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A/ LOS AMINOÁCIDOS:
1 Generalidades:
- Los aminoácidos, aislados por primera vez en el siglo XIX, forman las
proteínas al asociarse linealmente.
- Poseen un carbono central, con H, NH 2 (amino), COOH (carboxilo) y una
cadena lateral R variable.
- La región cte de los aa es siempre polar: presenta un grupo ácido con carga
negativa, y uno básico con carga positiva: NH3+ – CH – COO-
- Los aminoácidos se diferencian por su cadena R.
- Sólo 20 aminoácidos conforman las proteínas recién sintetizadas y son
codificados por el ADN. Después de maduración, las proteínas pueden presentar
más de 100 aa distintos, todos derivados de los 20 iniciales (EJ; Prolina >
Hydroxiprolina).
- Los 20 aa iniciales se clasifican, entre otros, como -aminoácidos: Ambos
grupos, amino y carboxilo, se encuentran en posición . Reciben el nombre de aa
proteicos.
- Muchos aa no proteicos son también vitales. Por ejemplo la -Alanina es un
importante neuroransmisor.
2 Aminoácidos proteicos:
- Por las propiedades de su radical R podemos clasificarlos en 4 grupos:
- Los aa NO POLARES son aquellos cuyo R no es polar, ni tiene carga:
Alanina (Ala; A)
Valina (Val; V)
Leucina (Leu; L)
Isoleucina (Ile; I)
Prolina (Pro; P)
Fenilalanina (Phe; F)
Triptófano (Trp; W)
Metionina (Met; M)
1
Tirosina (Tyr; Y)
Asparagina (Asm; N)
Glutamina (Gln; Q)
- CON CARGA NEGATIVA, son ácidos:
Aspartato (Asp; D)
Glutamato (Glu; E)
- CON CARGA POSITIVA, son básicos:
Lisina (Lys; K)
Arginina (Arg; R)
Histidina (Hys; H)
4 Reactividad:
Carboxilo + Alcohol > Ester
+ Amina > Amida
+ Reductor > Alcohol
+ descarboxilación > Amina
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5 Propiedades ácido/base de los aminoácidos:
- Cada ácido tiene su base conjugada y viceversa. Por ello se determina Ka,
cte de disociación del ácido en el punto en el que se alcanza el equilibrio entre
acido y base.
pKa = -log Ka
pH = -log [H+]
pH = pKa1 pH = pKa2
50% [Ala +] 50% [Ala 0]
50% [Ala 0] 50% [Ala -]
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Si pH = pI, se encuentra la especie con carga neta nula.
Si pH < pI, carga neta +.
Si pH > pI, carga neta -.
- EJEMPLO: Alanina; pI= (pKa1 + pKa2) / 2 = 6,61
- Los aminoácidos ácidos y los básicos presentan una curva con cuatro
regiones verticales y tres mesetas, pues tienen cuatro formas y tres pKa.
- Los aa ácidos tienen dos mesetas (pK) con pH < 7. Las especies presentes
son: [aa +], [aa 0], [aa -], [aa 2-].
- Los aa basicos tienen dos mesetas (pK) con pH > 7. Las especies presentes
son: [aa 2+], [aa +], [aa 0], [aa -].
- Hys presenta una meseta central casi neutra (pH = 6).
6 Solución tampón:
- Se trata de soluciones capaces de captar H+ y OH- neutralizando cambios
de pH.
- Se forma por una alta concentración de ácido débil en sus dos formas
(acido + base conjugada), al 50%.
- Para obtener un tampón con aa debe seleccionarse el aa cuyo pK a sea más
próximo al pH dado para la solución. (Caso ideal: pK a = pH).
A/ LOS PÉPTIDOS:
1 Generalidades:
- Cortas cadenas de aminoácidos unidos linealmente. Algunos, no codificados
por el ADN, suelen derivar de la hidrólisis de proteínas y de otros péptidos, por la
acción de enzimas Proteasas.
- Los dipéptidos se forman por dos aa. Por ejemplo, la insulina es un
dipéptido no derivado de proteína.
- Los oligopéptidos se forman de menos de 20 aa.
- Los polipéptidos son los péptidos más grandes. Incluyen a las proteínas.
- Las uniones entre los aa son uniones covalentes que se producen entre el
grupo carboxilo del primer aa y el grupo amino del siguiente.
- El péptido presenta por lo tanto polaridad: El primer aa presenta solo un
grupo amino libre: el amino terminal a-t. El último aa tiene sin embargo un único
grupo carboxilo libre: el carboxilo terminal c-t.
2 El enlace peptídico:
- Se trata de un enlace covalente y rígido. Al producirse por ataque nucleófilo,
se desprende una molécula de agua.
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NH2 – CH – COOH + NHH – CH – COOH
R’ R’’
NH2 – CH – CO – NH – CH – COOH
R’ R’’
+ H2O
- El CO que queda del grupo COOH presenta un doble enlace. Al unirse con
el grupo amino del siguiente, el carbono reparte el doble enlace con la siguiente
proporción: 60 % C=O; 40 % C=N.
- Este enlace doble entre C y N hace del enlace una unión rígida sin
propiedad de giro, a diferencia de los otros enlaces N – C y C – C.
- Este enlace no es termodinámicamente favorable, y no suele darse
espontáneamente.
- Sin embargo, los valores de esos pK cambian: Cuantos más aa hay de por
medio, más separados se encuentran los grupos ionizables. En el caso de Ala,
pKa1 = 2,35; para AlaAla, pKa1 = 3,12; y en el caso de AlaAlaAla, pKa1 = 3,39.
La fuerza del grupo ácido carboxílico disminuye visiblemente.
- Según aparecen en R más grupos ionizables, se añaden más mesetas a las
dos básicas (a-t y c-t).
AlaAlaLysAla:
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NH2 – CH – CO – NH – CH – CO – NH – CH – CO – NH – CH – COOH
R R R R
NH2
pKa1
pKa2
P +: NH3+ COO-
COO- R NH3+ NH3+
pKa3
P 0: NH2 COO-
COO- R NH3+ NH3+
pKa4
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- En este caso encontramos cuatro pKs y cuatro mesetas en la curva (y no
cinco), pues los dos NH2 de R de Lys se desprotonan de un mismo paso.
- Para el calculo de pI, es decir, el valor de pH para el cual hay 100% de [P
0], debemos utilizar pKa3 y pKa4, sin olvidar que [P +] ha de ser el doble de [P 2-]:
(P +) = 2(P 2-)
pI = (pKa3 + pKa4 – (log 2)) / 2
- Carnosina: Ala_Hys.
- Anserina: Ala_N-3-metil-His. Se encuentra como tampón ac/base en el
músculo.
- Glutatión: Glu_Cys_Gly. Muy abundante en todos los seres vivos. Unión
Glu-Cys especial, mediada por el carboxilo del R de Glu, no por el -carboxilo.
- El grupo tiol puede reaccionar reduciendo otra proteína. En ese caso queda
oxidado y pierde su protón. Dos moléculas de glutatión oxidadas pueden quedar
unidas por un puente disulfuro. Esta forma está presente en eritrocitos: mantiene el
hierro en forma ferrosa evitando que se oxide. Evita también la oxidación en otros
tipos celulares, por ejemplo, evitando enfermedades neurodegenerativas.
R’1 – S – S – R’2
- Muchos Antibióticos son oligopéptidos o derivados de aa con uniones
particulares, como la Penicilina, Gramicidina S o Bacitracina A.
Gramicidina S:
Leu – D-Phe – Pro – Val – Orn
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- Muchos importantes péptidos son Hormonas, como, por ejemplo, la insulina
y el glucagón, de efectos contrarios, secretados en el páncreas, que controlan el
metabolismo de hidratos de carbono y lípidos. También lo son Serotonina,
Dopamina, Estamina o Adrenalina.
6 Los Neuropéptidos:
- Son la mayor familia de péptidos con actividad biológica. Se forma de más
de 100 tipos de peptidos.
- Los neuropéptidos (NP) se encuentran en el sistema nervioso. Pueden ser
neurotransmisores o tener diversas funciones moduladoras como transmisión
peptidérgica.
- Los NP controlan y modulan el apetito, la agresividad, el dolor o la
memoria.
- Endorfinas y Encefalinas se oponen a la transmisión del dolor. Son los
péptidos opioïdes u opiaceos. Presentan receptores en las mbrs de neuronas,
comunes a los de la morfina, produciendo el mismo efecto. (Morfina no es un NP).
Se relacionan con la acupuntura y también con el sistema inmune.
- Las encefalinas son oligopéptidos: Tyr Gly Phe Leu; Tyr Gly Phe Met.
- Las endorfinas presentan mayores pesos moleculares.
- Muchos importantes neuropéptidos son hormonas secretadas en el eje
Hipotálamo-Hipófisis. Reciben el nombre de Factores de Liberación y controlan
toda la producción endocrina de nuestro cuerpo, como GnRH, hormona liberadora
de gonadotropinas, que controla los ciclos sexuales.
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II/ Introducción a las Proteínas:
- Si por una mutación cambia o desaparece un aa, la prot puede perder sus
propiedades naturales. Algunas posiciones de aa se presentan invariables a lo
largo de la evolución.
2 Niveles estructurales:
- Las proteínas presentan distintos niveles estructurales. El tipo de estructura
depende en gran medida de su tamaño.
- Estructura primaria: Secuencia linear de aa, de n-t a c-t. Sirve para predecir
estructuras superiores.
- Estructura secundaria: Ángulo y disposición de los aa respecto a los aa
colindantes. Algunas estructuras, como hélice o laminar, se repiten
frecuentemente en distintas proteínas.
- Estructura terciaria: Plegamiento total en el espacio del conjunto de aa,
generalmente de aspecto globular. No todas las proteínas presentan este tipo de
estructura, descubierta con Rayos X.
- Estructura cuaternaria: Asociación de varios polipéptidos proteicos en un
polímero. Solo en algunos casos. Por ejemplo, homodímeros o heterodímeros.
