D32 ha sido diseñada para brindar alta resistencia
contra la infección por VIH en el trópico CCR5 sin objetivo significativo
actividad [32]. Colectivamente, estos estudios han establecido
la interrupción artificial del gen CCR5 por los sistemas ZFNs
seguido de un trasplante de células autólogas como
enfoque razonable y prometedor para el desarrollo
de nuevas estrategias para el tratamiento del VIH. En consecuencia varios
los ensayos están actualmente en curso, como se describe a continuación (Tabla 1).
En comparación con los sistemas ZFN, las tecnologías TALEN y CRISPR
todavía están en etapas más tempranas de desarrollo. Sin embargo,
primeros resultados prometedores para la modificación de CCR5 usando
TALEN o CRISPR / Cas9 provienen de modelos animales y
estudios de células humanas [33-35] e indican que estos sistemas
pueden convertirse en herramientas útiles para la producción de CCR5-
células deficientes en el futuro. Curiosamente, TALEN
mostró una citotoxicidad mucho menor y significativamente menor
actividad fuera del objetivo que ZFNs [33].
Ensayos clínicos
Se realizaron búsquedas en http://clinicaltrials.gov/for clinical trials
de la aplicación de la edición de genes dirigidos a CCR5 en
Pacientes infectados por el VIH Un resumen se describe en
Tabla 1. Células diana para el gen CCR5 mediado por ZFN
la disrupción utilizada en todos estos ensayos es autóloga
Células T CD4 +. Los diseños del estudio se centran en diversas condiciones,
que podría afectar la persistencia de modificaciones
células, incluidas las destinadas a aumentar el injerto
de células reinfundidas a través de la administración de baja
dosis no mieloablativas de ciclofosfamida.
Un estudio de fase I publicado recientemente describe la viabilidad
y seguridad de CC4 + T autólogo modificado por CCR5
infusiones celulares [31]. En este estudio de serie de casos, doce
pacientes con infección vírica por VIH en cART recibieron un
infusión en dosis única de ex vivo expandido, autólogo
Células T CD4 + que se han modificado en el gen CCR5
por ZFNs. Se produjo un evento adverso grave en un solo
paciente que desarrolló fiebre, escalofríos y dolor en las articulaciones / espalda
dentro de un día después de la infusión. Todos los pacientes del estudio mostraron una
aumento significativo en el recuento de células T CD4 + periféricas en
una semana después de la infusión y las células que llevan una modificación
en uno o ambos alelos del gen CCR5 constituido, en
promedio, alrededor del 14% de las células T CD4 + circulantes. Seis de
los pacientes sufrieron interrupción del tratamiento de la semana
4 a 16 post infusión. Hubo un rebote viral rápido en todos
seis pacientes y la interrupción del tratamiento tuvo que ser terminado
en dos de estos pacientes debido a altas cargas virales. En
pacientes que completaron el período de interrupción del tratamiento,
la carga viral disminuyó continuamente desde el pico
nivel durante la ausencia de cART. Curiosamente, uno
el paciente tenía un nivel de viremia relativamente bajo y pico tardío y luego controló el VIH hasta
un nivel indetectable hasta
semana 16. Posteriormente se encontró que este paciente era
heterocigoto para la mutación CCR5D32. Por lo tanto es
es probable que la tasa de knockout bialélico del gen CCR5
y consecuente interrupción completa de la superficie CCR5
expresión en el grupo reinfused de células T CD4 + era
mayor en comparación con los pacientes restantes. Eficaz
el control viral probablemente depende del grado de
interrupción bialélica del gen CCR5, destacando el
necesidad de estrategias que aseguren un gen CCR5 altamente eficiente
nocaut en un solo nivel de celda. Sin embargo, en todos los doce
pacientes totalizan células T CD4 + y números de genes modificados
disminuido progresivamente durante la interrupción del tratamiento
de 12 semanas. Se mantuvieron células genéticamente modificadas
detectable durante el seguimiento a largo plazo y representado
<2% de las células T CD4 + en la sangre periférica
después del período de observación más largo de 42 meses.
