Trabajo Práctico N˚2

Aislamiento de la caseína, lactosa y

grasa de la leche

Asignatura:​​ Laboratorio de Química II

Fecha de realización:​​ 03/10/18 y 10/10/18

Fecha de entrega:​​ 17/10/18

Alumnos:​​ Galbán Francisco, Mobili Agustina y Torreani Josefina

Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

Objetivos
-Separación cualitativa de la caseína, lactosa y grasa de leche.

-Determinación cuantitativa del contenido de grasa en leche en polvo entera.

Introducción​​ [1]
​

La leche es una sustancia opaca, blanca, de sabor dulce y pH cercano a neutro, además
de tener una composición relativamente compleja. Sus cuatro componentes más importantes,
que pueden separarse mediante distintos solventes, son:

- Lípidos: c​ omponentes esenciales de las grasas (triglicéridos).

- Proteínas:​ caseínas, albúminas y globulinas.
- Glucósidos: ​esencialmente lactosa.
- Sales.
El trabajo práctico consta de separar los componentes previamente mencionados, a
partir de la reconstrucción de la leche en polvo, logrando una concentración cuatro veces
mayor a la normal.

Los componentes de la leche se encuentran en diferentes formas físicas. La ​caseína se

encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico), en forma de micelas, lo cual permite su
separación de la leche por acidificación ( en este caso, con el agregado de ácido acético). Así, se
disuelve el fosfato de calcio y los grupos fosfato se protonan. La precipitación de la caseína
comienza entonces, generando su desnaturalización: la caseína pierde sus estructuras de
orden superior. Lo cual genera una masa blanca, gomosa y amorfa, que luego se separa por
filtración.

El sobrenadante obtenido de la filtración, se utiliza para separar la ​lactosa​. Dicha

separación se lleva a cabo mediante dos filtraciones al vacío. En la primera se filtran las
lactoglobulinas y el carbonato cálcico (previamente agregado para neutralizar el ácido
acético). El filtrado presenta una coloración amarillenta, por lo que se utiliza carbón activado
para separar las impurezas coloreadas de la muestra. Por ser el carbón activado polvo negro
muy fino con un área específica muy grande, pero con tamaño de poros muy pequeño, resulta
necesario emplear un lecho filtrante para realizar la segunda filtración. Entonces, a la solución
se le añade también un ayuda filtrante y etanol caliente que, luego de la filtración, provoca que

2
Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

precipite lactosa. Se aplica el lecho junto al solvente en el papel de filtro antes del filtrado,
procurando que éste quede cubierto por completo, y se mantiene húmedo el lecho para que
no se generen grietas.

Para aislar la grasa de la leche, se realiza una extracción con solventes orgánicos no
polares, como cloroformo a partir de una muestra de leche en polvo.

Figura 1.​​ Información nutricional de la leche en polvo con la cual se trabajó.

Procedimiento experimental

Se colocaron 20 g de leche en polvo en un vaso de precipitado. Posteriormente, se

agregaron 50 ml de agua y se agito hasta la desaparición de los grumos. Fue necesaria una
concentración de leche alta para poder, luego, realizar una separación cuantitativa de la
lactosa.

3
Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

Se calentó hasta 40 grados en baño maría. Con una agitación suave, se agregaron
lentamente 10 ml de ácido acético al 10%.

Se dejó decantar la caseína precipitada y, unos instantes después, se filtró por

gravedad sobre un trozo de gasa. Se colocaron 4 capas de gasa en el embudo, tomando la
precaución de escurrir el filtro y cambiarlo cuando se tapaba.

Con el fin de eliminar aquellas proteínas que no hayan podido ser eliminadas en la
anterior filtración (como por ejemplo la albumina, entre otras), se agregó 1 g de carbonato de
calcio para neutralizar el medio. Luego, se calentó la solución resultante a ebullición, con
agitación rápida durante 2 a 3 minutos. Finalmente, se filtró al vacío con el objetivo de separar
el carbonato de calcio y las albuminas, entre otros solidos presentes.