- Cada nivel estructural es determinante sobre el siguiente.
- Se habla de Proteínas Oligoméricas cuando estas forman un polímero por
enlaces de fuerza débil, como los puentes disulfuro.
- Las proteínas de estructura secundaria también son llamadas Proteínas
Fibrosas. Son estructurales de los tejidos y poco solubles en agua. Presentan
diagramas sencillos de Rayos X.
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- Las proteínas de estructuras terciaria o cuaternaria también son llamadas
Proteínas Globulares. Son hidrosolubles pues al plegarse sobre sí mismas pueden
presentar en superficie sus regiones más hidrofílicas.
- Las Estructuras Supersecundarias son secuencias de estructuras secundarias
que se repiten frecuentemente en proteínas globulares formando dominios
estructurales localizados. Por ejemplo, laminar; hélice; laminar…, o bien,
laminar; codo; laminar; codo…
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- Las cadenas pueden asociarse de forma paralela o antiparalela, siendo la
antiparalela la más estable pues presenta los átomos de N y C que han de unirse,
más cerca uno del otro.
Paralelo: R H O R
– N – CH – C – N – CH – C – N – CH – C –
H O R H O
O R H O R H
– C – N – CH – C – N – CH – C – N – CH – C – N –
H O R H O
Antiparalelo: R H O R
– N – CH – C – N – CH – C – N – CH – C –
H O R H O
O H R O H
– C – CH – N – C – CH – N – C – CH – N –
R O H R
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CH2
Pro O Gly
CH2 CH – C – N – CH2
H
CH2 – N C=O
C=O H–N
CH CH
R1 R2
B/ Proteínas Fibrosas:
1 Las Queratinas:
- Proteína fibrosa insoluble de secuencias muy repetidas de hélice, unidas
en estructuras superiores.
- Tres hélices unidas longitudinalmente forman una protofibrilla. Varias de
estas últimas se unen en microfibrillas, varias de las cuales forman las
macrofibrillas.
- Las macrofibrillas de distintos tipos de Queratinas se encuentran sobre todo
en las uñas y en el pelo.
- Los enlaces laterales entre las hélices es mediado por puentes disulfuro
resultantes de la oxidación del tiol de Cys. Es el motivo por el que el pelo quemado
huele a sulfuro.
- Cada tipo de Queratina tiene distinta proporción de Cys.
- Cuanto más Cys presente, más puentes se forman y más rígida y quebradiza
será la fibra (%Cys (UÑAS, PEZUÑAS) >22).
- Cuanto menos Cys presente, más flexible será la fibra (%Cys (PIEL, LANA, PELO) =
10).
2 El Colágeno:
- Proteína fibrosa insoluble de secuencias muy repetidas de Hélices de
Colágeno, unidas en estructuras superiores.
- Es una estructura también muy frecuente en tegumentos, ligamentos y
tendones en todos los animales.
- Se forma principalmente de:
33% Gly
13% Pro
4-OH-Pro (Hidroxiprolina, Hyp)
Lys
5-OH-Lys (Hyl)
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- Hyp y Hyl derivan de Pro y Lys respectivamente durante la maduración de la
proteína. Requiere la acción de Peroxidasas, y de la presencia de ácido ascórbico
y vitamina C.
- Su plegamiento secundario forma una Hélice de Colágeno, levógira (hacia
la izquierda) debido al giro de Pro facilitado por Gly, y abierta dejando los R hacia
el exterior.
- Existen 12 tipos de Hélice de Colágeno conocidas. En algunos también se
encuentra Cys.
- El Tropocolágeno es la unidad fundamental de las Fibras de Colágeno. Se
trata de la unión longitudinal de tres Hélices de Colágeno, generalmente del mismo
tipo, que se retuercen una sobre las otras formando un cable firme y resistente.
- La estabilidad del Tropocolágeno depende de las fuerzas de WW y de los
puentes de hidrógeno que se forman entra Hyp y Pro próximas.
- Algunas Hexosas e Hidratos de Carbono se unen a Hyl de Tropocolágeno,
por medio de puentes de H, estabilizando la estructura.
- Los Tropocolágenos se asocian entre sí formando estructuras superiores. Se
asocian unos con otros de manera ordenada, en estructura cabeza – cola.
- Esta estructura se estabiliza por la formación de enlaces covalentes entre Lys.
Estos enlaces muy firmes mantienen y dan resistencia a nuestros cuerpos.
- Con el tiempo van aumentando las uniones covalentes, haciendo el colágeno
más rígido y quebradizo, y menos elástico.
- Desaminación oxidativa: Reacción mediada por la enzima Lisina Oxidasa
del grupo amino de R de Lys:
Lys R1 – NH – CH – CO – R2
(CH2)3
N
CH
(CH2)3
Hyl R1 – NH – CH – CO – R2
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- Finalmente aparecen las estructuras superiores, que se forman directamente
en su lugar definitivo.
- Proteína poco nutritiva por su alta concentración en Gly e incompleta su
poca variedad de aa.
- Patología genética: Ausencia de Pteropéptidos. Animal no se puede tener en
pie.
- Otras patologías: Artritis, Cirrosis hepática.
1Generalidades:
- Solo algunas proteínas presentan estructura terciaria y/o cuaternaria. Se
denominan Proteínas Globulares.
- Estas proteínas son solubles en disolventes polares. Se pueden encontrar en
el interior Car y en la MEC.
- Muchas son de muy gran tamaño. Fueron fáciles de descubrir por ello.
- Los R hidrofóbicos suelen encontrarse escondidos en el interior de la
estructura globular de la proteína, exponiéndose las regiones hidrofílicas hacia el
exterior.
- La estructura supersecundaria es determinante en la estructura globular.
- Algunas de estas proteínas presentan hasta 80% de dominios hélice y
laminar, al igual que Codos. La Albumina, por ejemplo, se forma básicamente
de esas tres estructuras secundarias.
- Los Dominios Globulares son unidades muy señaladas de plegamiento,
como subconjuntos morfológicos dentro de la proteína globular.
- Algunos de estos dominios están relacionados con Dominios Funcionales,
cuando presentan actividad catalítica.
- Los Centros Activos son dominios estructurales y funcionales que son
activados o desactivados por medio de cambios conformacionales.
- Las proteínas que cumplen varias funciones suelen tener varios dominios
estructurales y varios centros activos. En este caso varias conformaciones pueden se
funcionales.
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- Pueden formarse puentes de hidrógeno intracatenarios, entre átomos
electronegativos: – O – H – O – u – O – H – N –. Son enlaces débiles que
estabilizan el plegamiento.
- También pueden formarse, entre dos Cys, puentes disulfuro.
- Una proteína puede plegarse de múltiples formas distintas. Influye tanto la
estructura primaria como los posibles cambios conformacionales.
- En concreto una proteína de sólo 100 aa tendría 3 100 posibilidades de
plegamiento. Tarda 10-13 segundos en probar una posibilidad. Por lo tanto:
- Estos datos aclaran que una proteína no puede probar todas las
conformaciones posibles, y que debe plegarse rápida y definitivamente.
- Este plegamiento controlado y directo recibe el nombre de estructura nativa.
- Las Chaperoninas son proteínas que intervienen en el plegamiento,
ejerciendo como molde y acelerando el proceso.
- Un pequeño cambio en el plegamiento de la proteína globular es tan
importante como un cambio en su estructura primaria. El paso de PrPC a PrPSc, por
ejemplo, depende de un pequeño cambio conformacional en un dominio
localizado.
- Se puede hacer una predicción grosera del plegamiento de una proteína a
partir de su estructura primaria, por medio de la estructura supersecundaria.
EJEMPLO:
Arg Arg Arg Arg Ala Val Lys Ala Val Ser Pro Gly Val Pro Gly Gly Ala Ala Gly
? h ol Codo h ol
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Aumento de fuerza iónica (FI).
Utilizando agentes desnaturalizantes, como lejía o detergentes.
- Algunas proteínas resisten los cambios de temperatura, pH y FI
- Mediante cambios de pH o utilización de algunos agentes desnaturalizantes,
la desnaturalización de las proteínas es reversible.
- En el caso de detergentes, como SDS, la región polar se introduce en la
proteína globular, quedando las cabezas hacia el exterior. Esto modifica las
fuerzas de WW.
- La desnaturalización se puso de manifiesto gracias a la Ribonucleasa. El
plegamiento de esta proteína es estabilizado por puentes disulfuro entre Met. Por
acción de alcohol y urea los enlaces se rompen. Posteriormente, en presencia de
O2, se forman nuevos enlaces distintos a los de la estructura nativa, quedando la
proteína inactiva. Ambos cambios son reversibles.
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III/ Técnicas de purificación y análisis de proteínas:
A/ Preparación de muestras:
1 Homogeneización:
- Previo al estudio de una proteína se debe localizar en el organismo que la
sintetiza. Lograremos purificarla conociendo sus propiedades biológicas, químicas
y físicas.
- Una vez localizadas las células se procede a la homogeneización. Una vez
extraídas se procede a su ruptura. Se pueden utilizar diversas técnicas como la
batidora, ultrasonidos o el choque osmótico.
- Para evitar la desnaturalización de las proteínas, se utiliza una solución
tampón, con baja temperatura y fuerza iónica.
- El tejido queda triturado, y sus componentes homogeneizados.
B/ La centrifugación:
1 Generalidades:
- La técnica se utiliza para separar los componentes de una muestra en
función de su Coeficiente de Sedimentación S (Unidad Svedberg), el cual depende
del peso y la forma de cada partícula.
- Para ello, la Centrifugadora es una máquina que somete las muestras a una
fuerza centrífuga, que depende de la gravedad y sobre todo de las revoluciones
por minuto.
- Las Ultracentrífugas son las centrifugadoras más fuertes.
- Los tubos con las muestras se colocan en el Rotor de la centrifugadora.
Existen varios tipos de Rotor en función de su inclinación, y de si esta es o no
variable.
- El ángulo facilita y hace más efectiva la centrifugación. Si es muy inclinado
el tubo puede derramarse.