Conclusiones
Se han logrado algunos avances prometedores en la edición de genes
tecnología desde la prueba de principio para CCR5-deficiente
la terapia con células madre en la infección por VIH se publicó por primera vez en
2009 [3]. La eficiencia de la disrupción del gen CCR5 bialélico
parece necesitar más mejoras para lograr un
Grupo de células resistentes al VIH con alta efectividad. El critico
umbral para el número de células deficientes en CCR5 infundidas
requerido para el control viral efectivo es desconocido en este punto
pero, si es suficientemente eficiente, la manipulación dirigida por CCR5
el sistema inmune del huésped puede tener potencial como
terapia curativa del VIH. Sin embargo, al deshabilitar la replicación
de CCR5 usando cepas virales, este huésped manipulado inmune
sistema aún sería susceptible para la quimioquina C-X-C
receptor 4 (CXCR4) -utilizando variantes del VIH, que generalmente
emerger durante etapas posteriores de la infección por VIH, están asociados
con altas cargas virales, y puede replicarse en ausencia de
Expresión CCR5. En consecuencia, aplicación terapéutica
de los métodos de edición de genes disruptivos de CCR5 serán limitados
a personas infectadas por el VIH que no tienen CXCR4
son. Manipulación del gen CXCR4 locusin humansis
generalmente problemático ya que puede tener graves consecuencias
como resultado de sus funciones inmunológicas indispensables
[36,37]. Además, en el contexto de reinfused ex vivo CCR5-
células T CD4 + modificadas, otros tipos de células tales como monocitos,
macrófagos y células dendríticas siguen siendo un objetivo potente
poblaciones de CCR5 que usan el VIH y facilitan el virus en curso
replicación, que a su vez permite la evolución y el crecimiento
de variantes virales que usan CXCR4. Un enfoque para
crear una fuente permanente de linfoide y mieloide
Las células inmunitarias resistentes al VIH deberían infundir CCR5-
células madre hematopoyéticas autólogas alteradas. Sin embargo, el injerto eficiente de células
madre requiere el preacondicionamiento
con agentes conocidos por inducir una amplia gama de
complicaciones que incluyen lesiones tóxicas, citopenias severas,
y para aumentar el riesgo para el desarrollo de tumores malignos.
Finalmente, la eliminación del reservorio viral latente sigue siendo
Ser dirigido. Células de larga vida infectadas de forma latente con
El VIH competente para replicación continuará produciendo viriones
incluso después del injerto de células genéticamente modificadas.
Por lo tanto, las células residuales CD4 + no modificadas todavía
ser fuentes significativas de crecimiento viral que eventualmente
conducir a la aparición de variantes de VIH que usan CXCR4 y
fracaso terapéutico consecuente. En ese contexto, comparando
los resultados del caso recientemente publicado de un
Paciente infectado por VIH que experimentó un rebote viral rápido
después del trasplante alogénico de células madre CCR5D32 / D32
[4
] y el caso del paciente de Berlín [2] es
interesante. Con base en la diferencia dramática en los resultados,
se puede especular que el reservorio viral difiere
en tamaño, distribución y / o calidad entre los dos
pacientes y, como resultado, se eliminó de manera más eficiente
en el paciente de Berlín Homocigosidad para el CCR5D32
mutación que estaba presente en el Berlín infectado por el VIH
paciente antes del trasplante podría haber sido beneficioso
en este sentido debido a la expresión de CCR5 monoalélica
en las células diana del VIH pueden tener un efecto protector contra
la formación y / o estabilidad de reservorios virales [38,39].
Esto también es sugerido por los dos casos de infección por VIH
pacientes en Boston que eran heterocigotos para el
Mutación CCR5D32 antes de que recibieran CCR5 de tipo salvaje
células madre y convertido a quimerismo de donante completo
[40]. Aunque el VIH generalmente rebota de forma persistente
reservorios virales a los pocos días de la interrupción de cART después de
trasplante de células madre [41,42], el VIH permaneció indetectable
durante tres y 8 meses después de la interrupción del TARG
en los dos pacientes de Boston sugiriendo que el
El sistema inmune CCR5D32 / wt puede albergar reservorios reducidos
de VIH competente para la replicación [43]. Afortunadamente, nuestro
conocimiento sobre la biología del reservorio viral continuamente
mejora y el desarrollo de terapias
estrategias dirigidas a la eliminación del VIH latente
el embalse está progresando