El filtrado claro obtenido que contenía lactosa se concentró por evaporación hasta la
mitad de su volumen agitando vigorosamente, obteniéndose, de esta manera, un solución
concentrada de lactosa.

Por otra parte, se calentaron en un vaso de precipitado 175 ml de etanol al 95%,

llevándolos cerca de ebullición. Llegada la temperatura cerca de ebullición, se agregó la
solución concentrada de lactosa al vaso. Luego, agitando, y sacando el vaso del fuego, se
agregan 1,5 g de carbón activado.

Se llevó a cabo la preparación del agente filtrante para una posterior filtración al vacío,
de la solución obtenida en el paso anterior: se preparó a partir de 10 g de Celite y 50 ml de
etanol al 95%, ya que se utilizó un embudo Buchner de pequeño tamaño. Se colocó el lecho en
el Buchner y, sin hacer vacío en el kitasato, se dejó que el etanol filtrara. Se buscó tener un
lecho homogéneo (sin canales) y no seco por completo, para que no se agrietara.

Se vertió la solución alcohólica con la lactosa en el embudo y se filtró al vacío. Se

guardó el líquido sobrenadante en vaso de precipitado (previamente pesado vacío). Este se
tapó y se dejó cristalizar la lactosa. Finalmente, se pesaron los cristales obtenidos.

Los lípidos fueron extraídos con éter de petróleo, en vez de cloroformo como se
indicaba en el módulo de la catedra. Para ello, se agregaron 100 ml de éter de petróleo a 20 g

4
Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

de leche en polvo. Se calentó a ebullición bajo campana para evitar la inhalación de vapores
tóxicos, con agitación constante durante 2 a 3 minutos.

Se filtró al vacío con el objetivo de remover los restos de leche y separar la grasa
disuelta, recogiendo el filtrado en un cristalizador previamente tarado.

Se evaporo todo el éter de petróleo calentando bajo campana. Por último, se esperó a
que enfriara el cristalizador y se pesó en balanza analítica con las grasas dentro del mismo.

Materiales utilizados
● Vaso de precipitado (250,400,500 ml)
● Varilla de vidrio
● Espátula
● Vidrio de reloj
● Placa calefactora
● Embudo Buchner
● Kitasato
● Embudo
● Gasas
● Probeta (50,100 ml)
● Cristalizador
● Pipeta
● Balanza analítica
● Pizeta
● Propipeta

Reactivos utilizados
● Leche entera en polvo
● Agua destilada
● Etanol 95%
● Celite
● Carbón activado
● Carbonato de calcio (CaCO3)
● Éter de petróleo
● Ácido acético al 10 %

5
Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

Resultados experimentales y cálculos

Separación de proteínas y lactosa

Esta primera parte del práctico fue de carácter cualitativo.

Pudimos observar que la caseína tiene un aspecto grumoso, de color amarillento y

resultó ser un sólido bastante espeso.

Por otro lado, el sólido remanente sobre el papel de filtro(albúminas) tenía un aspecto
gomoso.

Los cristales recogidos luego de una semana de realizado el aislamiento ,

correspondientes a la lactosa, presentaron forma de solcitos pequeños, como puede
observarse en la Figura 2.

Figura 2​. Cristales de lactosa.

Se pesó por un lado el vaso de precipitados vacío y por otro el vaso con los
cristales(luego de haber evaporado todo el etanol) y se calculó el porcentaje de lactosa en la
leche en polvo.

m vaso ppdo vacío = 148.8 g

m vaso ppdo + cristales = 151.5 g

m cristales de lactosa = 2.7 g

m leche en polvo = 20.0368 g

6
Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

%P /P Lactosa = masa lactosa

masa leche en polvo * 100
2.7 g
%P /P Lactosa = 20.0368 g * 100 = 13.48%

Por tanto, según los resultados experimentales obtenidos, en cada 100 g de leche en
polvo hay 13.48 g de lactosa.