- El tiempo al que se somete la muestra a fuerzas centrífugas también es
responsable de la situación final de los componentes.
2 La Centrifugación Diferencial:
- Permite separar los componentes de la muestra, realizando una
centrifugación fraccionada y aplicando una fuerza cada vez superior.
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- En función de la proteína que deseamos analizar elegimos uno u otro
precipitado.
- Si deseamos estudiar la fracción soluble de la muestra podemos centrifugar
directamente a 100 000 g.
MUESTRA HOMOGENEIZADA
Centrifugación a 100 g
Precipitado SOBRENADANTE
Células no trituradas
Centrifugado a 4 000 g
Precipitado SOBRENADANTE
Núcleos, Cloroplastos
Centrifugado a 15 000 g
Precipitado SOBRENADANTE
Mitocóndrias
Centrifugado a 30 000 g
Precipitado SOBRENADANTE
Lisosomas
Centrifugado a 100 000 g
Precipitado SOBRENADANTE
Microsomas Fracción Soluble
Sinaptosomas
Ribosomas
4 Ultracentrifugación analítica:
- Se utiliza para el análisis de muestras, no su purificación. Es una técnica
muy cara de realizar, pues se precisa de una centrifugadora especial.
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- Sirve para obtener datos como, por ejemplo, el peso molecular (PM) de una
proteína, o la pureza de una muestra determinada.
- Se debe trabajar con muestras de proteínas ya purificadas.
- Se emplea un haz de luz para medir la Absorbancia de rayos UV (AUV) y/o
el índice de refracción del medio (n), para deducir el PM de la proteína.
3 Dialisis:
- Esta técnica suele emplearse para separar las proteínas purificadas de las
sales que se encuentran en solución contaminando la muestra.
- Se emplea una Bolsa de Dialisis con microporos. En función de su tamaño
dejarán pasar a unas moléculas, y a otras no.
- Se introduce la muestra en una bolsa, y la bolsa en un recipiente con mucho
agua distilada. La sal sale de la bolsa y el agua entra, hasta que las
concentraciones osmolares se igualan.
- Se puede cambiar la bolsa a un nuevo recipiente con agua pura. Repitiendo
la técnica se elimina una cantidad considerable de sales.
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- Se puede utilizar, con el mismo fin, la ultrafiltración, sistema de filtración con
poros y embudo.
4 Liofilización:
- En una muestra poco concentrada, elimina el agua sin dañar las proteinas.
Hay varios métodos.
- Realizar una congelación rápida de la muestra seguida de Sublimación al
vacío, o Evaporación al vacío. Obtenemos polvo proteico.
- Se puede realizar en concentración con geles, utilizando una bolsa de
Diálisis en un recipiente con gel que absorben la humedad.
D/ Cromatografía:
1 Generalidades:
- Técnica de purificación y analítica. Puede separa los componentes en
función de distintos criterios:
De Reparto: de su solubilidad.
De Adsorción: de su polaridad. >DE INTERCAMBIO IONICO: de su carga.
De Permeabilidad: de su tamaño.
De Afinidad: de su especificidad biológica.
2 Cromatografía de Reparto:
- Esta técnica suele utilizarse con aa. Se utilizan técnicas de tinción para
poder visualizar su situación durante el experimento.
- Se puede realizar en placa fina o en columna. Se utilizan dos disolventes no
miscibles:
La fase estacionaria está inmóvil en la placa o columna.
La fase móvil se desplaza sobre la estacionaria.
- En función de su afinidad por cada una de las fases, los componentes de la
muestra quedarán anclados en la fase estacionaria, o de desplazarán con la fase
móvil.
- La separación de los componentes depende de su afinidad por una u otra
fase, y no de su tamaño.
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- Con un pH inicial extremo, todas las proteínas cargadas quedan retenidas.
Según hacemos variar el pH, las proteínas son liberadas ordenadamente, cuando
su pI = pH del medio.
- En lugar de variar el pH, se puede hacer variar la [Sal] aumentando la
fuerza iónica de la columna.
EJERCICIO: Realizamos un análisis de una muestra con tres proteínas idénticas, que
sólo se diferencian por un aminoácido: A (Glu), B (Val) y C (Lys). Por la técnica de
Cromatografía de Intercambio Aniónico, obtenemos tres fracciones a: pH = 4,5; pH
= 7; y pH = 7,5.
¿Cuál es el pI de cada una de las proteínas?
4 Cromatografía de Permeabilidad:
- Separa los componentes de una muestra en función de su tamaño o su
masa. Permite obtener el PM de las proteínas.
- Se utilizan columnas con polímeros de resinas; algunos con textura de gel,
como los polímeros de glucosa. Se trata de partículas independientes formadas por
fibras poliméricas.
- Estas partículas se hinchan en contacto con agua o con la fase móvil, y
pueden absorber compuestos de la muestra en función de su tamaño.
- Las proteínas que pueden atravesar la resina salen de la columna por orden
de peso molecular, de mayor a menor: No es una filtración sino una cromatografía.
- Se pueden recuperar por separado con un colector de fracciones.
- En función del tamaño del poro de la resina, aquellas proteínas que son
demasiado grandes quedan retenidas en la superficie de la columna. En este
sentido, se asemeja a una filtración.
- Debemos realizar un calibrado de la columna. Se realiza una recta de
calibrado de la siguiente relación:
log PM / Ve
- Tenemos:
V0: Volumen de exclusión, o de los intersticios entre partículas de gel.
Vi: Volumen interno de las partículas de gel.
Vt: Volumen total del lecho cromatográfico.
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Vt = V0 + Vi
KD = VACCESIBLE / Vi
Ve = V0 + KD.Vi
PM 12 400 25 000 44 000 68 000 240 000 330 000 670 000
Ve 206 184 165 153 115 106 90
SOLUCIÓN:
PM(- SDS) = 140 000 g.mol-1
PM(+ SDS) = 74 000 g.mol-1
La proteína es de estructura cuaternaria: Se trata de un homodímero. SDS desnaturaliza y rompe el
polímero.
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EJERCICIO: Se realiza una Cromatografía de Permeabilidad de una proteína,
después de la misma proteína en presencia de SDS, y finalmente en presencia de
SDS y Metanol.
Calculamos los PM de los resultados obtenidos: Un pico en el primer caso, un pico
en el segundo y dos picos en el tercero.
PM
(g.mol-1)
- SDS 200 000
- Metanol
+ SDS 50 000
- Metanol
+SDS 35 000
+Metanol 15 000
SOLUCIÓN:
La proteína es un homotetrámero de PM = 200.000. SDS lo rompe en cuatro subunidades de PM =
50.000. Cada subunidad es un heterodímero. metanol rompe las dos subunidades básicas de PM
= 35.000 y PM = 15.000.
5 Cromatografía de Afinidad:
- Es una técnica muy compleja y selectiva. Permite aislar totalmente una
proteína enzima en un único paso: rendimiento muy alto.
- Separa las proteínas por su especificidad biológica, gracias a la formación
del complejo Enzima – Sustrato, responsable de la formación de un Producto:
S+E ES E+P
- Se realiza en una columna con una resina específica, que debe ser
fabricada para el estudio de la proteína en cuestión. La resina incluye un sustrato
por el que la proteína enzima estudiada presenta afinidad.
- Durante la cromatografía se forma el complejo ES. Los restos eluyen y la
proteína queda fijada en la columna.
D/ Electroforesis:
1 Generalidades:
- Técnica de purificación y analítica. El criterio empleado es la carga de las
partículas de la muestra.
- La movilidad de las partículas es proporcional a su carga y a la resistencia
que opone la fase estacionaria.
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- Se crea sobre un gel hidratado un campo electromagnético, gracias a dos
polos: - Cátodo; + Ánodo.
- Las proteínas, en función de su carga, son arrastradas hacia uno u otro
polo.
2 Electroforesis de zona:
- Se utiliza para purificar proteínas. Suele realizarse sobre un gel de Agar o
Poliacrilamida (antes se usaba papel) colocado sobre un vidrio refrigerado. La
muestra se coloca en una pequeña zona central.
- En cada extremo del gel se coloca una cubeta con una solución tampón: una
con el ánodo y otra con el cátodo. El gel y la solución tampón se conectan con
papeles.
- En función de su carga + o -, la partícula presenta movilidad negativa (hacia
el cátodo) o positiva (hacia el ánodo) respectivamente.
- El peso y tamaño de las partículas modifica la velocidad a la que se
desplazan sobre la fase estacionaria.
- En función del valor absoluto de su carga, la proteína alcanzará movilidad
nula en el punto en el que encuentra su pI. Los cambios de pH del gel modifican la
movilidad.
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EJERCICIO: Trabajamos con Proteína X, PM = 140.000 g.mol-1: Realizamos
primero la técnica de Electroforesis PAGE-SDS, y posteriormente PAGE- SDS con
metanol. Obtenemos los resultados siguientes. ¿Qué podemos deducir?
67.000
43.000
30.000
20.000
g.mol-1
SOLUCIÓN:
Con SDS obtenemos una única banda alrededor de PM = 67.000 g.mol -1. La proteína es un
homodímero: 70.000 x 2 = 140.000 g.mol-1.
Con SDS y metanol obtenemos sin embargo dos bandas distintas, a 30.000 y 40.000
g.mol-1 aproximadamente. Cada monómero de la estructura cuaternaria está formado a su vez por
dos heterodímeros.
SOLUCIÓN:
Se trata sin duda de una proteína de estructura cuaternaria; un heteropolímero. Sin
embargo hay varias opciones: Dos subunidades de 100.000 g.mol-1 y dos de 50.000 g.mol-1, ó;
Una subunidad de 100.000 g.mol-1 y cuatro de 50.000 g.mol-1.
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D/ Otros métodos:
EJEMPLO; Ribonucleasa:
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IV/ Las Proteínas:
1Por su composición:
- Proteínas simples: Sólo se forman de aminoácidos.
- Proteínas conjugadas: Se forman de aa y grupos prostéticos unidos
fuertemente a la estructura primaria de la proteína.
- Las apoproteínas son proteínas conjugadas. Por ejemplo, la Mioglobina y la
Hemoglobina.
2 Por su estructura:
- Proteínas Fibrosas: Con estructura limitada primaria o secundaria. Por
ejemplo, Queratinas y Colagenos.
- Proteínas globulares: Plegadas en estructuras terciarias o cuaternarias.
3 Por su función:
- Las funciones de las proteínas son muy diversas.
- Reserva: Almacenan sustancias. Por ejemplo, la mioglobina almacena O2.
- Transporte: Transportan sustancias, generalmente sustancias no miscibles
con agua a través del torrente sanguíneo. Por ejemplo, la hemoglobina transporta
O2.
- Catalítica: Las proteínas que catalizan reacciones de sustancias, algunas
espontáneas acelerándolas, y otras permitiendo que se produzcan, reciben el
nombre de Enzimas. Son siempre globulares.
- Contráctil: Por ejemplo Actina, Miosina, Tubulina.
- Defensora o Inmune: Anticuerpos.
- Tóxica: Toxinas, como Votox o Glicina.
- Señales: Hormonas.
- Receptores: Proteínas transmembrana, transductoras de señales.
- Estructurales: Colágeno, Actina, Tubulina, Querantina, Agrecanes…
- Transportadora: Canales, Transportadores y Bombas iónicas
transmembrana.
- Anticongelantes, de Unión Celular, …
1 Generalidades:
- Todas las proteínas presentan una estrecha relación entre su estructura y su
función. Esta relación es patente por la afinidad que todas las proteínas
presentan por ciertos sustratos en un dominio de unión (secuencia concreta de aa):
Se trata de los Ligandos:
27
Proteína + Ligando PL
KA = [PL] / [P].[L]
= KA .[L] / ( 1 + KA .[L] )
- En el caso de una proteína dímero, con dos lugares de unión para ligandos:
P+L PL + L PL2
28
KA
/ [L]
n = 2 (dímero)
n: nº de corte, correspondiente al nº
de L que puede unir la proteína.
n
= n.KA.[L] / ( 1 + KA .[L] )
= n.KA.[L]C / ( 1 + KA .[L]C )
- C es el coeficiente de Hill:
C = 1; No hay interacción.
C > 1; Hay interacción positiva.
C < 1; Hay interacción negativa.
- En caso de interacción positiva, se favorece la unión del nuevo ligando. Es el
caso más frecuente de interacción:
nu
n
29
[L] / [L]
n
C/ Las Apoproteínas:
O2
Desoximioglobina Oximioglobina
Mb MbO2
30
2 La Mioglobina:
- La Mioglobina es una proteína globular monomérica, formada por una
cadena con 8 tramos hélice. No hay interacción.
- Su función es retener y reservar el O2 del cuerpo. Tiene un lugar de unión en
su único grupo Hemo.
= KA.[O2] / ( 1 + KA .[O2] )
= pO2 / ( KD + pO2 )
KD = p50
3 La Hemoglobina:
- Se trata de una proteína globular de estructura cuaternaria. En concreto se
trata de un homotetrámero (n = 4).
- Cada monómero que lo forma es similar a una proteína de Mioglobina, y
posee un grupo Hemo. Por lo tanto en total hay 4 grupos Hemo, y cuatro lugares
de unión al O2, uno por subunidad.
- Las subunidades presentan interacción positiva, es decir, C > 1 (C = 2,8).
- Para el caso de la Hb, p50 = 26 Torr. Es mucho mayor que en el caso de la
Mioglobina, por lo que presenta una afinidad mucho menor.
- Gracias a estas propiedades, la Hb se caracteriza por liberar O2 cuando
hay poca presencia en el medio, y absorberlo en tejidos donde hay una alta
concentración, generalmente los pulmones.
31
- Existen varios tipos de Hb, en función de los tipos de Subunidades. Estas
subunidades presentan ligeras diferencias, pero guardando siempre similitud a la
Mb. Hb se encuentra en los Eritrocitos.
Hb A: 2 + 2 (Normal)
Hb F: 2 + 2 (Sangre materna – Fetal)
Hb A2: 2 + 2 (Patológica en altas concentraciones)
- La diferencia entre los tipos de subunidades depende de cambios de aa en
posiciones no críticas. No implican grandes cambios. Hay 9 posiciones invariables
entre todos los seres vivos con Mb y Hb.
- Al separar las subunidades, su afinidad por el sustrato aumenta, igualando
la de la Mb. Pierde sin embargo la capacidad transportadora.
- La Hb es sintetizada en los reticulocitos del tejido hematopoyético, y es
liberada a la sangre en los Eritrocitos.
- Es una proteína imprescindible en organismos de gran tamaño, pues es
capaz de absorber el O2 de los pulmones, pero también de liberarlo en los tejidos
alejados que necesitan respirar, como músculos o SN.
- Tenemos, en este caso:
= KA.pO2C / ( 1 + KA.pO2C )
nu
32
- Cuanto menor es p50, mayor es la afinidad de la proteína por su ligando.
Al ser inverso a KA, utilizamos KD para realizar el cálculo;
= pO2C / ( KD + pO2C )
KD = p50C
SOLUCIÓN:
Para Mb: PULMON = 99 % TEJIDOS = 95 %
Para Hb sin C: PULMON
= 79 % TEJIDOS = 40 %
Para Hb con C: PULMON
= 98 % TEJIDOS
= 36 %
Mb tiene mayor afinidad pues reserva oxígeno mientras Hb lo transporta hasta lugares donde
escasea. C de Hb aumenta su capacidad de absorber en pulmón y liberar en tejidos.
D/ La Hemoglobina:
1 Cambios conformacionales:
- Como vimos, la Mb sufría un cambio conformacional entre sus estados
MbO2 y Mb. Ocurre algo similar en el caso de Hb.
- Lógicamente, los cambios conformacionales que se producen en Hb al
recibir los primeros átomos de oxígeno modifican la proteína facilitando la entrada
de los siguientes.
- En concreto, el desplazamiento de la Hys proximal del Hemo que ha
recibido el oxígeno se desplaza y tira de la cadena de aa, modificando la
estructura cuaternaria por la rotura de enlaces secundarios.
- La rotura de 8 enlaces iónicos es responsable del paso de la forma tensa T a
la relajada R, los dos únicos estados posibles.
33
FORMA T:
ENLACES
que intervienen en el
cambio conformacional
1 2
+ +
1 + + 2
+ +
O2 O2
FORMA R:
at ct
- +
1 2
+ -
+ ct at +
ct ct
+ +
+ +
1 2
+ +
- -
+ +
34
- H+ son considerados Inhibidores Alostéricos de la proteína. Se acumulan
primero los enlaces Hys – Asp internos de la subunidades (en dibujo, enlaces en
forma de asa), cuando se sobrepasa el pI de Hys y queda protonada. Reforzando
estos enlaces refuerzan la forma T.
- Si sigue aumentando el pH, H+ se acumula en los enlaces at – ct, protonando
los grupos amino y reforzando los enlaces. Esto estabiliza aún más la forma T,
dificultando la entrada de oxígeno.
R – NH – COO-
4 El 2,3-Bifosfoglicerol:
- 2,3-BPG es sintetizado a partir de precursores en el interior de eritrocitos.
- Es un inhibidor alostérico de Hb, que actúa como intermediario durante la
glicólisis, o formación de Glucógeno a partir de Glucosa.
MUTASA
(Retrocontrol)
2,3-BPG
5 Inhibidores No Alostérico:
- El Monóxido de Carbono es un inhibidor no alostérico de la Hb, pues se une
al mismo dominio de unión que el oxígeno, bloqueándolo. Se une al Fe con 200
veces más afinidad que O2.
35
- Cuando CO se une a Fe lo hace definitivamente, pero aumenta también la
afinidad de los otros grupos Hemo, como lo haría el propio O 2.
- Cuando se el primer CO, estabiliza la forma R de la proteína. Cuando hay 4
grupos CO unidos, la proteína queda inutilizable.
- En condiciones normales, una persona no fumadora presenta 0,3 % de Hb
con CO.
- El Óxido Nítrico NO es otro inhibidor no alostérico de Hb se une a Fe, como
el oxígeno, pero en la forma T.
- Cuando se une NO, unido a su vez a Glutatión, actúa como vasodilatador,
facilitando la entrada del oxígeno a los tejidos, y la salida del dióxido de carbono.
7 Patologías de la Hemoglobina:
- Suelen derivar de la síntesis anómala de los monómeros.
- Anemia Falciforme: Se produce en la subunidad una mutación puntual Glu
> Val de una posición externa en forma T. Este cambio facilita la unión de Hb en
fibras. Los eritrocitos se deforman debido a estas fibras tornando falciformes y
perdiendo elasticidad, y se atascan en los capilares. Evitan la proliferación del
parásito de la Malaria.
- Talasemia: talasemia o talasemia, malformaciones en cadena o
respectivamente, impiden la correcta acción de Hb.
EJERCICIO:
1/ Enumerar las principales diferencias entre Hemoglobina y Mioglobina.
2/ ¿Cual es el efecto de los siguientes acontecimientos en la afinidad Hemoglobina
– O2?
1. Disociación de Hemoglobina en subunidades.
2. Aumento de [CO].
3. Aumento de [CO2].
4. Disminución del pH.
5. Cambio de Hys 143 () por Ser.
6. Mutación en Leu 143 ().
3/ ¿Qué Hys son fundamentales en la funcionalidad de la Hemoglobina, y por
qué?
36
SOLUCIÓN:
1/ Función: Hb transporta, menos afinidad, Mb acumula. Subunidades: Hb 4, Mb 1. Hb
con cooperación. Hb proteína alostérica
2/
1. Aumenta.
2. Aumenta.
3. Disminuye.
4. Disminuye.
5. Disminuye.
6. Aumenta.
3/ Hys proximal sujeta Hemo. Hys distal impide otras uniones en Fe como H 2O. Otras Hys
median uniones e interacciones entre subunidades y con los inhibidores.