Según los valores de la Figura 1, el porcentaje teórico de lactosa (carbohidratos) en la

leche el polvo es:
39 g
%P /P Lactosa teórica = 100 g * 100 = 39%

Aislamiento de la grasa de la leche

m leche entera en polvo = 10.0936 g

m cristalizador = 62.9578 g

m cristalizador + grasas = 63.1718 g

m grasas = 0.214 g

Según los valores de la Figura 1 cada 100 g de leche hay 26 g de grasas totales.

100 g leche → 26 %p/p grasas

10 g leche → 2.6 g grasas

En la práctica los resultados experimentales fueron los siguientes:

10.0936 g leche → 0.214 g grasas

100 g leche → 2.12 % p/p de grasas

En comparación con el valor del paquete el porcentaje de grasas obtenido fue mucho
menor debido a los problemas que se fueron presentando durante la práctica de
laboratorio,posteriormente mencionados en la parte de fuentes de error del respectivo
Práctico.

Cuestionario
1) Explicar detalladamente cual es la estructura que adopta la caseína que se encuentra
en la leche. En función de esto, explique por qué el agregado de ácido acético al 10%

produce la precipitación de la proteína.​[3]

​

7
Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

Las moléculas individuales de caseína se caracterizan en general por tener un tamaño

mediano (unos 200 aminoácidos, siendo algo menor la caseína κ), contar con pocos tramos
con estructura secundaria organizada, debido a la presencia de abundantes restos de prolina,
y tener unidos covalentemente grupos fosfato a algunos de los restos de serina, y muy
ocasionalmente a restos de treonina. La falta de organización de las moléculas de caseína ha
hecho que hasta el momento ninguna haya podido cristalizarse para llevar a cabo estudios
detallados de su estructura secundaria y terciaria.

Desde el punto de vista de la estructura, en la leche bovina (y en la mayoría de las

leches de otras especies) existen cuatro caseínas, conocidas como α​s1​, α​s2​, (la s del subfijo
indica que son “sensibles” al calcio, es decir, que pueden precipitar al asociarse con él) β y κ.
Las llamadas “caseínas γ” son simplemente fragmentos de la caseína β producidos por
proteolisis por la plasmina. Todas las caseínas tienen variantes genéticas, producidas por
sustitución de aminoácidos y en algunos casos por delección.

Existen diferencias en la proporción que representa cada tipo en el total de las

caseínas. De entre las especies más comunes, las mayores diferencias se encuentran en el
cotenido de caseína κ que representa el 3% de las caseínas de leche de búfala, el 13% de las
de la leche de vaca y el 26% de las de la leche humana.

Las micelas de caseína son partículas de un tamaño entre 50 y 500 nanómetros,

formadas por la asociación de moléculas de caseína junto con fosfato cálcico en forma coloidal.
El componente “mineral” representa alrededor del 7% del peso de la caseína. La estructura
interna de las micelas de caseína, si es que realmente puede hablarse de una estructura
organizada, está en discusión.

Por una parte, según el modelo más aceptado, las micelas estarían formadas por la
agregación de otras partículas menores, las llamadas “submicelas”, unidas entre sí a través de
puentes de fosfato y por interacciones hidrofóbicas. Las moléculas individuales de de caseína
se unirían dentro de las submicelas fundamentalmente a través de enlaces hidrofóbicos.
Ahora bien, las “submicelas” son probablemente estructuras menos definidas de lo que se ha
supuesto hasta el momento, y parece probable que el interior de las micelas tenga una
estructura menos organizada, con asociaciones de moléculas de caseína producidas por su
interacción con partículas de fosfato cálcico coloidal de tamaño nanométrico. De hecho, el otro

8
Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

modelo de micela de caseína propuesto implica la existencia de nanoclusters de fosfato cálcico

distribuido dentro de una partícula más o menos homogénea formada por la asociación de
caseínas individuales. La fosfoserina, que es una pieza esencial en el mantenimiento de la
estructura de cualquier modelo de micela de caseína, puede formar puentes con iones de
calcio.