37
IV/ Los Enzimas:
A/ Generalidades en Encimología:
1Introducción:
- Todos los pasos de todos los procesos metabólicos están catalizados por
enzimas, y la capacidad catalítica se considera, junto con la capacidad de
autorreplicación, una de las características fundamentales de la vida.
- Existen dos métodos generales mediante los cuales puede acelerarse la
velocidad de una reacción química. Uno de ellos es la elevación de la
temperatura; el otro consiste en utilizar un catalizador.
- El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio
activándolos, produciendo un estado de transición de menor energía que en la
reacción no catalizada. Una vez formados los productos el catalizador queda
libre, y puede ser de nuevo utilizado.
- La especificidad de las enzimas es muy importante para los seres vivos.
Cada célula contiene varios cientos de miles de compuestos diferentes, y existen
muchas combinaciones posibles entre las reacciones químicas que estos
compuestos pueden experimentar.
- Las enzimas cuidan de que tengan lugar, de manera específica, aquellas
reacciones que son esenciales e indispensables para que la célula viva.
- Todas las enzimas (salvo Ribosomas) son Proteínas Globulares. Presentan un
dominio de unión 3D de aminoácidos llamado Centro Activo, de conformación
especial para unión y catálisis de un sustrato.
- El centro activo es responsable de la alta especificidad biológica de las
enzimas.
38
5. Isomerasas (reacciones de isomerización).
6. Ligasas (formación de enlaces con consumo de ATP).
3 Los Cimógenos:
- Un Cimógeno es un tipo de enzima que se activa al separarse una parte de
la molécula, bien por acción de otra enzima o por un cambio en el medio en que
se encuentra, por ejemplo, un aumento de la acidez.
- Muchos cimógenos son enzimas proteolíticas o Proteasas, que se sintetizan,
almacenan y liberan en una forma molecular inerte (sin actividad). Así se evita la
digestión de la propia enzima y de proteínas circundantes.
- En el páncreas, además de la secreción de insulina por los islotes de
Langerhans, se producen varias secreciones digestivas, que suelen ser cimógenos.
- Las enzimas pancreáticas incluyen: -amilasa, Tripsina, Quimotripsina,
Elastasa, Carboxipeptidasas, Aminopeptidasas, Lipasas y Nucleasas.
- Las enzimas pancreáticas son cimógenos que requieren pH alcalino al ser
sintetizadas. Por ello el páncreas secreta líquido acuoso bicarbonatado de elevado
pH.
- La presencia de ácidos grasos y péptidos en el quimo intestinal estimula la
secreción pancreática de enzimas.
- Al llegar al duodeno, el alto pH del medio activa estos cimógenos que
comienzan a romper péptidos, ácidos nucleicos y lípidos, de forma que puedan ser
absorbidos por el tejido.
- Tripsina es un cimógeno que se activa al llegar al duodeno, debido a su
bajo pH, cambiando su conformación. La presencia de Tripsina permite la
transformación de los otros cimógenos del duodeno.
Tripsinógeno Tripsina
Proelastasa Elastasa
Quimotripsinógeno Quimotripsina
Procarboxipeptidasa Carboxipeptidasa
4 Las proteasas:
- Las proteasas catalizan la ruptura de proteínas en péptidos.
- Se dividen en cuatro grupos: Serinproteasas, Cisteínproteasas,
Aspartilproteasas y metaloproteasas. Sus centros activos incluyen, respectivamente,
Ser, Cys, Asp y átomo metálico.
- Las Serinproteasas son una gran familia de enzimas, generalmente
cimógenos.
39
- Incluyen, entre otras, Tripsina, Quimotripsina y Elastasa, del duodeno,
Pepsina del estómago, y otras proteasas del torrente sanguíneo, responsables de la
coagulación sanguínea, como la Trombina.
DADOR H
ángulo
ACEPTOR
40
EJEMPLO:
4 Los Cofactores:
- Se trata de factores que afectan a las interacciones ApoE – S.
- Son, en concreto, grupos cuya unión a la proteína es necesaria para su
activación catalítica, provocando cambios conformacionales. Pueden ser iones
metálicos, o moléculas orgánicas no proteicas.
- Las Apoenzimas son la parte proteica de algunas enzimas que necesitan
estar unidas a un cofactor para configurar correctamente su centro activo.
41
- Las coenzimas suelen ser modificadas durante la reacción, pero recuperan
su estado inicial al terminar esta.
S + E ES E + P
42
- Dado que V decae por diversos motivos, en cinética encimática se trabaja
con V0.
V
(Abs S)
V0
t
- V0 varía cuando lo hace la concentración de S inicial:
Si [S] inicial es bajo, V0 es bajo.
Cuanto mayor sea [S] mayor será también V0.
En función de la cantidad de E, se alcanza el estado de saturación cuando
[S] es muy elevado: Se alcanza entonces V0 MAX.
V0 MAX SATURACIÓN
V0
[S]INICIAL
3 Ecuación de velocidad de Michaelis – Mentel:
- Se define KM (mol-1; M), constante de Michaelis – Mentel, como la [S] para la
cual V0 = VMAX/2.
- KM depende del pH y la temperatura del medio, pero no de [E]. VMAX
depende de los tres factores.
- KM nos da una idea inversa de la afinidad de la E por su S, es decir, a
mayor KM menor afinidad.
43
V0
VMAX = a
VMAX
2
KM = b [S]
- De aquí, substituyendo (a) por VMAX, (b) por KM, y (x) por [S], obtenemos la
ecuación de Michaelis – Mentel:
1 / V0
KM / VMAX
1 / VMAX
1 / [S]
44
5 Deducción de la ecuación por el mecanismo de la reacción:
- El mecanismo simple del modo de acción de una enzima presenta tres
reacciones parciales, cada una con su constante cinética:
K1 K2
S + E ES E + P
K-1
KM = K-1 + K2 / K1
V0 = K2.[ES]
VMAX = K2.[E]INICIAL
45
KEQ + [S] = K2.[E]INICIAL.[S] / V0
KS = K-1 / K1
KS = [E].[S] / [ES]
46
D/ La Inhibición Encimática:
1Generalidades:
- La actividad encimática suele verse inhibida por diversas sustancias, por
procesos específicos.
- Estos procesos pueden ayudarnos a obtener información sobre el mecanismo
de las reacciones catalizadas, los grupos funcionales del centro activo de la
enzima, o los mecanismos de acción de las drogas.
- Ante un inhibidor, se produce la reducción de la actividad encimática.
- Las inhibiciones pueden ser de varios tipos, los principales son:
2 Inhibición Irreversible:
- E e I se unen covalentemente, o de modo muy fuerte, de tal manera que no
existe disociación.
- Estos inhibidores se utilizan como arma química, o en insecticidas para los
cultivos.
- Por ejemplo, Acetilcolinesterasa hidroliza Acetilcolina en uniones neuro-
musculares después de la sinapsis. Sin su inhibición, la excitación muscular
permanecería constante.
E + S ES E + P
+
I
Ki = [E].[I] / [EI]
47
- Al aumentar Ki, disminuye la afinidad de E por I.
- Basándonos en la recta de Lineweaver – Burk, al aumentar [I], aumenta la
pendiente de la recta KM / VMAX, pero VMAX se mantiene constante:
SIN I
CON I
1 / VMAX
- 1 / KM
- 1 / KM’
E + S ES E + P
+ +
I I
Ki Ki
EI + S ESI
48
SIN I
CON I
1 / VMAX’
1 / VMAX
- 1 / KM
E + S ES E + P
+
I
Ki
ESI
49
SIN I
CON I
50
- Las enzimas inducibles sólo aparecen cuando son necesarias para la célula.
Después se degradan.
- En procariontes los operones (conjuntos de proteínas) ven inducida su
síntesis de forma conjunta.
Regulación de su actividad encimática: Es el modo más rápido de control
sobre las rutas metabólicas. Se puede producir por medio de distintos
mecanismos:
1. Alosterismo.
2. Equilibrios polimerización/despolimerización.
3. Modificación covalente reversible.
4. Activación proteolítica, o modificación covalente irreversible (caracteristica
de proteasas; E digestivas y de coagulación sanguínea).
2 Regulación Alostérica:
- Se produce por medio de la unión de un efector alostérico a una enzima que
afecta al metabolismo, provocando un cambio conformacional.
- El efector puede ser un activador, en cuyo caso aumenta la afinidad de E
por su S. También puede ser un inhibidor, haciendo disminuir la afinidad de E por
su S.
- Mientras la cinética ecimática normal tiene forma hiperbólica de Michaelis –
Mentel, en el caso de una encima con cinética alostérica tiene forma sinusoidal:
V0
[L]
nu
[S]
51
- La Retroinhibición, o Inhibición Feed-Back, es muy frecuente en rutas
metabólicas complejas. El último producto de la ruta inhibe alostéricamente a las
enzimas que catalizan las primeras etapas.
- Por ejemplo, Aspartato Transcarbamilasa tiene subunidades catalíticas con
centros activos, y subunidades reguladoras con dominios de unión para efectores
alostéricos, separadas. ATP es un activador, que favorece la forma relajada del
centro activo. CTP es, sin embargo, un inhibidor que favorece el estado tenso.
2 2 +2
52
F/ Isoenzimas y Agrupaciones de Enzimas:
1 Las Isoenzimas:
- Se trata de las distintas formas que puede presentar una misma forma
encimática.
- Presentan distinta cinética y afinidad, distintos genes que las codifican,
distinta expresión genética en cada tejido, y disitnta presencia en los orgánulos
subcelulares.
- Por ejemplo, Lactato Deshidrogenasa cataliza las transformaciones entre
Piruvato y Lactato, acoplándose la reacción a la hidrólisis de NADH. Presenta 5
isoenzimas, de tipos M y H:
LDH M4 (múculos, hígado): En el músculo cataliza el paso P > L. El
Lactato es el producto final de la degradación de la glucosa en el músculo.