El fosfato de calcio se encuentra en las caseínas como “fosfato coloidal”, en forma no

cristalina. Las partículas de fosfato amorfo o coloidal dentro de la caseínas tienen un tamaño
del orden de 2,5 nanómetros, y están formadas por un núcleo de fosfato cálcico recubierto de
una capa de proteína de un espesor de alrededor de 1,5 nanómetros, unida al fosfato cálcico
mediante puentes a través de las fosfoserinas. La superficie exterior de la micela sería también
cambiante, especialmente sensible a las modificaciones del medio que alteraran la hidratación
de las moléculas.

En condiciones normales de pH y concentración de sales, las micelas de caseínas se

encuentra muy hidratadas, teniendo ligados alrededor de 3,7 gramos de agua por gramo de
proteína. La hidrofilicidad de las micelas de caseína se debe a que la caseína β situá su zona
hidrófila preferentemente hacia el exterior, y también lo hace la caseína κ, que se sitúa
preferentemente en la superficie de la micela.

Las micelas de caseína se desestabilizan fundamentalmente por dos procesos: Por la

acidez, y por la proteolisis de la caseína κ.

La acidez tiene dos efectos. En primer lugar, según va bajando el pH se van rompiendo
los enlaces entre los grupos fosfato y el ion calcio, al reducirse la ionización de los fosfatos. En
segundo lugar, las repulsiones entre las micelas se reducen, al acercarse el pH al punto
isoeléctrico de las caseínas. A un pH de alrededor de 4,5 , con el agregado de ácido acético
10% (y a una temperatura superior a 20ºC) las caseínas se unen, formando una cuajada poco
mineralizada.

2) Luego de separada la caseína, al sobrenadante se lo trata con CaCO3 y se calienta a

ebullición. ¿Cuál es el objetivo de esos tratamientos?

9
Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

Dado que la leche había sido acidificada para permitir la coagulación de la caseína,
posteriormente se la trata con una base, Carbonato de Calcio, para neutralizar el medio.

Las proteínas del lactosuero, que incluyen a las lactoalbúminas y lactoglobulinas, no

precipitan con las caseínas por simple acidificación sino que deben ser desnaturalizadas por el
calor. La desnaturalización se refiere a un cambio irreversible en algunas de las propiedades
de las proteínas, la que se observa más fácilmente es la pérdida de solubilidad. Los
mecanismos de desnaturalización se sitúan a nivel de los enlaces secundarios y
terciarios(enlaces Calcio, Fósforo, Hidrógeno), que mantienen a la proteína en una
configuración globular o replegada. La destrucción de estos enlaces abre las cadenas
polipeptídicas, características de las proteínas, produciendo una pérdida de solubilidad y una
consecuente precipitación de las albúminas y las globulinas.

3) ¿Cómo explica que la grasa de la leche se mantenga en suspensión acuosa en forma

aparentemente estable, sin separarse de ella?

La materia grasa se encuentra en forma de glóbulos esféricos suspendidos en la fase

acuosa. El diámetro de estos glóbulos varía normalmente entre 2 y 10 micrómetros. Cada uno
de ellos consiste en una masa de triglicéridos envuelta en una membrana lipoproteica. Los
triglicéridos más insaturados y los que tienen peso molecular más bajo, están situados en el
centro del glóbulo , probablemente porque son líquidos y así quedan retenidos por los
glicéridos más sólidos que se localizan en la periferia.