En el hígado cataliza L > P. Se debe a su sensibilidad a la relación
NADH/NAD+, baja en el hígado y alta en el músculo.
LDH M3H (otros)
LDH M2H2 (cerebro, riñón)
LDH MH3 (otros)
LDH H4 (corazón): Calatiza el paso L > P, evitando que el Lactato se
acumule.
- Una misma isoenzima puede catalizar su propia reacción en un sentido u
otro, influida por las condiciones del medio, como por ejemplo, la relación
NADH/NAD+.
- Se puede encontrar en un mismo tejido distintas isoenzimas separadas en
distintos compartimentos. Por ejemplo, las enzimas que catalizan los cambios de
conformación de proteínas y metabolitos para que puedan hacer rutas indirectas
atravesando membranas físicas.
2 Agrupaciones Multienzimáticas:
- Sistemas formados por varias enzimas asociadas, de manera a obtener el
mayor rendimiento energético posible. Hay tres tipos de complejos:
- Los Agregados Multienzimáticos, son varias enzimas asociadas en un único
complejo. Varios intermediarios de secuencias de reacciones cercanas en rutas
metabólicas pueden así permanecer unidas covalentemente.
- Las Enzimas Asociadas a la Membrana celular, si están implicadas en la
misma ruta metabólica suelen encontrarse ordenadas en función de su
participación en la ruta en la membrana.
- Las Enzimas Multifuncionales son enzimas con distintas actividades
enzimáticas en una misma proteína.
- Las agrupaciones multienzimáticas confieren una serie de ventajas:
La unión de un efector puede modificar la actividad catalítica de todo el
complejo.
La agrupación disminuye la difusión de los metabolitos, y el tiempo de
transición, haciendo disminuir el gasto energético de una ruta.
53
V/ Nucleósidos y Nucleótidos:
A/ Introducción:
3 Nomenclatura:
- Nucleósidos:
Utilizamos el prefijo Desoxi- si el azúcar es -2-desoxi-D-Ribosa.
Seguido, el nombre de la BN: -Guan-, -Aden-, -Cit-, -Tim-.
Finalmente, utilizamos el sufijo –osina en purinas, e –idina en pirimidinas.
EJEMPLOS: Guanosina, Desoxiadenosina, Citidina, Desoxitimidina.
- Nucleótidos:
Partimos del nombre del nucleósido.
A continuación se pone el número del Carbono del azúcar que media la
unión (5’, 3’…).
Finalmente se indica el número de grupos fosfato unidos: monofosfato,
Difosfato, Trifosfato.
- Suele emplearse un tipo de nomenclatura por iniciales.
54
EJEMPLOS:
Adenosina-5’-Monofosfato (AMP)
Adenosina-5’-Trifosfato (ATP)
Desoxiguanosina-5’-Monofosfato (dGMP)
B/ Nucleótidos no nucleicos:
- Para ambas reacciones: G0 = -7,3 kCal/mol. Por ello, otras reacciones
metabólicas no espontáneas pueden acoplarse a esta hidrólisis, y utilizarla como
fuente de energía de activación.
55
2 El Coenzima Nicotinamida Adenina Difosfato (NAD+/NADH):
- Se trata de un dinucleótido, con dos ribosas y dos grupos P que median la
unión. Una ribosa está unida a Adenina mientras la otra se une al grupo
Nicotinamida.
- Nicotinamida es la parte vitamínica del coenzima.
- Es un coenzima común a Oxidoreductasas, como por ejemplo, Lactato
Deshydrogenasa (LDH) o Malato Deshydrogenasa (MDH).
- El grupo Nicotinamida puede captar 2e- y 1H+ del Sustrato en su C4,
diferenciándose las formas oxidada y reducida. Es un coenzima fundamental en
rutas de metabolismo Redox:
Reducción
NAD+ + 2H+ + 2e- + S NADH + H+ + P
OX RED
Hidrólisis de aa
Trp Nicotinamida
Reducción
FMN + 2H+ + 2e- FMNH2
OX RED
56
- Es un coenzima propia de Deshidrogenasas Dependientes de Flavina, de las
cadenas respiratorias.
4 El Coenzima A (CoA):
- Es un coenzima que actúa como transportador de grupos Acilo, gracias al
átomo de azufre del extremo Tiol.
- Su estructura es similar al nucleótido ADP, pero formado por Ribosa-3’-
fosfato (en total, 3 grupos P). Unido al P en se encuentra un ácido pantoténico, y
finalmente el grupo -mercaptoetilamina con SH extremo.
- El ácido pantoténico es su parte vitamínica. Este coenzima adquiere un
papel fundamental en el metabolismo.
CH3 – CO – S – CoA
5 Nucleótidos cíclicos:
- Al elevarse su concentración en el citosol celular, AMP cíclico (cAMP) y GMP
cíclico (cGMP) ejercen el papel de segundos mensajeros en la transducción de
señales celulares, implicando cambios metabólicos.
- cAMP y cGMP provienen de ATP y GTP por la acción de las enzimas
Adenilato Ciclasa y Guanilato Ciclasa respectivamente. Se desprende pirofosfato.
La reacción se produce ante la llegada de una señal externa.
ADENILATO CICLASA
ATP cAMP + PPi
GUANILATO CICLASA
GTP cGMP + PPi
57
C/ Los Ácidos Desoxirribonucleicos (DNA):
1Generalidades:
- En 1869 Miesher aisla por primera vez en la historia Ácidos Nucleicos:
cromosomas (DNA) de leucocitos. Logra aislarlos rompiendo las células con
Clorhídrico, rompiendo los núcleos con tratamiento alcalino, y extrayendo el
precipitado: lo llamó Nucleína.
- El Cromosoma es una larga macromolécula filamentosa formada por un alto
número de ácidos desoxirribonucleicos, unidos por enlaces fosfodiester entre
Desoxirribosas (en C5 y C3) y Fosfatos:
5’ 3’
3’ 5’
58
GRUPOS ACEPTORES:
CETO: IMINO:
R
GRUPOS DADORES:
C O R C N H
GRUPOS DADORES:
ENOL: AMINO:
R H
C OH R C N
R H
- Los restos hidrofóbicos de las BN crean en el medio celular Efectos
Hidrofóbicos, por lo que tienden a colocarse espontáneamente en el interior de la
estructura, afectando a la estabilidad del DNA.
- Entre la BN se establecen fuerzas de WW. Al haber un grandísimo número
de BN, estas fuerzas también afectan a la estabilidad del DNA.
- Algunos casos son motivos de inestabilidad, como la repulsión entre grupos
Fosfodiester a pH = 7 (Cargas -). Se encuentran neutralizadas por iones Mg2+
unidas al esqueleto del DNA.
59
estrecho, y uno menor superficial y ancho. 1 vuelta de hélice = 11 BN. Caso de
RNA de doble hélice, o híbridos DNA-RNA.
- Z-DNA presenta grupos P en Zig-Zag. Hélice levógira termodinámicamente
no favorable. Surco mayor convexo, surco menor profundo. 1vuelta de hélice = 12
BN. Se descubrió gracias a un Hexanucleótido formado por C y G:
CGCGCG
GCGCGC
- En Z-DNA, G se dispone SIN (BN y pentosa del mismo lado del enlace), y C
se dispone ANTI (Viceversa).
1 Generalidades:
- Los RNA fueron descubiertos y aislados pr primera vez posteriormente al
descubrimiento de los DNA, por Hoppe – Seyler. Fueron extraídos de levaduras.
Posteriormente de plantas y bacterias.
- En 1914 Feulger utiliza colorantes específicos para RNA y DNA,
comprobando la coexistencia de ambos tipos de moléculas en la mayoría de las
células.
- Se trata de una larga molécula de Ribonucleótidos unidos por enlaces
Fosfodiester en 3’ y 5’. Presenta un esqueleto constante de Ribosas – Fosfato, y una
región variable con BN. La estructura de una hebra es similar a la del DNA.
- Las principales diferencias RNA/DNA son:
60
Ribosas (Impiden la formación de B-RNA) / Desoxirribosas.
Monocatenarias (bicatenarios, Híbridos DNA-RNA) / Doble Hélice.
A-RNA (en caso de bicatenarias e híbridos) / B-DNA, A-DNA, Z-DNA.
Urácilo (U) / Timina (T).
Reactivo / Estable.
- El grupo OH en 2’ de la Ribosa impide la formación de B-RNA: El tipo
estructural B es el más estable. Estos OH promueven la reactividad química del
RNA y permiten interacciones entre zonas alejadas de la molécula.
- Por ello RNA es más inestable, y no adquiere las proporciones del DNA, ni
sus funciones de estabilidad y conservadurismo genético.
- En las cadenas monocatenarias de RNA suelen producirse emparejamiento
de bases dando lugar e estructuras llamadas Orquilla y Bucle.
3 Las Nucleasas:
- Se trata de un grupo de enzimas, dentro de las Serinproteasas, capaces de
hidrolizar los enlaces fosfodiester del RNA, y de las hebras de DNA.
- Están presentes en los lisosomas de la mayoría de las células en todos los
organismos vivos.
- Son liberadas por el páncreas al tubo digestivo, donde catalizan la digestión
de los ácidos nucleicos.
- Se distinguen Ribonucleasas y Desoxirribonucleasas en función del tipo de
ácidos nucleicos que hidroliza.
- Se distinguen, en función de la región del ácido nucleico en la que llevan a
cabo su acción:
Endonucleasas: En posiciones externas.
Exonucleasas 5’: En los extremos 5’.
Exonucleasas 3’: En los extremos 3’.
- Se distinguen también por el tipo de nucleótido que originan:
Tipo a: Rompen antes del P originando un 5’-Monofosfato Nucleósido.
Tipo b: Rompen después del P originando un 3’-Monofosfato Nucleósido.
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- Las Endonucleasas de Restricción tienen alta especificidad, pues reconocen
una corta secuencia de BN antes de realizar el corte. Sólo hidrolizan dichas
secuencias.