Los fosfolípidos son moléculas hidrófilas y lipófilas. Esta peculiaridad les confiere un
papel fundamental en la estabilidad de los glóbulos suficiente para formar una capa
monomolecular en la superficie de todos los glóbulos grasos. La parte polar de los fosfolípidos
se orienta hacia la fase acuosa y el segmento apolar hacia la fase lípida.

Los glóbulos grasos están cargados negativamente y estas cargas también contribuyen
a mantener su estabilidad, lo que se observa en la Figura 3.

10
Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

Figura 3.​ Estructura del glóbulo graso.

4) ¿Cómo prepara un lecho filtrante y que cuidados debe tener? ¿En qué casos recurre a
esta técnica de filtración?

Cuando el tamaño de las partículas a filtrar es muy pequeño, como el caso de la

filtración de carbón activado, debe recurrirse a la preparación de un lecho filtrante con un
ayuda-filtrante, como el Celite o Hy-flo. En este caso se prepara una suspensión de celite en
alcohol etílico y se vierte sobre un embudo Buchner. Posteriormente se deja que el alcohol
filtre, tomando la precaución de conectar al vacío y que el sobrenadante de la filtración sea
transparente. Debe dejarse que el líquido filtre por gravedad para permitir la formación de un
lecho homogéneo, sin canales internos. No debe secarse por completo el lecho, dado que
podría agrietarse. La presencia de canales o grietas resulta sumamente indeseable pues a
través de las mismas pueden filtrarse las partículas que desean retenerse.

Una vez que se ha obtenido un lecho homogéneo, se vierte la solución a filtrar y se

conecta el kitasato a una trompa de agua que genera un vacío parcial y permite la correcta
filtración de la misma.

11
Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

5) ​Completar el esquema de separación para el aislamiento de la caseína y la lactosa de

la leche.

6) Investigar acerca de los productos comerciales disponibles para ser utilizados como
lechos filtrantes. Haga un listado de los mismos, indicando su composición.

-​Arenas verdes​​(con alto % de gloconita): los filtros de arena son los más utilizados para
filtrar aguas con pequeñas cantidades de contaminantes. Las partículas en suspensión que
lleva el agua son retenidas durante su paso a través de un lecho filtrate de arena. La arena
verde es un medio color morado-negro usado para remoción de hierro, manganeso y sulfuro
de hidrogeno del agua. También puede remover radio y arsénico. Es procesada con minerales

de glauconita y zeolita.​[4]

-​Grava Sílica​​: la mayoría de las gravas ya renas sílicas en sus diferentes granolumetrías son
de cierto material rocoso, cuya composición es altamente rica en feldespatos ortoclásicos.

-​Productos de diatomita​​: altamente purificados, poseen una estructura porosa como así
compleja otorgada por la presencia de dióxido de silicio. En general muestran un contenido
metálico con una bajísima solubilidad y gran brillo. Además, poseen baja densidad. Son de uso
frecuente en la filtración de la cerveza.

7) ¿En qué consiste el carbón activado? Describa sus usos más frecuentes.

12
Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

El carbón activado o carbón activo es carbón poroso que atrapa compuestos,

principalmente orgánicos, presentes en un gas o en un líquido. Lo hace con tal efectividad, que
es el purificante más utilizado por el ser humano.

Activar un carbón consiste en hacerlo poroso para ampliar su capacidad de adsorción.

Un gramo de carbón de leña tiene un área superficial de alrededor de 50 m2. Con la activación,
ésta llega a 600 u 800 m2. Es decir, aumenta entre 12 y 16 veces.
Los ​átomos de carbono que forman un sólido al que llamamos “carbón”, se ligan entre
sí mediante uniones de tipo covalente. Cada átomo comparte un electrón con otros cuatro
átomos de carbono (hay que recordar que en las uniones iónicas, el átomo más
electronegativo le roba uno o más electrones al otro).
Los átomos que no están en la superficie, distribuyen sus cuatro uniones en todas las
direcciones. Pero los átomos superficiales, aunque están ligados con otros cuatro, se ven
obligados a hacerlo en menor espacio, y queda en ellos un desequilibrio de fuerzas. Ese
desequilibrio es el que los lleva a atrapar una molécula del fluido que rodea al carbón.
La capacidad de un carbón activado para retener una sustancia determinada no sólo
está dada por su área superficial, sino por la proporción de poros cuyo tamaño sea el
adecuado, es decir, un poco adecuado tiene un diámetro de entre una y cinco veces la
molécula de que se va a adsorber.
Si se cumple esta condición, la capacidad de un carbón activado puede ser de entre el
20% y el 50% de su propio peso.
Usos más frecuentes del carbon activado:

● Remoción de impurezas que le dan color, olor y sabor al agua potable.

● Proceso de descafeinado del café.
● Decoloración de azúcar, mieles, caramelos.
● Decoloración de licores, jugos, vinagres.
● Tratamiento de agua en procesos industriales.
● Tratamiento terciario de aguas residuales.
● Purificación de aire y gases industriales.
● Respiradores de cartucho (Mascarillas para gases).
● Eliminación de olores en lugares cerrados: cocinas, bodegas, refrigeradores, etc.
● Purificación de aire comprimido (tanques de buceo y hospitales).
● Adsorbente de etileno para evitar la maduración prematura de frutas y verduras.
● Tratamiento contra intoxicaciones agudas.
● Tratamiento de llagas, quemaduras, o heridas, con apósitos de carbón activado
impregnado con plata.
● Recuperación de oro, plata y otros metales.​[5]

13
Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

Fuentes de error
Si bien la primera parte del práctico fue de carácter cualitativo se pueden comentar
algunos factores que pueden haber modificado el correcto desarrollo del práctico:

● A la hora de realizar la filtración por gravedad con embudo y gasa, se debe tener en
cuenta que quizá no todo la solución haya podido escurrir perfectamente, es decir,
puede que se en ese paso se pierda cierta cantidad de solución.
● La filtración al vacío de la solución concentrada de lactosa fue realizada tres veces
debido a la dificultad encontrada en la formación del agente filtrante de Celite.
Por otro lado, en la segunda parte del práctico que fue el aislamiento de la grasa de la
leche se pudieron destacar los siguientes hechos:

● Fue calculado el porcentaje de grasa por diferencia de pesada, este hecho introduce un
cierto error que es mayor, debido a que se trata de una medición indirecta.
● En el momento del trasvase de la leche en polvo desde el vidrio de reloj al vaso de
precipitado, en el que se formó la solución con el agregado de éter etílico, se introduce
un cierto error ya que puede que se haya perdido una cierta cantidad masa. Aunque
las pérdidas puede que no sean significativas, modifican levemente la masa de leche
pesada y, por lo tanto, el porcentaje de grasa presente.
● A su vez, se pudo haber evaporado todo el éter de petróleo, esto genera que el residuo
de la leche pase a un color amarillo oscuro con olor a ¨manteca quemada¨ , lo cual
genera un error en la posterior pesada de las grasas.

Conclusión
Se lograron cumplir los objetivos planteados al inicio del práctico ya que se pudo
aislar y reconocer los distintos componentes de la leche, así como también, adquirir un mayor
conocimiento acerca de compuestos orgánicos más complejos como lo son los lípidos,
proteínas y carbohidratos. Además, se supo entender la importancia del uso de ciertos
reactivos de laboratorio como el agente de filtración y el carbón activado.

Bibliografía
[1] Módulo de la cátedra de Laboratorio de Química II 2018.

14
Trabajo Práctico N​​˚2
Galbán –Mobili -Torreani

[2] Modulo de Laboratorio de Química I.

[3] ​http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/proteins/caseina.html

[4]​https://www.proyectos-microclima.com/productos/lechos-filtrantes/

[5]​https://www.carbotecnia.info/encyclopedia/que-es-el-carbon-activado/

15