- Fueron descubiertas en bacterias, durante la década de 1970. Se nombran,
por este orden, en función del género, especie y cepa de la bacteria que los
sintetiza. Se asignan números romanos para diferenciarlas.
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VI/ Procesos Moleculares de la Expresión de la Información
Genética:
1 Generalidades:
- La replicación de la información genética es fundamental, previamente a la
Mitosis y la Meiosis. Permite el paso de cromosomas de una a dos cromátidas.
- La replicación exacta del DNA permite su transferencia fiel a siguientes
generaciones de células, e incluso organismos.
- El proceso se basa en la especificidad en el emparejamiento de BN (A-T; C-
G): Conociendo la secuencia de una de las cadenas, se puede deducir la cadena
complementaria.
- Watson y Crick descubrieron que, durante la replicación, cada una de las
cadenas actúa como molde para la síntesis de su cadena complementaria.
- Las DNA – Polimerasas son el grupo de enzimas que catalizan la síntesis de
DNA, dirigidas por una cadena molde. Necesitan detectar la presencia de un
Fragmento Cebador con OH en 3’ de la cadena molde para iniciar la síntesis.
- La síntesis tiene lugar de 5’ hacia 3’. Se utilizan como precursores
desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP).
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- DNA – Polimerasa III se encarga de la replicación durante la elongación de
la nueva cadena. Su cinética es 250 – 1000 N/s. Se trata de un polímero
asimétrico, con un núcleo central con tres subunidades: (elongación),
(exonucleasa 3’) y . Tiene otras subunidades, como (abrazaderas).
- Las tres DNA – Pol presentan actividad exonucleasa 3’, lo que les concede la
propiedad de reparar sus propios errores durante la replicación.
- DNA – Pol I tiene además actividad exonucleasa 5’ fundamental para
eliminar los Fragmentos Cebadores.
- La replicación se inicia en el punto Origen (Ori C) de origen, en el DNA
circular. Es un proceso Bidireccional: se forman dos Orquillas de Replicación que se
desplazan desde O en sentidos contrarios.
- En cada Orquilla de Replicación, hay replicación continua en una de las
hebras, la Cadena Conductora (de 5’ a 3’), y discontínua en la complementaria, o
Cadena Retardada (de 3’ a 5’); en esta última los fragmentos discontinuos reciben
el nombre de Fragmentos de Okazaki.
- La formación de estos fragmentos de Okazaki en la Cadena Retardada es
lógica teniendo en cuenta que DNA – Pol sintetizan siempre de 5’ a 3’, y dado que
ambas cadenas son antiparalelas: En la hebra complementaria (Retardada), DNA –
Pol actúa en sentido contrario al sentido de abertura de la Orquilla.
- Tanto en el fragmento continuo como en cada fragmento de Okazaki, la
síntesis comienza por un fragmento cebador de RNA, sintetizado por una Primasa
(DNA – Pol especializada).
- Las dos Orquillas de Replicación se encuentran en el polo opuesto a Ori C
terminando la replicación del plásmido.
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La subunidad exonucleasa 3’ detecta y corrige los errores recién
producidos en la nueva hebra.
Una misma DNA Pol III en cada orquilla de replicación cataliza las
síntesis de las cadenas Conductora y Retardada. (Hipótesis Bucle).
La polimerización tiene lugar por el ataque Nucleófilo del OH unido
en 3’ terminal, al trifosfato de 5’ del NTP, que al polimerizar pasa a
NMP.
6. DNA Pol I entra en acción. Tiene tres subunidades con actividad enzimática:
Exonucleasa 5’: Elimina los fragmentos cebadores en 5’ del DNA.
Polimerasa 5’ > 3’ Rellena los huecos de los fragmentos cebadores
con DNA. Desplaza las muescas.
Exonucleasa 3’: Corrige los errores recién cometidos en la síntesis.
7. La enzima DNA – Ligasa une los fragmentos de DNA de las hebras
fragmentadas, devolviendolas a la normalidad.
- HIPÓTESIS: Se forma un Bucle en la Cadena Retardada (ver fotocopia)
permitiéndose la lectura y síntesis simultánea de ambas cadenas, de 5’ a 3’. Por
ello DNA – Pol III es un polímero asimétrico. Al terminar una fragmento de Okazaki
se suelta un bucle y se forma uno nuevo en el siguiente fragmento cebador.
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- La Fotodimerización de dos TMP adyacentes es una de las lesiones más
frecuentes. Se produce ante rayos UV, que pueden dar lugar cáncer.
- La incorporación de un dímero de Timina unido por dos puentes de H
impide la correcta replicación del DNA. Se inicia todo un mecanismo de detección
y reparación en procariontes:
1. La Escinucleasa (con actividad endonucleasa) corta el fragmento que incluye
el dímero en la hebra replicada.
2. DNA Pol I sintetiza el DNA correspondiente al hueco, y DNA ligasa
incorpora el fragmento reparado en la hebra replicada.
- En procariontes y algunos eucariontes se encuentra DNA fotoliasa, que
absorbe los rayos UV. Con la energía de un fotón rompe un dímero de Timina en
BN originales.
- La Desaminación Hidrolítica es otra lesión frecuente del DNA. Se trata de la
substitución de grupos Amino por grupos Ceto. Transforma los NMP, por ejemplo,
transforma A en Hipoxantina, G en Xantina, y C en U.
- La DNA Glicosilasa rompe los enlaces N-Glicosílicos de la BN modificada.
Las endonucleasas cortan el fragmento que contiene la BN modificada. Finalmente
entran en acción DNA Pol I y DNA ligasa.
- Existen muchos factores del medio que influen en la modificación de BN,
como las radiaciones ionizantes, el oxígeno radiactivo, las reacciones oxidantes, o
pérdidas espontáneas de BN.
1 Generalidades:
- La Transcripción es un proceso fundamental de la expresión de la
información genética. La información contenida en un fragmento del DNA
cromosómico, que recibe el nombre de Gen, es capaz de atravesar la membrana
nuclear en forma de mRNA, en busca de un Ribosoma que realice la Traducción.
- RNA Polimerasa es la enzima responsable de llevar a cabo el proceso de
Transcripción de los genes. Sintetiza los RNA siempre de 5’ a 3’.
- Para su acción, requiere de la presencia de precursores activados NTP (ATP,
GTP, CTP y UTP), la presencia de Mg2+, y un molde de DNA, generalmente
dicatenario.
2 La Transcripción en procariontes:
- RNA Pol es la principal enzima relacionada con la Transcripción en
procariontes. Coactua con proteínas moduladoras de su actividad. Lee la hebra de
3’ a 5’ (sintetizando mRNA de 5’ a 3’).
- La cadena leída recibe el nombre de Hebra Antisentido, pues es
complementaria a la secuencia de RNA, y complementaria a la otra hebra que
recibe el nombre de Hebra Molde (no leída).
- Las funciones de RNA Pol son numerosas:
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1. Localiza los Centro de Iniciación o Promotores.
2. Separa localmente las hebras de DNA en el punto +1, donde se inicia la
Transcripción de la hebra antisentido.
3. Selecciona el NTP adecuado.
4. Cataliza la formación de enlaces fosfodiester por ataques nucleófilos.
5. Localiza las Señales de Terminación de la transcripción.
- RNA Pol se forma de seis subunidades:
(2 subunidades) reguladoras y responsables de la Iniciación de la
Transcripción. Forman parte del núcleo central de la proteína.
se encarga de llevar a cabo la iniciación y elongación. Forma
parte del núcleo central.
’ es la subunidad abrazadera que se une al molde de DNA. Forma
parte del núcleo central.
localiza el Promotor, lugar en que se inicia la elongación.
de funciones desconocidas.
- El proceso de Transcripción transcurre en tres etapas: Iniciación, Elongación
y Terminación.
-35 -10 +1
TTGACA-------------------TATTAT-----(A o G)
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- La Burbuja de Transcripción se desplaza a lo largo de la hebra de DNA,
pero tanto su longitud como la del híbrido DNA-RNA que se forma tras su paso son
constantes
- La subunidad de RNA pol cataliza la formación de los enlaces fosfodiester
de los nucleótidos incorporados, de forma similar a la replicación del DNA,
cambiando T por U.
- Cuando RNA Pol se desplaza, el DNA rota en su interior, y se crean
tensiones que ralentizan la velocidad de la burbuja de Transcripción. Las
Tropoisomerasas rebajan dichas tensiones.
- La última etapa es la Terminación. Tiene lugar de un modo muy selectivo, al
igual que la Iniciación.
- En el DNA, el final de los genes está marcado por determinados Fragmentos
Pausa, donde disminuye notablemente la velocidad de Transcripción.
- En estos fragmentos pausa hay numerosas señales de terminación:
Secuencias Palindrómicas de A y T, que al ser transcritas forman en el RNA
estructuras en Orquilla o Bucle, con fuertes uniones C-G.
- NUS A permanece durante la elongación unido a RNA Pol, evitando la
asociación de la subunidad . Facilita el reconocimiento de las señales de
terminación.
-------CGGCG---------CGCCGUUUUUUUUUUUU
4 La Transcripción en Eucariontes:
- Es, de nuevo, un proceso similar pero algo más complejo. Intervienen tres
tipos de RNA Polimerasas:
RNA Pol I: En genes de rRNA (18S, 5,8S, 28S).
RNA Pol II: En genes de mRNA para traducción a proteínas.
RNA Pol III: Genes para snRNA, tRNA y rRNA (5S).
- Además de estas, existen otras en mitocondrias y cloroplastos.
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- Todos los RNA transcritos primarios de eucariontes necesitan sufrir un
Proceso de Maduración antes de poder ser considerados activos y alcanzar su
conformación definitiva.
- Se distinguen tres tipos de maduración de RNA transcrito primario:
1. Eliminación de Secuencias: Pueden ser secuencias externas de 5’ o 3’
necesarias para iniciación y terminación. También pueden ser Intrones;
secuencias internas que no contienen información necesaria para prteínas.
2. Adición de Secuencias No Codificadas: Por ejemplo, la adición en tRNA de
CCA.
3. Modificaciones Covalentes: La más frecuente es la metilación de las BN. En
ocasiones también metilación de las ribosas en 2’.
Casos de Metilaciones:
Ribosa 2’-O-Metilribosa
A 6-Dimetiladenina
U T
Dihidrouridina
Ribotiuridina
Pseudouridina
LA MADURACIÓN EN E. COLI
Exón Intrón
MADURACIÓN
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- Posteriormente a la eliminación de intrones, los exones suelen ser
empalmados. Este proceso de Splicing es catalizado por encimas específicas. -
Finalmente se forma una caperuza CAP en el extremo 5’ del RNA, que
protege ante ataques de exonucleasas, y puede ser reconocido por los Ribosomas
en el citosol.
- El primer nucleótido en 5’ del RNA es un NTP. Por acción de una Fosfatasa
pierde su P en . Después se produce una Guanilización a costa de GTP. G queda
unido por medio de tres grupos P al extremos 5’ del mRNA, antes de que éste
pueda abandonar el núcleo celular.
1 Generalidades:
- Se trata del proceso de Biosíntesis de Proteínas, y es por lo tanto también un
proceso fundamental para toda célula viva.
- Se utiliza el molde de mRNA que transporta la información de un gen. En
concreto, la secuencia de BN (4 elementos) determina el orden de la secuencia de
-L-aa proteicos (20 elementos).
- Debido a la diferencia en el número de elementos, 1 codón = 3 BN = 1 aa.
Varios codones distintos pueden codificar un mismo aa.
- La traducción de un lenguaje al otro se realiza respetando el Código
Genético Universal, que es idéntico en, prácticamente, todos los seres vivos.
- tRNA transporta los aa que van a ser incorporados al péptido (aminoacil-
tRNA). Tiene un papel de intermediario en la Traducción.
- rRNA entra en juego formando una parte constitutiva de los Ribosomas;
maquinaria necesaria para la Traducción.
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- Las regiones apareadas suelen determinar la estructura de la molécula. Las
regiones no apareadas adquieren papeles funcionales; son las siguientes:
Extremo 3’ terminal unido a Secuencia CCA donde se une el aa.
Lazo TC: Las BN T y proceden de la Metilación de U.
Lazo Anticodón, Formado por 7 BN, posee en situación central las 3 BN
complementarias al codón cuyo aa es transportado en 3’-CCA.
Brazo Adicional Variable (l variable)
Lazo DHU (DiHidroUridina; UH2): Varias BN U son metiladas
transdormándose en D (UH2).
- Las modificaciones covalentes que tienen lugar en determinadas BN está
relacionado con el desapareamiento de BN de las regiones que las incluyen.
-C-U-X-Y-Z-A’-A-
ANTICODÓN
3 La Activación de Aminoácidos:
- Se da este nombre a la formación del enlace 3’-CCA – aa. Esta unión es
imprescindible para la biosíntesis de proteínas, pues los aa son incapaces de
reconocer el molde de mRNA.
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2. Se forma la unión aa-tRNA catalizada por las Aminoacil-tRNA-Sintetasas.
Se desprende el AMP.
- Las Aminoacil-tRNA-Sintetasas son altamente específicas a la hora de
relacionar cada aa con su tRNA. Existe al menos una para cada aa. Son capaces
de corregir errores.
EJEMPLOS:
Ser: 6 codones sinónimos.
Gly: 4 codones sinónimos.
Lys: 2 codones sinónimos.
- Tres de los tripletes, UAA, UGA y UAG, son codones STOP, o señales de
terminación.
- El codón iniciador AUG es reconocido por un tRNA iniciador (tRNAi)
especial que transporta siempre formil-Met.
- Además de servir como triplete iniciador, AUG marca la Pauta de Lectura,
pues define en toda la secuencia de aa donde comienza cada codón. Cualquier
desplazamiento en un número no divisible por 3 cambiaría todos los codones y,
radicalmente, la proteína.
- Las interacciones Codón – Anticodón se producen por emparejamiento de
las BN según las normas de Watson y Crick, pues en codón y anticodon las BN se
disponen de forma antiparalela.
- Posición Flexible o de Balanceo: Se trata de la posición 3’ del codón (5’ de
anticodon), que recibe este nombre debido a que las BN no siempre coinciden en
esta posición.
- Por ello algunos tRNA pueden unirse a varios codones, cuando la posición
de balanceo no coincide, mientras las dos primera BN lo hacen. Estos codones son
los Codones Sinónimos.
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EJEMPLO:
GCA Ala – tRNA
GCC Anticodón: CGI (I = Inosina)
GCU
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Alinea el molde de mRNA.
Participa en la selección del codón iniciador AUG.
Controla la fidelidad de la Traducción.
Interviene en la Terminación y la liberación del material.
- Siempre lee el molde de mRNA de 5’ a 3’, realizando la síntesis proteica de
a-t (NH3+) a c-t (COOH).
- Para descubrir el orden de síntesis de los péptidos se utilizaron reticulocitos
de conejo, que sintetizan activamente hemoglobina:
1. Se añaden aa marcados radiactivamente.
2. Detención: Se eliminan los aa marcados antes del tiempo de síntesis de una
cadena completa de Hg.
3. Aislamiento de las proteínas.
- Las cadenas que pudieron terminar su síntesis durante el corto pulso de aa
marcados presentaban radiactividad en su extremo c-t.
- Pudieron demostrarlo también utilizando Péptidos Sintéticos. Conociendo los
aa codificados se pudo identificar cual de ellos presenta su grupo amino (o
carboxilo) libre:
AAA = Lys
AAC = Asn
7.1La Iniciación:
- Participan IF1, IF2 e IF3.
- tRNA iniciador (tRNAi) es siempre el primer tRNA que se une, que
corresponde al codón iniciador AUG, marcando la Pauta de Lectura.
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- Siempre lleva unido formil-metionina (f-Met) (radical formilo en NH3+). No
es el mismo que transporta normalmente Met.
- En algunos casos el codón iniciador puede ser GUG (Val)
1. Disociación de las dos subunidades del Ribosoma.
2. IF3 se une a 30S evitando la reasociación con 50S. Facilita la colocación del
molde y colabora en la colocación del tRNAi.
3. IF2 unido a GTP se une a 30S y reconoce tRNAi, situándolo en el lugar que
le corresponde.
4. IF1 se une a 30S colaborando con IF3 e IF2.
5. Se produce la colocación del molde de mRNA en 30S. Una secuencia rica
en Purinas del rRNA 16S se aparea con la hebra molde de mRNA.
6. IF2 reconoce AUG y lo coloca en el lugar del Ribosoma en el que debe
interaccionar con el Anticodón de tRNAi.
- El resultado de este proceso recibe el nombre Complejo de Iniciación 30S.
Se forma de rRNA 30S, molde de mRNA, tRNAi con f-Met y Factores de Iniciación.
7. Se desprende IF3 pudiendo asociarse la subunidad 50S.
8. Se produce la hidrólisis de GTP de IF2, desprendiéndose entonces IF2 e IF3.
- El resultado final del proceso es el Complejo de Iniciación 70S. Se forma de
rRNA 30S, rRNA 50S, molde de mRNA, y tRNAi con f-Met. La Pauta de Lectura
queda marcada.
7.2 La Elongación:
- Participan EF Tu, EF Ts y EF G (o Translocasa).
- Los lugares A (aminoacil) y P (peptidil) de 50S del Ribosoma juega un papel
fundamental en la biosíntesis de proteínas. En ellas se unen respectivamente, el
aminoacil-tRNA nuevo y el peptidil-tRNA.
- El lugar E (vacío) ha sido descrito recientemente. Presuntamente alberga los
tRNA que acaban de ceder su aa al péptido.
1. EF Tu Selecciona el siguiente aminoacil-tRNA y lo coloca en el lugar A en
función del codón expuesto. Hidroliza GTP.
2. EF Ts cataliza el intercambio GDP > GTP en EF Tu para dejarlo activado
ante la llegada del nuevo codón. En un primer paso EF Tu pierde su GDP. A
continuación EF Tu y EF Ts con GTP forman un dímero. Finalmente EF Tu es
liberado activo, con GTP.
3. Peptidil Transferasa cataliza la unión de c-t de f-Met con a-t del nuevo aa.
Esta enzima forma parte de 50S, y cataliza el ataque nucleófilo de NH3+ a
COO- sin gasto energético.
EJEMPLO: Peptidil-tRNA:
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4. Se produce la Translocación del molde, que avanza un codón. Interviene EF
G o Translocasa, que hidroliza GTP:
Peptidil-tRNA libera el péptido y es arrastrado al lugar E.
Aminoácil-tRNA recibe la unión del péptido con el aa que
transportaba, siendo arrastrado al lugar P.
El lugar A queda vacío y expone un nuevo codón. Se repite el
proceso desde el paso 1.
- La síntesis de toda la Estructura Primaria de una Proteína tiene lugar por la
repetición de este proceso, codón tras codón.
7.3 La Terminación:
- Participan RF1, RF2 y RF3. Forman dímeros pudiendo reconocer distintas
Señales de Terminación:
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- Existen numerosos Factores que intervienen en la Traducción:
9 Factores de Iniciación (Incluído IF3).
3 Factores de Elongación (EF 1 EF 1 , y EF 2, corresponden
respectivamente a EF Tu, EF Ts y EF G).
Un único factor de terminación (RF).
- tRNAi no lleva unido f-Met sino Met, pero es igualmente distinto a los otros
tRNA que unen Met normalmente.
- El péptido recién sintetizado incluye Secuencias Señal que determinan su
destino final en las células y los tejidos. Después de ser reconocidas, estas
secuencias son eliminadas durante la Maduración.
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- Tiene receptores en la membrana de la mitocóndria, cercanos a canales que
permiten el paso controlado de péptidos.
- Finalmente se produce el plegamiento en la Matriz Endocondrial.
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- Alcanza el AG donde tiene lugar la segunda proteólisis y se obtiene la
proteína Madura: Insulina. Es secretada al torrente sanguíneo.
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